DE69927518T2

DE69927518T2 - Rekombinante lösliche fc rezeptoren

Info

Publication number: DE69927518T2
Application number: DE69927518T
Authority: DE
Inventors: Peter Sondermann; Robert Huber; Uwe Jakob
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-12-04
Also published as: JP2015157869A; EP1135486B1; EP1135486A1; ATE520774T1; JP6113965B2; EP1006183A1; CA2352539A1; US20070207163A1; ES2249926T3; AU1780000A; US8666680B2; US20090292113A1; DE69927518D1; DK1642974T3; JP2012188456A; US7074896B1; EP1642974B1; NZ511664A; JP4914535B2; ATE305511T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein homogenes Präparat zur Herstellung eines rekombinanten löslichen Fc-Rezeptors (FcR), nämlich FcγRIIb oder FcγRIII, und ein Verfahren zur Herstellung des homogenen Präparates aus rekombinantem löslichem FcγRIIb oder FcγRIII. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das homogene Präparat aus rekombinantem löslichem FcγRIIb oder FcγRIII enthält.
Fc-Rezeptoren (FcRs) spielen eine Schlüsselrolle beim Schutz des humanen Organismus gegen Infektionen. Nachdem Pathogene Zugang in den Blutkreislauf gefunden haben, werden sie durch Immunglobuline (Igs) opsoniert. Die resultierenden Immunkomplexe binden aufgrund ihrer Multivalenz mit hoher Affinität an FcR-tragende Zellen, das zu Clusterbildung der FcRs führt, was zum Auslösen mehrerer Effektorfunktionen führt (Metzger, H., 1992A). Diese umfassen, in Abhängigkeit von dem exprimierten FcR-Typ und assoziierten Proteinen, Endocytose mit nachfolgender Neutralisierung der Pathogene und Antigenpräsentation, Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC), Sekretion von Mediatoren oder die Regulation der Antikörperproduktion (Fridman et al., 1992; van de Winkel und Capel, 1993).
Es gibt spezifische FcRs für alle Ig-Klassen, wobei diejenigen für IgG die häufigsten sind mit der höchsten Diversität. Zusammen mit dem Hochaffinitätsrezeptor für IgG (FcεRIa) treten FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIIIa (CD16) als Typ I-Transmembranproteine oder in löslichen Formen (sFcRs) auf, es gibt jedoch auch eine Glycosylphosphatidylinositol-geankerte Form des FcγRIII (FcγRIIIb). Darüber hinaus tereten FcγRs in verschiedenen Isoformen (FcγRIa, b1, b2, c; FcγRIIa-2, b1-3, c) und Allelen (FcγIIa1-HR, -LR; FcγRIIIb-NA1, -NA2) auf (van de Winkel und Capel, 1993). Im Gegensatz zu den insgesamt homologen extrazellulären Teilen unterscheiden sich die Membran-überspannenden und die cytoplasmatischen Domänen. Sie können vollständig entfernt sein oder können eine Größe von 8 kDa aufweisen. Sie können entweder ein auf Tyrosin basierendes Aktivierungsmotiv mit 26 Aminosäuren (ITAM) wie in FcγRIIa oder ein entsprechendes inhibierendes Motiv mit 13 Aminosäuren (ITIM) in FcγRIIb, das bei der Signaltransduktion umfasst ist, enthalten (Amigorena et al., 1992).
Bei Bewertung über den erhaltenen Abstand von Cysteinen besteht der extrazelluläre Teil der FcRs aus drei (FcγRI, CD64) oder zwei (FcεRI, FcγRII, CD32 und FcγRIII, CD16) Ig-ähnlichen Domänen (10 kDa/Domäne) und gehört daher zur Immunglobulin-Superfamilie. Diese hoch glykosylierten Rezeptoren sind Homologe und die gesamte Identität in einer Aminosäuresequenz zwischen den FcγRs und FcεRIa überschreitet 50 % in ihren extrazellulären Regionen. Nichtsdestotrotz variiert die Affinität von FcRs für ihre Liganden stark. Die höhere Affinität von ungefähr 10⁸M^–1 des FcγRI für Fc-Fragment wird seiner dritten Domäne zugeschrieben, während die anderen FcγRs mit zwei Domänen eine Affinität für IgG aufweisen, die zwischen 10⁵ und 10⁷ M^–1 variiert. Die Affinität des Zweidomänen-FcεRIa für IgE überschreitet diese Werte bei weitem, mit einer Konstante von 10¹⁰M^–1 (Metzger, H. 1992B). Im Gegensatz zu den genannten FcRs stellt der Niederaffinitätsrezeptor für IgE FcεRII einen Transmembranproteintyp dar und zeigt eine geringere Homologie. FcγRs werden exprimiert in einem definierten Muster auf allen immunologisch aktiven Zellen. FcγRI wird konstitutiv exprimiert auf Monocyten und Makrophagen und kann induziert werden auf Neutrophilen und Eosinophilen. Die physiologische Rolle von FcγRI ist noch unbekannt, da die Expression auf Monocyten nicht vital ist (Ceuppens et al., 1988). Die GPI-verankerte Form von FcγRIII (FcγRIIIb) wird ausschließlich auf Granulozyten exprimiert. Aufgrund dessen, dass ein Cytoplasmateil fehlt, tritt die Signaltransduktion in die Zelle nur über andere Transmembranproteine, wie Komplementrezeptor Typ 3 (CR3), auf, der wenigstens mit Fcγ3IIIb assoziieren kann (Zhou et al., 1993; Poo et al., 1995). FcγRIIIa wird hauptsächlich auf Monocyten und Makrophagen exprimiert, jedoch nur in Verbindung mit den assoziierten Proteinen (z.B. α- oder γ-Ketten). FcγRII ist der Rezeptor mit der weitesten Verbreitung auf immunkompetenten Zellen und ist hauptsächlich involviert in der Endocytose von Immunkomplexen.
FcγRIIa und FcγIIb unterscheiden sich in ihrer extrazellulären Region durch nur 7 der Aminosäurereste. Nichtsdestotrotz können beide Formen voneinander unterschieden werden durch ihre Bindungscharakteristika an humane und Maus-IgG-Subklassen (van de Winkel und Capel, 1993) und ihre unterschiedliche Affinität für humane IgGs (Sondermann et al., 1998A). Die Situation wird noch komplizierter durch den hoher Responder/niederer Responder (HR/LR)-Polymorphismus von FcγRIIa, der benannt wird nach der Fähigkeit von T-Zellen einiger Individuen auf IgG1-induzierte Mitogenese zu reagieren (Tax et al., 1983). Später wurde gefunden, dass die beiden Austausche in der Aminosäuresequenz zwischen der LR- und der HR-Form die Fähigkeit zum Binden von humanem IgG2 modifizieren, was zu der Annahme führt, dass mindestens eines von ihnen an der IgG-Bindung beteiligt ist (Hogarth et al., 1992).
Im Gegensatz zu der vorteilhaften Rolle, die FcRs im gesunden Individuum spielen, vermitteln sie auch die Stimulierung des Immunsystems bei Allergien (FcγRIa) oder Autoimmunkrankheiten. Darüber hinaus verwenden einige Viren FcγRs, um Zugang zu Zellen zu erhalten, wie HIV (Homsy et al., 1989) und Dengue (Littaua et al., 1990), oder sie verlangsamen die Immunreaktion durch Blockieren von FcγRs, wie im Falle von Ebola (Young et al., 1998) und Masern (Ravanel et al., 1997).
Daher war der Gegenstand, der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegt, die Bereitstellung von Rezeptoren, die leicht zu produzieren sind und vorteilhaft verwendet werden können für medizinische oder diagnostische Anwendungen.
Darüber hinaus war ein Gegenstand der Erfindung die Bereitstellung löslicher Rezeptoren, die eine Bindungsspezifität und Aktivität zeigen, die analog zu der der Rezeptoren ist, die natürlich im menschlichen Körper vorkommen und welche es zusätzlich möglich machen Kristalle herzustellen bzw. zu produzieren, die für eine Strukturbestimmung geeignet sind.
Der Gegenstand wird erreicht durch rekombinante lösliche Fc-Rezeptoren, nämlich FcγRIIb und FcγRIII, die nur aus dem extrazellulären Teil des Rezeptors bestehen und nicht glykosyliert sind. Die Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher gekennzeichnet durch das Fehlen von Transmembrandomänen, Signalpeptiden und Glykosylierung. Darüber hinaus behalten die FcRs gemäß der Erfindung weiterhin Bindungskapazität für Antikörper und/oder geeignete Kristallisation.
Die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der Erfindung sind rekombinanter löslicher FcγRIIb und FcγRIII. Da IgG-Moleküle charakteristisch sind für mehrere Krankheiten und Zustände, sind ihre Bestimmung und mögliche Wege der Beeinflussung der IgG-Moleküle von großem Interesse.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein homogenes Präparat aus rekombinantem löslichem FcγRIIb oder FcγIII, worin der Rezeptor gekennzeichnet ist durch das Fehlen einer Transmembrandomäne, eines Signalpeptids und einer Glykosylierung, wobei das Präparat erhältlich ist durch Expression einer Nukleinsäure, die für einen solchen Rezeptor codiert, in Prokaryonten unter Bedingungen, die zur Bildung bzw. Produktion von unlöslichen Einschlusskörperchen führen, und Renaturierung der Rezeptormoleküle aus den Einschlusskörperchen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der rekombinante lösliche FcR-Rezeptor humanen Ursprungs. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält er eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO. 3 oder 4 gezeigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung findet die Herstellung der löslichen Fc-Rezeptoren vorzugsweise in prokaryotischen Zellen statt. Nach einer solchen Expression bilden sich unlösliche Einschlusskörperchen, die das rekombinante Protein enthalten, in prokaryotischen Zellen, wodurch eine Reinigung erleichtert wird durch Separieren der Einschlusskörperchen von den anderen Zellkomponenten bevor Renaturierung der Proteine, die darin enthalten sind, stattfindet. Die Renaturierung der FcRs gemäß der vorliegenden Erfindung, die in den Einschlusskörperchen enthalten sind, kann prinzipiell entsprechend bekannter Verfahren stattfinden. Der Vorteil der Herstellung in prokaryotischen Zellen, die Bildung von Einschlusskörperchen und die so erhaltenen rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren machen es möglich, ein sehr reines und im Besonderen ebenfalls homogenes FcR-Präparat zu erhalten. Ebenfalls weist das erhaltene Produkt aufgrund des Fehlens einer Glykosylierung große Homogenität auf.
Lösliche Fc-Rezeptoren, die bisher produziert bzw. gebildet wurden durch rekombinante Mittel, zeigten im Besonderen den Nachteil, dass eine viel aufwändigere Reinigung erforderlich war, da sie in eukaryotischen Zellen exprimiert wurden und aufgrund der Glykosylierung, die nicht immer einheitlich in prokaryotischen Zellen ist, waren diese Produkte ebenfalls weniger homogen.
Die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung machen es sogar möglich, Kristalle zu bilden, die geeignet sind zur Verwendung bei einer Röntgenanalyse, wie später in der Beschreibung erklärt werden wird. Die FcRs der vorliegenden Erfindung zeigen darüber hinaus praktisch die gleiche Aktivität und Spezifität wie die Rezeptoren, die natürlich in vivo auftreten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines homogenen Präparates aus rekombinantem löslichem FcγRIIb oder FcγRIII, worin eine Nukleinsäure, die für einen löslichen FcγRIIb- oder FcγRIIIb-Rezeptor codiert, in Prokaryoten exprimiert wird, unter Bedingungen, die die Bildung von Einschlusskörperchen bevorzugen, abtrennen Einschlusskörperchen und Renaturieren von rekombinantem löslichem Fc- Rezeptor, um ein homogenes Präparat davon bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Prokaryoten E.coli.
Die Nukleinsäure, die für einen löslichen FcγRIIb- oder FcγRIII-Rezeptor codiert, kann nur die codierenden Sequenzen oder zusätzlich Vektorsequenzen und/oder im Speziellen Expressionskontrollsequenzen enthalten, die operativ mit der Sequenz verknüpft sind, die für den rekombinanten FcR codiert, wie Promotoren, Operatoren und dgl. Vorzugsweise enthält die Nukleinsäure eine Sequenz wie in einer der SEQ ID Nr: 9 und 10 gezeigt. Zum Vergleich zeigt SEQ ID Nr: 13 und SEQ ID Nr: 14 die entsprechenden Wildtypsequenzen, die für FcγRIIb und FcεRIa codieren.
SEQ ID Nrn: 15-18 zeigen die Wildtypsequenzen für FcγRI, FcγRIIa, FcγRIII und FcεRII.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Nukleinsäure zusätzlich Expressionskontrollsequenzen, die operabel mit der Sequenz verbunden sind, die für rekombinanten Fc-Rezeptor codiert.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure auf einem prokaryotischen Expressionsvektor enthalten. Wenn Nukleinsäure Vektorsequenzen enthält, sind dies vorzugsweise Sequenzen eines oder verschiedener prokaryotischer Expressionsvektoren, vorzugsweise von pET-Vektoren. Alle anderen bekannten Funktionen oder Komponenten von Expressionsvektoren können ebenfalls in der rekombinanten Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sein, falls dies gewünscht ist. Dies können z.B. Resistenzgene sein, die eine wirkungsvolle Selektion transformierter Wirtszellen erlauben.
Die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der Erfindung können im pharmazeutischen Bereich verwendet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein homogenes Präparat eines rekombinanten löslichen FcγRIIb- oder FcγRIII-Rezeptors enthält. In der pharmazeutischen Zusammensetzung wirken die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren als aktives Mittel. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann diese pharmazeutische Zusammensetzung natürlich herkömmliche geeignete Träger und Hilfssubstanzen enthalten. Solche Substanzen sind dem Fachmann in der Technik bekannt, wobei die Art der Verabreichung ebenfalls beachtet werden muss. Die pharmazeutische Zusammensetung der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden für die Behandlung oder Verhinderung von Autoimmunkrankheiten, Allergien oder Tumorkrankheiten.
Lösliche Formen von Fc-Rezeptoren, wie etwa FcγRIII, vermitteln Isotyp-spezifische Regulation des B-Zellwachstums und der Immunglobulinproduktion. In einem Mausmodell für Myelom suprimiert sFcR das Wachstum und die Immunglobulinproduktion von Tumorzellen (Müller et al, 1985, Roman et al., 1988; Teillaud et al., 1990). Darüber hinaus bindet sFcR an Oberflächen-IgG auf Kulturen von humanen IgG-sezernierenden Myelomzellen und bewirkt Suppression von Tumorzellwachstum und IgG-Sezernierung. Ausgedehntes Aussetzen dieser Zellen unter sFcR führt zu Tumorzellcytolyse (Hoover et al., 1995).
Ebenfalls können Überreaktionen des Immunsystems bei allergischen Reaktionen oder aufgrund massiver Antigenbelastung z.B. verringert werden durch intravenöse Anwendung von löslichem FcR (lerino et al. 1993).
Daher ist eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS, rheumatischer Arthritis oder multiplem Myelom. Vorzugsweise weist der rekombinante lösliche FcγRIIb oder FcγRIII, der in dieser pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, eine Aminosäuresequenz auf wie in den SEQ ID Nrn: 3 bzw. 4 gezeigt.
Jedoch können die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden für eine große Anzahl von Untersuchungen oder Anwendungen, da sie spezifisch mit Antikörpern reagieren. In vivo sind die löslichen Fc-Rezeptoren starke Immunregulatoren, die, falls sie in erhöhten Gehalten vorliegen, zu einer bemerkenswerten Suppression des Immunsystems führen, was zu vielen teilweise bekannten und teilweise noch nicht verstandenen Wirkungen führt.
Eine mögliche Anwendung der rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Antikörpermenge eines bestimmten Typs in dem Blut oder Serum eines Patienten, gekennzeichnet durch die Verwendung eines rekombinanten löslichen FcR gemäß der Erfindung in einem Immunoassay, und die Bestimmung des Vorliegens von FcR-Antikörperkomplexen. Ein solcher Assay erlaubt die Untersuchung auf das Vorliegen einer bestimmten Art Antikörper und erlaubt auch die Bestimmung der Menge von Antikörpern, die in dem Blut, Plasma oder Serum eines Patienten vorliegen. Im Besonderen ist dieses Verfahren geeignet und vorteilhaft zur Bestimmung einer Prädisposition oder Manifestation einer Allergie.
Jeder Immunoassaytyp ist prinzipiell geeignet für dieses Verfahren, solange das Vorliegen von FcR-Antikörperkomplexen damit nachgewiesen werden kann. Sowohl ELISA (Festphasen-Enzymimmunoassay), insbesondere Sandwich-Assays, und RIA (Radioimmunoassay), jedoch auch kompetitive Testverfahren sind geeignet.
Darüber hinaus ist ein Verfahren bevorzugt, worin das Vorliegen löslicher FcRs zu bestimmen ist, und falls erforderlich zu quantifizieren ist. Für eine solche Bestimmung wird vorzugsweise ein kompetitives Immunoassayverfahren verwendet, worin als Kompetitionsreagens ein rekombinanter löslicher Rezeptor gemäß der Erfindung verwendet wird. Mittels dieses Tests kann unter anderem der Immunstatus des Patienten mit chronischen Erkrankungen des Immunsystems in einem kompetitiven Immunoassay bestimmt werden. Chronische Krankheiten im Sinne dieser Verfahren sind z.B. AIDS, SLE (systemischer Lupus erythematodes), MM (multiples Myelom) oder rheumatische Arthritis.
Eine weitere mögliche Anwendung der rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung liegt im Untersuchen von Substanzen im Hinblick auf ihre Fähigkeit als Inhibitoren auf die Erkennung und Bindung von Antikörpern an entsprechende zelluläre Rezeptoren zu wirken.
Mittels moderner Screeningtechniken bzw. Untersuchungstechniken, wie etwa HTPS (High Throughput-Screening) in Kombination mit Multivertiefungsmikrotiterplatten und automatischen Pipettiervorrichtungen, ist es heutzutage möglich, simultan eine Vielzahl von Substanzen auf spezifische Eigenschaften zu testen. Da die FcRs gemäß der vorliegenden Erfindung leicht unter geringen Kosten gebildet werden können, können sie auch in solchen Reihentests verwendet werden, durch welche Substanzen mit einer inhibierenden Wirkung leicht identifiziert werden können.
Insbesondere die rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Inhibitoren zu finden oder zu untersuchen, die in der Lage sind zum Inhibieren der Erkennung und der Bindung der entsprechenden Antikörper an den speziellen interessierenden Rezeptor.
Eine weitere potenzielle Anwendung der rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der Erfindung ist ihre Verwendung wenn sie an eine feste Phase gebunden sind. Solche Festphase-gebundenen Rezeptoren können für Immunoassays oder andere Anwendungen verwendet werden, worin der Rezeptor in einer immobilisierten Form vorteilhaft verwendet werden kann.
Zum Beispiel kann die feste Phase ein Chromatographieträgermaterial sein, auf welchem der Fc-Rezeptor fixiert ist, z.B. Sepharose, Dextransulfat, usw. Solche Chromatographiematerialien mit Fc-Rezeptoren, die daran gebunden sind, können vorteilhaft zur Adsorption von Immunglobulinen aus dem Blut, Plasma oder Serum von Patienten oder aus dem Kulturüberstand von Immunglobulin-produzierenden Zellen verwendet werden (dies bedeutet Konzentration, Anreicherung und Reinigung von Antikörpern).
Auf der einen Seite können die Antikörper, die an das Chromatographiematerial gebunden sind, eluiert werden und z.B. der Immunstatus eines Patienten dadurch bestimmt werden. Auf der anderen Seite können Antikörper aus dem Blut eines Patienten damit angereichert werden bevor weitere Tests durchgeführt werden. In vielen Fällen ist es schwierig, diagnostische Assays unter Verwendung von Blutproben durchzuführen, wenn die letzteren nur eine sehr kleine Anzahl zu identifizierender Antikörper enthalten. Mittels einer Konzentration unter Verwendung einer spezifischen chromatographischen Säule mit Fc-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung, können Antikörper von Interesse leicht konzentriert und separiert werden von vielen anderen Substanzen, welche den Test stören könnten.
Im Grunde ist es auch möglich, ein Chromatographiematerial in einem extrakorporalen Perfusionssystem zum Waschen des Blutes im Falle bestimmter Krankheiten zu verwenden, worin die Entfernung von Antikörpern eine entscheidende Rolle spielt.
Es ist jedoch ebenfalls möglich, ein anderes Material als feste Phase zu verwenden, an welches der rekombinante lösliche Fc-Rezeptor gemäß der Erfindung gekoppelt wird, z.B. Mikrotiterplatten oder kleine Reaktionsgefäße, an deren Wände Fc-Rezeptoren entweder direkt oder indirekt gebunden sind. Solche festen Phase und Gefäße können besonders wichtig sein für diagnostische Verfahren, da sie ein Screening bzw. eine Untersuchung ermöglichen durch Verwendung von Immunoassays, z.B. zum Nachweis des Vorliegens bestimmter Immunglobuline in dem Blut oder anderen Körperfluiden von Patienten.
Eine weitere mögliche Anwendung der rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren gemäß der Erfindung ist ihre Verwendung bei der Röntgenanalyse. Daher war es ebenfalls von großem Interesse, Kristallstrukturdaten von Fc-Rezeptoren der Erfindung und/oder Fc-Rezeptor-Ig-Komplexen (Beispiele 1, 3) zu erhalten. Auf der einen Seite ist dies ein Schlüssel zum Verständnis des molekularen Mechanismus bei der Immunkomplexerkennung. Auf der anderen Seite können diese Strukturdaten verwendet werden, um allgemeine Merkmale in den Strukturen verschiedener Fc-Rezeptoren zu finden und die Kenntnis der Strukturen zu verwenden, um Inhibitoren zu erzeugen oder neue künstliche Antikörperrezeptoren zu identifizieren und herzustellen bzw. zu produzieren. Zum Zweck des Vergleichs war es ebenfalls von großem Interesse, Kristallstrukturdaten der Fc-Rezeptoren zu erhalten, die durch die vorliegende Erfindung nicht umfasst oder beansprucht sind (Beispiele 2, 4 bis 6).
Es war ebenfalls von großem Interesse eine Information über die konkreten Bindungsstellen von Immunglobulinen an ihre jeweiligen Rezeptoren in natürlich auftretenden dreidimensionalen Molekülen zu erhalten. Daraus können noch genauere Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Antikörper und Rezeptor erhalten werden und ebenfalls darüber, wie diese Wechselwirkungen moduliert werden. In diesem Zusammenhang bedeutet Modulation entweder eine Verstärkung der Wechselwirkung oder eine Verringerung, die zu einer Inhibierung durch oder Abdecken der Bindungsstellen, auf ein oder mehreren Teilen des Komplexes führt.
Zum Erhalten solcher Kristallstrukturdaten und Konformationsinformation wird ein kristallines Präparat des rekombinanten löslichen Fc-Rezeptors gemäß der Erfindung als auch der rekombinanten löslichen Fc-Rezeptoren, die nicht umfasst oder beansprucht sind durch die vorliegende Erfindung, verwendet. Die rekombinanten löslichen FcRs können überraschenderweise durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung rein genug erhalten werden, um Kristalle zu zu bilden, die verlässliche Röntgenstrukturbestimmungsdaten ergeben. Eine solche Kristallisation war mit den bisher gebildeten Rezeptormolekülen, zumeist aufgrund des Fehlens einer Hiomogenität, nicht möglich.
Über Kristallstrukturanalyse der kristallinen Präparate konnten die exakten Aminosäuren der Fc-Rezeptor/Ig-Komplexe nachgewiesen werden, die die Kopplung vermitteln. Diese Aminosäuren sind in den 6a und 6b gezeigt und der Typ der Bindung zwischen den einzelnen Aminosäuren beider Moleküle in dem Komplex ist ebenfalls angegeben. Aus den Kristallstrukturdaten kann eine Information über die dreidimensionale Struktur und die aktiven Stellen zur Bindung von Antikörpern erhalten werden. Im Besonderen kann ein kristallines Präparat eines Komplexes aus rekombinantem löslichem Fc-Rezeptor gemäß der Erfindung und dem entsprechenden Immunglobulinmolekül verwendet werden zur Erzeugung der Kristallstrukturdaten für die Komplexe. Diese Daten erlauben die Bestimmung der tatsächlichen Wechselwirkungen, die zwischen den beiden Molekülen aufgebaut werden und erlauben zum ersten Mal das Erhalten einer exakten Information über die Wechselwirkung der Moleküle, wobei eine Kenntnis über mögliche Stellen zur Inhibierung oder Verstärkung der Bindung vermittelt werden. Auf Basis der aus den Kristallstrukturdaten erhaltenen Information können die Erkenntnisse, die erforderlich sind zum Bewirken einer Modulation der Wechselwirkung zwischen Fc-Rezeptor und Immunglobulin erhalten werden. Diese Modulation kann von einer Verstärkung bis zur vollständigen Inhibierung bis zur Inhibierung der Bindung führen.
Die Kristallstrukturen können z.B. verwendet werden, um Inhibitoren, Antagonisten und künstliche Rezeptormoleküle zu entwickeln. Geeigneterweise werden die Strukturdaten zur Erzeugung und/oder Identifizierung von Inhibitoren bzw. neuen Rezeptoren in einem Computer-unterstützen Modellierungsprogramm verwendet.
Computerprogramme, die geeignet sind zur Computer-unterstützen Wirkstoffentwicklung und zum Screening bzw. Untersuchen sind dem Fachmann in der Technik bekannt und allgemein verfügbar. Sie liefern die Möglichkeit zur Untersuchung zig-facher Zusammensetzungen auf dem Computer im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bindung an ein bestimmtes Molekül wenn die entsprechenden Strukturdaten in den Computer eingegeben werden. Mit der Hilfe dieser Möglichkeit kann eine große Anzahl bekannter chemischer Zusammensetzung untersucht werden im Hinblick auf ihre inhibierende oder antagonisierende Wirkung. Der Fachmann in der Technik benötigt nur die Kristallstrukturdaten, die wie oben beschrieben bereitgestellt sind, und ein kommerziell erhältliches Screeningprogramm (Program Flexx: Vom GMD-German National Research Center for Information Technology, Schloss Birlinghoven, D-53754 Sankt Augustin, Deutschland).
Ebenso ist eine weitere mögliche Anwendung der erhaltenen Kristallstrukturdaten über die Rezeptoren bzw. die Rezeptor/Immunglobulin-Komplexe zur Identifikation und Herstellung neuer Fc-Rezeptoren, welche z.B. als Antagonisten und Kompetitoren verwendet werden können. Die Kristallstrukturdaten und die Daten über die Aminosäuren, die bei der Bindung von Fc-Rezeptoren umfasst sind, die daraus erhalten werden, können z.B. dazu dienen, mutierte Immunglobuline zu erzeugen, die ebenfalls als Inhibitoren verwendet werden können. Es ist vorstellbar, dass mutierte oder chemisch modifizierte Inhibitoren eine starke Bindung eingehen und daher eine Blockierung von Rezeptoren bewirken. Auf der anderen Seite können die Daten, die für die Bindungsstellen von Immunglobulinen erhalten werden, auch verwendet werden zur Identifizierung und/oder Herstellung von Inhibitoren für Immunglobulinmoleküle. Solche Immunglobulininhibitoren können eine dreidimensionale Struktur aufweisen, die komplementär zu der Immunglobulinbindungsstelle für rekombinante lösliche Fc-Rezeptoren ist und die Bindung von Immunglobulinen an Fc-Rezeptoren inhibieren. Der Ausdruck "komplementär" ist so zu verstehen, dass die Inhibitormoleküle Substanzen sein müssen, welche in der Lage sind, mindestens soviele Bindungsstellen auf dem Immunglobulin oder auf dem Fc-Rezeptor abzudecken, dass die Bindung zwischen Fc-Rezeptor und Immunglobulin mindestens entscheidend geschwächt ist. Die Abdeckung kann sowohl stattfinden durch Binden an die Aminosäuren, die die Komplexbildung von der jeweiligen Komponente vermitteln, jedoch auch auf eine solche Art, dass zumindest Komplexbildung nicht länger möglich ist, sei dies durch sterische Inhibierung oder durch Bindung an benachbarte Aminosäuren, jedoch Abdeckung der Aminosäure, die bei der Komplexbindung zwischen Fc-Rezeptor und Immunglobulin beteiligt ist.
In Verbindung mit den Kristallstrukturdaten, die wie in den Beispielen beschrieben, erhalten wurden, war es zum ersten Mal möglich, die exakten Bindungsstellen und die Aminosäuren zu bestimmen, die an der Bindung des Antikörpers und der Antikörperrezeptormoleküle beteiligt sind. Es ist nun möglich, spezifische Bindungsmoleküle zu Entwickeln und Kandidatenzusammensetzungen am Computer zu untersuchen. Dies ermöglicht die Auswahl solcher Zusammensetzungen aus einer Vielzahl möglicher Kandidatenzusammensetzungen, die eine ausreichende Inhibierung der Komplexbildung zwischen Fc-Rezeptor und Immunglobulin bewirken.
Was wichtig für die Inhibitoren ist, ist, dass sie bezüglich ihrer Struktur und Spezifität in der Lage sind zum Binden an die FcRs oder Immunglobuline und so die normale Bindung zwischen FcRs und den konstanten Teilen der Antikörper verhindern.
Solche Inhibitoren können z.B. kleine organische Moleküle sein, welche leicht oral verabreicht werden können. Sie sind eine interessante Alternative zu Cortison bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Wirt/Transplantat-Abstoßungen. Ein solches Molekül würde auch Neuinfektionsraten mit bestimmten Viren unterdrücken, z.B. Dengue-Virus, worin der mit Antikörper überzogene Virus FcγRIIb abhängig internisiert ist (Littaua et al., 1990), HIV, worin auf CD4-positiven T-Zellen eine Antikörperverstärkung der HIV-Infektion vermittelt wird durch FcγRIII (Homsy et al., 1989) oder Ebola, worin das Virus, das Glycoprotein sezernierte, frühe neutrophile Aktivierung durch Blockieren von sFcγRIII inhibiert, was die Wirtsreaktion auf die Infektion beeinträchtigt (Yang et al., 1998).
Daher kann mit der Kenntnis der Struktur der homologen Rezeptoren und des Rezeptor-Antikörper-Komplexes im atomaren Detail eine neue Möglichkeit für eine rationale Wirkstoffentwicklung eröffnet werden. Der Fc-Rezeptor bindet zwischen den beiden CH2-Domänen des Fc-Fragments in der sogenannten unteren Gelekregion (lower hinge Region) (8). Die Bindungsregion des Fc-Rezeptors ist in Beispiel 1 beschrieben (die Kontaktgrenzfläche zu IgG). Die Reste, die die Wechselwirkung zwischen FcR und Immunglobulin fördern, sind in den 7, 10a und 10b gezeigt. Dabei werden drei Wechselwirkungsregionen ersichtlich (5).
Erste Region: FcR (Reste 85 bis 87 und Rest 110) – Ig (Kette A-Reste 326-328)
Prolin 328 des Ig wird auf sandwichartig angeordnet durch die Reste Trp 87 und 110. Diese Reste sind konserviert unter den IgG- und IgE-Rezeptoren, als auch in dem IgG und IgE. Eine Inhibitorbindung an diese wichtige Region würde die Bindung stark stören. Diese Region ist zusätzlich attraktiv für die Inhibitorentwicklung, da die exponierte hydrophobe Oberflächenregion, die die Reste Trp 87, Ile 85, Gly 86 der Rezeptoren umfasst, verwendet werden kann, um zusätzliche Bindungsenergie zu erhalten. Diese funktionellen Gruppen der Thr 113- und Glu 18- und Lys 19-Seitenketten in der Nachbarschaft können besonders zur spezifischen Inhibitorbindung beitragen.
Zweite Region: FcR (Reste 126-132 und Reste 155-158) – Ig (Kette A- und Kette B-Reste 234-239)
Die Amino-terminalen Reste 234-239 der beiden Ig-Ketten werden differenziert erkannt durch den FcR, wobei die zweifache Symmetrie des Fc-Fragments gebrochen wird. Diese Reste der Fc-Fragmentkette A sind in Kontakt mit den Resten Val 155 – Lys 158 des Rezeptors und die gleichen Reste von Fc-Fragmentkette B mit den Rezeptorresten Gyl 126 – His 132. Diese Region zeigt die meisten Unterschiede im Sequenzalignment der Rezeptoren, als auch der Immunglobuline und sollte daher bei der Spezifitätserzeugung erfasst sein. Die tiefe Spalte zwischen den Fc-Fragmentketten ist gut geeignet für eine Inhibitorentwicklung und würde die Stelle der Wahl für die Entwicklung von Inhibitoren sein, wenn die Belange der Spezifität betroffen sind.
Dritte Region: FcR (Reste 117, 126 und 129-132) – Ig (Kette B-Reste 264-265 und Reste 296-297)
Die Bindungsregion ist gekennzeichnet durch eine Anhäufung von Aminosäureresten, die funktionelle Gruppen in ihren Seitenketten tragen, die auf verschiedene Arten verwendet werden könnten zur Inhibitorentwicklung auf dem Rezeptor und der Ig-Stelle des Kontakts.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbindung mit den Figuren weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
shFcγRIIb (löslicher humaner FcγRIIb)
1.1 Klonieren und Expression
Die cDNA von humanem FcγRIIb2 (Engelhardt et al., 1990) wurde modifiziert unter Verwendung von mutagener PCR (Dulau et al., 1989). Daher wurde ein nach vorne gerichteter Primer verwendet zum Einbringen eines neuen Startmethionis nach der Spaltungsstelle des Signalpeptids innerhalb einer NcoI-Stelle (5'-AAT AGA ATT CCA TGG GGA CAC CTG CAG CTC CC-3'), während der reverse Primer ein Stoppcodon zwischen dem mutmaßlichen extrazellulären Teil und der Transmembranregion, gefolgt von einer SalI-Stelle, einführte (5'-CCC AGT GTC GAC AGC CTA AAT GAT CCC C-3'). Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und SalI verdaut, kloniert in einen pET11d-Expressionsvektor (Novagen) und die vorgeschlagene Sequenz wurde bestätigt. Das erste Konstrukt wurde in BL21 (DE3) propagiert (Grodberg und Dunn, 1988). Für die Überexpression von FcγRIIb wurde eine einzelne Kolonie der transformierten Bakterien inokuliert in 5 ml LB-Medium, das 100 μg Ampicillin pro ml (LB-Amp100) enthielt, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kultur wurde 200-fach in LB-Amp 100 verdünnt und die Inkubation wurde fortgesetzt bis ein OD600 von 0,7-0,9 erreicht war. Die Überproduktion des Proteins wurde induziert durch Zugeben von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM. Nach einer Wachstumsperiode von 4 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation (30 min, 4000 × g) geerntet und resuspendiert in Beschallungspuffer (30 mM Natriumphosphat, 300 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 7,8). Nach Zugabe von 0,1 mg Lysozym pro ml Suspension und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur wurde Beschallung auf Eis durchgeführt (Branson Sonifier, Danbury, CT; Macrotip, 90 Leistung, 80 % Intervall, 15 min.). Die Suspension wurde zentrifugiert (30 min, 30.000 × g) und resuspendiert mit einem Dounce-Homogenisator in Beschallungspuffer, der 0,5 % LDAO enthielt. Der Zentrifugationsschritt und die Resuspension in LDAO enthaltendem Puffer wurde einmal wiederholt bevor dieses Verfahren zweimal ohne LDAO wiederholt wurde. Die gereinigten Einschlusskörperchen wurden bei 4 °C aufbewahrt.
1.2 Neufaltung (Refolding) und Reinigung von löslichem humanem FcγRIIb (shFcγRIIb)
Die gereinigten Einschlusskörperchen wurden gelöst bis zu einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml in 6 M Guanidinchlorid, 100 mM 2-Mercaptoethanol und von dem unlöslichen Material durch Zentrifugation getrennt. Die Neufaltung wurde erreicht durch rasche Verdünnung. Dafür wurde 1 ml der Einschlusskörperchenlösung unter Rühren innerhalb von 15 Stunden in 400 ml des Neufaltungspuffers (0,1 M TRIS/HCl, 1,4 M Arginin, 150 mM Natriumchlorid, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG, 0,1 mM PMSF, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 8,5, 4 °C) getropft. Hiernach wurde das Gemisch für 2 bis 3 Tage gerührt bis die Konzentration der freien Thiolgruppen auf 1 mM durch Luftoxidation gemäß Messung entsprechend Ellman (Ellman, 1959) verringert war. Die Lösung wurde gegen PBS dialysiert und steril filtriert bevor sie 10-fach in einer Rührzelle aufkonzentriert wurde, die mit einer 3kD-MWCO-Ultrafiltrationsmembran ausgestattet war. Die Proteinlösung wurde auf eine hIgG-Sepharosesäule (50 mg hIgG pro ml Sepharose 4B) aufgebracht. Ungebundenes Protein wurde mit 50 mM TRIS, pH-Wert 8,0, ausgewaschen vor Elution von FcγRIIb durch einen pH-Wert-Sprung (150 mM Natriumchlorid, 100 mM Glycin, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 3,0). Das Eluat wurde unmittelbar neutralisiert mit 1 M TRIS, pH-Wert 8,0. Die FcγRIIb enthaltende Lösung wurde konzentriert und einer Gelfiltration unterzogen auf einer Superdex-75 Säule, äquilibriert mit Kristallisationspuffer (2 mM MOPS, 150 mM Natriumchlorid, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 7,0). Die Fraktionen, die FcγRIIb enthielten, wurden gepool, konzentriert auf 7 mg/ml und bei –20 °C aufbewahrt.
1.3 Gleichgewichtsgelfiltrationsversuche
Eine Superdex75-Säule wurde mit FPLC verbunden und äquilibriert mit PBS, das 10 μg shFcRIIb pro ml enthielt. Humanes Fc-Fragment wurde bis zu einer Konzentration von 1 μg/10 μl in dem Gleichgewichtspuffer gelöst und injiziert. Das resultierende Chromatogramm ergab ein positives Signal, das den Komplex des shFcγRIIb- und des Fc-Fragments umfasste, während das negative Signal das Fehlen von Rezeptor, der aus dem Laufpuffer verbraucht wurde zur Komplexbildung, darstellt.
1.4 Kristallisation und Datensammlung
Anfangskristallisationsversuche unter Verwendung eines sparse matrix screens für 96 Bedingungen (Jancarik und Kim, 1991), wurden in aufliegenden Tropfen (Sitting drops) bei 20 °C, unter Verwendung des Dampfdiffusionsverfahrens durchgeführt. Auftretende Kristalle wurden verbessert durch Ändern des pH-Werts als auch der Salz-, Präzipitanten- und Additivkonzentration. Diffraktionsdaten geeigneter Kristalle wurden auf einem Bildplattensystem (MAR Research) dargestellt, unter Verwendung von monochromatisierter Graphit-CuKγ-Strahlung aus einem RU200b Rotationsanodengenerator (Rigaku), der bei 50 kV und 100 mA betrieben wurde. Die Reflektionen wurden integriert mit dem Programm MOSFLM (Leslie, 1997) und nachfolgend wurden die Daten skaliert, reduziert und gerundet, um die Strukturfaktoramplituden zu erhalten, unter Verwendung von Routinen des CCP4-Programms (Collaborative Computational Project, 1994).
1.5 Zusammenfassung von Expression, Reinigung und Neufaltung von shFcγRIIb
Der extrazelluläre Teil von FcγRIIb wurde in hohen Graden exprimiert unter der Kontrolle eines T7-Promotors in dem T7-RNA-Polymerase-positiven E. coli-Strang BL21/DE3 (Grodberg & Dunn, 1988). Das Protein wurde in Einschlusskörperchen eingelagert, welche in dem ersten Reinigungsschritt verwendet wurden. Die Isolierung der Einschlusskörperchen wurde begonnen mit einem intensiven kombinierten Lysozym/Beschallungs-Verfahren, um eigentlich alle Zellen zu öffnen, die ansonsten das Produkt verunreinigen würden. Die nachfolgenden Waschschritte mit dem Detergenz LDAO, das ausgezeichnete Eigenschaften beim Lösen von Verunreinigungen aufweist, jedoch nicht für die Einschlusskörperchen als solche, ergab schließlich ein Produkt mit einer Reinheit von > 90 % (1).
Dieses Produkt wurde verwendet für Neufaltungsversuche, ohne weitere Reinigung. Die Einschlusskörperchen wurden bei einer hohen Konzentration von 2-Mercaptoethanol und Guanin gelöst, um die Verschiebung von kovalenten und nicht-kovalenten Aggregaten zu Monomeren sicherzustellen. Diese Lösung wurde rasch verdünnt mit Widerfaltungspuffer, um Kontakte zwischen den ungefalteten Proteinmolekülen zu minimieren, die ansonsten Aggregate bilden würden. Die Verwendung von Arginin in dem Neufaltungspuffer verhindert die irreversible Modifizierung von Seitenketten, wie es häufig mit Harnstoff festgestellt wird. Nach Zugabe des Proteins zu dem Neufaltungspuffer wurde die Lösung bei 4 °C gerührt bis die Konzentration freier Thiolgruppen auf 1 mM verringert war, was absolut erforderlich war, da frühere Dialysen zu einem inaktiven Produkt führten. In einem zweiten Reinigungsschritt wurde der dialysierte und widergefaltete FcγRIIb an immobilisiertes hIgG gebunden, um kleinere Anteile von E.coli-Proteinen und inaktivem Rezeptor zu entfernen. Das Protein wurde mit einem pH-Wert-Sprung eluiert und unmittelbar neutralisiert. Nach diesem Affinitätschromatographieschritt ist shFcγRIIb im Wesentlichen rein, ausgenommen eine kleinere Verunreinigung, die aus der Coelution von IgG resultiert, welches aus der Matrix selbst nach wiederholter Anwendung ausgelaugt wird (1). Das IgG als auch Rezeptormultimere, die nicht sichtbar sind in reduzierendem SDS-PAGE, könnten leicht entfernt werden durch Gelfiltration. Parallel zu der Entfernung der Verunreinigungen in diesem Schritt wird der Puffer quantitativ ausgetauscht. Dieses Verfahren stellt eine definierte Zusammensetzung der Proteinlösung bereit, da selbst leichte Variationen Irreproduzierbarkeit der Kristallisationsversuche bewirken könnten, oder sogar die Bildung von Kristallen inhibieren könnten. Insgesamt 6 mg reines Protein konnten pro Liter E.coli-Kultur gewonnen werden, was etwa 10 % des FcγRIIb-Gehalts der Einschlusskörperchen ist.
N-terminales Protein-Sequenzieren ergab die Identität mit der erwarteten Sequenz H₂N-GTPAAP, ohne nachweisbare Verunreinigung. ESI-MS-Analyse zeigte, dass das letztendliche Material, das in Kristallisationsversuchen verwendet wurde, homogen ist in Bezug auf die Größe. Aus der primären Sequenz wurde das Molekulargewicht mit 20343 Da berechnet, was 20429 Da entspricht, die durch Massenspektrometrie gefunden wurden. Der Unterschied liegt innerhalb des Fehlers des Geräts und kein zusätzliches Signal für eine Spezies, die das Leitmethionin enthält, wird gefunden.
Die Kristallisation von shFcγRIIb wurde durchgeführt in aufliegenden Tropfen unter Verwendung des Dampfdiffusionsverfahrens. Anfangsversuche mit einer sparse matrix screen (Jancarik & Kim, 1991) führten bereits zu kleinen Kristallnadeln. Nachfolgende Optimierung der vorhergehenden Kristallisationsbedingung durch Variation von Präzipitationsmittel, Salz, ihrer Konzentration und pH-Wert, führte zur Isolierung von drei verschiedenen Kristallformen. Orthorhomboedrische Kristalle wuchsen aus einem Gemisch von 1,5 μl Vorratslösung (33 % PEG2000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,4) mit 3 μl der Proteinlösung. Sie erschienen innerhalb von 3 Tagen und erreichten ihre letztendliche Größe von ungefähr 80 μm × 80 μm × 500 μm nach einer Woche. Diese Kristalle beugten auf 1,7 Å. Kristalle konnten auch gezüchtet werden in zwei anderen Raumgruppen aus der Vorratslösung, die 26 % PEG8000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,6, 5 mM Zn(OAc)₂, 100 mM Natriumchlorid (hexagonale Form) und 26 % PEG8000, 0,2 M NaOAc, pH-Wert 5,6, 10 % (V/V) 1,4-Dioxan, 100 mM Natriumchlorid (tetragonale Form) enthielt. Diese Kristalle hatten eine geeignete Größe für Röntgenanalyse, jedoch beugten sie nur auf 2,7 Å und 3,8 Å für die tetragonale bzw. hexagonal Kristallform (Tabelle 1).
FcγRII wurde in E.coli exprimiert, was neben den vergleichsweise geringen Herstellungskosten und der Verfügbarkeit, mehrere Vorteile aufweist, insbesondere wenn die Glykosylierung, die durch Säugerzellen durchgeführt wird, nicht erforderlich ist für die Funktion des Proteins, wie im Falle von FcγRII, worin IgG-Bindung unabhängig von der Kohlehydratanhaftung auftritt (Sondermann et al., 1998A). In E.coli kann ein homogenes Produkt reproduzierbar erzeugt werden, was im Gegensatz zur Expression in Säugerzellen steht, worin Chargen-abhängige Variationen häufig beobachtet werden. In einem solchen System wird das Produkt für mehrere Tage Proteasen bei Temperaturen von mehr als 30 °C ausgesetzt. Im Gegensatz hierzu führt die Expression des Proteins in E.coli unter der Kontrolle des starken T7-Promotors bei 37 °C häufig zur Bildung von für Protease unzugänglichen Einschlusskörperchen. Ein weiterer Vorteil der Expression in Bakterien ist, dass das Material als frei von pathogenen Keimen betrachtet werden könnte, welche aus verwendetem fötalem Kalbserum oder der Zelllinie selbst stammen könnten. Bei der Säugerexpression muss besondere Vorsicht während der Reinigung des Zielproteins vorgesehen werden, da potenziell wirksame Hormone oder Wachstumsfaktoren mitgereinigt werden könnten. Ein Fall, worin die Wirkungen von sFcγR einer TGFβ1-Verunreinigung zugeschrieben werden, ist bereits beschrieben (Galon et al., 1995).
1.6 Reinigung
Das Reinigungsverfahren ist einfach. Es besteht aus drei Schritten, welche leicht an einem einzigen Tag durchgeführt werden können. Das Protein wird in einer reinen Form und in hohen Ausbeuten erhalten und könnte sogar in beachtlicher Qualität ohne teure IgG-Affinitätssäule erhalten werden. Der Erfolg eines solchen Protokolls würde abhängen von der sorgfältigen Herstellung der Einschlusskörperchen, da die meisten der Verunreinigungen bereits in dem ersten Reinigungsschritt eliminiert werden können.
1.7 Charakterisierung
Der gereinigte FcγRIIb wurde durch SDS-PAGE und isoelektrisches Fokussieren, als auch N-terminales Sequenzieren und Massenspektrometrie charakterisiert. So kann das Material als rein und homogen in Bezug auf seine chemische Zusammensetzung betrachtet werden, jedoch die interessante Frage, ob der Rezeptor korrekt gefaltet ist, bleibt zu diskutieren. Alle Cysteine sind gepaart, da keine freien Thiolgruppen mit dem Ellman-Test nachgewiesen werden. Das Material ist monomer und eluiert mit der erwarteten Retensionszeit in Signalen mit symmetrischer Form von einer Größenausschlusschromatographiesäule. Darüber hinaus bindet FcγRIIb an IgG-Sepharose, rekombinantes FcγIIb von E.coli ist aktiv, da es spezifisch IgG bindet.
1.8 Kristallisation
Die orthorhomboedrische Kristallform von FcγRIIb beugt Röntgenstrahlen auf eine eine Auflösung von 1,7 Å, was eine drastische Verbesserung im Vergleich mit früher berichteten Kristallen des gleichen Moleküls ist, die aus Insektenzellexpression stammen (Sondermann et al., 1998A). Diese Kristalle beugten auf 2,9 Å und waren von der Raumgruppe P3,21. Daher beeinflusst die Glykosilierung des von Insektenzellen abgeleiteten Rezeptors die Kristallisationsbedingungen. Anstelle der trigonalen Raumgruppe werden verschiedene Formen gefunden. Nach einer möglichen Auflösung der Struktur werden diese Kristallformen dabei helfen, künstliche Konformationen des Proteins aufgrund von Kristallkontakten zu identifizieren.
FcγRs zeigen keine Sequenzähnlichkeit mit anderen Proteinen, jedoch aufgrund eines konservierten Cysteinabstands (Cysteinspacing) werden sie der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet. Folglich versuchten wir seine Struktur durch molekularen Ersatz zu lösen, jedoch schlugen zahlreiche Versuche unter Verwendung von IgG-Domänen von einer Vielzahl von Molekülen fehl. Daher muss die Struktur von FcγRIIb durch die Verfahren des multiplen isomorphen Ersatzes gelöst werden.
Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass FcγRIIb in einer aktiven Form von E.coli erhalten werden kann. Dies ist die Basis für Kristallographieuntersuchungen, die bald aufgrund der bereits gewonnen Kristalle mit außerordentlicher Qualität zur Strukturlösung dieses wichtigen Moleküls führen. Die Struktur wird eine Information über die IgG-Bindungsstelle liefern und einen Ausgangspunkt für die auf dem Kenntnisstand basierende Entwicklung von Wirkstoffen darstellen, die die Erkennung des Liganden durch seinen Rezeptor stören. Darüber hinaus scheint es aufgrund der hohen Homologie zwischen FcγRIIb und anderen FcRs, einschließlich FcεRIa, möglich, dass diese Moleküle auf die gleiche Art produziert werden könnten, was ein wertvolles Material für die laufende Forschung liefern würde.
1.9 Verfahren
Proteinchemie
Rekombinanter löslicher humaner FcγRIIb wurde in E.coli exprimiert, neugefaltet, gereinigt und kristallisiert, wie an anderer Stelle beschrieben (Sondermann et al., 1998B). Kurz gesagt wurde die mutmaßliche extrazelluläre Region von hFcγRIIb2 (Engelhardt et al., 1990) in E.coli überexprimiert. Einschlusskörperchen wurden gereinigt durch Lysozymbehandlung der Zellen und nachfolgende Beschallung. Die resultierende Suspension wurde zentrifugiert (30 min 30.000 × g) und gewaschen mit Puffer, der 0,5 % LDAO enthielt. Ein Zentrifugationsschritt und Resuspension in LDAO-enthaltendem Puffer, wurde einmal wiederholt bevor dieses Verfahren zweimal ohne LDAO wiederholt wurde. Die Einschlusskörperchen wurden in 6 M Guanidinhydrochlorid gelöst und das Protein wurde wie beschrieben renaturiert. Die dialysierte und filtrierte Proteinlösung wurde auf eine hIgG-Sepharosesäule aufgegeben und durch einen pH-Wert-Sprung eluiert. Die konzentrierten neutralisierten Fraktionen wurden einer Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex-75 Säule unterzogen (26/60, Pharmacia).
Kristallisation
Kristallisation wurde durchgeführt in Sitting drops bei 20 °C, unter Verwendung der Dampfdiffusionstechnik. Kristallisationsuntersuchungen wurden durchgeführt durch Verändern des pH-Werts, Salzes, Präzipitationsmittels und der Additive. Die letztendlichen Kristalle, die zur Datensammlung verwendet wurden, wurden gezüchtet in 33 % PEG2000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,4 (orthorhomboetrische Form), 26 % PEG8000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,6, 10 % (V/V) 1,4-Dioxan, 100 mM Natriumchlorid (tetragonale Form) und 26 PEG8000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,6, 5 mM ZN(OAc)₂, 100 mM Natriumchlorid (hexagonale Form). Das von Insektenzellen stammende Protein wurde kristallisiert in 32 % PEG6000, 0,2 M Natriumacetat, pH-Wert 5,3.
Herstellung von Schweratomderivaten
Die Schweratomderivate wurden hergestellt durch Eintauchen der Kristalle in den Kristallisationspufter, enthaltend 2 mM Platin(II)-(2,2'-6,2''-terpyridinium)chlorid für 24 Stunden oder 10 mM Uranylchlorid für 8 Tage.
Röntgendatensammlung
Diffraktionsdaten wurden auf einem Bildplattensystem (MAR-Research) gesammelt, unter Verwendung von -monochromatischer Graphit-CuK_σ-Strahlung eines RU200b Rotationsanodengenerators (Rigaku), der bei 50 kV und 100 mA betrieben wurde. Die Reflexionen wurden mit dem Programm MOSFLM 5.50 (Leslie, 1997) integriert und nachfolgend wurden die Daten skaliert und gerundet, um die Strukturfaktoramplituden unter Verwendung von Routinen des CCP4-Programms (Collaborative Computational Project, 1994) zu erhalten.
Strukturbestimmung
Die Struktur wurde mit den Standardverfahren des MIR-Verfahrens gelöst. Aus der großen Anzahl von Durchtränkungen, die mit verschiedenen Schweratomkomponenten durchgeführt wurden, lieferten nur die beiden Verbindungen interpretierbare Patterson-Karten (Patterson maps). Die Schweratompositionen für jedes Derivat wurden aus verschiedenen Patterson-Karten bestimmt und die Ausgangsphasen wurden berechnet. Kreuzphasen-Differenz-Fourier-Karten wurden verwendet, um die Schweratompositionen zu bestätigen und einen gemeinsamen Ursprung für die Derivate festzulegen. Anormaliedaten wurden mit aufgenommen, um zwischen den Enantiomeren zu unterscheiden. Die Schweratomparameter wurden weiterhin verfeinert mit dem Programm MLPHARE des CCP4-Programmpakets, was zu den Statistiken führte, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind. Eine Elektronendichtekarte wurde berechnet bis zu einer Auflösung von 2,1 Å und die Phasen wurden weiter verbessert durch Solvent Flattening und Histogrammabstimmung mit dem Programm DM des CCP4-Programmpakets. Die resultierende Elekronendichtekarte war von ausreichender Qualität, um die meisten der Aminosäurereste aufzubauen. Der Modellaufbau wurde durchgeführt mit O (Jones et al., 1991) auf einer Indigo2-Arbeitsstation (Silicon Graphics Incorporation). Die Strukturverfeinerung wurde mit XPLOR (Brünger et al., 1987) durchgeführt durch schrittweises Erhöhen der Auflösung auf 1,7 Å, unter Verwendung des Parametersatzes von Engh und Huber (Engh & Huber, 1991). Als die Struktur vollständig war nach mehreren Runden Modellaufbau und individueller einschränkender B-Faktorenverfeinerung (R_fac = 29 %/R_frei = 36 %), wurden 150 Wassermoleküle in die Elektronendichte eingebaut, wenn eine Fo-Fc-Karte, konturiert bei 3,5 σ, mit gut definierter Elektronendichte einer 2Fo-Fc-Karte, konturiert bei 1 σ, übereinstimmte. Die resultierende Verfeinerungsstatistik ist in Tabelle 3 gezeigt.
1.10 Strukturbestimmung
Die Kristallstruktur von rekombinantem löslichem humanem FcγRIIb wurde gelöst durch mehrfachen isomorphen Ersatz (MIR) bis 1,7 Å Auflösung, da eine Strukturauflösung durch molekularen Ersatz mit isolierten Domänen des Fc-Fragments von humanem IgG1 (Huber et al., 1976, PDB-Eintrag 1fc1; Deisenhofer, 1981) fehlschlug. Der mutmaßliche extrazelluläre Teil des Rezeptors (Aminosäurereste 1 bis 187, wie in SEQ ID Nr:2 angegeben) wurde für Kristallisationsversuche verwendet (Sondermann et al., 1998B), während das Modell, das die Reste 5 bis 176 als die Termini enthält, flexibel ist und nicht in der Elektronendichte verfolgbar ist. Zusätzlich enthält das Modell 150 Wassermoleküle und die Verfeinerungsstatistiken sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Struktur enthält ein cis-Prolin an Position 11. Keiner der Hauptkettentorsionswinkel ist in nichterlaubten Regionen der Ramachandran-Darstellung lokalisiert. Das vollständig verfeinerte Modell wurde verwendet, um die Struktur des gleichen Proteins in Kristallen der Raumgruppe P4₂2₁2 und der glykosylierten Form, die von Insektenzellen abgeleitet ist in Kristallen der Raumgruppe P3₁21 aufzulösen (Tabelle 2).
Die Polypeptidkette von FcγRIIb faltet sich in zwei Ig-ähnliche Domänen, wie erwartet wird aus ihrer Angliederung an die Immunglobulinsuperfamilie. Jede Domäne besteht aus zwei beta-Blättern, die in einem Sandwich angeordnet sind, wobei die konservierte Disulfidbrücke die Stränge B und F auf den gegenüberliegenden Blättern verbindet (3). Drei anti-parallele β-Stränge (A1, B, E) stehen einem Blatt aus 5 β-Strängen (C', C, F, G, A2) gegenüber, wobei Strang A1 das dreisträngige β-Blatt verlässt und über das viersträngige anti-parallele Blatt kreuzt, wobei der kurze parallele fünfte Strang A2 hinzugefügt wird. Die Anordnung der sekundären Strukturelemente als auch ihre Verbindung ist identisch in beiden Domänen des FcγRIIb und ein steifer Körper, der von einer Domäne auf die andere passt, zeigte einen quadartischen Mittelwert-Abstand (r.m.s.-Abstand) von 1,29 Å von 67 übereinstimmenden Cα-Atomen.
Die Domänen sind nahezu lotrecht zueinander angeordnet, wobei ein Winkel von 70 Grad zwischen ihren langen Achsen eingeschlossen wird, wobei eine herzförmige Gesamtstruktur gebildet wird. Diese Anordnung führt zu einer umfassenden Kontaktregion zwischen den Domänen (4). Reste von Strang A2 und von der Segmentverbindung A2 und A1 der N-terminalen Domäne mischen sich mit Resten der Stränge A1 und B aus der C-terminalen Domäne. Diese Region ist eng gepackt und die Wechselwirkung wird verstärkt durch mehrere Wasserstoffbindungen, was zu einer steifen Anordnung führt. Dies wird bestätigt durch die Konservierung der Struktur in drei verschiedenen Raumgruppen. In orthorhomboedrischen, tetragonalen und hexagonalen (abgeleitet von Insektenzellen) Kristallformen wird eine Abweichung von weniger als 2° des Interdomänenwinkels gefunden.
1.11 Gesamtstrukturen
Die Struktur von rekombinantem humanem FcγRIIb, der von E.coli abgeleitet war, wurde durch MIR aufgelöst, bis zu 1,7 Å -Auflösung von orthorhomboetrischen Kristallen. Eine im Wesentlichen identische Struktur wird gefunden in tetragonalen Kristallen und bei Protein, abgeleitet aus Insektenzellen, in hexagonalen Kristallen. In allen drei Strukturen wurde gefunden, dass die letzten neun Reste der Polypeptidkette nicht geordnet sind. Die Flexibilität der C-terminalen Linkerregion zwischen dem strukturierten Kern des Moleküls und des Transmembranteils kann funktionell relevant sein, um etwas Reorientierung des Rezeptors zu erlauben, um die Erkennung der Fc-Teile in Immunkomplexen zu verbessern.
1.12 Homologe Rezeptoren
Die Ig-Domänen, die bei der Ig-Superfamilie von Proteinen gefunden werden, sind gekennzeichnet durch eine beta-Sandwichstruktur mit einer konservierten Disulfidbrücke, die zwei Stränge gegenüberliegender Blätter verbindet. Die typische Anordnung von 3 und 4 anti-parallelen beta-Strängen, die ein Sandwich bilden, wie in FcγRIIb gefunden, tritt ebenfalls in dem T-Zell-Rezeptor, dem Fc- Fragment, dem CD4- oder dem Fab-Fragment auf. Das strukturelle Alignment der einzelnen Ig-Domänen dieser Moleküle mit den beiden Domänen des FcγRIIb zeigt eine gemeinsame, eng verwandte Struktur. Die relative Anordnung der Domänen ist jedoch nicht in Beziehung mit diesen Molekülen und deckt einen breiten Sektor ab. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit zwischen Ig-Domänen aus verschiedenen Molekülen und der bemerkenswert geringen Abweichung des quadratischen Mittelwerts von Cα-Atomen, die resultiert, wenn die beiden Domänen von FcγRII überlagert werden, wird keine signifikante Sequenzähnlichkeit gefunden (5a und 5b). Ein Sequenz-Alignment auf Strukturbasis zeigt ein konserviertes hydrophobes Muster entlang der Sequenz der Domänen, zusammen mit, neben Cysteinen, nur wenigen identischen Aminosäureresten. Zuerst stellten wir ein Alignment auf Strukturbasis von zwei C-terminalen Domänen der schweren IgG1-Kette und des FcγRIIb her und gaben die Sequenzen der anderen verwandten FcγR- und der FcεRIa-Domänen zu. Dies zeigt, dass die Sequenzen der Drei-Domänen FcγRI- und der Zwei-Domänenrezeptoren kompatibel mit dem Hydrophobizitätsmuster von Ig-Domänen sind und mehrere konservierte Aminosäurereste werden zum Vorschein gebracht. Erstens sind die verschiedenen Domänen eines FcR miteinander verwandter als mit Ig-Domänen aus anderen Molekülen der Ig-Superfamilie. Zum zweiten stehen die N-terminalen Domänen der Rezeptoren wie die die zweiten Domänen in Beziehung zueinander. Zum dritten zeigt die Sequenz der dritten Domäne von FcγRI Merkmale beider Gruppen von Domänen. Zusammengefasst bestätigen wir die Angliederung der FcRs zur Ig-Superfamilie und spekulieren, dass alle FcR-Domänen von einem gemeinsamen Vorgänger abstammen, einem alten Eindomänenrezeptor, der eine zweite Domäne durch Genduplikation erworben hat. Weitere divergente Entwicklung eines solchen Zweidomänenrezeptors führte zu der vorliegenden Diversität, einschließlich FcγRI, das eine dritte Domäne erworben hat.
Konservierung dieser Aminosäurereste, die zu dem Interdomänenkontakt in FcγRIIb beim Alignement beitragen, ist ein Hinweis auf eine ähnliches Domänen- Alignment in verschiedenen Rezeptoren. In Tabelle 4 sind die Reste zusammengefasst, die mit ihren Seitenketten zum Interdomänenkontakt (4) beitragen für FcγRIIb, zusammen mit den entsprechenden Aminosäureresten in anderen Rezeptoren gemäß des Sequenz-Alignments auf Strukturbasis von 5b. Ausgenommen Asn 15, das nicht konserviert ist unter den FcRs, sind die umfassten Reste identisch oder konservativ ersetzt, wobei starke Unterstützung für eine ähnliche Struktur und Domänenanordnungen in allen FcRs bereitgestellt wird.
1.13 Kontaktgrenzfläche zu IgG
Es gibt nur begrenzte Information über die Wechselwirkungen von FcRs mit ihren Liganden aus Mutagensestudien (Hogarth et al., 1992; Hulett et al., 1994; Hulett et al., 1995). Durch systematisches Austauschen von Schleifen zwischen den β-Strängen von FcγRIIa und FcεRIa-Aminosäureresten wurden die B/C-, C'/E- und F/G-Schleifen der C-terminalen Domäne als wichtig für die Ligandenbindung beurteilt (3, 5b). In dem Strukturmodell sind diese Schleifen benachbart und frei zugänglich für den potenziellen Liganden. Zusätzlich wurden die meisten der Aminosäurereste in diesen Schleifen ausgetauscht durch Alanine durch Einstellenmutationen, was zu einer drastischen Veränderung der Affinität von FcγRIIa für dimäres humanes IgG1 führte. Ebenfalls deutet der Einzelaminosäureaustausch von Arg 131 durch His in der C-terminalen Domäne (C'/E-Schleife) in dem hoher Responder/niederer-Responder Polymorphismus, welcher die Affinität des FcγRIIa für Maus-IgG1 verändert, auf diese Region hin. Daher sind die Aminosäurereste in diesem Bereich entweder wichtig für Ligandenbindung oder für die strukturelle Integrität dieser Region. Hier zeigt die Struktur ein Clustern der hydrophoben Aminosäurereste Pro 114, Leu 115 und Val 116 in der Nachbarschaft von Tyr 157. Dieser Abschnitt wird getrennt von der Region Leu 159, Phe 121 und Phe 129 durch die positiv geladenen Aminosäurereste Arg 131 und Lys 117, welche aus der Kernstruktur hervorstehen (5b).
1.14 Glykosylierung
In der Sequenz von FcγRIIb werden drei potenzielle N-Glykosylierungsstellen gefunden. Alle drei Stellen sind auf der Oberfläche des Moleküls und sind zugänglich. Sie sind lokalisiert in den E/F-Schleifen (N61 und N142) beider Domänen und auf Strang E (N 135) der C-terminalen Domäne (3, 6). Da das Material, das für die Lösung dieser Struktur verwendet wird, erhalten wurde aus E. coli, enthält es keine Kohlenhydrate, während die FcRs, die aus Säugerzellen isoliert sind, stark glykosyliert sind. Die drei potenziellen Glykosylierungsstellen sind eher weit entfernt von der mutmaßlichen IgG-Bindungsregion lokalisiert und nicht-glykosylierter FcγRIIb bindet humanes IgG, wodurch eine untergeornete Rolle der Glykosylierung der Bindung nahegelegt wird. Dies wurde bestätigt durch die Struktur des FcγRIIb, der in Insektenzellen erzeugt wird, welcher glykosyliert ist (Sondermann et al., 1998A). Ausgenommen einer 2°-Änderung des Interdomänenwinkels, die möglicherweise aufgrund verschiedener Kristallkontakte besteht, wurden keine Unterschiede zwischen den glykosylierten und unglykosylierten Proteinenstrukturen gefunden. Die drei Glykosylierungsstellen werden nur optional verwendet, wie durch SDS-PAGE gezeigt, worin das Material in vier Banden erscheint. Keine zusätzliche Elektronendichte für diese Zucker wurde als Konsequenz chemischer und struktureller Heterogenität gefunden.
Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)
shFcγRIIa (löslicher humaner FcγRIIa)
Die Verfahren wurden entsprechend Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen die angegebenen Veränderungen:
2.1 Klonieren und Expression
shFcγRIIa wurde erzeugt durch Mutieren der jeweiligen Wildtyp-cDNA (Stengelin et al., 1988) und entsprechend Beispiel 1 exprimiert mit den mutagenen Primern, die in Tabell 5 aufgeführt sind. Zur Expression des Proteins wurde ein pET22b + Vektor ausgewählt.
2.2. Neufaltung und Reinigung
shFcγRIIa wurde neugefaltet gemäß Beispiel 1, mit dem entsprechenden Neufaltungspuffer, der in Tabelle 6 angegeben ist.
2.3 Kristallisation
shFcγRIIa wurde kristallisiert wie unter den in Tabelle 7 angegebenen Bedingungen beschrieben.
2.4 Strukturbestimmung
Die Struktur wurde aufgelöst mit dem Verfahren des isomorphen Ersetzens mit shFcγRIIb als Suchmodel.
Beispiel 3
shFcγRIII (löslicher humaner FcγRIII)
Das Verfahren wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen die angegebenen Veränderungen:
3.1 Klonieren und Expression
sshFcγRIII wurde erzeugt durch Mutieren der entsprechenden Wildtyp-cDNA (Simmons & Seed, 1988) und exprimiert gemäß Beispiel 1 mit den mutagenen Primern, die in Tabelle 5 angegeben sind. Für die Expression des Proteins wurde ein pET22b + Vektor gewählt.
3.2 Neufaltung und Reinigung
shFcγRIII wurde neugefaltet gemäß Beispiel 1, mit dem entsprechenden Neufaltungspuffer, der in Tabelle 6 angegeben ist.
3.3 Kristallisation
shFcγRIII wurde kristallisiert wie unter den in Tabelle 7 angegebenen Bedingungen beschrieben.
3.4 Strukturbestimmung
Die Struktur wurde gelöst mit dem Verfahren des isomorphen Ersetzens mit shFcγRIIb als Suchmodell.
3.5 Kristallisation eines shFcγRIII:hFc1-Komplexes
hIgG1, das abgeleitet war von dem Serum eines Myelompatienten, wurde verwendet, um Fc-Fragmente (hFc1) durch Verdau mit Plasmin (Deisenhofer et al., 1976) herzustellen. Die resultierenden Fc-Fragmente wurden von den Fab-Fragmenten durch Protein A-Chromatographie abgetrennt. Teilweise verdautes hIgG wurde entfernt durch Größenausschlusschromatographie mit MBS (2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 7,0) als Laufpuffer.
Äquimolare Mengen von hFc1 und shFcγRIII wurden gemischt und verdünnt mit MBS auf eine Konzentration von 10 mg/ml. Der Komplex wurde wie beschrieben unter den in Tabell 5 angegebenen Bedingungen kristallisiert.
Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel)
shFcεRII (löslicher humaner FcεRII)
Das Verfahren wurde entsprechend Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen die angegebenen Veränderungen:
4.1 Klonieren und Expression
FcεRII wurde erzeugt durch Mutieren der jeweiligen Wildtyp-cDNA (Kikutani et al., 1986) und exprimiert gemäß Beispiel 2 mit den mutagenen Primern, die in Tabelle 5 angegeben sind. Für die Expression des Proteins wurde ein pET23a + Vektor gewählt.
4.2 Neufaltung und Reinigung
Neufaltung von shFcεRII wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, erreicht, mit der Ausnahme, dass vor der schnellen Verdünnung die gelösten Einschlusskörperchen dialysiert wurden gegen 6M Guanidinchlorid, 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,0. shFcεRII wurde entsprechend Beispiel 1 mit dem entsprechenden Neufaltungspuffer neu gefaltet, der in Tabelle 6 angegeben ist. Nach Neufaltung wurde die Proteinlösung gegen PBS dialysiert, 100-fach konzentriert und gereinigt durch Gelfiltrationschromatographie auf Superdex 75. Der erhaltene reine shFcεRII wurde gegen 2 mM TRIS/HCl, 150 mM NaCl, 0,02 Natriumazid, pH-Wert 8,0, dialysiert, auf 10 mg/ml konzentriert und bei 4 °C aufbewahrt.
Beispiel 5 (Vergleichsbeispiel)
shFcγRI (löslicher humaner FcγRI)
Das Verfahren wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen die angegebenen Veränderungen:
5.1 Klonieren und Expression
shFcγRI wurde erzeugt durch Mutieren der jeweiligen Wildtyp cDNA (Allen & Seed, 1988) und exprimiert gemäß Beispiel 1 mit den mutagenen Primern, die in Tabelle 5 angegeben sind. Zur Expression des Proteins wurde ein pET32a + Vektor ausgewählt, der nach dem N-terminalen Thioredoxin ein Hexahistidin-tag mit einer C-terminalen Thrombin-Spaltungsstelle aufweist, gefolgt durch den shFcγRI im Rahmen mit den genannten Proteinen und Aminosäureresten. Zur Überexpression des Fusionsproteins wurde der E.coli-Stamm BL21 (DE3), der die Plasmide pUBS und pLysS (Novagen) enthält, verwendet.
Die gereinigten Einschlusskörperchen in 6M Guanidin-HCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, solubilisiert und an eine Ni-NTA-Säule (Quiagen) gebunden. Die Elution wurde mit einem Imidazol-Gradienten im Bereich von 0 bis 1 M Imidazol durchgeführt. Das eluierte Protein wurde gegen ein 1000-faches Volumen von 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 2 mM GSH, 0,5 mM GSSG für 24 Stunden bei 4 °C dialysiert. Nach Konzentrieren der Proteinlösung auf 25 % des Anfangsvolumens wurde Thrombin zugegeben. Nach 6 h Inkubation bei 37 °C wurden das N-terminale Thioredoxin und das His-tag vollständig entfernt, wie durch N-terminales Sequenzieren verifiziert. Während dieses Verdaus präzipitierte der shFcγRI quantitativ aus der Lösung.
5.2 Neufaltung und Reinigung
shFcγRI wurde gemäß Beispiel 1 neugefaltet mit dem entsprechenden Neufaltungspuffer, der in Tabelle 6 angegeben ist. Nach dem das Redox-Potenzial auf 1 mM abnahm, wurde die Lösung gegen PBS, pH-Wert 8,0, dialysiert und konzentriert.
Das neugefaltete Protein wurde durch Größenausschlusschromatographie analysiert, was ein Signal des vorgeschlagenen monomeren Rezeptors ergab, und nicht reduzierendes SDS-PAGE, das eine Hauptbande bei 30 kDa zeigte.
Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)
shFcεRIa (löslicher humaner FcεRIa)
Das Verfahren wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen die angegebenen Veränderungen:
6.1 Klonieren und Expression
shFcεRI wurde erzeugt durch Mutieren der jeweiligen Wildtyp-cDNA (Kochan et al., 1988) und exprimiert gemäß Beispiel 1, mit den in Tabelle 5 angegebenen mutagenen Primern. Zur Expression des Proteins wurde ein pET23a + Vektor gewählt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: 15 % Reduzierendes SDS-PAGE, das die Reinigung von FcγRIb zeigt Bahn 1: Molekulargewichtsmarker. Bahn 2: E.coli-Lysat vor Induktion. Bande 3: E.coli-Lysat 1 h nach Induktion. Bande 4: E.coli-Lysat 4 h nach Induktion. Bande 5: gereinigte Einschlusskörperchen von sFcγRIIb. Bande 6: Eluat der hIgG-Affinitätssäule. Bande 7: Gepoolte Fraktionen der Gelfiltrationssäule.
2: Gleichgewichtsgelfiltration
1 μg hFc, gelöst in 10 μl Äquilibrationspuffer (10 μg sFcγRIIb/ml PBS) wurde aufgebracht auf eine Größenausschlußchromatographiesäule und die Absorption des Ausflusses wurde gemessen als eine Funktion der Zeit (280 nm). Das injizierte Fc-Fragment bildete einen Komplex mit dem FcγRIIb in dem Gleichgewichtspuffer (t = 22 min). Das negative Signal von verbrauchtem sFcγRIIb wird bei t = 26 min beobachtet.
3: Gesamtstruktur von humanen sFcγRIIb
Stereobahndarstellung der sFcγRIIb-Struktur. Die Schleifen, von welchen angenommen wird, dass sie wichtig für IgG-Bindung sind, sind in rot angegeben, mit einigen der Resten innerhalb der Bindungsstelle und der konservierten Disulfidbrücke in einer Kugel-Stab-Darstellung. Die potenziellen N-Glykosylierungsstellen sind als grüne Kugeln gezeigt. Die Termini sind markiert und die β-Stränge sind fortlaufend nummeriert für die N-terminale Domäne in schwarz und für die C-terminate Domäne in blau. Die Figur wurde entwickelt unter Verwendung der Programme MOLSCRIP (Kraulis, 1991) und RENDER (Merritt und Murphy, 1994).
4: Interdomänenkontakte
Die Figur zeigt eine Nahaufnahme der Reste, die bei den Interdomänenkontakten von sFcγRIIb beteiligt sind. Die Aminosäurereste der N-terminalen Domäe sind blau dargestellt und die der C-terminalen Domäne gelb. Das Modell ist überlagert durch eine 2Fo-Fc-Elektronendichte, konturiert bei 1 σ, erhalten aus den Endkoordinaten. Wasserstoffbrücken zwischen den Domänen sind als weiße Linien dargestellt. Die Figur wurde entwickelt unter Verwendung des Programms MAIN (Turk, 1992).
5a: Überlagerung der beiden FcγRIIb-Domänen und der CH2-Domäne von humanem IgG1
Beide Domänen von FcγRIIb und die CH2-Domäne von hIgG1 wurden überlagert. Die N-terminale Domäne ist in blau angegeben, die C-terminale in rot und die CH2-Domäne von hIgG1 in grün. Die jeweiligen Termini sind markiert und die konservierten Disulfidbrücken sind als dünne Linien gezeigt.
5b: Strukturbasierte Sequenz-Alignment der sFcγRIIb-Domänen mit Domänen anderer Mitglieder der FcR-Familie
Der obere Teil der Figur zeigt die Struktur-basierende Sequenzalignment der FcγRIIb und hIgG1-Fc-Fragment-Domänen, realisiert mit dem Programm GBF-3D-FIT (Lessel & Schomburg, 1994). Die Aminosäurereste mit einem Cα-Abstand von weniger als 2,0 Å in den überlagerten Domänen sind maskiert: lila für übereinstimmende Reste zwischen den Fc-Fragmentdomänen; gelb für Reste in den FcγRIIb-Domänen, grün wenn sie in allen vier Domänen überlagert werden können. Die β-Stränge sind gezeigt unter diesem Teil der Alignment und sind übereinstimmend mit 3 markiert.
Der untere Teil der Figur zeigt das Alignment der Aminosäuresequenzen der anderen FcγRs und des homologen FcεRIa gegenüber dem Profil, das in dem oberen Teil der Figur angegeben ist, unter Verwendung von Routinen aus der GCG-Packung (Genetics Computer Group, 1994). Die obere und untere Reihe der Nummerierung betrifft die N- und C-terminalen Domänen des FcγRIIb. Die konservierten Cysteine sind in Fuchsin angegeben und die potenziellen Glykosylierungsstellen in blau. Identische Reste innerhalb der ersten Domäne sind orange markiert, diejenigen in der zweiten Domäne rosa und grün, wenn die Reste innerhalb beider Domänen konserviert sind. Die weniger konservierte dritte Domäne von FcγRI ist angeordnet zwischen den ersten und den zweiten Domänen. Rote Pfeile zeigen auf die Reste, die beteiligt sind an Seitenkettenkontakten zwischen der ersten und der zweiten Domäne, während blaue Pfeile Reste zeigen, die relevant für IgG-Bindung sind. Die Figur wurde mit dem Programm ALSCRIPT (Barton, 1993) erzeugt.
6: Die mutmaßlichen Bindungsstellen von FcγRIIb
Festoberflächendarstellung von FcγRIIb, gemäß Erzeugung durch GRASP (Nicholls et al., 1991), wobei die Farbcodierung gemäß dem relativen Oberflächenpotenzial von negativ (rot) zu positiv (blau) ist. 6a zeigt das Molekül wie in 3 durch eine Rotation von etwa 90° im Gegenuhrzeigersinn um die Vertikale. In 6b wird das Molekül um 90° im Uhrzeigersinn um die gleiche Achse rotiert. Beide Ansichten zeigen die mutmaßlichen Bindungsregionen auf der C-terminalen (6a) und N-terminalen Domäne (6b). Die Aminosäurereste, die zuvor diskutiert wurden, sind markiert.
7: Cα-Spur der überlagerten Strukturen der Fcγ-Rezeptoren
FcγRIII rot, FcγRIIa grün und FcγRIIb blau. Reste, die wichtig für die IgG-Bindung sind, sind als Kugel-und-Stab gezeigt. Die N- und C-Termini sind markiert.
8: Übersicht über die FcγFIII/Fc-Fragmentkristallstruktur in einer Banddarstellung
Die Zuckerreste, die an das Fc-Fragment gebunden sind, sind im Kugel-und-Stab-Modell dargestellt. Der FcγRIII (blau) bindet in der unteren Gelenkregion (hinge region) zwischen der Kette-B (rot) und Kette-A (grün) des Fc-Fragments.
9: Nahaufnahme der Bindungsregion des FcγRIII und des Fc-Fragments
Das Farbschema ist in Übereinstimmung mit 8 und Reste, die wichtig für Komplexbildung sind, sind in einem Kugel-und-Stab-Modell gezeigt.
10a:
Im oberen Teil der 10a wird ein Sequenz-Alignment der Fc-Rezeptor-ecto-Domänen auf Strukturbasis gezeigt. Konservierte Reste sind gelb schattiert und identische Reste orange. Der untere Teil der Figur zeigt einen Teil der Alignment der humanen Antikörpersequenzen. Reste der humanen FcγRIII, die in Kontakt mit dem Fc-Fragment in der komplexen Kristallstruktur sind, sind durch Linien verbunden (schwarz für hydrophobe Wechselwirkung, rot für Salzbrücken und blau für Wasserstoffbrücken). Reste des Fc-Rezeptors in Kontakt mit der A-Kette des Fc-Fragments sind mit gestrichelten Linien verbunden und diejenigen, die in Kontakt mit der B-Kette des Fc-Fragments sind, mit durchgehenden Linien.
Rote, blaue und schwarze Linien bedeuten geladene, polare bzw. andere Kontakte.
10b:
Im oberen Teil von 10b ist eine Alignment auf Strukturbasis der Fc-Rezeptor-ecto-Domänen gezeigt. Konservierte Reste sind gelb schattiert und identische Reste orange. Konservierte Reste mit den weniger verwandten Kir- und FcA-Rezeptor-Sequenzen sind blau schattiert. Der untere Teil der Figur zeigt einen Teil des Alignments humaner Antikörper mit der Maus-IgE (mIgE)-Sequenz. Reste des humanen FcγRIII in Kontakt mit dem Fc-Fragment in der komplexen Kristallstruktur sind durch Linien verbunden (schwarz für hydrophobe Wechselwirkung, rot für Salzbrücken und blau für Wasserstoffbindungen). Reste des Fc-Rezeptors, die in Kontakt mit der A-Kette des Fc-Fragments sind, sind durch gestrichelte Linien verbunden und diejenigen, die in Kontakt mit der B-Kette des Fc-Fragments sind, mit durchgehenden Linien. Rote, blaue und schwarze Linien bedeuten geladene, polare bzw. andere Kontakte.
11 und 12:
11 und 12 zeigen ein Algnment der gebildeten sFcγR, sFcεRIa und der Kurzform von sFcεRII und die produzierten sFcγR bzw. sFcεRIa, ohne sFcεRII. Tabelle 1:
Tabelle 2:
Tabelle 3:

R_frei:: 5 % der Reflexionen wurden als ein Referenzdatensatz verwendet und waren nicht in der Verfeinerung enthalten.

Tabelle 4:
Tabelle 5: Primer, die zur Amplifikation von FcRs verwendet werden
Eingebaute Restriktionsstellen sind unterstrichen, Start- und Stoppcodons sind in Fettdruck dargestellt.
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Homogenes Präparat aus rekombinantem, löslichem FcγRIIb oder FcγRIII, wobei der Rezeptor durch das Fehlen einer Transmembrandomäne, eines Signalpeptids und einer Glykosylierung gekennzeichnet ist, wobei das Präparat durch Expression einer einen solchen Rezeptor codierenden Nukleinsäure in Prokaryonten unter Bedingungen, die zur Bildung von unlöslichen Einschlusskörperchen führen, und Renaturierung der Rezeptormoleküle aus den Einschlusskörperchen erhältlich ist.
Homogenes Präparat nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor eine der in SEQ ID Nr. 3 und 4 gezeigten Aminosäuresequenzen enthält.
Homogenes Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rezeptor menschlichen Ursprungs ist.
Verfahren zur Herstellung eines homogenen Präparats aus einem rekombinanten, löslichen Fc-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine einen löslichen FcγRIIb- oder FcγRIII-Rezeptor codierende Nukleinsäure in Prokaryonten unter Bedingungen, welche die Bildung von Einschlusskörperchen begünstigen, exprimiert wird, die Einschlusskörperchen abgetrennt werden und der rekombinante, lösliche Fc-Rezeptor renaturiert wird, um ein homogenes Präparat davon bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Prokaryonten E. coli sind.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei eine Nukleinsäure verwendet wird, die eine der in SEQ ID Nr. 9 und 10 gezeigten Sequenzen enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei eine Nukleinsäure verwendet wird, die zusätzlich Expressionskontrollsequenzen enthält, welche in operativer Verknüpfung mit der den rekombinanten Fc-Rezeptor codierenden Sequenz vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Nukleinsäure in einem prokaryontischen Expressionsvektor, vorzugsweise einem pET-Vektor, enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein homogenes Präparat eines rekombinanten, löslichen FcγRIIb- oder FcγRIII-Rezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Autoimmunkrankheiten, Allergien oder Tumorerkrankungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS, rheumatoider Arthritis oder multiplem Myelom.