HUT50498A - Process for producing soluble recombinant fc under epsilon receptor - Google Patents

Description

A találmány oldható Fc^,-receptorra , előállítására, valamint alkalmazására vonatkozik.

Legutóbb Tadamitsu Kishimoto és mtsai [Cell,

47, 657-665 (1986)] , valamint Guy Delespesse és mtsai EThe EMBO 3., 6, 109-114 (1987)1 ismertették a szakirodalomban az FCffR humán limfocita immunglobulin receptor molekuláris szerkezetét, klónozását és expresszióját.

Az Rc^R molekuláris szerkezete (lásd az 1. ábrát) a következő képet mutatja: a sejt membránban úgy helyezkedik el, hogy N-terminusza a sejt belsejébe nyúlik és karboxi-terminusza a sejten kívülre esik.

a tripszin-szerü proteázok számára potenciális hasítási helyet képez, s ez magyarázza a Fc^R szolubilis komponenseinek a jelenlétét a B sejtek és bizonyos B limfoblasztoid sejtvonalak tenyészetének felüluszójában. Ez lehet az oka kapcsolódott része vagy IgE-vel komplexet alkotó része jelen van normál és atópiás egyének szérumában, de ez utóbbi csoportban jelentősen nagyobb mennyiségben.

Továbbá, a még nyilvánosságra nem hozott

87111392.4 sz. európai szabadalmi bejelentésben szerepel egy olyan cDNS szekvenciának a leírása, amelyben az 1-143 aminosavakat kódoló cDNS szekvenciának legalább egy részét olyan megfelelő cDNS fragmentum helyettesíti, amely egy eukarióta szignál szekvenciát kódol. Azaz, az ismertetett • ·

- 3 ps-FcpR-1 plazmidban (lásd a 4. ábrát) az 1-133 aminosavakat kódoló szekvencia helyett a következő BSF-2 szignál szekvencia (BSF = B cell stimulating factor =

B sejt növekedési faktor) helyezkedik el:

A LE392 plazmidot [Cell, 47, 657-665 (1986)] , amelyet a Budapesti Egyezmény alapján 1986. augusztus 1-én helyeztünk letétbe FERM BP-1116 szám alatt, HindlII-al emésztjük, aminek eredményeképpen egy 1,0 kb (kilo bázis pár) Hindui fragmentumot kapunk, amely a teljes hosszúságú Fc^R cDNS-ből a 134-321 aminosavakat kódoló szekvenciát tartalmazza. Ezután e fragmentum benyúló 3’ végét betöltjük a DNS polimeráz Klenow fragmentje segítségével, majd a DNS-t Pstl-el emésztjük. A kapott fragmentumot megfelelő vektorbe klónozzuk, előnyösen egy BamHI-Pstl-el emésztett pBSF2-L8-ba, mely vektort alkalmas módon a következőképpen szerkesztjük meg:

A pBSF-2.38-at [Natúré, 324, 73-76 (1986)] HindlII-al és BamHI-vel emésztjük, s igy előállítjuk az 1,2 kb EcoRI-BamHI BSF-2 cDNS inszertumot. A kapott fragmentumot, amely a teljes hosszúságú BSF-2 cDNS-t tartalmazza, ezután Hinfl-el emésztjük, majd a benyúló 3' végeket a DNS polimeráz Klenow fragmentjével betöltjűk. KpnI-el való emésztés után a kapott 110 bp Kpnl-Hinfl fragmentumot, amely a BSF-2 vezérszekvenciát tartalmazza, beklónozzuk az előzőleg KpnI-el és Smal-el • · · · ·«·· • · · · • ······ emésztett pGEM4 többszörös klónozó helyére. Az egyik szelektált kiónt elszaporitottuk és pBSF2-L8-nak neveztük el (lásd s 3. ábrát).

A pBSF2-L8-at BamHI-el emésztjük, majd a benyúló 3' végeket a DNS polimeráz Klenow fragmentjével betöltjük. A BamHI hely betöltése után a fent említett HindlII-PstI Fc^R cDNS-t beklónozzuk a BamHI-Pstl-el hasított előbb említett pBSF2-L3-ba. Az egyik szelektált kiónt elszaporitottuk és psFc^R-1-nek neveztük el (lásd a 4. ábrát).

Meglepő módon azt találtuk, hogy ha egy olyan kódoló szekvencia fejeződik ki, amelyben az 1-148 aminosavakat kódoló cDNS szekvenciának legalább egy részét egy eukarióta szignál szekvenciát kódoló megfelelő cDNS fragmentummal helyettesítjük, úgy a többsejtű szervezetekből származó sejtekben egy erősen bioaktiv vizoldható Fc^R-t kapunk.Ezt elvileg bármilyen sejt tenyészettel megkaphatjuk, akár gerincesekből, akár gerinctelenekből származó sejteket használunk. Azonban a gerincesekből származó sejtek a legelőnyösebbek, s igy a gerincesek sejtjeinek szaporítása tenyészetben (szövettenyészet) rutin eljárássá vált a legutóbbi években LTissue Culture, Academic Press, Kruse és Patterson (1973)]. Hasznos sejtvonalak például a következők: VERŐ és HeLa sejtek, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalak és a

VV138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonal. Az ezen sejteknél alkalmazott expressziós vektorok (ha szükséges) egy replikációs origót, egy promotert, amely a kifejezendő génnel szemben helyezkedik el az összes szükséges riboszóma kötőhellyel együtt, RNS splicing helyeket, poliadenilációs helyet és transzkripciót leállító szekvenciákat tartalmaznak.

Emlős sejtekben való felhasználásnál az expreszsziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran virális genomok szolgáltatják. Az általánosan használt promoterek például a polyomavírusból, adenovirus-2-ből és leggyakrabban a simianvirus 40-ből (SV40-ből) származnak. Az SV40 korai és késői promoterei különösen hasznosak, mivel mindkettő könnyen izolálható a vírusból olyan fragmentum formájában, amely még az SV40 virális replikációs origóját is tartalmazza [Fiers és mtsai, Natúré, 273, 113 (1978)].Kisebb és nagyobb SV40 fragmentumok szintén használhatók, feltéve, ha tartalmazzák azt a mintegy 250 bp hosszú szekvenciát, amely a Hindin helytől a virális replikációs origóban lévő BglI helyig terjed. Ezenkívül az is lehetséges, és gyakran kívánatos, hogy olyan promoter- és szabályozó szekvenciákat használjunk, amelyek természetes kapcsolatban vannak a kívánt gén szekvenciával, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák kompatibilisek a gazdasejt rendszerekkel.

Replikációs kezdőpontról vagy úgy gondoskodunk, hogy a vektor szerkesztésekor exogén eredetű origót vezetünk be, amely származhat az SV40-böl vagy más virális forrásból (például: polyoma, adeno, VSV, BPV, stb), de a gazdasejt kromoszómái is replikációs mechanizmusából is származtathatjuk. Ha a vektor a gazdasajt kromoszómájába van integrálva, az utóbbi megoldás gyakran megfelelő.

A legelőnyösebb azonban egy olyan klónozó hordozó (ingázó plazmid) használata, amely mind eukariótában, mind prokariótában lehetővé teszi a replikációt. A plazmidnak az a képessége, hogy prokariótákban replikálódik, alkalmas módot nyújt ahhoz, hogy manipuláljuk a DNS szekvenciát és hogy nagymennyiségű plazmid DNSre tegyünk szert, amelyre az emlős sejtek transzfekciójánál szükség van.

Egy ilyan ingázó plazmid prokarióta DNS elemeket, valamint eukariótákból származó DNS szekvenciákat tartalmaz.

A plazmid prokarióta része egy replikációs kezdőpontból áll, amely rendszerint a pBR322 plazmádból ER.C.Mulligan és mtsai, Proc.Natl. Acad, Sci. , 78, 2072-2076 (1981)] származik és egy marker génből, amely megkönnyíti a szelektálást antibiotikum tartalmú táp • · • ·· ·

- 7 talajon. A legáltalánosabban használt szelekciós gének azok, amelyek ampicillin, tetraciklin vagy kloramfenikol rezisztenciát közvetítenek (lásd R.C. Mulligan és mtsai fenti közleményét).

Az ingázó plazmid eukarióta részének tartalmaznia kell egy replikációs origót, amely rendszerint virális genom eredetű, például SV40 E R. C, Mulligan és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78., 2072-2076 (1981 )] vagy bovin papillomavirus [BPV; D. DiMaio és mtsai, Mól. Cell.Biol., 4, 340-350 (1984)] eredetű. Másodszor egy szelekciós marker génre is szükség van, hogy az ingázó plazmidot tartalmazó sejtnek lehetővé tegye a szelektív körülmények közötti növekedést , s hogy a plazmid fennmaradjon a sejtekben. A marker gén lehet prokarióta vagy eukarióta eredetű. Példák prokarióta génekre: a xantin-guanin-foszforibozil transzferázt kódoló gpt gén [R.C.Mulligan és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 2072-2076 (1981 ) és Science , 209 , 1422 (1980)], a G418 neomicin származékkal szembeni rezisztenciát közvetítő bakteriális foszfatázt kódoló neo gén [P.Southern és mtsai, □. Mól. Appl. Génét. , 327 (1982), U.Scholer és mtsai, Cell, 36, 1422 (1984)] , a kloramfenikol acetil-transzferázt kódoló CAT gén [C.Gorman, Mól. Cell.Biol,, 2, 1044 (1982)]. Példa eukarióta génre: a tímidin kinázt • ·····« “ · · • · ^, · · · ♦ ·· kódoló gén EM. Wigler, és mtsai, Cell, 11 , 223 (1977)1 .

A harmadik eukarióta DNS elem, amely a kívánt klónozott gén expresszióját teszi lehetővé, egy promoter szekvencia,amely vagy konstitutív vagy indukálható lehet. Konstitutív promoter például a simianvirus 40 vagy a Rous szarkómavirus promotere ER.C.Mulligán és mtsai, Science, 209, 1422 (1980), L.Laimons és mtsai, Proc.Natl.Acad.Sci., 79, 6453 (1982)1. Indukálható promoter az egér emlő tumor vírus (MMTV = murine mammalian tumor vírus) promotere [A.B. Chapman és mtsai. Mól. Cell Bioi. , 3, 1421-14291 , a hősokk protein promoter EH. Pelham és mtsai, EMBO 0., 1_, 1473 (1982)1 és a metallotionein promoter EK.Mayo és mtsai, 99^Cell , 29~^ ( 1982 ) , M. Karin és mtsai, Natúré, 299 , 797 (1982)1 .

Hogy az Fc£_-receptor protein vizoldható részéből viszonylag nagy mennyiségekhez jussunk magasabbrendü eukariótákban, annak egyik útja az, hogy az Fc^-receptor szolubilis részét kódoló gént hozzákapcsoljuk az SV40 promoterhez (konstitutív) és e hibrid gént beklónozzuk egy dihidrofolát reduktázt (dhfr) kódoló gént tartalmazó plazmádba. Szelektív nyomásra a dhfr gén és a szomszédos DNS szekvenciák ezerszeresre szaporodnak, nemcsak a dhfr gén hozamát, növelve, hanem a szolubilis Fc^-receptor rész kitermelését is (EP-A-0 093 619).

• · • · • · · · · · • · · · • · · · • ·

- 9 A találmány egy előnyös megvalósítási módját mindamellett az alábbiak jelentik: egy olyan vektor, amely többsejtű szervezetek sejtjeiben való kifejeződésre alkalmas és amely a 4, ábrán bemutatott psFc^R-1 fent említett kódoló szekvenciáit tartalmazza; az ilyen vektorral transzficiált sejtek; a megfelelő gének, amelyek mesterségesen hozzá vannak kapcsolva egy megfelelő replikonhoz és szabályozó szekvenciákhoz; a kifejezett vizoldható Fc^R és előállításának eljárásai.

Egy ilyen, találmány szerinti vektort például a PDE-2, pSV2 vagy 7Th3M alap-vektor felhasználásával a következőképpen állíthatunk elő:

a) A PDE-2 expressziós vektort (lásd az 1986/88879 számú japán szabadalmi leírást), amely két SV40 korai promotert hordoz, EcoRI-el emésztjük (standard technikák alkalmazásával) és a psFcpR-1 EcoRI fragmentumával ligáljuk, amely a BSF-2 vezérszekvenciáját tartalmazza (lásd a 2. ábrát). A kapott PDE-2sFc_<£_R expressziós vektor szerkezetet használjuk majom COS-7 sejtekben való kifejezésre.

b) A TH3M expressziós vektort [Proc.Natl.Acad, Sci., 84, 3365-3369 (1987)] CKhoI-el emésztjük, majd a linearizált plazmidot tompa végűvé alakítjuk Klenow fragment segítségével dNTP jelenlétében. Ezután a vektort bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeljük, fenollal extraháljuk és kicsapjuk.

• 4 plazmido t

Ezzel párhuzamosan a psFc£_R-1 [az Fc^-receptor gén szolubilis részét és a BSF-2 vezérszekvenciát a géntől upstream irányban (ellenirányban) tartalmazza] EcoRI-el emésztjük

Klenow betöltési reakció után a DNS fragmentumot elektroeluáljuk.

A linearizált, defoszforilált 9Th3M vektort a BSF-2sFc£2:^dNS fragmentumhoz ligáljuk dal juk

E.coli sejteket transzformálunk, a és ITsFc^R jelöléssel játjuk el.

plazmidot szaporit-

c) A pSV2-gpt expressziós vektort EScience,

209

1422 (1980)] EcoRI-el és BamHI-el emésztjük, majd a kapott DNS-t etanollal csapjuk ki és ezután Klenow frag menttel kezeljük. Az enzim inaktiválása után a DNS-t bor jubél alkalikus foszfatázzal kezeljük, fenollal extrahál juk, agaróz gélben tisztítjuk és elektroeluáljuk.

Ezzel párhuzamosan Fspl-el és HindlII-al emésztjük a dihidrofolát reduktáz gént a hörcsög sejtekből származó megfölslő szabályozó szakaszt [Mol. Cell

Bioi.

425-440 etanollal való kicsapás után az izolált 2658 bp DNS fragmentumot tompa végűvé alakítjuk, majd agaróz gélben tisztítjuk és elektroeluáljuk.

(1986)]

Az igy kapott DNS fragmentumot és a módosított ··· ··· _ · · · ·· ··· ·· ·· ·« • ·· • · ··♦ ·« pSV2-gpt vektort összekapcsoljuk (ligázzal) és bevisszük E.coli 3M101 sejtekbe, EcoRI-el és MstlI-vel végzett restrikciós enzimes analízis után két pozitív kiónt szelektáltunk, amelyek a dhfr génnek az SV40 ori-hoz viszonyított orientációjában különböztek egymástól, s ezeket pSV2-gpt-dhfrl7, illetve pSV2-gpt-dhrf20 megjelöléssel láttuk el.

A kapott pSV2-gpt-dhfr vektorok közül egyet Apal-el emésztünk és Klenow enzimmel kezelünk. A fenol-kloroformos extrahálás és etanolos kicsapás után kapott DNS-t HindlII-al, majd az enzim inaktiválása után borjúból alkalikus foszfatázzal inkubáljuk, A kívánt pSV2-dhfr vektort, amely nem tartalmaz gpt gént, úgy kapjuk meg, hogy fenol-kloroformos extrahálást végzünk, agaróz gélben kromatografalunk és elektroeluálunk. Az ilyen módon izolált pSV2-dhfr vektort egy olyan DNS amely az Fc£_R szolubilis részét fragmentummal ligáljuk.

kódoló szekvenciát tartalmázzá, mely szekvencia upstream (ellenirányban) kapcsolódik a fragmentumot előnyösen amely a BSF-2 vezérszekvenciához ellenirányban kapcsolódó

Fc^receptor gén szolubilis részét tartalmazza. Ezután a kapott reakció-keveréket Klenow enzimmel inkubáljuk dNTP jelenlétében a tompa végek kialakítása céljából. Ezután • · · ·· • · »· • · következik a fenollal való extrahálás és az etanolos kicsapás. A kapott DNS-t HindlII-al inkubáljuk, fenol/kloroformmal extraháljuk és agaróz gélben tisztítjuk. Az izolált 1.500 bp fragmentumot elektroeluáljuk, a fragmentumot a linearizált pSV2-dhfr vektorral ligáljuk, s ezzel transzficiáljuk az E.coli HB101 sejteket. Restrikciós enzimes analízis után két pozitív kiónt szelektáltunk, a pSV2-dhfrlY-sFc^ kiónt, illetve a pSV2-dhfr20-sFcg_kiónt.

A kapott expressziós vektorokat kínai hörcsög petefészek sejtekben való kifejezésre használtuk.

A mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből származó sejt tenyészeteket is használhatunk gazdák gyanánt. Elvileg bármilyen ilyen tenyészet alkalmazható, akár gerincesekből, akár gerinctelenekből származik.

A sejtek tenyésztése (szövet tenyészet) rutin módszerré vált [Tissue Culture, Academic Press, Kruse és Patterson (1973)]. Gerinces eredetű gazdasejt-vonalak például a következők: VERŐ, HeLa sejtek, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalak és a VV138, BHK, COS-7 és MDCK sejt vonalak; az utóbbi években azonban a gerinctelenekből származó sejtvonalak is használatosakká váltak (például a Spodoptera frugiperda sejtekből klónozott 8f9 klónozott sejtvonal; ATCC-től beszerezhető).

Az ilyen sejtekhez alkalmas expressziós vektorok rendszerint tartalmaznak - ha szükséges - egy replikációs origót, a kifejezendő génnel szemben elhelyezkedő promotert az összes szükséges riboszóma kötőhellyel együtt, RNS splicing helyeket, poliadenilációs helyet és transzkripciós terminátor szekvenciákat.

Emlős sejtekben való alkalmazásnál az expreszsziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran vírus genomok szolgáltatják. Általánosan használt promoterek például a polyoma vírusból, adenovirus-2-ből és leggyakrabban a simianvirus 40-ből (SV40) származnak; gerinctelenekből való sejtek esetében például az Autographa californica nukleáris polyhedrosisvírus (AcNPV) polihedrin génjének promotere alkalmazható [M.D.Summers és G.E. Smith: A Manual of Methods fór Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures (1987) Department of Entomology, Texas, Agricultural Experiment Station és Texas A and M Universityl.

Az SV40 korai és késői promoterei különösen hasznosak, mivel mindkettő igen könnyen izolálható a vírusból mintegy olyan fragmentumot, amely az SV40 virális replikációs kezdőpontját is tartalmazza [Fiers és mtsai, Natúré, 273, 113 (1978)1 . Kisebb és nagyobb SV40 fragmentumokat szintén használhatunk, feltéve, ha azt a körülbelül 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely a HindlII helytől a virális replikációs origóban lévő BglI helyig terjed. Ezenkívül lehetséges és gyakran kívánatos is, hogy olyan promoter és

- 14 szabályozó szekvenciákat használjunk, amelyek természetes kapcsolatban vannak a kívánt génszekvenciával, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák kompatibilisek a gazdasejt rendszereivel (például a dhfr gén a CHO sejtekkel ).

Replikációs kezdőpontról vagy úgy gondoskodunk, hogy a vektor szerkesztésekor idegen eredetű origót vezetünk be , amely származhat az S\/40-ből vagy más virális forrásból (például: polyoma, adeno, VSV, BPV, AcNVP, stb.), vagy pedig a gazdasejt kromoszómáiig replikációs mechanizmusa szolgáltatja. Ha a vektor a gazdasejt kromoszómájába van integrálva, úgy ez utóbbi megoldás gyakran elegendő.

A legelőnyösebb· azonban egy olyan klónozó hordozó (ingázó plazmid) használata, amely mind prokariótákban, mind eukariótákban lehetővé teszi a replikációt. A plazmádnak az a képessége, hogy prokariótákban replikálódik, egyszerű eszközt ad ahhoz, hogy a DNS szekvenciát manipuláljuk és hogy nagymennyiségű plazmid DNS-re tegyünk szert az emlős sejtek transzfekciójához.

Egy ilyen ingázó plazmid prokarióta DNS elemeket és aukariótákból származó DNS szekvenciákat is tartalmaz.

A plazmid prokarióta része egy replikációs origóból áll, amely rendszerint a pBR322 plazmidból származik ER.C. Mulligan és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. , 78 , • ·* ··· ·· ·· · · • · · ·»«··· «· • · · · · · ·

- 152071-2076 (1981)] és egy marker génből, amely a szelekciót könnyíti meg antibiotikum tartalmú táptalajban. A szelekcióhoz leggyakrabban használt gének azok, amelyek vagy ampicillinnel, tetraciklinnel, tetraciklinnel vagy kloramfenikollal szembeni rezisztenciát közvetítenek (lsd R.C. Mulligan és mtsai fent idézett közleményét).

Az ingázó plazmid eukarióta részének tartalmaznia kell egy replikációs origót, amely rendszerint virális genom eredetű, például simianvirus 40.eredetű [R.C. Mulligan és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 73, 2072-2076 (1981)1 , vagy bovin papillomarivus eredetű [0. DiMaio és mtsai, Mól.Cell, Bioi,, 4, 340-350 (1984)]. Másodszor szükség van egy szelekciós marker génre, hogy az ingázó plazmidot tartalmazó sejtnek lehetővé tegye a szelektív körülmények közötti növekedését a végből, hogy a plazmid fennmaradjon. A marker gén lehet prokarióta, vagy eukarióta eredetű. Prokarióta gén például a gpt gén, amely a Xantin-guanin-foszforibozil transzferázt kódolja [R.C. Mulligan és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 2072-2076 (1981 )] és Science, 209, 1422 (1980)1 a neo gén, amely egy bakteriális foszfatázt kódol, s ez közvetíti a G418 neomicin származékkal szembeni rezisztenciát [P.Southern és mtsai, □. Mól. Appl. Génét., 327 (1982), U.Scholer és mtsai, Cell, 36 , 1422 (1984)1 , s a CAT gén, amely a kloramfenikol-acetil transzferázt kódolja [C.Gorman, Mól. Cell.Bioi., • 4 • · »·· 4·· • · 94 • 44 · ··4· • · 4» • · · · ·4«

2_, 1044 (1982)]. Eukarióta gén például a timidin-kinázt kódoló gén [M.Wigler és mtsai, Cell. U , 223 (1977)]. A harmadik eukarióta DNS elem, amely a kívánt klónozott gén expresszióját lehetővé teszi, egy promoter szekvencia, amely vagy konstitutív vagy indukálható lehet. Konstitutív promoter például a simianvirus 40 vagy a Rous szarkómavirus promoter [R. C. Mulligan és mtsai , Science, 209, 1422 (1980)_T L. Laimons és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. , 79, 6453 (1982)]. Indukálható promoter az egér emlőtumorvírus promoter [A.B.Chapman és mtsai, Hol. Cell. Bioi., 3, 1421-1429], a hősokk protein promoter [H.Pelham és mtsai, EMBO 3., 1_, 1473 (1982)1 és a metallotioné in promoter EK. Mayo és mtsai, Cell, 29, 99 (1982), M,Karin és mtsai, Natúré , 299, 797 (1982)].

Egy idegen DNS-nek a megfelelő gazdasejtekbe való bevitelét a következőképpen oldhatjuk meg: a DNS-t közvetlenül a gazdasejt sejtmagjába mikroinjiciáljuk [M.Capecchi, Cell, 22, 479 (1980)]; az idegen DNS-t hordozó bakteriális protoplasztot az eukarióta gazdasejttel fuzionáljuk [W.Schaffer, Proc. Natl. Acad.Sci. , 77, 2163 (1980)]; a gazdasejt membránját elektroporációval kilyukasztjuk a beviendő DNS jelenlétében [E.Neuman és mtsai, ΞΜΒΟ 3., 841 (I982)];a rekombináns DNS-t tartalmazó liposzómákat a gazdasejtekkel fuzionáljuk ER. Fraley és mtsai, 3.Bioi.Chem. ,

• * · · ·· ··· ·♦

255, 10431 (1980)]. A leggyakrabban használt módszerek: a DNS és kalcium-foszfát ko-precipitációja [F.L., Graham és A.D. van dér Erb, Virology, 52 , 456 (1973)] és a DEAE-dextrán közvetítette transzfekció [A. Vahari és mtsai, Virology, 2.7, 435 (1965)].

A transzficiált COS-7 vagy CHO sejteket inkubáljuk, majd a tenyészet felüluszókat összegyűjtjük és szolubilis Fcg_R tartalomra vizsgáljuk a következőképpen:

A COS sejt felüluszókat EoL-3 eozinofil sejtvonalon teszteljük. Ez a sejtvonal Fc^R-t fejez ki. Az ilyen receptorok jelenlétét Fc^R (8-30) specifikus monoklonális antitestekkel vizsgáljuk 87110658.9 számú európai szabadalmi bejelentésem szerint. Az 5..ábra bemutatja, hogy ezek a sejtek Fc^R-re festődnek a 8-30 antitestekkel, a kontrollokhoz képest.

A sejteken lévő Fc^_R ezenkívül a humán IgE-vel fedett marha vörösvérsejt (ORBC = ox red blood cell) assay alkalmazásával mutatható ki [A.Gonzalez-Molina és H.L. Spiegelberg, □.Clin.Invest., 59, 616 (1977)]. Az IgE-rozetta képző sejtek számát megkapjuk, ha s bovin szérum albuminnal fedett fixált ORBC-vel való nem spcifikus kötődések számát levonásba helyezzük.

• ·· ·· ···· *· ······· « « • · · ··» ··· «· • · · · « · ·

- 18 A PDE-2sFc£R transzficiált COS sejt felüluszóban kapott IgE-kötő aktivitást azon gátló hatás segítségével analizáljuk, amely az IgE-ORBC-nek az EoL-3 sejtekhez való kötődésében (rozetta képzés) nyilvánul meg. Az I. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a szolubilis Fc£R képes az IgE-nek receptoraihoz való kötődését kompetitiv módon gátolni.

A szolubilis receptor aktivitás jelenlétét az alant leirt ELISA assay-vel bizonyítjuk.

Az Fc£_R aktivitást a 3-5 és 8-30 monoklonális antitestekhez való kötődési képességgelmérjük és kettős antitestes ELISA-val (enzyme-linked immunosorbent assay) határozzuk meg. Mig a kontroll COS-7 sejtek felüluszóiban nem volt kimutatható Fc^R aktivitás, addig a PDE-2sFc£-Rrel transzficiált COS-7 sejtek által szekretált receptor aktivitás jelentős volt. Az Fc^R aktivitás szintje ténylegesen 5 és 25 egység/ml volt az 1 %, illetve 10 % fetális borjú szérumot (FCS = fetal calf serum) tartalmazó transzficiált tenyészetek felüluszójában. Az Fc^R aktivitási eredményeket a 6. ábra foglalja össze.

Hasonló eredményeket kaptunk, amikor transzficiált CHO sejtekből izolált vizoldható Fc^R-t használtunk.

Az is ismeretes, hogy az azonnali tipusu túlérzékenység a tünetek széles spektrumában nyilvánul meg, amely a szénanáthától (seasonal rhinitis) az anafilaxiáig terjed. Az azonnali túlérzékenység mechanizmusában szerepet játszanak az IgE antitestek és a reaktív sejtek, ilye nek a szöveti hízó sejtek és a bazofil sejtek, amelyeknek a felületén specifikus receptorok találhatók ezen antitestek számára. Ha ezeket a sejteket specifikus allergénekkel aktiváljuk, biokémiai történések sorozata indul meg, melyek következtében a sejtek granuláiból kész mediátorok szabaulnak fel és újonnan szintetizálódott membrán-arachidonsav lipid metabolitok. Ezek az anyagok gyulladásos folyamatot okoznak, melyet megnövekedett ér-permeabilitás és simaizom-összehuzódás jellemez és mindezen kórképet ilyen reakciók kisérnek. A sejtek kemotaktikus hatására a folyamat kiszélesedik. Ilyen sejtek a neutrofil és eozinofil sejtek amelyek a reakciót ezután azáltal fokozzák, hogy saját gyulladáskeltő komponenseket bocsátanak ki. Az eozinofilekre specifikus faktorok családjához tartoznak az anafilaxiás eozinofil kemotaktikus faktorok ezek savanyu tetrapeptidek ameaz eozinofil sejteket az allergiás reakció helyére vonzzák. A legújabb felfedezések az allergiánál és a parazitás fertőzéseknél az eozinofilek fontosságára mutatnak rá. Ki mutatták, hogy az eozinofil sejtek felületükön IgE recepto rokat (Fc^R) hordoznak, amelyek IgE jelenlétében aktivan résztvesznek az IgE-közvetitette történésekben, amelyeket a degranulálódás és a gyulladásos folyamatok további kiszélesedése jellemez. Ezenfelül az eozinofil sejteken lévő Fc^R alacsony affinitásu, összehasonlítva a hízósejteken és

a bazofil sejteken lévő Fc^R-rel. Az eozinofil sejtek nagy fontosságára való tekintettel az azonnali-tipusu túlérzékenységben és különösen az asztmában igen fontos, hogy eszközt találjunk ezen sejtek IgE-közvetitette degranulációjának a szabaályozására. Feltesszük, hogy az IgE-kötő faktorok képesek lehetnének erre akár úgy, hogy az IgE bioszintézisét szabályozzák, vagy úgy, hogy a szérum IgE-t neutralizálják, vagy hogy eltakarítják.

Az előbb említett bizonyítékok azt mutatják,hogy a találmány szerint előállított vizoldékony Fc^JR megköti az IgE-t és oldott formájában megakadályozhatja az IgE-nek az eozinofil sejtekhez való kötődését, s ismeretes, hogy az eozinofil sejtek az azonnali túlérzékenység (allergia) és főként az asztma bizonyos megnyilvánulásaiban játszanak szerepet.

Ennélfogva a találmány szerint előállított szolubilis az allergia gyulladáskeltő hatásainak szabályozásában nyer felhasználást és alkalmas az IgE által indukált helyi és allergiás reakciók kezelésére és megelőzésére, mely a találmány egy további tárgyát képezi.

Gyógyszerként való falhasználás céljára a szolubilis Fc^R-t megfelelő gyógyszerkészítmények tartalmazhatják, ilyenek az oldatok vagy a permetek.

• · • ·· · · ···· • · · · · · · · · • · · ······ ·* • · · · · · ·

- 21 A következő példák, amelyek bár a találmányt nagyobb részletességgel magyarázzák, nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

A. példa

A 3-5 (X| ) θθ a 3-30 (p) monoklonális anti-Fc^R antitesteket úgy állítjuk elő, hogy P3U1 myeloma sejteket RPMI-8866 sejtekkel (lásd 1986. julius 29-én benyújtott 86 110 420.6 számú európai szabadalmi bejelentésünket) immunizált Balb/c egerekből származó lép sejtekkel hibridizáltuk. A 8-30 antitest az Fc^R IgE-kötő helyéhez közeli epitópot ismeri fel és blokkolni tudja az IgE kötődését a 8866 limfobiasztoid sejtekhez. A 3-5 antitest az Fc^R-en egy másik epitópot ismer fel és nem tudja hatékonyan blokkolni az IgE-nek a receptoraihoz való kötődését. Ezen antitestek 46 kü és 25 kD polipeptideket precipitálnak redukáló és nem redukáló körülmények mellett. A monoklonális antitesteket ascites folyadékból tisztítottuk 50 %-ra telített ammónium-szulfátos kicsapással, majd gélszürés következett. Az IgM osztályhoz Sepharose 6B-t (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) használtunk, az IgGl osztályhoz ioncserélő kromatográfiát alkalmaztunk OAE-Sephadex (Pharmacia) használatával. A poliklonális egér IgG-t ugyanígy izoláltuk. Az anti-egér IgM-alkalikus foszfatáz konjugátumot a Tago cégtől (Burlingame, CA, USA) szereztük be.

8. példa

A psFcfR-1 plazmid szerkesztése

a) A pBSF2-38 plazmidból [Natúré, 324, 73-76 [1986)1 , amely a pGEM4 Smal helyén a BSF-2 cDNS-t tartalmazza, 350/Ug-ot 700 egység EcoRI-el és BamHI-el emésztünk 500/Ul magas sótartalmú pufferben (100 mmól NaCl, 50 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgCl₂, 1 mmól DTT) 2 órán át 37 °C-on, Az emésztett DNS-t preparatív 1 %-os agaróz gél elektroforézissel választjuk el és a gélből a teljes hosszúságú 1,2 kb BSF-2 cDNS-t tartalmazó EcoRI-BamHI fragmentumot elektroeluáljuk, 70 %-os etanollal

Az emésztett

DNS-eket /U1 x nick-transzlációs-pufferben (50 mmól trisz.HCl, pH = 7,2 lOmmól MgSO^, 0,1 mmól

DTT, 50/ug/ml BSA) oldjuk fel, majd 1 ml 8,0 egység/ml Klenow fragmenttel és 1 mmól dNTP-vel inkubáljuk 20 °C-on percig. A betöltéses reakciót 70 °C-on 5 perces inku bációval állítjuk le. A kapott 127 bp tompa végű fragmentumot fenollal extraháljuk, majd 40 egység KpnI-el emésztjük 5O/U1 alacsony sótartalmú pufferben (10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgCl₂ , 1 mmól (DDT) 1 órán át 37 °C-on, 2,5 egység bakteriális alkalikus foszfatázzal

inkubáljuk 65 °C-on 30 percig, ezután 1 %-os preparativ agaróz gélre visszük és elektrotorétizáljuk. A BSF-2 vezér szekvenciát tartalmazó 110 bp fragmentumot elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. A 110 bp fragmentumot 10/ul ligáz-pufferben (50 mmól trisz.HCl, pH = 7,4 10 mmól MgCl₂, 10 mmól OTT, 1 mmól spermidin, 1 mmól ATP, 0,1 mg/ml BSA) oldjuk fel, és ezután 1^ug KpnI-el és Smal-el emésztett pGEM4-el kapcsoljuk össze úgy,hogy 200 egység T4 ligázzal inkubáljuk 4 °C-on 16 órán át. A ligáz-reakcióeleggyel E.coli (MC1065) sejteket transzficiálunk. A kapott telepek közül négyet kiszúrunk, egy kiónt kiválasztunk és szaporítunk, majd miután megállapítottuk, hogy e kiválasztott klón plazmidja csak sgy vezér szekvenciát tartalmaz, elneveztük pBSF2-L8-nak (lásd a 3. ábrát).

b) 80/Ug L.E-392 vagy pGEM4 (pFccR-1) plazmidot emésztünk 150 egység HindlII-al 200/ul alacsony sótartalmú pufferben (10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgClg» 1 mmól OTT) 37 °C-on 1 órán át, majd 1 %-os preparativ agaróz gélben elektroforetizáljuk. A szolubilis

Fc^R szakaszt tartalmazó Hindin fragmentumot a gélből elektroeluáljuk, etanollal kicsapjuk és 1/Ug/ml koncentrációban, TE-pufferben feloldjuk. A Hindii! fragmentum

1/Ug-ját 8,0 egység Klenow fragmenttel és 1 mmól dNTP-vel inkubáljuk lO^ul 1 x nick-transzlációs pufferben 20 °C~on • · · · • · · · • · • · · ·· · · · percig, hogy betöltsük a benyúló 3' végeket, majd fenollal extraháljul és etanollal kicsapjuk. A Hindii! fragmentumokat, melyeknek 3' végét betöltöttük, 2 egy-

ben (50 mmól NaCl, 10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól

MgClg> 1 mmól OTT) 37 °C-on 1 órán át, majd 0,25 egység bakteriális alkalikus foszfatázzal inkubáljuk 65 °C-on 30 percig, végül etanollal kicsapjuk. Külön emész tünk 2 egység BamHI-el 1^ug pBSF2-L8-at 20/ul magas sótartalmú pufferben 37 °C-on 1 órán át, ezután fenolos extrahálás és etanolos kicsapás következik. A BamHI-el emésztett pBSF2-L8-at 10^ul 1 x nick-transzlációs-pufferben oldjuk és 8,0 egység Klenow fragmenttel és 1 mmól dNTP-vel inkubáljuk 20 °C-on 30 percig, hogy betöltsük a benyúló 3' végeket, majd fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A pufferben oldjuk, 2 sótartalmú egység Pstl-el emésztjük 37 °C-on órán át , fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.

A szolubilis Fc^R-t kódoló szakaszt tartalmazó és a Pstlel emésztett fragmentumot és a Pstl-el emésztett pBSF2-L8-at 200 egység T4 DNS ligázzal 4 °C-on 16 órán át tartó inkubálással kapcsoljuk össze

10/ul ligáz-pufferben, majd a reakcióeleggyel E.coli (MC1065) sejteket transzficiálunk. Nyolc telepet szúrtunk ki a kapott telepek közül.Egy telepet kiválasztottunk, elszaporitottuk

*

- 25 és miután meghatároztuk a plazmid szerkezetét, psFc^R-1nek neveztük el. Az elszaporitott psFc^R-1 hét bázist tartalmaz - ez a pGEM4~be való többszörös klónozás eredménye

- a BSF-2 vezérszekvsncia és az Fc^R szekvencia közötti keretben (lásd az 1. ábrát: 137-143 nukleotid).

C. példa

A pSV2-qpt-dhfr plazmidok szerkesztése

a) a pSV2-gpt expressziós vektor [Science,

209, 1422 (1980)] 5 ^ug-jat EcoRI-el és BamHI-el emésztjük 100 mmól NaCl-t, 10 mmól trisz.HCl-t (pH = 7,5), 6 mmól

MgCl₂-t, 100/ug/ml zselatint és 6 tartalmazó oldatban, 37 °C-on egy mmól β-merkapto-etanolt éjszakán át. A DNS-t etanollal csapjuk ki -70 °C-on, majd a DNS-t 5 egység Klenow fragmenttel inkubáljuk 15 percig 37 °C-on 7 mmól MgCl^» mmól trisz.HCl (pH = 7,5), 50 mmól NaCl , 1 mmól DTT és

5/umól dNTP tartalmú oldatban.

Miután az enzimet 60 °C-on percig inaktiváltuk, a reakcióelegyhez hozzáadunk 1/10 térfogat trisz.HCl-t (pH = 8,0) és 20 egység borjúból alkalikus foszfatázt, majd 37 °C-on 2 órán át inkubáljuk. Ezután a kívánt DNS-t tartalmazó oldatot kétszer extraháljuk fenollal, majd 1 %-os agaróz gélre visszük. A módosított linea rizált plazmidot elektroeluláljuk.

b) A pBR322-dhfr plazmidból [Mól,Cell.Bioi. , , 425-440 (1986)] - amely a dhfr (dihidrofolát-reduktáz)

gént és a hörcsög sejtekből származó megfelelő szabályozó szakaszt tartalmazza - 5/Ug-ot 25 egység Fspl-el és 60 egység HindlII-al emésztünk lOO^ul 10 mmól trisz.HCl-t (pH = 7,5), 50 mmól NaCl-t, 6 mmól MgCl₂-t, 6 mmól β-merkap to-etanolt és 100/ug/ml zselatint tartalmazó oldatban °C-on egy éjszakán át. Etanolos kicsapás után a kapott

DNS fragmentumot (2658 bázis pár) tompa végűvé alakítjuk és a fent leirtf szerint tisztítjuk.

c) A dhfr fragmentumot és a módosított pSV2-

-gpt vektort

10_/Ul ligáz pufferben kapcsoljuk össze (40 egység ligáz, 50 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgCl₂, mmól OTT, 1 mmól ATP, 50/ug/ml BSA) 14 °C-on egy éjszakán át , majd E.coli 3M101 sejtek transzformálására hasz náljuk. EcoRI-el és MstlI-vel végzett restrikciós enzimes analízis után két pozitív kiónt szelektáltunk, amelyek a dhfr gén orientáltságában (az SV40 ori-hoz képest) különböztek egymástól. A vektorok neve: pSV2-gpt-dhfr17 , illetve pSV2-gpt-dhfr20.

d) Az egyik pSV2-gpt-dhfr plazmidból

5/Ug-o egység Apal-el emésztünk 100 mmól NaCl, 10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 6 mmól MgCl₂, 6 mmól B-merkapto-etanol és 100/ug/ml zselatin tartalmú oldatban, 2 órán át 37 °C-on. Klenow fragmenttel betöltést végzünk úgy, hogy 25 percig 20 °C-on 5 egység Klenow enzimmel kezeljük ugyanezen reakcióelegyet

5/Umól dNTP jelenlétében, • · · * · · · • · ······ · · • · · · · · majd a DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk, végül etanolos kicsapással gyűjtjük össze. A kapott DNS-t

10/ul

100 mmól Na^_Cl, 10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 6 mmól MgClg , mmól β-merkaptoetanol és

oldatban oldjuk fel és 2 órán át 37 zselatin tartalmú

C-on 20 egység

HindlII-al inkubáljuk. Az enzimet 10 percig 70 °C-on inak tiváljuk, a reakcióelegyhez hozzáadunk 20 egység borjúból alkalikus foszfatázt és 30 percig tovább inkubáljuk 37 °Con, A kívánt DNS-t tartalmazó elegyet fenol/kloroformmal kétszer extraháljuk, végül 1 /-os agaróz gélre visszük, A pSV2-dhfr vektort, amely nem tartalmazza a gpt gént, elektroelucióval tisztítjuk (lásd a 7. ábrát).

1. példa

A PDE-2sFcrR szerkesztése

A PDE-2 expressziós vektor (lásd az

1986/88879 számú japán szabadalmi leírást) 20/ug-ját egység EcoRI-el emésztjük 2 órán át 37 °C-on 1OO/U1 összmennyis égben , mely 50 mmól NaCl-t, 100 mmól trisz.HCl-t (pH = 7,5), 5 mmól MgCl^-t és 100/Ug/ml BSA-t tartalmaz.

A DNS-t fenol/kloroformmal extraháljuk, majd etanollal

percig, majd két fenol/kloroformos extrakció következik, végül etanolos kicsapás. Az emésztett DNS-t 25/Ul • ·

- 28 ben oldjuk, 20 egység bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeljük 65 °C-on 30 percig, kétszer extraháljuk fenol/kloroformmal , majd etanollal kicsapjuk. Ezzel párhuzamosan előállítunk a psFc^R-1 plazmidból egy EcoRI fragmentumot (lásd a 4, ábrát) a következőképpen: 20/Ug psFc^R-1-et emésztünk 37 °C-on 2 órán át 20 egység EcoRI-el mmól

NaCl-t, 100 mmól trisz.HCl-t, pH = 7,5,

1OO/ul mmól

MgClg-t és 100/Ug/ml BSA-t tartalmazó oldatban. Mind a vektor, mind az inszertum DNS_t 1 5(-os preparativ agaróz gélre visszük és elekt roforetizáljuk. A psFcpR-1 1,5 kb

EcoRI fragmentumát ( a BSF-2 vezérszekvenciából és az sFc£_-szekvenciából áll) és a linearizált PDE-2 vektort elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. A defoszforilált , linearizált vektort összekapcsoljuk (Ugráljuk) a 1 ,5 kb hosszú EcoRI fragmentummal oly módon, hogy 200 egység T4 ligázzal inkubáljuk 20^ul ligáz-pufferben (50 mmól trisz.HCl, pH = 7,4, 10 mmól MgCl₂, 20 mmól DTT, 1 mmól spermidin, 1 mmól ATP és lOO^ug/ml BSA) 4 °C-on 16 órán át, majd az elegyet Ξ.coliba transzficiáljuk. Restrikciós enzimes analízist végzünk a korrekt inszertum azonosítására Egy pozitív kiónt szelektáltunk, melyet PDE-2sFc_<£R-ne k neveztünk el. A kapott PDE-2sFc_{c_R expressziós vektort használtuk majom COS-7 sejtekben való kifejezéshez, ismert módszerek szerint.

··

2. példa • · ···· • · •*· ··· • ·

A JÍH3M expressziós vektorból [Proc. Natl.

Xhol-el emésztünk 2 órán át 37 °C-on 50 mmól NaCl , 10 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 6 mmól , 6 mmól £-merkapto-etanol és 100 zselatin tartalmú oldatban, ez után a linearizált plazmidnál tompa végeket alakítunk ki úgy, hogy Klenow fragmenttel kezeljük 5_zumól dNTP jelenlétében 20 °C-on 25 percen át. Ezután a vektort bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeljük, fenollal extraháljuk és kicsapjuk.

Párhuzamosan 5 ,ug plazmidot (az Fcy-receptor gén szolubilis részét a géntől upstream irányban tartalmazza, valamint a BSF-2 vezérszekvenciát) emésztünk 20 egység EcoRI-el 37 °C-on 2 órán át a fent leirt pufferben. A Klenow betöltés után a DNS fragmentumot agaróz gélből elektoeluáljuk. A linearizált, defoszforilált 5Γ H3M vektort a BSF-2/sFcy-DNS fragmentummal ligáljuk 20/Ul 50 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgClg , 20 mmól DTT, 1 mmól ATP, 50/ug/ml BSA és 40 egység T4 DNS ligáz tartalmú oldatban 14 °C-on egy éjszakán át. A kapott plazmáddal E.coli sajteket transzformálunk és így szaporítjuk.

3. példa

PDE-2sFc^R expressziója ·· ·· ···· ·« • · · · · · · * · ♦·· ··« ·· • · · · · ·

COS-7 sejteket (5.10 sejt/60 mm-es lemez) öntünk ki 60 mm-es lemezekre a transzfekció előtt egy nappal.

A transzfekcióra 1 ml elegyet használunk, mely 2 ^ul plazmid DNS-t , 25 mmól trisz.HCl-t (pH = 7,5), 137 mmól NaCl-t,

5 mmól KCl-t , 0	,6 mmól NagHPO^-et, 0,5 mmól MgCl2-t , 0,7
mmól CaCl2-t és	500/Ug DEAE-dextránt (Pharmácia Fine Chemi·
cals) tartalmaz.	, Egy órás 37 °C-on való inkubálás után az

oldatot 10 % FCS-el és 150 ^umól kloroquinnal kiegészített DMEM tápoldattal helyettesítjük, s 37 °C-on 3 órán át inkubáljuk,majd friss 10 % FOS tartalmú DMEM oldattal cseréljük ki. A transzfekció után egy nappal a tápoldatot 1 FCS-el vagy 10 % FCS-el kiegészített DMEM-re cseréljük. A tápoldat cseréje után két nappal a tenyészet felüluszókat össze gyűjtjük és szolubilis Fc^ aktivitásra vizsgáljuk.

Hasonló eredményeket kaptunk OTsFc^R-rel transzficiált COS-7 sejtekkel.

4. példa

IgE rozetta képzés és gátlás

IgE rozetta gátlás céljából 25 ^ul-ben g dozó sejteket (5.10 /ml) keverünk meghatározott

Fc£_R hormennyiségü (például lOO^ul) vizsgálandó mintához vagy kontroll oldathoz és 1 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A három vagy több

- 31 ·· ·· ···· ·· • · · · · · · • · ·«···· · · • · · · · * • ·· ·· ··· ··

ORBC-ből álló rozettákat számoljuk össze. Az eredményeket az I. táblázat mutatja be. Az I-es és Il-es kísérletben Fc^ hordozó sejtek gyanánt az EoL-3 sejteket használtuk. Kontrollként a kontroll COS-7 sejteket - azaz a nem transzformált sejtek - felüluszója szolgálat.

5, példa

ELISA (enzyme-1inked imniunosorbent assay)

A 96 tartályos mikrotitráló lemezeket először a 3-5 monoklonális antitesttel fedjük: lOO^ul/tartály (lO,ug/ml) fedőpufferben (0,1 mólos NaHC0_, pH = 9,6).

/ ·>

Ezután a lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk, majd négyszer mossuk öblítő pufferrel, azaz Dulbecco féle foszfát pufferrel, mely 0,05 % Tween 20-at tartalmaz , majd hozzáadunk WO^ul előzőleg a hígító pufferrel vizsgálandó anyagot,melyet [0,05 mól trisz.HCl, pH =

8,1, 1 mmól MgCl^ , 0,15 mól NaCl , 0,05 % (tf/tf) Tween 20, 0,02 % NaN^, 1 % BSA] hígítottunk. A mikrotitráló lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd négyszer mossuk öblítő pufferrel, s ezután hozzáadunk megtitrált és hígított kecske-anti-egér

IgM - alkalikus foszfatáz konjugátumot. A lemezeket két órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk és ezután négyszer mossuk öblítő pufferrel. Az utolsó lépésben lOO^ul szubsztrátumot, p-fenil-dinátrium-főszfát-ot (1 mg/ml)

- 32 adunk a reakcióelegyhez, szubsztrátum-pufferben (0,05 mól NaHCO^ , pH = 9,8, 10 mmól MgCl₂.6H₂0) és kolorimetriásan mérjük lét órán át minden 30 percben

405 és 620 nm-en. Az Fc^R aktivitásra kapott eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be.

6. példa

A pSV2-dhfr-sFc^ szerkesztése

A TH3M plazmidból (az Fc^-receptor gén szolubilis részét tartalmazza, mely upstream kapcsolódik a

BSF-2 vezérszekvenciához)

10/ug-ot emésztünk

Ps tl-el órán át 37 °C-on 50 mmól NaCl-t , 10 mmól trisz.HCl-t (pH = 7,5), 6 mmól MgCl₂-t, 6 mmól fi-merkapto-etanolt és 100/ug/ml zselatint tartalmazó oldatban. A reakcióelegyet 5 egység Klenow enzimmel inkubáljuk 25 percig °C-on 50/umól dNTP jelenlétében, hogy kialakítsuk a tompa végeket, ezután a DNS-t fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A kapott DNS-t 20/ul 100 mól NaCl, mmól trisz.HCl (pH = 7,5), 6 mmól, MgClg , 6 mmól β-merkapto-etanol és

100/ug/ml zselatin tartalmú oldatban oldjuk fel, melyet ezután 20 egység Hindii! -al in kubálunk 37 °C-on 2 órán át. Fenol/kloroformos extrahá lás után a kívánt DNS-t tartalmazó reakcióelegyet 1 %-os agaróz gélre visszük és egy 1.500 bp hosszú fragmentumot elektroeluálunk. A linearizált pSV2-dhfr vektorba (hiány zik belőle a gpt gén) bekötjük az 1,500 bp fragmentumot.

·*·· ··

- 33 A reakció lO^ul 50 mmól trisz.HCl, pH = 7,5, 10 mmól MgClg, 20 mmól OTT, 1 mmól ATP, 50/Ug/ml BSA és 40 egység T4 DNS ligáz tartalmú oldatban megy végbe, 14 °C-on egy éjszakán át. A ligázos keveréket használjuk az E.coli HB101 sejtek transzformálására. Restrikciós enzimes analízis után szelektáltunk egy pozitív kiónt, melyet pSV2-dhfr-sFc^jelzéssel láttunk el (7. ábra).

7. példa

A pSV2-dhfr-sFc^kifejeződése

Dihidrofolát reduktáz-hiányos kínai hörcsög petefészek sejteket (dhfr~, L.Chasin) szaporítunk «-ΜΕΜ tápoldatban, mely 10 fetális borjuszérumot, hipoxantint és timidint (HT) tartalmaz, A pSV2-dhfr17-sFcplazmiddal vagy a pSV2-dhfr20-sFc_<£_ plazmiddal úgy transzf iciáljuk a CHO sejteket, hogy a kalcium-foszfátos precipitációs módszert [Virology, 52, 456 (1973)1 használjuk. Egy nappal a „ 5 transzfekció előtt 7.10 sejtet öntünk ki lemezekre. A sejteket 10/Ug plazmid DNS-t tartalmazó kalcium-foszfát csapadékkal kezeljük 4 órán át 37 °C-on. Ezután a tápoldatot leszívjuk és szelektív, 10 % fatális borjú szérummal kiegészített öc-MEM tápoldattal helyettesítjük, melyet 2 naponként cserélünk. A transzformált sejtek 12-16 nap múlva jelennek meg, amelyeket klónozó fecskendőkkel vagy pipetta hegyekkel izolálunk. A felüluszókat ELISA assayvel teszteljük szolubilis Fc^R-re.

* 9 A · • · · · • · 9 9 ·*«··· ·*

I. táblázat

Az EoL-3 sejtek IgE-rozetta képzésének gátlása

	rekombináns	szolubilis	1 LL	rel
			Hiqitások
		hiqits lan	t- 1/3	1/9	1/27
1.kísérlet	Kontroll	ND	19.6 %	20.2%	20. 1 %
	rFC£R	ND	10.0	12.1	14. 1
2.kísérlet	Kontroll	22.9	20. 9	19. 9	18.4
	rFc^R	10. 1	12.2	14.7	16.4

Claims (21)

1. Klónozott gén, amely mesterségesen hozzá van kapcsolva többsejtű szervezetek sejtjeiben való kifejezéshez alkalmas replikonhoz és szabályozó szekvenciához, azzal jellemezve , hogy benne az 1. ábra szerinti teljes Fc£_R gén 1-148 aminosavát kódoló szekvenciának legalább egy részét egy eukarióta szignál szekvencia vagy egy ennek megfelelő kódoló szekvencia helyettesíti.

2. Az 1. igénypont szerinti klónozott gén azzal jellemezve, hogy az említett szignál szekvencia az interleukin-cDNS szignál szekvencia, vagy egy ezzel egyenértékű kódoló szekvencia.

3. A 2. igénypont szerinti klónozott gén azzal jellemezve, hogy az említett szignál szekvencia a BSF-2 szignál szekvencia vagy egy ezzel egyenértékű kódoló szekvencia.

4. A 3. igénypont szerinti klónozott gén azzal jellemezve, hogy az említett BSF-2 szignál szekvencia a pBSF-2.38 plazmid 110 bp hosszú KpnI-HinfI fragmentumából áll vagy egy ezzel ekvivalens kódoló szekvenciából.

5. Az 1. igénypont szerinti klónozott gén azzal jellemezve, hogy képlete a 4. ábra szerinti vagy egy ezzel ekvivalens kódoló szekvencia.

- · 36 -

6. Expressziós vektor azzal jellemezve, hogy képes kifejeződni olyan többsejtű szervezetből származó sejtekben, amelyek az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti klónozott gént vagy egy azonosan kódoló gént tartalmaznak.

7. A 6. igénypont szerinti vektor azzal jellemezve, hogy azonos a 2. ábrán bemutatott PDE-2sFc^_R, vagy a 7. ábrán bemutatott pSV2-dhfr-sFc^ vagy a 8. ábrán bemutatott J/TsFc^R vektorral.

8. Többsejtű szervezetből származó sejt azzal jellenezve ,hogy a 6. vagy a 7. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzficiálva,

9. A 8. igénypont szerinti többsejtű szervezetből való sejt azzal jellemezve, hogy az illető sajt egy gerinces sejtvonalból származó sejt.

10. A 9. igénypont szerinti többsejtű szervezetből származó sejt azzal jellemezve, hogy az említett gerinces eredetű sejt COS-7 vagy CHO sejt.

11. A humán alacsony affinitásu Fc^receptor vizoldható része azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypont bármelyike szerinti DNS molekula kódolja.

12. A 11. igénypont szerinti humán alacsony affinitásu Fc^receptor vizoldható része azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Fc^-receptort a 8-10. igénypon- ·· ·· ···· ··

4 · · · · tok bármelyike szerinti sejtvonal fejezi ki.

13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti humán alacsony affinitásu Fc^j-rsceptor vizoldható része azzal jellemezve, hogy legalább az 1. ábra szerinti 150-321 aminosavakat tartalmazza.

14. Az 11-13. igénypontok bármelyike szerinti humán alacsony affinitásu Fcg_-receptor vizoldható része azzal jellemezve, hogy a BSF-2.38 vezérpeptidet és az 1. ábra szerinti 134-321 aminosavakat tartalmazza.

15. A 14. igénypont szerinti humán alacsony affinitásu γο,ρ.-rece'ptor vizoldható része azzal jellemezve, hogy a kifejeződött peptid képlete a 4. ábra szerinti.

16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti humán alacsony affinitásu Fc^-receptor vizoldható részének O-glükozilált származéka.

11-16. igénypontok

17. Gyógyszerkészítmény azzal jellemezve, hogy a bármelyike szerinti valamelyik vizold ható Fc£_~receptort

18. A 17 igénypont szerinti gyógyszerkészítmény azzal jellemezve, hogy a lokális és szisztémás Igt-aller giás reakciók kezelésére szolgál

19. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti vizoldható Fc^-receptor azzal jellemezve, hogy gyógyszerek • ·· ·· ···· ·· »······ ·· • · · ··· ··« ·· • · · · · · · előállítására használható.

20. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti klónozott gén előállítására, azzal jellenezve , hogy az 1. ábra szerinti 150. aminosavtól kezdődő humán alacsony affinitásu receptorból legalább a vizoldható részt kódoló DNS szekvenciát Összekapcsoljuk egy eukarióta szignál szekvenciával.

21. Eljárás a 6. vagy 7.

igénypont szerinti azzal jellemezve , hogy egy megfelelő linearizált vektort összekapcsolunk az 1-5 igénypontok bármelyike szerinti klónozott génnel.

vagy 7. igénypont szerinti expressziós vektorral transz23. kijárás a 11-16. igénypontok bármelyike szetására, azzal jellemezve, hogy a 8-10. igénypontok bármelyike szerinti transzficiált sejtet tenyésztjük és a te r24. Eljárás a 17. vagy 18. igénypont szerinti gyógyszerkészitmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 11-16. igénypontok bármelyike szerinti vizoldható Fcg-re ceptor hatásos mennyiségét gyógyszerkészítménnyé feldőlgozzuk