CN111183150B - Fcγ受体突变体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及包含Fcγ受体突变体的多肽。通过用不同的氨基酸序列置换Fcγ受体的部分氨基酸序列来优化本公开的Fcγ受体突变体，以便具有对免疫球蛋白优异的选择性结合能力，从而有效地用于延长药物的体内半衰期、检测和纯化免疫球蛋白、并抑制器官移植排斥或预防或治疗自身免疫性疾病的用途。

Description

Fcγ受体突变体
技术领域
本公开涉及与IgG抗体的结合能力提高的Fcγ受体突变体。
背景技术
在人免疫细胞中表达的Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa)与IgG抗体的Fc区域(下部铰链区域和上部CH2区域)结合。在这些Fcγ受体中，在血液中FcγRI对IgG的亲和力最高。但是，由于非常差的热稳定性和低表达水平，在医学或工业应用中存在困难。
同时，FcγRIIa是在各种免疫细胞，例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等的表面表达的跨膜蛋白。它是针对IgG的亲和力相对较低(KD＝约10-6)的受体。FcγRIIa与IgG抗体的Fc区域(下部铰链区域和上部CH2区域)结合，并通过细胞内信号传导机制激活免疫细胞。
如果可以制备和应用存在于细胞外区域并且针对IgG的亲和力比野生型Fcγ受体高得多的可溶性Fc-γ受体，则可以有效抑制将自体细胞识别为抗原的自身抗体与免疫细胞表面的Fcγ受体的结合。这可以明确地用于治疗自身免疫性疾病，该疾病是其中自身抗体在器官中积聚且自体细胞被识别为外源抗原，从而导致炎症的病症。
通常，除抗体外，大多数蛋白药物的体内保留时间短，血清半衰期不超过24小时。抗体IgG通过胞饮作用随机进入细胞，然后释放到中性pH的血流中，而不会通过与FcRn结合而在弱酸性pH的内体中降解。因此，其在体内保留约3周。Fcγ受体与抗体IgG结合的过程可用于开发延长蛋白药物的血清半衰期的融合伴侣。
对针对靶疾病表现出高特异性且几乎无副作用的蛋白药物的需求正在稳步增长，与之一致的，在世界范围内正在积极开展改善蛋白药物的功效和稳定性的研究。特别是，由于蛋白药物的血清半衰期在蛋白的作用机理、副作用程度、治疗功效、生产成本、施用次数等方面起着至关重要的作用，因此世界领先的制药公司和蛋白工程研究组积正在积极开展延长蛋白药物半衰期的研究。
作为代表性实例，将靶蛋白用PEG(聚乙二醇)聚合物修饰，或将靶蛋白与抗体Fc或白蛋白融合以延长血清半衰期。
如果将生物相容性聚合物例如PEG缀合于靶蛋白的特异性位点或非特异性结合到几个位点，则可以减少由于蛋白酶的降解。另外，由于分子量增加，肾脏的排泄可能减少，血液保留时间可能延长。由于Enzon在1990年开发的PEG修饰的腺嘌呤脱氨酶获得了USFDA的批准并投放市场，因此可商购获得10多种产品并将其用于临床。罗氏公司用PEG聚合物修饰干扰素-α(PEG化)以用作丙型肝炎的治疗剂，并将其以品牌名称Pegasys商业化。安进公司用20kDa PEG修饰了被开发用于治疗白细胞减少的非格司亭(Neupogen)的N端，以用于商业化的持续治疗形式Neulasta。但是，当大量注射蛋白时，PEG部分会从体内缓慢清除。另外，据报道长期注射高分子量PEG可能引起副作用。血清稳定性与PEG的分子量密切相关。分子量为40000Da或高于40000Da的PEG不易制备，并且众所周知的是，随着分子量的增加，由于与蛋白的反应性低，产率降低，并且蛋白本身的滴度也迅速降低。另外，因为PEG聚合物是具有各种分子量分布的聚合物的混合物，所以与PEG缀合的蛋白治疗剂是异质的，并且在生产和质量控制上造成困难。因此，迫切需要开发新的蛋白工程技术以延长蛋白药物的血清半衰期，该技术以用例如PEG的聚合物进行形式修饰为特征。
正在研究和开发与抗体Fc融合的各种Fc融合蛋白药物，以改善具有药理作用的蛋白药物的血清半衰期。治疗性蛋白与人抗体的Fc区域的融合使得可以通过与FcRn受体结合来利用细胞回收机制。1998年开发了将干扰素-α和Fc片段用肽接头连接的技术，2003年开发了通过将人红细胞生成素和Fc用肽接头连接而获得的融合蛋白。作为一个代表性的实例，依那西普是TNF-α的抑制剂，TNF-α是引起关节炎的主要细胞因子。它是通过将细胞外存在的部分TNF-α受体与免疫球蛋白的Fc片段融合而获得的蛋白药物。目前，包括依那西普在内的十种Fc融合蛋白已获得USFDA批准并用于临床。然而，由于Fc的固有免疫细胞激活功能，与Fc片段融合的蛋白治疗剂具有细胞毒性问题，并且不利的是，由于受体介导的清除，半衰期没有显著延长。另外，由于它们应该与作为同型二聚体存在的Fc片段融合，因此存在靶蛋白的药理活性改变的问题。
还正在研究一种使用存在于人血清中的白蛋白而不是Fc片段作为融合伴侣来延长蛋白治疗剂的血清半衰期的方法。人类基因组科学采用了白蛋白融合技术正在临床开发与白蛋白融合的包括人生长激素、干扰素等的蛋白药物。由于白蛋白是具有大分子量(66.5kDa)的大蛋白，因此所得的融合蛋白可能会抑制靶蛋白的活性。
期望将使用FcγR突变体的技术应用于各种蛋白治疗剂和候选蛋白质，以大大延长血清半衰期。另外，具有药理作用但由于体内半衰期短和停留时间短而在临床应用中受到限制的许多肽类药物可与FcγR突变体融合以大大延长血清半衰期。因此，预期该药物将长时间在靶组织上发挥功效，从而显著降低施用剂量和频率、降低新药开发的成本以及大大提高新药物开发的可行性。
自身免疫性疾病是指人体产生的抗体识别自体细胞并且免疫细胞通过免疫反应攻击自体细胞的疾病。免疫细胞具有可与抗体结合的FcγR。与抗体的结合导致免疫应答，例如ADCC或ADCP。因此，结合到识别自体细胞的抗体并阻断已识别的自体细胞与免疫细胞结合的可溶性FcγRIIa可有利地开发为用于自身免疫性疾病的治疗剂。为此目的，使用具有低IgG亲和力的野生型可溶性FcγRIIb抑制自身免疫性疾病的药物正处于II期临床试验中(Sondermann等人，Curr Opin Immunol，2016)。
在背景技术部分中给出的以上描述仅用于改善对本公开的背景的理解，并且不应被解释为承认其对应于本领域普通技术人员先前已知的现有技术。
公开
技术问题
本公开的发明人努力寻找了能够延长许多肽类药物的血清半衰期的Fcγ受体突变体，该多肽类药物由于其体内半衰期短且体内停留时间短而不能应用于临床。结果，他们发现了通过将部分氨基酸序列置换为不同的氨基酸序列进行优化，与野生型相比，可以显著提高Fcγ受体的IgG结合能力，并完成了本公开。
本公开涉及提供包含Fcγ受体突变体的多肽。
本公开还涉及提供编码多肽的核酸分子。
本公开还涉及提供含有核酸分子的载体。
本公开还涉及提供含有载体的宿主细胞。
本公开还涉及提供含有多肽、核酸分子或载体的组合物。
本公开还涉及提供含有多肽或核酸分子的组合物。
本公开还涉及提供用于检测含有IgG抗体的多肽或IgG抗体的Fc区域的试剂盒。
本公开还涉及提供融合蛋白或肽，其中多肽与生理活性蛋白或生理活性肽融合。
本公开还涉及提供用于制备包含Fcγ受体突变体的多肽的方法。
本公开还涉及提供用于鉴定样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的存在的方法。
本公开还涉及提供用于纯化样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的方法。
本公开还涉及提供用于筛选具有与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的人Fcγ受体突变体的方法。
根据以下详细描述、权利要求和附图，本公开的其他目的和优点将是明显的。
技术方案
在本公开的一个方面，本公开提供了包含Fcγ受体突变体的多肽。
本公开的发明人努力寻找了能够延长许多肽类药物的血清半衰期的Fcγ受体突变体，该肽类药物由于其体内半衰期短且体内停留时间短而不能应用于临床。结果，他们发现了通过将部分氨基酸序列置换为不同的氨基酸序列进行优化，与野生型相比，可以显著提高Fcγ受体的IgG结合能力。
在本说明书中，术语“Fcγ受体突变体”指与野生型Fcγ受体不同的Fcγ受体的多肽。不同之处可能包括与免疫球蛋白的结合能力、治疗潜力、氨基酸组成、溶解度等方面的差异。具体而言，它是指来自由天然或合成氨基酸构成的Fcγ受体的一个或多于一个氨基酸序列中发生的变化，使得该Fcγ受体能够结合到免疫球蛋白或其Fc区域(Fc区域)，并且该变化包括氨基酸的置换、缺失或插入。
免疫球蛋白可以是IgG、IgE、IgA、IgM或IgD中的任一种。具体而言，其是IgG。免疫球蛋白可以衍生自任何动物，包括人、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、鸡、鸵鸟和骆驼。具体而言，它衍生自人。
根据本公开的具体示例性实施方案，当与野生型Fcγ受体相比时，本公开的Fcγ受体突变体具有改善的特征。
在本说明书中，术语“改善的特征”指当与野生型Fcγ受体相比时的期望的特征。该特征可包括提高或增强的与免疫球蛋白或Fc区域的结合能力，通过结合到免疫球蛋白的Fc区域来调节或抑制免疫功能，延长血清中用作治疗剂的多肽或蛋白质的半衰期，或允许检测靶标多肽或蛋白质(例如免疫球蛋白)或提高检测准确性。
在本说明书中，术语“与免疫球蛋白的结合能力的变化”指本公开的Fcγ受体突变体与免疫球蛋白的结合活性与野生型Fcγ受体与免疫球蛋白的结合活性不同。它可以指免疫球蛋白与受体之间的结合能力的变化，即与野生型Fcγ受体与免疫复合物、聚集体、二聚体或单体免疫球蛋白的结合能力相比，受体与免疫复合物、聚集体、二聚体或单体免疫球蛋白的结合能力的变化。
在本说明书中，术语“影响与免疫球蛋白结合能力的一种或多于一种氨基酸的变化”指与野生型Fcγ受体和免疫球蛋白之间的结合相关联的Fcγ受体的氨基酸区域或氨基酸区域的区域中的变化。变化可能是由置换、缺失或插入引起的。
根据本公开的示例性实施方案，当与野生型Fcγ受体相比时，本公开的Fcγ受体突变体与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高。当与野生型Fcγ受体相比时，Fcγ受体突变体的结合能力可以提高10％或大于10％、20％或大于20％、30％或大于30％、40％或大于40％、50％或大于50％、60％或大于60％、70％或大于70％、80％或大于80％或90％或大于90％，或当与野生型Fcγ受体相比时，Fcγ受体突变体的结合能力可以提高2倍或大于2倍、3倍或大于3倍、4倍或大于4倍、5倍或大于5倍、6倍或大于6倍、7倍或大于7倍、8倍或大于8倍、9倍或大于9倍、10倍或大于10倍、20倍或大于20倍或30倍或大于30倍(实施例2、8、10、11、13、15-17和19)。
根据本公开的具体示例性实施方案，与野生型Fcγ受体相比，该突变体与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高3倍或大于3倍。
根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的Fc受体的形式为分离形式，这意味着除去了其他蛋白和/或非蛋白分子。
当基于重量、活性、氨基酸相似性、与抗体或其他现有工具的反应性测量时，与非Fc受体分子相比，分离的形式的纯度可以为至少40％或大于40％，具体地为60％或大于60％，更具体地为75％或大于75％，更具体地为85％或大于85％。
本公开的包含Fc受体的多肽可以结合到细胞膜或支持工具，或者可以为可溶形式。为了用作药物组合物，多肽可以特异性地为可溶形式。
多肽可以用在适当条件下产生可检测信号的报告分子标记。报告分子可以是放射性核苷酸、化学发光分子、生物发光分子、荧光分子或酶。常用的酶可能包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等。
具体地，本公开的Fc受体突变体包括天然或人工突变体、野生型Fc受体的氨基酸的变体或衍生物。突变体、变体或衍生物所基于的野生型Fc受体可以衍生自人或动物物种。具体而言，动物物种可以是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、骆驼、山羊等。
用于制备本公开的Fc受体突变体的氨基酸变化，即缺失、插入或置换，是通过现有手段实现的。当Fc受体突变体衍生自重组体时，编码该分子的核酸可以是其中充分引入或缺失了与一种或多于一种氨基酸的插入或置换相关联的密码子的核酸。当通过重新肽合成而合成受体分子时，可以引入所需的氨基酸序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，该突变体可以是其中SEQ ID NO 43或SEQ IDNO 49的野生型Fcγ受体的序列的第117位氨基酸和第159位氨基酸被改变的突变体。
根据本公开的具体示例性实施方案，该突变体是其中SEQ ID NO 43或SEQ ID NO49的野生型Fcγ受体的序列的第117位氨基酸、第119位氨基酸和第159位氨基酸被改变，并且另外地，选自第86位氨基酸、第127位氨基酸和第171位氨基酸的一个或多于一个氨基酸被改变的突变体。
根据本公开的具体示例性实施方案，该突变体是Fcγ受体突变体，该Fcγ受体突变体包含其中SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换而第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，该突变体是其中除置换了SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸和第159位氨基酸之外，还置换了选自第55位氨基酸、第86位氨基酸、第119位氨基酸、第127位氨基酸和第171位氨基酸的一个或多于一个氨基酸的突变体。
根据本公开的具体示例性实施方案，该突变体是Fc-γ受体突变体，该Fc-γ受体突变体包含其中SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第86位氨基酸被天冬氨酸(D)置换、第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换、第119位氨基酸被蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)置换、第127位氨基酸被亮氨酸(L)置换、第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换、且第171位氨基酸被谷氨酸(E)置换的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，除了SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸和第159位氨基酸被置换之外，该突变体还包含一个或多于一个选自以下的氨基酸置换：用组氨酸(H)置换第55位氨基酸、用天冬氨酸(D)置换第86位氨基酸、用蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)置换第119位氨基酸、用亮氨酸(L)置换第127位氨基酸和用谷氨酸(E)置换第171位氨基酸。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 44的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 45的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 46的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 47的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 48的序列。
根据本公开的具体示例性实施方案，突变体包含SEQ ID NO 50的序列。
本公开的Fcγ受体突变体包括Fcγ受体的各种突变体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)。具体而言，其可以是FcγIIa受体突变体或FcγIIb受体突变体。
在本公开的另一方面，本公开提供了编码多肽的核酸分子、包含核酸分子的载体或包含载体的宿主细胞。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于制备含有Fcγ受体突变体的多肽的方法，其包括：
a)培养包含载体的宿主细胞的步骤，所述载体包含编码多肽的核酸分子；和
b)回收由宿主细胞表达的多肽的步骤。
本公开的核酸分子可以是分离的或重组的，并且不仅可以包括单链或双链DNA或RNA，还可以包括与其互补的序列。当从天然来源分离核酸时，“分离的核酸”可以是从个体的分离的基因组的基因序列分离的核酸。从模板例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸酶促合成或化学合成的核酸也可以理解为分离的核酸分子。分离的核酸分子是作为片段或较大核酸构建体的组成部分的核酸分子。当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果多肽在分泌前被表达为前蛋白，则将用于前序列或分泌型前导序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA，如果启动子或增强子影响多肽序列的转录，则将该启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”指被连接的DNA序列是邻近的，并且对于分泌型前导序列而言是邻近的并且存在于同一阅读框中。但是，增强子不必是邻近的。通过在方便的限制性酶切位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在本说明书中，术语“载体”指能够插入核酸序列以将核酸序列引入可以复制它的细胞中的载体。核酸序列可以是外源的或异源的。载体可以是质粒、黏粒或病毒(例如噬菌体)，尽管不限于此。本领域技术人员可以根据标准重组技术构建载体(Maniatis,等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1988；Ausubel等人,In:Current Protocols in Molecular Biology,John,Wiley&Sons,Inc,NY,1994；等)。
在本说明书中，术语“表达载体”指含有编码至少部分转录的基因产物的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白、多肽或肽。表达载体可以包含各种调控序列。载体或表达载体可以包含控制转录和翻译的调控序列和提供不同功能的其他核酸序列。
在本说明书中，术语“宿主细胞”包括真核细胞和原核细胞，并且指可以复制载体或可以表达由载体编码的基因的任何生物体的可转化细胞。宿主细胞可以被载体转染或转化，这指将外源核酸分子转移或引入宿主细胞的过程。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于鉴定样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的存在的方法，其包括：
a)制备用于鉴定IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的存在的样品的步骤；
b)通过将上述多肽与样品混合在一起而使它们结合的步骤；和
c)鉴定结合了多肽的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的存在的步骤。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于纯化样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的方法，其包括：
a)通过将上述多肽与包含IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的样品混合在一起而将它们结合的步骤；和
b)纯化结合了多肽的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的步骤。
如上所述，由于与野生型Fcγ受体相比，本公开的Fcγ受体突变体与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高，因此可以有效地用于鉴定IgG抗体或IgG抗体Fc区域的存在、对其进行检测或纯化。
可以通过几种已知技术中的任一种进行多肽的分离和纯化。实例包括离子交换色谱、凝胶渗透色谱、亲和色谱、高效液相色谱(HPLC)、反相高效液相色谱和制备型圆盘凝胶电泳，但不限于此。多肽分离和纯化技术可能需要根据常规方法对多肽进行修饰。例如，可以在镍柱纯化过程中将组氨酸标签添加到蛋白中。其他修饰可能诱导更高或更低的活性，允许产生更多的蛋白或简单地纯化蛋白。其他标签可以包括FLAG标签。具体而言，该标签用于真核宿主。
纯化多肽的方法包括基于溶解度变化纯化蛋白质的硫酸铵沉淀法。该方法比常规技术例如盐析更具特异性。通常使用硫酸铵，因为它具有高溶解度并且可以使盐溶液具有高离子强度。多肽的溶解度根据溶液的离子强度而变化，因此根据盐浓度而变化。
由于多肽在高离子强度下的溶解度明显不同，因此盐析是非常有助于纯化特定多肽的有用的方法。具体而言，通过添加离液序列低(kosmotropic)的硫酸铵，不仅沉淀了折叠副产物例如未折叠和错误折叠的物质，而且沉淀了宿主细胞衍生的杂质例如细胞壁组分和多肽。因为沉淀效率随着沉淀剂浓度的增加而增加，所以可以获得高纯度的Fc受体突变体产物，而Fc受体突变体在如此高的硫酸铵浓度下不沉淀。
通过离心除去沉淀的多肽，从而增加沉淀的目标多肽的浓度，同时将多肽副产物保留在溶液中。然后，通过离心回收沉淀的目标多肽并将其溶解在新鲜缓冲液中进行纯化。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于筛选针对IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的方法，其包括：
a)建立Fcγ受体突变体库的步骤，该库包含其中SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换而第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换的序列；和
b)从库中筛选当与仅包含两个氨基酸序列的置换的Fcγ受体突变体相比时，具有与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的步骤。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于筛选对IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的方法，其包括：
a)建立Fcγ受体突变体库的步骤，该库包含SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换而第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换，还包含选自第86位氨基酸、第127位氨基酸和第171位氨基酸的一个或多于一个氨基酸的置换的序列；和
b)从库中筛选当与仅包含第117位和第159位氨基酸的两个氨基酸序列的置换的Fcγ受体突变体相比时，具有与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的步骤。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于筛选对IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的方法，其包括：
a)建立Fcγ受体突变体库的步骤，该库包含SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第55位氨基酸被组氨酸(H)置换，第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换，第119位氨基酸被缬氨酸(V)置换，第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换，且第171位氨基酸被谷氨酸(E)置换的序列；和
b)从库中筛选当与仅包含第55位、第117位、第119位、第159位和第171位氨基酸的五个氨基酸序列的置换的Fcγ受体突变体相比时，具有与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体的步骤。
本公开的筛选方法可用于筛选当与Fcγ受体突变体相比时，与IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的结合能力提高的Fcγ受体突变体。
根据本公开的筛选方法筛选的突变体还可以包括以下氨基酸变化：选自SEQ IDNO 43或SEQ ID NO 49的第55位氨基酸、第86位氨基酸、第119位氨基酸、第127位氨基酸和第171位氨基酸的一个或多于一个氨基酸的置换。
根据本公开的具体示例性实施方案，还可以存在一个或多于一个选自以下的氨基酸置换：用组氨酸(H)置换第55位氨基酸、用天冬氨酸(D)置换第86位氨基酸、用蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)置换第119位氨基酸、用亮氨酸(L)置换第127位氨基酸和用谷氨酸(E)置换第171位氨基酸。
根据本公开的示例性实施方案，通过上述筛选方法筛选与IgG抗体或IgG抗体的Fc区的结合能力提高的Fcγ受体突变体(实施例7和8)。
在本公开的筛选方法中，可以使用荧光激活细胞分选(FACS)或其他自动流式细胞术技术。流式细胞术的仪器是本领域技术人员已知的。这些仪器的实例包括FACSAria、FACSStar Plus、FACScan和FACSort(加利福尼亚州福斯特城的Becton Dickinson)、Epics C(佛罗里达州海厄利亚的Coulter Epics分部)、MOFLO(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的Cytomation)和MOFLO-XDP(印第安纳州印第安纳波利斯的Beckman Coulter)。通常，流式细胞术技术包括液体样品中细胞和其他颗粒的分离。通常，流式细胞术的目的是分析分离的颗粒的一种或多于一种特征(例如，标记的配体或其他分子的存在)。当颗粒逐个通过传感器时，根据尺寸、折射、光散射、不透明度、粗糙度、形状、荧光等对颗粒进行分类。
在本公开的另一方面，本公开提供了包含上述多肽、核酸分子或载体的组合物。
根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的组合物用于检测样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域。
在本说明书中，术语“样品”指可能包含IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的物质。样品可以是从对象天然或人工分离的排泄物、细胞、血液、血浆、血清、毛发、尿液等。
本说明书中使用的术语“对象”包括哺乳动物，其包括例如人和黑猩猩的灵长类动物，例如狗、猫等的宠物，例如牛、马、绵羊、山羊等的家畜，以及例如小鼠、大鼠等的啮齿动物。
另外，组合物可以包含在试剂盒中，该试剂盒可用于检测样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域、定量对象体内IgG抗体的量、或测量或检测患者的免疫相关疾病(例如，由免疫超敏反应、自身免疫性疾病或器官移植引起的免疫学变化)。
在本公开的另一方面，本公开提供了融合蛋白或肽，其中多肽与生理活性蛋白或生理活性肽结合。
根据本公开的融合蛋白或肽的体内半衰期延长，这是因为生理活性蛋白或生理活性肽与Fcγ受体突变体结合，因此可以在体内保留更长的时间。
在本说明书中，术语“融合蛋白(融合多肽)”可以指具有新的分子结构的融合蛋白，其中一种或多于一种具有生理活性的蛋白结合到Fcγ受体突变体的N端或C端。并且，“融合肽”指具有新的分子结构的融合肽，其中一种或多于一种具有生理活性的低分子量肽结合到Fcγ受体突变体的N端或C端。
生理活性蛋白或生理活性肽可以直接或通过氨基酸构成的接头与Fcγ受体突变体结合。
具体地，可以使用已知的基因重组技术将生理活性蛋白或生理活性肽结合到Fcγ受体突变体。可以使用已知的交联剂将其结合到Fcγ受体突变体的N端、C端或自由基。
生理活性蛋白可包括激素及其受体、生物反应调节剂及其受体、细胞因子及其受体、酶、抗体、抗体片段等。具体而言，生理活性蛋白可包括人生长激素(hGH)、胰岛素、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素、甲状旁腺激素(PTH)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白细胞介素、巨噬细胞激活因子、肿瘤坏死因子、组织纤溶酶原激活因子、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、hBMP2(人骨形态发生蛋白2)、KGF(角质形成细胞生长因子)、PDGF(血小板衍生的生长因子)、葡萄糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、乳糖酶、腺苷脱氨酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板激活因子、乙酰水解酶、中性内肽酶、尿激酶、链激酶、髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶、肉毒毒素、胶原酶、透明质酸酶、L-天冬酰胺酶、单克隆抗体、多克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd等，尽管不限于此。
生理活性肽可以包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物、艾塞那肽及其类似物、生长抑素及其类似物、LHRH(黄体生成素-释放激素)激动剂和拮抗剂、促肾上腺皮质激素、生长激素-释放激素、催产素、胸腺素α-1、促肾上腺皮质激素-释放因子、降钙素、比伐卢定、血管升压素类似物、生理活性蛋白的片段等，尽管不限于此。
本公开的肽可有效地用于延长另一种生理活性蛋白或肽的体内半衰期。由于延长的体内保留，融合蛋白或融合肽可能具有延长的体内半衰期。
根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的组合物是用于免疫抑制的药物组合物。
本公开的药物组合物可以包含：(a)多肽、编码该多肽的核酸分子或包含该核酸分子的载体；和(b)药学上可接受的载体。
根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的组合物是用于抑制器官移植排斥反应或用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于抑制免疫或器官移植排斥的方法，其包括施用药物组合物的步骤。
在本公开的另一方面，本公开提供了用于预防或治疗自身免疫性疾病的方法，其包括施用药物组合物的步骤。
在本说明书中，术语“自身免疫性疾病”与“自身免疫性病症”可互换使用，并且指由于对自身细胞、组织或器官的异常免疫应答而引起的病症。术语“炎性疾病”与术语“炎性病症”可互换使用，并且指以炎症，特别是慢性炎症为特征的疾病。自身免疫性疾病可能与炎症有关，也可能与之无关。此外，炎症可能会或可能不会导致自身免疫性疾病。
可以通过本公开的药物组合物预防或治疗的自身免疫性疾病的实例包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合症、艾迪生氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、慢性疲劳免疫功能低下综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、变应性肉芽肿性血管炎、瘢痕性类天疱疮、CREST综合症、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA神经炎、幼年性关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、皮肌炎、原发性醛固酮增多症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、赖特综合征、类风湿性关节炎、结节病、皮痹、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白点病和韦格纳肉芽肿，尽管不限于此。
本公开的药物组合物中包含的药学上可接受的载体是常用的载体，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，尽管不限于此。除上述成分外，本公开的药物组合物还可包含润滑剂、保湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995)中有详细描述。
本公开的药物组合物可以例如通过静脉内注射、局部注射、腹膜内注射等口服或肠胃外施用，特别是肠胃外施用。
本公开的药物组合物的适当施用剂量取决于例如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重和性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应灵敏度等因素而变化。普通培训的医师可以容易地确定并开出对所需治疗或预防有效的施用剂量。根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的药物组合物的每日施用剂量为0.0001mg/kg至100mg/kg。
本公开内容的药物组合物可以根据本领域普通技术人员可以容易地实施的方法，使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制成单剂量形式或多剂量包装。该制剂可以是在油或含水介质中的溶液、悬浮剂、乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且还可以包含分散剂或稳定剂。
本公开的药物组合物可以单独使用或与其他常规化学疗法或生物疗法组合使用。通过联合疗法可以更有效地治疗免疫相关疾病。
有益效果
本公开的特征和优点可以总结如下：
(i)本公开提供了包含Fcγ受体突变体的多肽。
(ii)本公开还提供了用于制备多肽的方法。
(iii)通过用不同的氨基酸序列置换Fcγ受体的部分氨基酸序列来优化本公开的Fcγ受体突变体，以便提供对免疫球蛋白优异的选择性结合能力。因此，它可有效地用于延长药物的体内半衰期、检测和纯化免疫球蛋白、抑制器官移植排斥或预防或治疗自身免疫性疾病。
附图说明
图1示意性地说明了本公开的FcγRIIa突变体库的建立。
图2显示了筛选对人血清IgG表现出高亲和力的SH2A40突变体的过程。
图3显示的结果表明了在SDS-PAGE上已经以高纯度纯化了FcγRIIa蛋白(32kDa)。
图4比较了SH2A40与为Fc添加的N-连接的常规糖基化基序的结合能力。
图5示意性地说明了获得纯化的SH2A40的过程。
图6显示了通过进行ELISA研究SH2A40的活性的结果。
图7示意性地说明了建立FcγRIIa突变体库的过程，其中没有形成N-连接的常规糖基化基序。
图8比较了使用建立的库和流式细胞术筛选的突变体(MG2A28和MG2A45)对Fc的结合能力。
图9显示了纯化筛选的突变体的结果。
图10显示了研究筛选的突变体与Fc的结合能力的ELISA结果。
图11显示了通过生物层干涉法测量Fcγ受体突变体和利妥昔单抗的KD值的结果。
图12比较了使用建立的库和流式细胞术筛选的突变体(MG2A28.1和MG2A45.1)对Fc的亲和力。
图13显示了纯化筛选的突变体的结果。
图14显示了研究筛选的突变体与Fc的结合能力的ELISA结果。
图15显示了通过生物层干涉法测量Fcγ受体突变体和利妥昔单抗的KD值的结果。
图16显示了研究Fcγ受体突变体与小鼠血清IgG的结合能力的ELISA结果。
图17显示了比较野生型FcγRIIb和引入了MG2A45.1突变的FcγRIIb(MG2B45.1)对人血清IgG-FITC的亲和力的结果。
图18显示了在哺乳动物细胞中表达的贝伐单抗scFv、贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1。
图19显示了对于贝伐单抗scFv，分析贝伐单抗scFv、贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1的VEGF结合活性的ELISA分析结果。
图20显示了对于FcγRIIa，分析贝伐单抗scFv、贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1的IgG1 Fc(利妥昔单抗)结合活性的ELISA分析结果。
最佳方式
在下文中，将通过实施例详细描述本公开。然而，以下实施例仅用于说明性目的，并且对于本领域普通技术人员明显的是，本公开的范围不受实施例限制。
实施例
实施例1.FcγRIIa突变体库的构建
基于pMopac12-NlpA-FcγRIIa-FLAG载体，使用MJ#160和MJ#161引物制备了引入随机突变的FcγRIIa基因，以使得在FcγRIIa中发生约0.2％的随机突变。另外，通过使用MJ#160、MJ#161、p788、p789、p790、p791、p792和p793引物在FcγRIIa的IgG Fc结合位点处引入简并密码子NNK来制备引入了各种氨基酸的目标插入物(表1)。将制备的两种插入物用SfiI(New England Biolab)限制性内切酶处理，并将其与载体连接。然后，通过转化到大肠杆菌(E.coli)Jude1((F'[Tn10(Tetr)proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1araD139Δ(ara leu)7697galUgalKrpsLendA1nupG)构建FcγRIIa突变体库(库大小：2.2x109)(图1)。
[表1]
实施例2.通过细菌培养和流式细胞术筛选FcγRIIa突变体库
将1mL已建立的FcγRIIa突变体库细胞在含有2重量/体积％葡萄糖和氯霉素(40μg/mL)的超级肉汤(TB)培养基中，在37℃的条件下以250rpm摇动培养4小时。将培养的库细胞以1:100接种到TB培养基中，然后在250rpm摇动的同时在37℃下培养至OD600 0.6。然后，在25℃下培养20分钟以进行冷却后，添加1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导表达。培养完成后，回收细胞，并通过OD600归一化以14000rpm离心1分钟。收集后，通过加入1mL的10mM Tris-HCl(pH 8.0)将细胞重悬，并离心1分钟。将该洗涤过程重复两次。在重悬于1mL STE[0.5M蔗糖、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH 8.0)]中后，通过在37℃下旋转30分钟来除去细胞外膜。离心并丢弃上清液后，通过加入1mL溶液A[0.5M蔗糖、20mM MgCl2、10mM MOPS，pH 6.8]对残留物进行重悬，然后离心。将其重悬于1mL的由1mL的溶液A和20μL的50mg/mL的溶菌酶溶液制备的混合溶液后，通过在37℃下旋转15分钟来除去肽聚糖层。离心并除去上清液后，将残留物重悬于1mL PBS中。取300μL所得溶液，将其与700μL的PBS和人血清IgG-FITC探针(Sigma Aldrich)合并，然后通过在室温下旋转在原生质球中用荧光探针标记。标记后，用1mL的PBS洗涤一次，通过流式细胞术(S3细胞分选器；Bio-Rad)回收显示高荧光的前3％的细胞，并再次分选以提高纯度。在使用MJ#160和MJ#161引物以及Taq聚合酶(Biosesang)通过PCR从再次分选的样品中扩增基因后，用SfiI限制性内切酶处理和转化连接，构建了基因扩增的子库。重复此过程共4轮后，通过分析40个单独的克隆，筛选显示出对人血清IgG的亲和力高于野生型FcγRIIa(SEQ ID NO 35和43)对人血清IgG的亲和力的SH2A40突变体(SEQ ID NO 36和44)(图2)。
实施例3：克隆、表达和纯化分离的SH2A40突变体以用于在哺乳动物细胞中的表达
为了在HEK293F细胞中表达筛选的SH2A40突变体，使用Vent聚合酶和MJ#162和MJ#163引物通过PCR扩增基因来制备pMAZ-FcγRIIa(野生型)和pMAZ-FcγRIIa突变体(SH2A40)，然后通过用BssHII和XbaI(New England Biolab)限制性内切酶处理连接。将克隆到哺乳动物细胞表达载体pMAZ中的基因转染到HEK293F细胞中，并以300mL的规模瞬时表达。培养完成后，通过以2000rpm离心10分钟除去细胞，取上清液并使用25xPBS平衡。将所得溶液通过0.2-μm瓶顶过滤器(Merck Millipore)过滤。加入1mL用PBS平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)浆料后，将溶液在4℃下搅拌16小时，然后将其流入聚丙烯柱(Thermo FisherScientific)。取通过的溶液，将其与树脂结合，然后依次用50mL的1xPBS、25mL的10mM咪唑缓冲液、25mL的20mM咪唑缓冲液和200μL的250mM咪唑缓冲液洗涤。用2.5mL的250mM咪唑缓冲液洗脱。用Amicon Ultra-4(Merck Millipore)浓缩收集的蛋白，并通过SDS-PAGE(Bio-Rad)纯化(图3)。证实在SDS-PAGE上以高纯度纯化了FcγRIIa蛋白(32kDa)。
实施例4：使用由IgG1亚类构成的利妥昔单抗进行ELISA，以分析通过哺乳动物细胞培养产生的FcγRIIa蛋白的活性和结合能力
将50μL利妥昔单抗用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，然后在室温下用100μL的5％BSA(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL FcγRIIa蛋白添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，在室温下使用50μL的抗His-HRP缀合物(Sigma-Aldrich)进行抗体反应持续1小时并进行洗涤。通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应。然后，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)进行分析。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，可以比较和分析利妥昔单抗的Fc区域与野生型FcγRIIa、SH2A40的结合能力。SH2A40显示出与WTFcγRIIa相似的结合能力，这是由于新产生了N-连接的常规糖基化基序(图4)。
实施例5.用于表达MBP-FcγRIIa蛋白的克隆，在大肠杆菌中的表达及纯化
为了产生作为可溶性蛋白的经筛选的SH2A40，使用IIa_Fw_NdeI和IIa_Rv_HindIII引物进行PCR。用NdeI和HindIII(New England Biolab)处理并与pET22b-MBP-TEV位点-His载体连接后，将产物转化到BL21(DE3)细胞中。在含有2重量/体积％的葡萄糖和氨苄青霉素(100μg/mL)的TB培养基中在37℃下预培养细胞，同时以250rpm摇动。将培养的细胞以1:100接种到TB培养基中，然后在250rpm摇动的同时在37℃下培养至OD600 0.6。随后，将细胞在18℃下培养20分钟以进行冷却后，通过添加1mM IPTG诱导表达14小时。培养完成后，通过以7000rpm离心10分钟收获细胞。将细胞超声处理(5秒开/10秒关，100个循环)以进行裂解，并以15000rpm离心30分钟。将上清液通过0.45-μm注射器过滤器过滤。将过滤的上清液与Ni-NTA树脂结合，用100mL的10mM咪唑缓冲液和100mL的20mM咪唑缓冲液洗涤，然后用4mL的50mM咪唑缓冲液洗脱。将洗脱的样品与50mM Tris-HCl进行缓冲液交换，并使用TEV-GST将MBP-SH2A40裂解为MBP和SH2A40。然后，使用GST树脂和直链淀粉树脂除去TEV-GST和MBP蛋白，仅获得纯的SH2A40(图5)。
实施例6.ELISA法分析大肠杆菌中表达的FcγRIIa突变体与IgG1的结合能力
进行了ELISA以研究SH2A40的活性。将50μL利妥昔单抗用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的4％脱脂奶(GenomicBase)(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将50μL的WTFcγRIIa和SH2A40用1％脱脂奶(在0.05％PBST中)连续稀释后添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物(Sigma)在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)进行分析(图6)。
实施例7：FcγRIIa突变体库的构建，其中不形成N-连接的常规糖基化基序
构建库以筛选对IgG Fc具有高亲和力的FcγRIIa突变体，其中在FcγRIIa突变体中没有形成N-连接的常规糖基化基序(N-X-S/T)(SH2A40:K117N,L159Q)。该库的构建侧重于V116、K117和T119位置，其中在SH2A40中形成了N-连接的常规糖基化基序。以SH2A40为模板构建库。为了避免未配对的Cys，使用了减少的密码子(图7)。
1.子库-1：在第117位无Asn或Cys形成
使用pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAG作为模板。将NNK简并密码子用于第116位和第119位以编码20个氨基酸，将NNG还原密码子用于第117位以编码13个氨基酸，并使用编码单个氨基酸的引物编码其余5个氨基酸(Gln、Phe、His、Ile、Tyr)。使用MJ#160和MJ#112引物和Vent聚合酶(New England Biolab)扩增FcγRIIa基因的前116位的片段1，并使用相同比例的MJ#113-MJ#118的混合物与MJ#161扩增后侧的片段2。制备的两个片段用Vent聚合酶组装并用SfiI(New England Biolab)限制性内切酶处理。
2.子库-2：在第119位无Ser、Thr或Cys形成
使用pMopac12-NlpA-FcγRIIa(SH2A40)-FLAG作为模板。将NNK简并密码子用于第116位和第117位以编码20个氨基酸，将NNG还原密码子用于第119位以编码12个氨基酸，并使用编码单个氨基酸的引物编码其余5个氨基酸(Ala、Gly、Pro、Arg、Trp)。使用MJ#160和MJ#112引物和Vent聚合酶(New England Biolab)扩增FcγRIIa基因的前116位的片段1，并使用相同比例的MJ#119-MJ#124的混合物与MJ#161扩增后侧的片段2。制备的两个片段用Vent聚合酶组装并用SfiI(New England Biolab)限制性内切酶处理。
通过转化构建FcγRIIa库，将用限制性内切酶处理的两个子库基因连接到Jude1中(理论库大小：4.3x 104，实验库大小：6.3x 108)。
实施例8：通过流式细胞术使用已建立的库分离例如MG2A28、MG2A45的突变体(针对人血清IgG的亲和力分析)
将建立的库在250mL烧瓶中的25mL TB+2％葡萄糖培养基中在37℃下孵育4小时，然后以1:100接种至含有100mL TB培养基的500mL烧瓶中，然后培养至OD600＝0.6。在25℃和250rpm下冷却20分钟后，通过添加1mM IPTG在25℃和250rpm下进行5小时过表达。过表达后，测量OD600值，并通过以14000rpm离心1分钟收集归一化量的细胞。通过加入1mL的10mMTris-HCl(pH 8.0)使细胞重悬后，离心1分钟。将该洗涤过程重复两次。在重悬于1mL STE[0.5M蔗糖、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH 8.0)]中后，通过在37℃下旋转30分钟来除去细胞外膜。离心并除去上清液后，通过加入1mL溶液A[0.5M蔗糖、20mM MgCl2、10mM MOPS，pH6.8]来进行重悬。将所得溶液离心。将其重悬于1mL的由1mL的溶液A和20μL的50mg/mL的溶菌酶溶液制备的混合溶液后，通过在37℃下旋转15分钟来除去肽聚糖层。离心并除去上清液后，将剩余物重悬于1mL PBS中。取300μL所得溶液，将其与700μL的PBS和人血清IgG-FITC探针(Sigma Aldrich)合并，然后通过在室温下旋转在原生质球中用荧光探针标记。标记后，用1mL PBS洗涤一次并在PBS中稀释20次，然后通过流式细胞术(S3细胞分选仪；Bio-Rad)回收显示高荧光的前3％细胞。为了更有效的筛选，将分选的细胞再次分选。在使用MJ#1和MJ#2引物以及Taq聚合酶(Biosesang)通过PCR从再次分选的细胞中扩增基因后，用SfiI限制性内切酶处理和转化连接，构建了基因扩增的子库。在重复该过程总共3轮后，通过对超过50个单独克隆进行碱基序列分析，筛选出对人血清IgG的Fc区域显示出更高亲和力的突变体(图8)。
实施例9：克隆、表达和纯化分离的突变体以用于在哺乳动物细胞中表达
为了表达从HEK293F细胞中筛选出的突变体中的MG2A28(SEQ ID NO37和45)和MG2A45(SEQ ID NO 38和46)，使用Vent聚合酶和MJ#162和MJ#163引物通过PCR扩增基因来制备pMAZ-FcγRIIa突变体(MG2A28)和pMAZ-FcγRIIa突变体(MG2A45)，然后通过用BssHII和XbaI(New England Biolab)限制性内切酶处理连接。将克隆到哺乳动物细胞表达载体pMAZ中的基因转染到HEK293F细胞中，并以300mL的规模瞬时表达。培养完成后，通过以2000rpm离心10分钟除去细胞，取上清液并使用25xPBS平衡。将所得溶液通过0.2-μm瓶顶过滤器(Merck Millipore)过滤。加入1mL用PBS平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)浆料后，将溶液在4℃下搅拌16小时，然后将其流入聚丙烯柱(Thermo Fisher Scientific)。取通过的溶液，将其与树脂结合，然后依次用50mL的1xPBS、25mL的10mM咪唑缓冲液、25mL的20mM咪唑缓冲液和200μL的250mM咪唑缓冲液洗涤。用2.5mL的250mM咪唑缓冲液洗脱。用Amicon Ultra-4(Merck Millipore)浓缩收集的蛋白，并通过SDS-PAGE(Bio-Rad)纯化(图9)。证实在SDS-PAGE上以高纯度纯化了FcγRIIa蛋白(32kDa)。
实施例10：ELISA用于分析突变体与由IgG1亚类构成的利妥昔单抗的Fc的结合能力
将50μL利妥昔单抗用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的5％ BSA(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL FcγRIIa突变体添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物(Sigma)在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)进行分析(图10)。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，可以比较和分析利妥昔单抗的Fc区域与FcγRIIa突变体的结合能力。
实施例11：通过生物层干涉法测量FcγRIIa突变体和利妥昔单抗的KD值
为了测定作为占人血清约70％或大于70％的IgG亚类且主要用于各种抗体药物中的IgG1与Fc的结合能力，使用利妥昔单抗测定了FcγRIIa突变体的亲和力。使用Blitz(Fortebio)测量FcγRIIa突变体的结合能力。为了稳定分析，将利妥昔单抗抗体固定在用40μg/mL乙酸钠(pH 5.0)溶液稀释的胺反应性第二代(AR2G)生物传感器(Fortebio)上，并通过与用1x动力学缓冲液(Fortebio)连续稀释的FcγRIIa突变体(野生型SH2A40、MG2A28、MG2A45)反应来分析结合能力(图11)。使用Blitz Pro 1.2软件(Fortebio)计算平衡结合常数(KD)。结果，证实在本公开中筛选的SH2A40、MG2A28和MG2A45与Fc的结合能力分别具有3.57倍、6.16倍和8.26倍的提高。
实施例12：基于亲和力成熟的MG2A28和MG2A45的FcγRIIa易错PCR库的建立
为了构建基于MG2A28和MG2A45的FcγRIIa突变体库，以pMopac12-NlpA-FcγRIIa(MG2A28,MG2A45)-FLAG为模板进行易错PCR。使用Taq聚合酶(Takara)的易错PCR技术将随机点突变引入FcγRIIa区域。进行PCR以使得两个突变体MG2A28和MG2A45以50％:50％的相同比率存在于库中。使用MJ#160和MJ#161引物将点突变引入总FcγRIIa基因的0.3％的核苷酸中。然后，通过用SfiI限制性内切酶处理、连接并转化到Jude1中(库大小：2.6x 109，实验错误率：0.32％)来构建FcγRIIa库。在该库中，FcγRIIa突变体在大肠杆菌的内膜上展示。
实施例13：使用已建立的库和流式细胞术分离例如MG2A28.1、MG2A45.1的突变体(对人血清IgG的亲和力分析)
将已建立的库在250mL烧瓶中的25mL TB+2％葡萄糖培养基中在37℃下孵育4小时，然后将小管量(1mL)以1:100接种至含有100mL TB培养基的500mL烧瓶中。培养至OD600＝0.6后，随后在25℃和250rpm下冷却20分钟后，通过添加1mM IPTG在25℃和250rpm下进行5小时过表达。过表达后，测量OD600值，并通过以14000rpm离心1分钟收集归一化量的细胞。通过加入1mL的10mM Tris-HCl(pH 8.0)使细胞重悬后，离心1分钟。将该洗涤过程重复两次。在重悬于1mL STE[0.5M蔗糖、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH 8.0)]中后，通过在37℃下旋转30分钟来除去细胞外膜。离心并除去上清液后，通过加入1mL溶液A[0.5M蔗糖、20mMMgCl2、10mM MOPS，pH 6.8]来进行重悬。将所得溶液离心。将其重悬于1mL的由1mL的溶液A和20μL的50mg/mL的溶菌酶溶液制备的混合溶液后，通过在37℃下旋转15分钟来除去肽聚糖层。离心并除去上清液后，将剩余物重悬于1mL PBS中。取300μL所得溶液，将其与700μL的PBS和人血清IgG-FITC探针(Sigma Aldrich)合并，然后通过在室温下旋转在原生质球中用荧光探针标记(第1-2轮：20nM，第3轮：5nM)。标记后，用1mL PBS洗涤一次并在PBS中稀释20次，然后通过流式细胞术(S3细胞分选仪；Bio-Rad)回收显示高荧光的前3％细胞。为了更有效的筛选，将分选的细胞再次分选。在使用MJ#1和MJ#2引物以及Taq聚合酶(Biosesang)通过PCR从再次分选的细胞中扩增基因后，用SfiI限制性内切酶处理和转化连接，构建了基因扩增的子库。重复此过程共5轮后，分析了超过70个单独克隆的由于与IgG-FITC结合的荧光强度。由此，筛选出对人血清IgG的Fc区域具有高亲和力的突变体。通过碱基测序证实，分离了基于MG2A28的突变体和基于MG2A45的突变体(图12)。
实施例14：用于表达分离的突变体的克隆，在哺乳动物细胞中表达和纯化
为了表达从HEK293F细胞中筛选出的突变体中的MG2A28.1(SEQ ID NO 39和47)和MG2A45.1(SEQ ID NO 40和48)，使用Vent聚合酶和MJ#162和MJ#163引物通过PCR扩增基因来制备pMAZ-FcγRIIa突变体(MG2A28.1)和pMAZ-FcγRIIa突变体(MG2A45.1)，然后通过用BssHII和XbaI(New England Biolab)限制性内切酶处理连接。将克隆到哺乳动物细胞表达载体pMAZ中的基因转染到HEK293F细胞中，并以300mL的规模瞬时表达。培养完成后，通过以2000rpm离心10分钟除去细胞，取上清液并使用25xPBS平衡。将所得溶液通过0.2-μm瓶顶过滤器(Merck Millipore)过滤。加入1mL用PBS平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)浆料后，将溶液在4℃下搅拌16小时，然后将其流入聚丙烯柱(Thermo Fisher Scientific)。取通过的溶液，将其与树脂结合，然后依次用50mL的1xPBS、25mL的10mM咪唑缓冲液、25mL的20mM咪唑缓冲液和200μL的250mM咪唑缓冲液洗涤。用2.5mL的250mM咪唑缓冲液洗脱。用Amicon Ultra-4(Merck Millipore)浓缩收集的蛋白，并通过SDS-PAGE(Bio-Rad)纯化(图13)。证实在SDS-PAGE上以高纯度纯化了FcγRIIa蛋白(32kDa)。
实施例15：ELISA用于分析突变体与由IgG1亚类构成的利妥昔单抗的Fc的结合能力
将50μL利妥昔单抗用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的5％ BSA(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL FcγRIIa突变体添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物(Sigma)在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)进行分析(图14)。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，可以比较和分析利妥昔单抗的Fc区域与FcγRIIa突变体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)的结合能力。
实施例16：通过生物层干涉法测量FcγRIIa突变体和利妥昔单抗的KD值
为了测定作为占人血清约70％或大于70％的IgG亚类且主要用于各种抗体药物中的IgG1与Fc的结合能力，使用利妥昔单抗测量FcγRIIa突变体的亲和力。使用Blitz(Fortebio)测量FcγRIIa突变体的结合能力。为了稳定分析，将利妥昔单抗抗体固定在用40μg/mL乙酸钠(pH 5.0)溶液稀释的胺反应性第二代(AR2G)生物传感器(Fortebio)上，并通过与用1x动力学缓冲液(Fortebio)连续稀释的FcγRIIa突变体(MG2A28.1、MG2A45.1)反应来分析结合能力(图15)。使用Blitz Pro 1.2软件(Fortebio)计算平衡结合常数(KD)。结果，证实在本公开中筛选的MG2A28.1和MG2A45.1与Fc的结合能力分别具有5.39倍和32.09倍的提高。
实施例17：通过ELISA分析使用小鼠模型的哺乳动物实验的与小鼠血清IgG的结合能力
将50μL小鼠血清IgG用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的5％ BSA(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL FcγRIIa突变体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物(Sigma)在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo FisherScientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)进行分析(图16)。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，可以比较和分析小鼠血清IgG与FcγRIIa突变体(野生型、MG2A28、MG2A45、MG2A28.1、MG2A45.1)的结合能力。与野生型相比，除MG2A28外的所有突变体均表现出相似或更高的与小鼠血清IgG的亲和力。特别地，MG2A45和MG2A45.1突变体显示出对小鼠血清IgG的最高亲和力。
实施例18：引入点突变以研究与FcγRIIa具有约96％同源性的FcγRIIb对Fc的亲和力
进行实验以分析筛选的点突变体对FcγRIIb(SEQ ID NO 41和49)的影响。为此，将pMopac12-NlpA-FcγRIIb-FLAG质粒用作模板，并使用Quikchange定点诱变(Agilent)技术将MG2A45.1点突变(R55H、K117N、T119V、L159Q、V171E)中的R55H和L159Q引入FcγRIIb基因。使用MJ#200、MJ#201、MJ#202和MJ#203引物用于引入每个点突变。使用Pfu turbo聚合酶(Agilent)进行PCR后，在37℃下孵育3小时以进行DpnI(New England Biolab)限制性内切酶处理。转化制备的基因后，通过碱基测序证实成功引入了点突变。组装PCR技术用于引入三个点突变K117N、T119V和V171E。将具有通过Quikchange定点诱变引入的R55H和L159Q的质粒用作模板。使用MJ#160、MJ#197、MJ#198和MJ#199引物和vent聚合酶(New EnglandBiolab)扩增两个片段，并组装MJ#160和MJ#199。然后，通过SfiI限制性内切酶处理、连接、转化和碱基测序，完成了其中插入MG2A45.1的所有五个点突变的pMopac12-NlpA-FcγRIIb(MG2B45.1)-FLAG基因的制备。
实施例19：野生型FcγRIIb和引入了MG2A45.1突变的FcγRIIb(MG2B45.1)对人血清IgG-FITC的亲和力的比较
比较FcγRIIb突变体(MG2B45.1)(SEQ ID NO 42和50)对人血清IgG-FITC的亲和力与野生型FcγRIIb对人血清IgG-FITC的亲和力。将在5mL TB+2％葡萄糖培养基中预培养的接种物以1:100接种到5mL的TB培养基中，直到OD600＝0.6。在25℃和250rpm下冷却20分钟后，通过添加1mM IPTG在25℃和250rpm下进行5小时过表达。过表达后，测量OD600值，并通过以14000rpm离心1分钟收集归一化量的细胞。通过加入1mL的10mM Tris-HCl(pH 8.0)使细胞重悬后，离心1分钟。将该洗涤过程重复两次。在重悬于1mL STE[0.5M蔗糖、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH 8.0)]中后，通过在37℃下旋转30分钟来除去细胞外膜。离心并除去上清液后，通过加入1mL溶液A[0.5M蔗糖、20mM MgCl2、10mM MOPS，pH 6.8]重悬。将所得溶液离心。将其重悬于1mL的由1mL的溶液A和20μL的50mg/mL的溶菌酶溶液制备的混合溶液后，通过在37℃下旋转15分钟来除去肽聚糖层。离心并除去上清液后，将剩余物重悬于1mL PBS中。取300μL所得溶液，将其与700μL的PBS和人血清IgG-FITC探针(Sigma Aldrich)合并，然后通过在室温下旋转在原生质球中用荧光探针标记(第1-2轮：20nM，第3轮：5nM)。标记后，随后用1mL PBS洗涤一次并在PBS中稀释20次，使用Guava(Merck Millipore)分析来自与FcγRIIb结合的人IgG-FITC的荧光信号(图17)。
实施例20：克隆贝伐单抗scFv和贝伐单抗scFv-FcγRIIa突变体以研究血清半衰期的延长
使用贝伐单抗的重链作为模板并使用Vent聚合酶以及BR#1和BR#2引物扩增VH基因，和使用轻链贝伐单抗作为模板并使用BR#4和BR#5引物扩增VL基因。使用引入到BR#3引物中的GS接头组装扩增的基因，并通过用BssHII和XbaI(New England Biolab)限制性内切酶处理、连接并克隆到pMAZ载体中来制备贝伐单抗scFv，该pMAZ载体是用于在哺乳动物细胞中表达的载体。使用BR#6和BR#7引物分别扩增野生型FcγRIIa和FcγRIIa突变体。使用引入BR#6中的GS接头组装扩增的FcγRIIa基因，以获得贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1基因。通过用BssHII和XbaI(New England Biolab)限制性内切酶处理扩增的基因、连接并克隆到pMAZ载体中来制备pMAZ-贝伐单抗scFv、pMAZ-贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和pMAZ-贝伐单抗scFv-MG2A45.1，该pMAZ载体是用于在哺乳动物细胞中表达的载体。表2中描述了该实施例中使用的引物。
[表2]
实施例21：贝伐单抗scFv和贝伐单抗scFv-FcγRIIa突变体的表达和纯化
制备的基因在Expi 293F细胞中以300mL的规模瞬时表达。培养完成后，通过以7500rpm离心15分钟来除去细胞，取上清液并使用25xPBS平衡。将所得溶液通过0.2-μm瓶顶过滤器(Merck Millipore)过滤。加入1mL用PBS平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)浆料后，将溶液在4℃下搅拌16小时，然后将其流入聚丙烯柱(Thermo Fisher Scientific)。然后，将溶液依次用25mL的10mM咪唑缓冲液、25mL的20mM咪唑缓冲液和250μL的250mM咪唑缓冲液洗涤。用4mL的250mM咪唑缓冲液洗脱。用Amicon Ultra-4(Merck Millipore)浓缩收集的蛋白，并通过SDS-PAGE(Bio-Rad)纯化(图18)。
实施例22：使用VEGF的ELISA以用于分析通过哺乳动物细胞培养产生的贝伐单抗scFv和贝伐单抗scFv-FcγRIIa突变体的活性和结合能力
将50μL的VEGF(Genscript)用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至500ng/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的5％ BSA(在0.05％PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL贝伐单抗scFv、贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1蛋白添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中添加50μL的20μg/mL人血清IgG，以防止二抗抗His抗体-HRP缀合物(Sigma-Aldrich)的Fc结构域与FcγRIIa交联，并在室温下进行反应1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)分析450nm处的吸光度。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，可以分析与γRIIa突变体融合的贝伐单抗scFv对VEGF的结合活性。结果，证实FcγRIIa野生型和FcγRIIa突变体MG2A45.1在与贝伐单抗scFv融合之后，保留了贝伐单抗scFv的特征性VEGF结合能力(图19)。此外，已证实了FcγRIIa融合蛋白在ELISA上显示出更高的结合能力，这是由于FcγRIIa具有通过非共价键形成二聚体的趋势(Maxwell,K.F.,M.S.Powell,M.D.Hulett,P.A.Barton,I.F.McKenzie,T.P.Garrett,和P.M.Hogarth.1999.Crystal structure of the humanleukocyte Fc receptor,FcγRIIa.Nat.Struct.Biol.6:437-442)。
实施例23：使用利妥昔单抗的ELISA以用于分析通过哺乳动物细胞培养产生的贝伐单抗scFv和贝伐单抗scFv-FcγRIIa突变体的活性和结合能力
将50μL利妥昔单抗用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)稀释至4μg/mL，在4℃下将其固定在平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(Costar)上16小时，在室温下用100μL的5％ BSA(在0.05％ PBST中)封闭2小时。用180μL的0.05％PBST洗涤4次后，将用封闭溶液连续稀释的50μL贝伐单抗scFv、贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-MG2A45.1蛋白添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，使用50μL抗His-HRP缀合物(Sigma-Aldrich)在室温下进行抗体反应持续1小时。洗涤后，随后通过添加50μL的1-步超快TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显色后，通过添加50μL的2M H2SO4终止反应，使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)分析吸光度。所有实验均一式两份进行。通过ELISA，证实排除了不含FcγRIIa的贝伐单抗scFv，贝伐单抗scFv-FcγRIIa野生型和贝伐单抗scFv-FcγRIIa-MG2A45.1保留了与由IgG1 Fc构成的利妥昔单抗的结合能力。另外，证实了与Fc的结合能力提高的MG2A45.1融合蛋白显示出与利妥昔单抗的结合能力提高，这表明野生型FcγRIIa及其突变体MG2A45.1的特性在与贝伐单抗scFv融合后得以保留(图20)。
尽管已经示出和描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离由所附权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下对其进行形式和细节上的各种改变。因此，旨在本公开不限于作为预期用于执行本公开的最佳模式而公开的特定示例性实施方案，而是本公开将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。

Claims (16)

1.一种包含Fcγ受体突变体的多肽，其中所述突变体是其中SEQ ID NO 43或SEQ IDNO 49的野生型Fcγ受体的序列的第117位氨基酸和第159位氨基酸被改变的突变体，
其中所述突变体由选自SEQ ID NO 45、46、47、48和50的序列组成，
其中与野生型Fc-γ受体相比，包含氨基酸取代的所述突变体具有改善的与人血清IgG抗体Fc区的结合能力。
2.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的多肽。
3.一种载体，其包含根据权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的载体。
5.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的核酸分子或根据权利要求3所述的载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物用于检测样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域。
7.一种用于检测IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的试剂盒，其包含根据权利要求6所述的组合物。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物是用于免疫抑制的药物组合物。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物是用于抑制器官移植排斥的药物组合物。
10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物是用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物。
11.根据权利要求5所述的组合物在制备用于抑制免疫或器官移植排斥的药物中的用途，其中根据权利要求5所述的组合物被施用。
12.根据权利要求5所述的组合物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，其中根据权利要求5所述的组合物被施用。
13.一种融合蛋白或融合肽，其中根据权利要求1所述的多肽结合到生理活性蛋白或生理活性肽，其中所述融合蛋白或融合肽由于体内保留时间延长而具有延长的体内半衰期。
14.一种用于制备包含Fcγ受体突变体的多肽的方法，其包括：
a)培养包含载体的宿主细胞的步骤，所述载体包含编码根据权利要求1所述的多肽的核酸分子；和
b)回收宿主细胞表达的多肽的步骤。
15.一种用于纯化样品中包含的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的方法，其包括：
a)通过将根据权利要求1所述的多肽与包含IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的样品混合在一起而将它们结合的步骤；和
b)纯化结合了多肽的IgG抗体或IgG抗体的Fc区域的步骤。
16.一种用于筛选针对人血清IgG抗体或人血清IgG抗体的Fc区域的结合能力增加的Fcγ受体突变体的方法，其包括：
a)建立Fcγ受体突变体库的步骤，所述库包括其中SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49的第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换，第119位氨基酸被蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)置换且第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换的序列；和
b)从库中筛选当与SEQ ID NO 43或SEQ ID NO 49仅包含第117位氨基酸被天冬酰胺(N)置换和第159位氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换的Fcγ受体突变体相比时，具有与人血清IgG抗体或人血清IgG抗体的Fc区域的结合能力增加的Fcγ受体突变体的步骤。
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