JP2023551194A - ウシ科動物抗体バリアント - Google Patents

Abstract

本発明は、概して、ウシ科動物抗体バリアント及びそれらの使用に関する。具体的には、本発明は、様々な特徴を改善するためのウシ科動物抗体の定常領域における変異に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２０日出願の米国仮特許出願第６３／１１６４９１号の優先権及び利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、ウシ科動物抗体バリアント及びそれらの使用に関する。具体的には、本発明は、様々な特徴を改善するためのウシ科動物抗体のＦｃ定常領域における１つ以上の変異に関する。

ウシ科動物ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、獣医学における有効な治療薬であり得る。数年前、３つのウシ科動物ＩｇＧサブクラスが同定された。しかしながら、ウシ科動物ＩｇＧの特徴の改善に関してはあまり研究されていない。

新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、リサイクル機序を通じて、その断片結晶化可能（Ｆｃ）領域とのｐＨ依存性相互作用において、ＩｇＧの半減期を延長する。具体的には、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの界面に広がるＦｃ領域は、細胞の表面上のＦｃＲｎと相互作用して、ＩｇＧ恒常性を調節する。この相互作用は、ＩｇＧピノサイトーシス後の酸性相互作用に好ましく、したがって、ＩｇＧは分解から保護される。次いで、エンドサイトーシスされたＩｇＧは、細胞表面にリサイクルされ、わずかにアルカリｐＨで血流中に放出され、それによって適切な機能にとって十分な血清ＩｇＧが維持される。したがって、ＩｇＧの薬物動態プロファイルは、それらのＦｃ領域の構造的及び機能的特性に依存する。

Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などの抗体エフェクター機能にも関与する。これらのエフェクター機能は、Ｆｃ領域とＦｃγＲとの相互作用に依存する。したがって、ＦｃγＲとの相互作用を調整するようにＦｃ領域を操作することは、治療用抗体の活性を増強するための有望なアプローチとして浮上した。

ヒトの健康において、数十年にわたるＦｃ工学は、薬物動態及びエフェクター機能を改善する多数の変異の同定につながった。これまでのところ、そのようなＦｃ工学研究はウシ科動物において報告されていない。

したがって、ウシ科動物ＩｇＧの様々な特徴を改善するために、新規のウシ科動物ＩｇＧ Ｆｃ領域変異の必要性が存在する。

本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧと比較して、所望の特徴を示す変異型ウシ科動物ＩｇＧに関する。具体的には、本出願の発明者らは、驚くべきことに、そして予想外にも、２１６位、２３４位、２３５位、２３７位、２７０位、３２９位、３３０位、３３１位、４３２位、４３４位、４３７位、又は４３３位（ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番された）のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することが、所望効果を示したことを見出した。例示的な実施形態では、予想外の所望の効果は、ＦｃＲｎに対する親和性の向上、補体依存性細胞傷害性の低減（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性の低減（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用の低減（ＡＤＣＰ）、Ｆｃγ受容体（ｂＦｃｇＲ）への結合の低減、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

別の態様では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧであって、当該置換が、アミノ酸残基２１６、２３４、２３５、２３７、２７０、３２９、３３０、３３１、４３２、４３４、４３７、又は４３３にある、修飾されたＩｇＧを提供する。

１つの例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインは、Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２１６Ｅ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ４３７Ａの置換のうちの１つ以上を含むＩｇＧ１定常ドメインである。

別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインは、Ａ３３０Ｓ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａの置換のうちの１つ以上を含むＩｇＧ２定常ドメインである。

更に別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインは、Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、及びＲ４３３Ｈの置換のうちの１つ以上を含むＩｇＧ３定常ドメインである。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の１つ以上のアミノ酸置換を含むウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、ポリペプチドを提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の１つ以上のアミノ酸置換を含むウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、抗体又は分子を提供する。

更なる態様では、本発明は、抗体又は分子を産生又は製造するための方法であって、方法が、抗体をコードする核酸配列を有するベクター又は宿主細胞を提供することを含み、当該抗体が、本明細書に記載の本発明の１つ以上のアミノ酸置換を含むウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、方法を提供する。

本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な説明の例及び図面から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながらも、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。

図面の簡単な説明
本特許又は出願書類には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公開の複写は、要望及び必要な料金の支払いに応じて、庁によって提供されるであろう。

エフェクター細胞の表面上のＦｃγ受容体へのＩｇＧ Ｆｃ結合によって誘発される標的細胞殺傷機能を図示する。 配列アラインメント、ウシ科動物ＩｇＧサブクラスを示す。３つの代表的なアロタイプを示す。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインは次のとおりである：ＣＨ１：残基１～９８、ヒンジ：９９から垂直線；ＣＨ２：２４３への垂直線；ＣＨ３：２４４～３５１。重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインは、太字及び下線で示される。ウシＩｇＧ３ａにおけるＣＨ１エキソンの３’伸長は、イタリック文字で示される。ヒンジのすぐ下流にある太字のアミノ酸は、「Ｗｉｎｔｅｒ」又は「ＬＡＬＡ」部位を表す。ｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ３ａについて、これらの部位は、それぞれ、ＬＰＧＧ及びＰＬＧＧである。この部位は、ｂＩｇＧ２ａにはない。ボックスには、ｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ３ａ ＣＨ２における「ＰＡＰ」領域、並びにｂＩｇＧ２ａにおける「ＳＡＳ」領域が含まれる。ｂＩｇＧ３ａにおける二重下線アルギニン（Ｒ）は、ヒスチジン（Ｈ）への点変異に関与する残基である。 ウシ科動物ＩｇＧ１サブクラスの３つの独自の対立遺伝子の配列アラインメントを示す。太字：アミノ酸「ＤＰ」領域は、プロテアーゼクリッピングを軽減するためにｂＩｇＧ１ａ上で変異させた。下線：アミノ酸は、エフェクター機能をノックアウトするためにｂＩｇＧ１ａ上で変異させた。ｂＩｇＧ１ｄは、ｂＩｇＧ１ｂと同義のアミノ酸配列を有するため、ｂＩｇＧ１アロタイプのアラインメントには含まれない。ｂＩｇＧ１に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である。 ウシ科動物ＩｇＧ２サブクラス、ｂＩｇＧ２ａ（ＮＣＢＩ Ｘ１６７０２．１）及びｂＩｇＧ２ｂ（ＮＣＢＩ Ｓ８２４０７）の２つの報告された対立遺伝子の、ウシから単離されたＩｇＧ２抗体の配列との配列アラインメントを示す。太字：アミノ酸は、エフェクター機能をノックアウトするためにｂＩｇＧ２ａ上で変異させた。本発明者らは、乳牛からＩｇＧ抗体を単離し、配列決定は、図４に「ウシ配列からのｂＩｇＧ２ａ」として示されるように、ｂＩｇＧ２ａについて報告されたものからの２残基の逸脱を明らかにした。この配列は、ｂＩｇＧ２の新しいアロタイプを表し得るが、本特許出願の目的のために、それは、ｂＩｇＧ２ａとほぼ同一のアラインメントのため、「ｂＩｇＧ２ａ」と称される。ｂＩｇＧ２に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である。 ウシ科動物ＩｇＧ３サブクラスの２つの対立遺伝子の配列アラインメントを示す。太字：アミノ酸は、エフェクター機能をノックアウトするためにｂＩｇＧ３ａ上で変異させた。下線：残基は、ｂＦｃＲｎへの親和性を向上させるためにｂＩｇＧ３ａ上に変異させた。ｂＩｇＧ３に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である。 エフェクター機能をノックアウトするためのウシ科動物ＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ１ａ Ｆｃ変異体を示す。太字：Ｗｉｎｔｅｒ変異Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ＊に関与する残基。ボックス：ＰＡＰからＳＡＳへの変異（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ＊）、ＰＡＰからＳＡＰへの変異（Ｐ３２９Ｓ＊）、及びＷｉｎｔｅｒ変異と組み合わせたＰＡＰからＰＳＳへの変異（ＳＳ変異；Ａ３３０Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ＊）に関与する残基。垂直線：ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質におけるＦｃ領域の開始。＊変異のアミノ酸残基は、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される。 ウシ科動物ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、及び両方のアロタイプのバリアントの細胞ベースの補体依存性細胞傷害性活性を示す。 ウシ科動物ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、及び両方のアロタイプのバリアントの細胞ベースの補体依存性細胞傷害性活性を示す。 ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳの抗体相同性モデリングを示す。Ａ）ＷＩＮＳＡＳ残基（矢印）を示す拡大サブパネルを用いたタンパク質モデルのオーバーレイ。Ｂ）ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ、及びｂＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳアロタイプのＷＩＮＳＡＳ変異体の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）比較（オングストローム単位）。 細胞ベースのアッセイにおける抗体依存性細胞食作用の排除のためのウシ科動物ＩｇＧ１ａサブクラス上のＦｃ変異を示す。 野生型ウシ科動物ＩｇＧ１ａ分子の分析ＳＥＣを示す。 ウシ科動物ＩｇＧ１ａ野生型（ＷＴ）Ｆｃの質量分析を示す。 ウシ科動物ＩｇＧ１ａ二重変異ＤＰ部位１及び２の質量分析を示す。 切断部位を排除するためのウシ科動物ＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ１ａのＤＰからＥＰへのＦｃ変異体を示す。太字：ＥＰへの「ＤＰ１」（部位１）の変異；下線：ＥＰへの「ＤＰ２」（部位２）の変異。 ｂＩｇＧ１ａ＿ＤＰ１＿ＤＰ２、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ１＿ＤＰ２、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＤＰ１＿ＤＰ２、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＤＰ１＿ＤＰ２の抗体相同性モデリングを示す。Ａ）ＤＰ１及びＤＰ２残基（矢印）を示す拡大サブパネルを用いたタンパク質モデルのオーバーレイ。Ｂ）ウシ科動物Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ１ｃ、及びＧ１ｄアロタイプのＤＰ１＿ＤＰ２変異体の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）比較。 エフェクター機能をノックアウトするためのウシ科動物ＩｇＧ２ａ及びｂＩｇＧ２ａ Ｆｃ変異体を示す。１行目の太字：独立した変異又は組み合わせとしてアラニンに変異された３つの残基Ｌ４３２＊、Ｎ４３４＊、及びＭ４３７＊。垂直線：ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質におけるＦｃ領域の開始。＊変異のアミノ酸残基は、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される。 ウシ科動物ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂサブクラス上のＦｃ変異が、細胞ベースの補体依存性細胞傷害性活性を排除することを示す。 ウシ科動物ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂサブクラス上のＦｃ変異が、細胞ベースの補体依存性細胞傷害性活性を排除することを示す。 ｂＩｇＧ２ａ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ及びｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａの抗体相同性モデリングを示す。Ａ）Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ残基（矢印）を示す拡大サブパネルを用いたタンパク質モデルのオーバーレイ。Ｂ）ウシ科動物ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアロタイプのＬ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ変異体の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）比較。 ウシ科動物ＩｇＧ２ａサブクラス上のＦｃ変異が細胞ベースのアッセイにおける抗体依存性細胞食作用を排除することを示す。 エフェクター機能をノックアウトするためのウシ科動物ＩｇＧ３ａ及びｂＩｇＧ３ａ Ｆｃ変異体を示す。太字：Ｗｉｎｔｅｒ変異（Ｐ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ＊）に関与する残基。ボックス：ＰＡＰからＳＡＳへの変異（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ＊）及びＰＡＰからＳＡＰへの変異（Ｐ３２９Ｓ＊）に関与する残基。垂直線：ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質におけるＦｃ領域の開始。＊変異のアミノ酸残基は、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される。 細胞ベースのアッセイにおける補体依存性細胞傷害性の排除のためのウシ科動物ＩｇＧ３ａ及びＩｇＧ３ｂサブクラス上のＦｃ変異を示す。 細胞ベースのアッセイにおける補体依存性細胞傷害性の排除のためのウシ科動物ＩｇＧ３ａ及びＩｇＧ３ｂサブクラス上のＦｃ変異を示す。 ｂＩｇＧ３ａ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ３ｂ＿ＷＩＮＳＡＳの抗体相同性モデリングを示す。Ａ）ＷＩＮＳＡＳ残基（矢印）を示す拡大サブパネルを用いたタンパク質モデルのオーバーレイ。Ｂ）ウシ科動物ＩｇＧ３ａ及びＩｇＧ３ｂアロタイプのＷＩＮＳＡＳ変異体の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）比較。 ウシ科動物ＩｇＧ３ａサブクラス上のＦｃ変異が細胞ベースのアッセイにおける抗体依存性細胞食作用を排除することを示す。 ｂＦｃＲｎ結合の改善のためのウシ科動物ＩｇＧ３ａ及びＦｃ変異体を示す。太字アルギニン（Ｒ）は、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番された、ヒスチジン（Ｈ）への点変異Ｒ４３３Ｈに関与する残基である。 ヒトＩｇＧ１、ウシ科動物ＩｇＧ１ａ、ウシ科動物ＩｇＧ２ａ、及びウシ科ＩｇＧ３ａのアミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される。図２３に示されるＩｇＧ１（ｂ、ｃ、ｄ）、ＩｇＧ２（ｂ）、及びＩｇＧ３（ｂ）の他の対立遺伝子のアミノ酸残基も、Ｅｕインデックスに従って付番された。 図２３続き。 図２３続き。 図２３続き。 図２３続き。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＩｇＧ１ａ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号１Ｓ８２４０９）のアミノ酸配列を指す。

配列番号２は、ＩｇＧ１ｂ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号Ｘ１６７０１）のアミノ酸配列を指す。

配列番号３は、ＩｇＧ１ｃ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号ＤＱ４５２０１４．１）のアミノ酸配列を指す。

配列番号４は、ＩｇＧ１ｄ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号Ｘ６２９１６．１）のアミノ酸配列を指す。

配列番号５は、ＩｇＧ２ａ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号Ｘ１６７０２．１）のアミノ酸配列を指す。

配列番号６は、ＩｇＧ２ｂ野生型（ＮＣＢＩ ＩＤ番号Ｓ８２４０７）のアミノ酸配列を指す。

配列番号７は、ＩｇＧ３ａ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号８は、ＩｇＧ３ｂ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号９は、乳牛由来のＩｇＧ２ａ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号１０は、ＤＰ１変異を有するＩｇＧ１ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号１１は、ＤＰ２変異を有するＩｇＧ１ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号１２は、ＤＰ１及びＤＰ２変異を有するＩｇＧ１ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号１３は、ＩｇＧ１ａ野生型断片の物理的位置９９～３２９のアミノ酸配列を指す。

配列番号１４は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ１ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号１５は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号１６は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ１ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号１７は、Ｗｉｎｔｅｒ及びＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号１８は、Ｗｉｎｔｅｒ及びＳＳ変異を有するＩｇＧ１ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号１９は、変異Ｌ４３２Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２０は、変異Ｎ４３４Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２１は、変異Ｍ４３７Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２２は、変異Ｌ４３２Ａ及びＭ４３７Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２３は、変異Ｎ４３４Ａ及びＭ４３７Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２４は、変異Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２５は、変異Ｌ４３２Ａ及びＮ４３４Ａを有するＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号２６は、ＩｇＧ３ａ野生型断片の物理的位置９９～３５２のアミノ酸配列を指す。

配列番号２７は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ３ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号２８は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号２９は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ３ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号３０は、Ｗｉｎｔｅｒ及びＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ａ断片のアミノ酸配列を指す。

配列番号３１は、変異Ｒ４３３Ｈを有するＩｇＧ３ａのアミノ酸配列を指す。

配列番号３２は、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を指す。

配列番号３３は、ＩｇＧ１ｂ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号３４は、ＩｇＧ１ｂ野生型の核酸配列を指す。

配列番号３５は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号３６は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号３７は、ＷｉｎＳＳ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号３８は、ＷｉｎＳＳ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号３９は、ＷｉｎＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号４０は、ＷｉｎＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号４１は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号４２は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号４３は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号４４は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号４５は、Ｄ２１６Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号４６は、Ｄ２１６Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号４７は、Ｄ２７０Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号４８は、Ｄ２７０Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号４９は、Ｄ２１６Ｅ及びＤ２７０Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号５０は、Ｄ２１６Ｅ及びＤ２７０Ｅ変異を有するＩｇＧ１ｂの核酸配列を指す。

配列番号５１は、ＩｇＧ２ｂ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号５２は、ＩｇＧ２ｂ野生型の核酸配列を指す。

配列番号５３は、Ｌ４３２Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号５４は、Ｌ４３２Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号５５は、Ｎ４３４Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号５６は、Ｎ４３４Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号５７は、Ｍ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号５８は、Ｍ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号５９は、Ｌ４３２Ａ及びＮ４３４Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号６０は、Ｌ４３２Ａ及びＮ４３４Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号６１は、Ｌ４３２Ａ及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号６２は、Ｌ４３２Ａ及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号６３は、Ｎ４３４Ａ及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号６４は、Ｎ４３４Ａ及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号６５は、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号６６は、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａ変異を有するＩｇＧ２ｂの核酸配列を指す。

配列番号６７は、ＩｇＧ３ｂ野生型のアミノ酸配列を指す。

配列番号６８は、ＩｇＧ３ｂ野生型の核酸配列を指す。

配列番号６９は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号７０は、Ｗｉｎｔｅｒ変異を有するＩｇＧ３ｂの核酸配列を指す。

配列番号７１は、ＷｉｎＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号７２は、ＷｉｎＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ｂの核酸配列を指す。

配列番号７３は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号７４は、ＳＡＳ変異を有するＩｇＧ３ｂの核酸配列を指す。

配列番号７５は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号７６は、ＳＡＰ変異を有するＩｇＧ３ｂの核酸配列を指す。

配列番号７７は、Ｒ４３３Ｈ変異を有するＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列を指す。

配列番号７８は、Ｒ４３３Ｈ変異を有するＩｇＧ３ｂの核酸配列を指す。

配列番号７９は、ｂＩｇＧ１ｂＷｉｎ（Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ）：ＬＰＧＧからＡＡＧＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８０は、ｂＩｇＧ１ｂＷｉｎ（Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ）：ＬＰＧＧからＡＡＧＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８１は、ｂＩｇＧ１ｂＷｉｎＳＳ（Ａ３３０Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＰＳＳの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８２は、ｂＩｇＧ１ｂＷｉｎＳＳ（Ａ３３０Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＰＳＳの隣接核酸配列を指す。

配列番号８３は、ｂＩｇＧ１ｂＳＡＳ（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＳの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８４は、ｂＩｇＧ１ｂＳＡＳ（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＳの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８５は、ｂＩｇＧ１ｂＳＡＰ（Ｐ３２９Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＰの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８６は、ｂＩｇＧ１ｂＳＡＰ（Ｐ３２９Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＰの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８７は、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ１（Ｄ２１６Ｅ）：ＤＰ１からＥＰ１の隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８８は、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ１（Ｄ２１６Ｅ）：ＤＰ１からＥＰ１の隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号８９は、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ２（Ｄ２７０Ｅ）：ＤＰ２からＥＰ２の隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９０は、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ２（Ｄ２７０Ｅ）：ＤＰ２からＥＰ２の隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９１は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９２は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９３は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｎ４３４Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９４は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｎ４３４Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９５は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９６は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９７は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９８は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号９９は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１００は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０１は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０２は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０３は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０４は、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ：ＬＨＮＨＹＭからＡＨＮＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＡＨＹＭ、ＬＨＮＨＹＭからＬＨＮＨＹＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０５は、ｂＩｇＧ３ｂＷｉｎ（Ｐ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ）：ＰＬＧＧからＡＡＧＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０６は、ｂＩｇＧ３ｂＷｉｎ（Ｐ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ）：ＰＬＧＧからＡＡＧＡの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０７は、ｂＩｇＧ３ｂＳＡＳ（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＳの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０８は、ｂＩｇＧ３ｂＳＡＳ（Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＳの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１０９は、ｂＩｇＧ３ｂＳＡＰ（Ｐ３２９Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＰの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１１０は、ｂＩｇＧ３ｂＳＡＰ（Ｐ３２９Ｓ）：ＰＡＰからＳＡＰの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１１１は、ｂＩｇＧ３ｂ＿Ｒ４３３Ｈ：ＡＬＲＮＨからＡＬＨＮＨの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１１２は、ｂＩｇＧ３ｂ＿Ｒ４３３Ｈ：ＡＬＲＮＨからＡＬＨＮＨの隣接アミノ酸配列を指す。

配列番号１１３は、ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）のアミノ酸配列を指す。

〔000154〕本発明の主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解されることができる。本発明は、本明細書で説明及び／又は示される特定の生成物、方法、条件、又はパラメータに限定されず、本明細書で使用される用語は、例としてのみ特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、特許請求される発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

〔000155〕本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

〔000156〕上及び本開示を通じて用いられる場合、以下の用語及び略語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解されるものとする。

定義
〔000157〕本開示において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、複数の指示物を含み、特定の数値への言及は、文脈が別段明らかに示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「分子」又は「化合物」への言及は、当業者に既知のそのような分子又は化合物及びそれらの等価物などのうちの１つ以上への言及である。「複数の」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ超を意味する。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。全ての範囲は、包括的かつ組み合わせ可能である。

〔000158〕本明細書及び特許請求の範囲において、免疫グロブリン重鎖におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）におけるＥｕインデックスのものである。「ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックス」は、ＩｇＧ抗体の残基付番を指し、本明細書では図２３に反映される。

〔000159〕「単離された」という用語は、核酸に関して使用される場合、それが通常、その自然源では会合している少なくとも１つの混入物質である核酸から同定及び分離される核酸である。単離された核酸は、それが自然で見出されるものとは異なる形態又は設定のものである。したがって、単離された核酸分子は、自然の細胞に存在する核酸分子と区別される。単離された核酸分子は、コードされるポリペプチドを通常発現する細胞内に含有された核酸分子を含み、例えば、核酸分子は、自然の細胞のものとは異なるプラスミド又は染色体位置にある。単離された核酸は、一本鎖形態又は二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸分子を利用してタンパク質を発現させる場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、センス鎖又はコード鎖を最小限度に含有するが、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含有する場合がある（すなわち、二本鎖であり得る）。

〔000160〕核酸分子は、別の核酸分子と機能的関係に配置される場合、「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に結合される」。例えば、プロモーター若しくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、核酸のコード配列に作動可能に連結されるか、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、核酸のコード配列に作動可能に連結される。発現する融合タンパク質が、バリアントＦｃ領域ポリペプチドの上流又は下流のいずれかに隣接する異種タンパク質又はその機能的断片を含むように配置されている場合、バリアントＦｃ領域をコードする核酸分子は、異種タンパク質（すなわち、自然で存在するようにＦｃ領域を含まないタンパク質又はその機能的断片）をコードする核酸分子に作動可能に連結され、異種タンパク質は、バリアントＦｃ領域ポリペプチドの直近に隣接し得るか、又は任意の長さ及び組成のリンカー配列によってそれから分離され得る。同様に、ポリペプチド（本明細書で「タンパク質」と同義に使用される）分子は、別のポリペプチドと機能的関係に配置される場合、「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に結合される」。

〔000161〕本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、バリアントＦｃ領域、又はモノクローナル抗体）に関して言及する場合、完全長ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持するそのタンパク質の断片を指す。断片は、６つのアミノ酸のサイズ～完全長ポリペプチドのアミノ酸配列全体から１つのアミノ酸を引いたものまでのサイズの範囲であり得る。本発明のバリアントＦｃ領域ポリペプチドの機能的断片は、本明細書で定義される少なくとも１つの「アミノ酸置換」を保持する。バリアントＦｃ領域ポリペプチドの機能的断片は、Ｆｃ領域と関連することが当該技術分野で既知である少なくとも１つの機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合、細胞表面受容体の下方制御、又は例えば、それが作動可能に結合しているポリペプチドのインビボ若しくはインビトロでの半減期を増加させ得る）を保持する。

〔000162〕「精製された」又は「精製する」という用語は、試料から少なくとも１つの混入物質を実質的に除去することを指す。例えば、抗原特異的抗体は、少なくとも１つの混入物質である非免疫グロブリンタンパク質の完全な又は実質的な（少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、又はより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％）除去によって精製され得、また同じ抗原に結合しない免疫グロブリンタンパク質の除去によっても精製され得る。非免疫グロブリンタンパク質の除去及び／又は特定の抗原に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の抗原特異的免疫グロブリンのパーセントの増加を生じる。別の例では、細菌宿主細胞で発現するポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）は、宿主細胞タンパク質の完全な又は実質的な除去によって精製され、それによって、試料中のポリペプチドのパーセントが増加する。

〔000163〕ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域）を指す「天然」という用語は、本明細書では、ポリペプチドが、自然で一般的に存在するポリペプチドのアミノ酸配列又は自然で存在するその多型からなるアミノ酸配列を有することを示すために使用する。天然ポリペプチド（例えば、天然Ｆｃ領域）は、組換え手段によって生成され得るか、又は自然源から単離され得る。

〔000164〕本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列の発現に必要な、所望のコード配列及び適切な核酸配列を含有する組換えＤＮＡ分子を指す。

〔000165〕本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、インビトロ、又はインサイチュ、又はインビボで配置されているかに関わらず、任意の真核細胞又は原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び昆虫細胞）を指す。

〔000166〕本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域又はバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の概して許容される境界は変動し得るが、ウシ科動物ＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、例えば、図２の垂直線からｃ末端までの範囲と定義される。いくつかの実施形態では、バリアントは、Ｆｃ領域の部分のみを含み、カルボキシ末端を含んでも含まなくてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、概して、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。いくつかの実施形態では、定常ドメインのうちの１つ以上を有するバリアントが企図される。他の実施形態では、そのような定常ドメインを有しない（又はそのような定常ドメインの部分のみを有する）バリアントが企図される。

〔000167〕ウシ科動物ＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、図２の垂直線から始まり、残基２４３まで延在する残基を指す。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点で独特である。２つのＮ連結した分岐状炭水化物鎖が、そのままの天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。

〔000168〕ウシ科動物ＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ３ドメイン」は、概して、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基、例えば、図２の２４４からｃ末端までの残基の範囲である。

〔000169〕「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。エフェクター機能の例としては、限定されないが、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）に作動可能に連結されることを必要とし得、様々なアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＰアッセイ、全血試料又は分別された血液試料からの標的細胞枯渇など）を使用して評価され得る。

〔000170〕「天然配列Ｆｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」は、自然で一般的に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を指す。例示的な天然配列ウシ科動物Ｆｃ領域は、図２の垂直線からｃ末端までである。

〔000171〕「バリアントＦｃ領域」は、本明細書で定義される少なくとも１つの「アミノ酸置換」が理由で、天然配列Ｆｃ領域（又はその断片）のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を有する。代替的な実施形態では、バリアントＦｃ領域は、本明細書に開示の方法に従って生成され得、このバリアントＦｃ領域は、抗体可変ドメイン又は非抗体ポリペプチド、例えば、受容体又はリガンドの結合ドメインなどの選択された異種ポリペプチドに融合され得る。

〔000172〕本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈における「誘導体」という用語は、アミノ酸残基置換の導入によって改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語はまた、ポリペプチドへの任意の種類の分子の共有結合によって修飾されているポリペプチドを指す。例えば、限定されないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾され得る。誘導体ポリペプチドは、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、当業者に既知の技法を使用する化学的修飾によって生成され得る。更に、誘導体ポリペプチドは、それが由来していたポリペプチドと同様又は同一の機能を有する。本発明のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドは、本明細書で定義される誘導体であり得、好ましくは、誘導体化は、Ｆｃ領域内で行われることが理解される。

〔000173〕ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域又はモノクローナル抗体）に関して本明細書で使用される場合、「実質的にウシ科動物起源の」は、ポリペプチドが、天然ウシ科動物アミノポリペプチドのものと少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％相同であるアミノ酸配列を有することを示す。

〔000174〕「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は、Ｆｃ領域（例えば、抗体のＦｃ領域）に結合する受容体を説明するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列ＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域、Ｆｃγ受容体又は「ＦｃｇＲ（Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」に結合し、これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び代替的にはスプライシングされた形態を含む、ＦｃγＲＩ（ＦｃｇＲ１）、ＦｃγＲＩＩ（ＦｃｇＲ２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃｇＲ３）サブクラスの受容体、並びに新規のウシ科動物Ｆｃγ２Ｒ（ｂＦｃｇ２Ｒ又はｂＦｃｇ２Ｒ）を含むものである。別の好ましいＦｃＲとしては、母体ＩｇＧの胎児への移行を担う新生仔受容体であるＦｃＲｎが挙げられる（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書で「ＦｃＲ」という用語によって包含される。

〔000175〕「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」という語句は、ＦｃｇＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、非特異的）（例えば、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ヒトにおけるＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃｇＲ３のみを発現する一方で、単球は、ＦｃｇＲ１、ＦｃｇＲ２、及びＦｃｇＲ３を発現する。文献によれば、ウシ科動物単球及びマクロファージは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソタイプについてＦｃｇＲを発現するが、好中球は、ＩｇＧ２、Ｆｃｇ２Ｒについて多数の受容体を発現するが、ｂＩｇＧ１についてはほとんど又は全く発現しない。

〔000176〕「抗体依存性細胞媒介性食作用」及び「ＡＤＣＰ」という語句は、ＦｃｇＲを発現する食細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞）（例えば、ＦｃｇＲ１、ＦｃｇＲ２ａ、及びＦｃｇＲ３）が、標的細胞上に結合したＩｇＧ抗体Ｆｃ領域を認識し、その後、ＩｇＧオプソニン化された粒子（例えば、細菌、死んだ組織細胞）の貪食につながるシグナル伝達カスケードを誘発する、細胞媒介性反応を指す。

〔000177〕本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」という語句は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施する（好ましくはウシ科動物の）白血球を指す。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃｇＲ３を発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介する白血球の例としては、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然源（例えば、血液又はＰＢＭＣ）から単離され得る。一例では、白血球は、ＦｃｇＲ１、又は他の関連するＦｃγ受容体を発現し、ＡＤＣＰ機能を誘発する。

〔000178〕「改変された」Ｆｃ受容体結合親和性を有するバリアントポリペプチドは、バリアントの親ポリペプチド又は天然Ｆｃを含むポリペプチドと比較して、向上した（すなわち、増加した、より大きい、又はより高い）か、又は減少した（すなわち、低減された、減少した、又はより低い）かのいずれかのＦｃ受容体結合親和性を有するものである。Ｆｃ受容体への増加した結合又は増加した結合親和性を示すバリアントポリペプチドは、親ポリペプチドよりも大きい親和性でＦｃ受容体に結合する。Ｆｃ受容体への減少した結合又は減少した結合親和性を示すバリアントポリペプチドは、その親ポリペプチドよりも低い親和性でＦｃ受容体に結合する。Ｆｃ受容体への減少した結合を示すそのようなバリアントは、Ｆｃ受容体への結合をほとんど又は認識できるほど有しない、例えば、親ポリペプチドと比較して、Ｆｃ受容体Ｆｃ受容体への０～２０％の結合を有し得る。結合アッセイにおけるバリアントポリペプチド及び親ポリペプチドの量が本質的に同じであり、他の全ての条件が同一である場合、その親ポリペプチドと比較して「向上した親和性」でＦｃ受容体に結合するバリアントポリペプチドは、親ポリペプチドよりも高い結合親和性でＦｃ受容体に結合するものである。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又は当業者が利用可能な他の方法において、Ｆｃ受容体結合親和性が決定される場合、例えば、向上したＦｃ受容体結合親和性を有するバリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、Ｆｃ受容体結合親和性における約１．１０倍～約１００倍（より典型的には、約１．２倍～約５０倍）の増加を示し得る。

〔000179〕本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」は、所与のアミノ酸配列における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を、別の異なる「置き換え」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置き換え残基又は複数の置き換え残基は、「自然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝子コードによってコードされる）であり得、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）から選択される。１つ以上の自然に存在しないアミノ酸残基との置換もまた、本明細書のアミノ酸置換の定義に包含される。「自然に存在しないアミノ酸残基」は、上に列挙される自然に存在するアミノ酸残基以外の残基を指し、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基に共有結合することが可能である。自然に存在しないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１－３３６（１９９１）に記載のものなどの他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。

〔000180〕「アッセイシグナル」という用語は、限定されないが、比色アッセイ、蛍光強度、又は分当たりの崩壊からの吸光度測定を含む、タンパク質－タンパク質相互作用を検出する任意の方法からの出力を指す。アッセイ形式は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、又は他の方法を挙げることができる。「アッセイシグナル」における変化は、細胞生存率における変化、並びに／又は動態オフレート、動態オンレート、若しくは両方における変化を反映し得る。「より高いアッセイシグナル」は、測定された出力数が別の数よりも大きいことを指す（例えば、バリアントは、親ポリペプチドと比較して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてより高い（より大きい）測定数を有し得る）。「より低い」アッセイシグナルは、測定された出力数が別の数よりも小さいことを指す（例えば、バリアントは、親ポリペプチドと比較して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてより低い（より小さい）測定数を有し得る）。

〔000181〕「結合親和性」という用語は、各Ｆｃ受容体－Ｆｃ結合相互作用と関連する平衡解離定数（濃度の単位で表される）を指す。結合親和性は、動態オフレート（概して、時間の逆数の単位、例えば、秒^－１で報告される）を動態オンレート（概して、単位時間当たりの濃度の単位、例えば、モル／秒で報告される）で除算した比に直接関係する。概して、これらのパラメータの各々が（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ又はＳＡＰＩＤＹＮＥ測定によって）実験的に決定されない限り、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ又はＫＤ）における変化が、オンレート、オフレート、又は両方の差に起因するかどうかを明確に述べることは不可能である。

〔000182〕本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、Ｆａｂ抗原結合領域を抗体のＦｃ領域に連結させるアミノ酸の範囲を指す。ＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する第１及び最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、整列させることができる。図２に示されるように、例えば、ウシ科動物ＩｇＧ定常領域におけるヒンジ領域は、残基９９から始まり、垂直線まで延在する。

〔000183〕「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒ及びＣ１ｓと一緒になって、ＣＤＣ経路の第１の構成要素である複合体Ｃ１を形成する。

〔000184〕本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」と同義に使用され、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性又は機能的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に網羅する。異なる種に由来する部分を含む、一本鎖抗体、及びキメラ、ウシ科動物、又はウシ化（ｂｏｖｉｎｉｚｅｄ）抗体、並びにキメラ又はＣＤＲを移植された一本鎖抗体などもまた、本発明及び「抗体」という用語に包含される。これらの抗体の様々な部分は、従来の技法によって化学的に一緒に合成的に結合され得るか、又は遺伝子工学技術を使用して連続したタンパク質として調製され得る。例えば、キメラ又はウシ化鎖をコードする核酸は、連続したタンパク質を生成するように発現し得る。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第４，８１６，３９７号、ＷＯ８６／０１５３３、米国特許第５，２２５，５３９号、及び米国特許第５，５８５，０８９号、及び同第５，６９８，７６２号を参照されたい。また、霊長類化抗体に関してはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５－１４６０，１９９３、並びに一本鎖抗体に関してはＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６，１９８８を参照されたい。本明細書では、Ｆｃ領域（又はその一部分）を含む抗体の全ての形態が、「抗体」という用語内に包含されることが理解される。更に、抗体は、当該技術分野で既知の方法に従って、検出可能な標識で標識され、固相上に固定化され、及び／又は異種化合物（例えば、酵素又は毒素）とコンジュゲートされ得る。

〔000185〕本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、そのままの抗体の一部分を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、線状抗体；一本鎖抗体分子；Ｆｃ又はＦｃ’ペプチド、Ｆａｂ及びＦａｂ断片、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片は、好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、及び任意選択的に、ＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域を保持する。他の好ましい実施形態では、抗体断片は、ＣＨ２領域の少なくとも一部分又はＣＨ２領域全体を含む。

〔000186〕本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、モノクローナル抗体に関して使用される場合、依然として機能的活性を保持するモノクローナル抗体の一部分を指すことが意図される。機能的活性は、例えば、抗原結合活性又は特異性、受容体結合活性又は特異性、エフェクター機能活性などであり得る。モノクローナル抗体機能的断片としては、例えば、ＶＬ、ＶＨ、及びＦｄなどの個々の重鎖又は軽鎖、及びそれらの断片；Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦａｂ’などの一価断片；Ｆ（ａｂ’）２などの二価断片；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；並びにＦｃ断片が挙げられる。そのような用語は、例えば、Ｈａｒｌｏｗｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９－２２４（１９９３）、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７－５１５（１９８９）、及びＤａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）に記載されている。機能的断片という用語は、例えば、モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化又は還元によって、及び当業者に既知の組換えＤＮＡ方法によって生成される断片を含むことが意図される。

〔000187〕本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５、１５、２０、２５、４０、５０、７０、９０、１００個以上の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチドの断片は、完全長ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。

〔000188〕本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、一価、二価、又は多価の免疫グロブリンを含む。一価キメラ抗体は、キメラ軽鎖とのジスルフィド架橋を通じて会合しているキメラ重鎖によって形成された二量体である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を通じて会合している２つの重鎖－軽鎖二量体によって形成された四量体である。ウシ科動物で使用するための抗体のキメラ重鎖は、ＣＨ１又はＣＨ２などのウシ科動物重鎖定常領域の少なくとも一部分に連結される、非ウシ科動物抗体の重鎖に由来する抗原結合領域を含む。ウシ科動物で使用するための抗体のキメラ軽鎖は、ウシ科動物軽鎖定常領域（ＣＬ）の少なくとも一部分に連結される、非ウシ科動物抗体の軽鎖に由来する抗原結合領域を含む。同じか又は異なる可変領域結合特異性のキメラ重鎖及び軽鎖を有する抗体、断片、又は誘導体はまた、既知の方法ステップに従って、個々のポリペプチド鎖の適切な会合によって調製され得る。このアプローチを用いて、キメラ軽鎖を発現する宿主と、キメラ重鎖を発現する宿主とを別個に培養し、免疫グロブリン鎖を別個に回収し、次いで会合させる。代替的に、宿主を同時培養し、鎖を培養培地中で自発的に会合させ、続いて組み立てられた免疫グロブリン、若しくは断片を回収してもよく、又は重鎖及び軽鎖の両方を同じ宿主細胞内で発現させてもよい。キメラ抗体を生成するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，２８４，４７１号、同第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、及び同第４，８１６，３９７号を参照されたい）。

〔000189〕本明細書で使用される場合、非ウシ科動物（例えば、マウス）抗体の「ウシ化」形態（すなわち、ウシ化抗体）は、非ウシ科動物免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含有するか又は配列を全く含有しない抗体である。ほとんどの場合、ウシ化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ヒト、又は非ヒト霊長類などの非ウシ科動物種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたウシ科動物免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ウシ科動物免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ウシ科動物残基によって置き換えられる。更に、ウシ化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、概して、抗体性能を更に向上するために行われる。概して、ウシ化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループ（ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ウシ科動物免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基の全て又は実質的に全てがウシ科動物免疫グロブリン配列のものである。ウシ化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはウシ科動物免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含み得る。

〔000190〕本明細書で使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種の「アドヘシン」タンパク質（例えば、受容体、リガンド、又は酵素）の結合ドメインを免疫グロブリン定常ドメインと組み合わせる抗体様分子を示す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外である（すなわち、「異種」である）、所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。

〔000191〕本明細書で使用される場合、「リガンド結合ドメイン」という用語は、対応する天然受容体の少なくとも定性的なリガンド結合能力を保持する任意の天然受容体、又はその任意の領域若しくは誘導体を指す。ある特定の実施形態では、受容体は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それにも関わらず、この定義によって具体的に網羅される他の受容体は、サイトカインの受容体であり、特に、チロシンキナーゼ活性を有する受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチン及び神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバー、並びに細胞接着分子（例えば、Ｅ－、Ｌ－、及びＰ－セレクチン）である。

〔000192〕本明細書で使用される場合、「受容体結合ドメイン」という用語は、例えば、細胞接着分子、又は対応する天然リガンドの少なくとも定性的な受容体結合能力を保持するそのような天然リガンドの任意の領域若しくは誘導体を含む、受容体の任意の天然リガンドを指す。

〔000193〕本明細書で使用される場合、「単離された」ポリペプチドは、その自然環境の構成要素から同定及び分離、並びに／又は回収されているポリペプチドである。その自然環境の混入構成要素は、ポリペプチドの診断的又は治療的使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を挙げることができる。ある特定の実施形態では、単離されたポリペプチドは、（１）ローリー方法によって決定して、ポリペプチドの９５重量％超、好ましくは９９重量％超まで、（２）回転カップシークエネータの使用によってＮ末端若しくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくは銀染色を使用する、還元又は非還元条件下でのＳＤＳ－ｐａｇｅによって均質性まで精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないであろうことから、組換え細胞内のインサイチュでのポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。

〔000194〕本明細書で使用される場合、「障害」及び「疾患」という用語は、慢性及び急性障害又は疾患（例えば、患者の特定の障害の素因となる病理学的状態）を含む、バリアントポリペプチド（本発明のバリアントＦｃ領域を含むポリペプチド）を用いた治療から利益を得るであろう任意の状態を指すために同義的に使用される。

〔000195〕本明細書で使用される場合、「受容体」という用語は、少なくとも１つのリガンドに結合することが可能なポリペプチドを指す。好ましい受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び任意選択的に、他のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、及び／又は膜アンカー）を有する細胞表面又は可溶性受容体である。本明細書に記載のアッセイで評価される受容体は、そのままの受容体、又はその断片若しくは誘導体（例えば、１つ以上の異種ポリペプチドに融合された受容体の結合ドメインを含む融合タンパク質）であり得る。更に、その結合特性について評価される受容体は、細胞内に存在し得るか、又は単離され得、任意選択的に、アッセイプレート又はいくつかの他の固相上にコーティングされ得るか、又は直接標識され、プローブとして使用され得る。

〔000196〕本明細書で使用する場合、親抗体と比較してウシ科動物エフェクター細胞の存在下で、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をノックアウト又はノックダウンするバリアントポリペプチドは、アッセイで使用されるバリアントポリペプチド及び親抗体の量が本質的に同じである場合、インビトロ又はインビボでは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣの媒介において実質的に活性が低いものである。例えば、そのようなバリアントは、同一のＡＤＣＣアッセイにおける親ポリペプチドよりも、所与のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣアッセイにおいて、低い、好ましくは無視できる量の標的細胞溶解又は食作用を引き起こす。そのようなバリアントは、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣアッセイを使用して同定されてもよいが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣ活性を決定するための他のアッセイ又は方法もまた用いられてもよい（例えば、動物モデル）。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドよりもＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣの媒介において約１００、７５、５０、又は２５パーセント少ない活性である。

ウシ科動物野生型ＩｇＧ
〔000197〕ウシ科動物ＩｇＧは、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｙｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２６（９），ｐａｇｅｓ ８４１－８５０、Ｋａｃｓｋｏｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．３３（２），ｐａｇｅｓ １８９－１９５、Ｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６５（１），ｐａｇｅｓ ３２－３８、及びＲａｂｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．４６（４），ｐａｇｅｓ ３２６－３３１に完全に記載されている。

〔000198〕一実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。別の実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧは、ＩｇＧ２である。更に別の実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧは、ＩｇＧ３である。一例では、ＩｇＧ１は、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ１ｃ、又はＩｇＧ１ｄである。別の例では、ＩｇＧ２は、ＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ２ｂである。更に別の例では、ＩｇＧ３は、ＩｇＧ３ａ又はＩｇＧ３ｂである。

〔000199〕ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ１ｃ、ＩｇＧ１ｄ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３ａ、及びＩｇＧ３ｂのアミノ酸配列及び核酸配列もまた、当該技術分野で周知である。

〔000200〕一例では、本発明のＩｇＧは、定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。別の例では、本発明の定常ドメインは、例えば、ＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、Ｆｃ領域を含む。

〔000201〕特定の例では、野生型定常ドメインは、配列番号１～８に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ１ｃ、ＩｇＧ１ｄ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３ａ、及びＩｇＧ３ｂの野生型定常ドメインは、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、及び８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＩｇＧ定常ドメインは、配列番号１～８のうちのいずれか１つの相同体、バリアント、異性体、又は機能的断片であるが、本明細書に記載のいかなる変異も有しない。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。例えば、一実施形態では、特定の実施形態では、ＩｇＧ２ａの野生型定常ドメインは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

〔000202〕ＩｇＧコンタント（ｃｏｎｔａｎｔ）ドメインはまた、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列と実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実質的に同じアミノ酸配列は、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８（１９８８）に従ってＦＡＳＴＡ検索方法によって決定して、比較したアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列として本明細書で定義される。

〔000203〕本発明はまた、本明細書に記載のＩｇＧ又はそれらの一部分をコードする核酸分子を含む。一実施形態では、核酸は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域、又はそれらの組み合わせを含む抗体重鎖をコードし得る。別の実施形態では、核酸は、例えば、それらの任意のバリアントを含む、ＶＨ領域若しくはそれらの一部分のうちのいずれか１つ、又はＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つを含む抗体重鎖をコードし得る。本発明はまた、例えば、それらの任意のバリアントを含む、ＣＬ領域若しくはそれらの一部分のうちのいずれか１つ、ＶＬ領域若しくはそれらの一部分のうちのいずれか１つ、又はＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つを含む抗体軽鎖をコードする核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、重鎖及び軽鎖、又はそれらの部分の両方をコードする。

〔000204〕配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９に記載の野生型定常ドメインのアミノ酸配列は、その対応する核酸配列によってコードされる。

修飾されたウシ科動物ＩｇＧ
〔000205〕本出願の発明者らは、驚くべきことに、そして予想外にも、２１６位、２３４位、２３５位、２３７位、２７０位、３２９位、３３０位、３３１位、４３２位、４３４位、４３７位、又は４３３位のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することが、所望効果を示したことを見出した。本明細書で使用される場合、位置という用語は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））におけるＥＵインデックスに従って付番された位置を指す。一実施形態では、所望の効果は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧと比較して、補体依存性細胞傷害性を排除又は低減することである。別の実施形態では、所望の効果は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧと比較して、抗体依存性細胞食作用を排除又は低減することである。更に別の実施形態では、所望の効果は、ＩｇＧのＦｃγ受容体（ｂＦｃｇＲ）への結合を排除又は低減することである。

〔000206〕一実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧであって、置換が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番されたアミノ酸残基２１６、２３４、２３５、２３７、２７０、３２９、３３０、３３１、４３２、４３４、４３７、又は４３３にある、修飾されたＩｇＧを提供する。これらの位置のアミノ酸は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。置換アミノ酸の例としては、例えば、限定されないが、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びプロリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、非天然アミノ酸である。

〔000207〕本発明の修飾されたウシ科動物ＩｇＧは、当業者に既知の任意の好適なウシ科動物ＩｇＧであり得る。修飾されたウシ科動物ＩｇＧの例としては、ＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ１ｃ、又はＩｇＧ１ｄ）、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）、又はＩｇＧ３（ＩｇＧ３ａ又はＩｇＧ３ｂ）の修飾されたバリアントが挙げられる。

ＩｇＧ１
〔000208〕例示的な一実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧは、例えば、修飾されたＩｇＧ１ａ、修飾されたＩｇＧ１ｂ、修飾されたＩｇＧ１ｃ、又は修飾されたＩｇＧ１ｄを含む、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１である。

〔000209〕一実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ１であって、置換が、アミノ酸残基３２９、３３０、３３１、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ１を提供する。３２９位、３３０位、又は３３１位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、セリンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、又は３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含む。

〔000210〕一態様では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、ＰＡＰからＳＡＰへの変異、ＰＡＰからＳＡＳへの変異、ＳＳ変異、Ｗｉｎｔｅｒ部位変異、又はそれらの組み合わせを含む。ＰＡＰからＳＡＰへの変異には、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）が含まれる。ＳＳ変異には、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、及び３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）が含まれる。

〔000211〕Ｗｉｎｔｅｒ部位は、アミノ酸残基２３４、２３５、２３７、又はそれらの組み合わせでの置換を含んでもよい。したがって、別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ１であって、置換が、アミノ酸残基２３４、２３５、若しくは２３７、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ１を提供する。２３４位、２３５位、又は２３７位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、アラニンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、２３４位でのプロリンのアラニンとの置換（Ｐ２３４Ａ）、２３５位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ２３５Ａ）、又は２３５位でのグリシンのアラニンとの置換（Ｇ２３７Ａ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000212〕例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000213〕一態様では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、ＤＰ部位のアミノ酸残基において置換を含む。したがって、別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ１であって、置換が、アミノ酸残基２１６、２７０、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ１を提供する。２１６位又は２７０位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、グルタミン酸との置換である。具体的には、一例では、置換は、２１６位でのアスパラギン酸のグルタミン酸（Ｄ２１６Ｅ）との置換又は２７０位でのアスパラギン酸のグルタミン酸との置換（Ｄ２７０Ｅ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｄ２１６Ｅ及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む。

〔000214〕例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２１６Ｅ、及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む。

〔000215〕別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ１であって、当該置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ１を提供する。４３２位、４３４位、又は４３７位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、アラニンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、４３７位でのスレオニンのアラニンとの置換（Ｔ４３７Ａ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000216〕別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２１６Ｅ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

ＩｇＧ２
〔000217〕別の例示的な実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧは、例えば、修飾されたＩｇＧ２ａ又は修飾されたＩｇＧ２ｂを含む、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ２である。修飾されたウシ科動物ＩｇＧ２は、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、及び３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）を含む、ＳＳ変異を含み得る。一実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ２であって、置換が、アミノ酸残基３３０、３３１、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ２を提供する。３３０位又は３３１位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、セリンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、又は３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインは、置換Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含む。

〔000218〕別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ２であって、置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ２を提供する。４３２位、４３４位、又は４３７位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、アラニンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、又は４３７位でのメチオニンのアラニンとの置換（Ｍ４３７Ａ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインは、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000219〕別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ２定常ドメインは、置換Ａ３３０Ｓ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

ＩｇＧ３
〔000220〕別の例示的な実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧは、例えば、修飾されたＩｇＧ３ａ又は修飾されたＩｇＧ３ｂを含む、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ３である。

〔000221〕一実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ３であって、置換が、アミノ酸残基３２９、３３０、３３１、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ３を提供する。３２９位、３３０位、又は３３１位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、セリンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、又は３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含む。

〔000222〕一態様では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、ＰＡＰからＳＡＰへの変異、ＰＡＰからＳＡＳへの変異、ＳＳ変異、Ｗｉｎｔｅｒ部位変異、又はそれらの組み合わせを含む。上述のように、ＰＡＰからＳＡＰへの変異は、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）を含み、ＰＡＰからＳＡＳへの変異は、３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）を含み、ＳＳ変異は、３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）との組み合わせで、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）を含む。

〔000223〕上記のように、Ｗｉｎｔｅｒ部位は、アミノ酸残基２３４、２３５、２３７、又はそれらの組み合わせでの置換を含み得る。したがって、別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ３であって、当該置換が、アミノ酸残基２３４、２３５、若しくは２３７、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ３を提供する。２３４位、２３５位、又は２３７位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、アラニンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、２３４位でのプロリンのアラニンとの置換（Ｐ２３４Ａ）、２３５位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ２３５Ａ）、又は２３５位でのグリシンのアラニンとの置換（Ｇ２３７Ａ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000224〕例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000225〕一態様では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、ＤＰ部位のアミノ酸残基において置換を含む。したがって、別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ３であって、置換が、アミノ酸残基２７０にあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ３を提供する。２７０位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、グルタミン酸との置換である。具体的には、一例では、置換は、２７０位でのアスパラギン酸位のアスパラギン酸のグルタミン酸との置換（Ｄ２７０Ｅ）である。

〔000226〕例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む。

〔000227〕別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ３であって、置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ３を提供する。４３２位、４３４位、又は４３７位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、アラニンとの置換である。具体的には、一例では、置換は、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、又は４３７位でのリジンのアラニンとの置換（Ｋ４３７Ａ）である。いくつかの実施形態では、修飾されたウシ科動物ＩｇＧ１定常ドメインは、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＫ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000228〕別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＫ４３７Ａのうちの１つ以上を含む。

〔000229〕したがって、更に別の実施形態では、本発明は、野生型ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧ３であって、当該置換が、アミノ酸残基４３３にあり、アミノ酸残基位置が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される、修飾されたＩｇＧ３を提供する。４３３位のアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、置換は、ヒスチジンとの置換である。具体的には、一実施形態では、置換は、４３３位でのアスパラギンのヒスチジンとの置換（Ｒ４３３Ｈ）である。

〔000230〕更に別の例示的な実施形態では、ウシ科動物ＩｇＧ３定常ドメインは、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｋ４３７Ａ、及びＲ４３３Ｈのうちの１つ以上を含む。

〔000231〕特定の例では、本発明の変異型ＩｇＧ１定常ドメインは、配列番号１０～１２及び１４～１８に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＩｇＧ１定常ドメインは、配列番号１０～１２及び１４～１８のうちのいずれか１つの相同体、バリアント、異性体、又は機能的断片であるが、本明細書に記載の本発明の変異を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

〔000232〕別の例では、本発明の変異型ＩｇＧ２定常ドメインは、配列番号１９～２５に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＩｇＧ２定常ドメインは、配列番号１９～２５のうちのいずれか１つの相同体、バリアント、異性体、又は機能的断片であるが、本明細書に記載の本発明の変異を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

〔000233〕特定の例では、本発明の変異型ＩｇＧ３定常ドメインは、配列番号２７～３１に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＩｇＧ３定常ドメインは、配列番号２７～３１のうちのいずれか１つの相同体、バリアント、異性体、又は機能的断片であるが、本明細書に記載の本発明の変異を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

〔000234〕配列番号１０～１２、１４～２５、及び２７～３１に記載の変異型定常ドメインのアミノ酸配列は、その対応する変異型核酸配列によってコードされる。

本発明の抗体分子を作製するための方法
〔000235〕抗体分子を作製するための方法は、当該技術分野で周知であり、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９４，９２５号、同第８，０８８，３７６号、同第８，５４６，５４３号、同第１０，３３６，８１８号、及び同第９，８０３，０２３号、並びに米国特許出願公開第２００６／００６７９３０号に完全に記載されている。当業者に既知の任意の好適な方法、プロセス、又は技法を使用することができる。本発明のバリアントＦｃ領域を有する抗体分子は、当該技術分野で周知の方法に従って生成され得る。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、受容体又はリガンドの抗体可変ドメイン又は結合ドメインなどの選択された異種ポリペプチドに融合され得る。

〔000236〕分子生物学の方法及び組換え技術の出現によって、当業者は、組換え手段によって抗体及び抗体様分子を生成し、それによって抗体のポリペプチド構造に見出される特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を生成することができる。そのような抗体は、当該抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングするか、又は当該ポリペプチド鎖を直接合成し、合成された鎖を組み立てて、特定のエピトープ及び抗原決定基に対する親和性を有する活性四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成することのいずれかによって生成され得る。これによって、異なる種及び供給源からの抗体を中和することを特徴とする配列を有する抗体の即時生成が可能になった。

〔000237〕抗体の供給源、又はインビトロ若しくはインビボで、研究室サイズ若しくは市販のサイズの大細胞培養物であるトランスジェニック動物を使用して、トランスジェニック植物を使用して、又はプロセスのいずれの段階でも生体を用いない直接化学的合成によって、それらがどのように組換え構築されたか、又はどのように合成されたかに関わらず、全ての抗体は、全体的に同様の三次元構造を有する。この構造は、多くの場合、Ｈ２Ｌ２として提供され、抗体が、一般的に、２つの軽鎖（Ｌ）アミノ酸及び２つの重鎖（Ｈ）アミノ酸を含むという事実を指す。両方の鎖は、構造的に相補的な抗原標的と相互作用することが可能な領域を有する。標的と相互作用する領域は、「可変」又は「Ｖ」領域と称され、アミノ酸配列における、異なる抗原特異性の抗体との違いを特徴とする。Ｈ又はＬ鎖のいずれかの可変領域は、抗原標的に特異的に結合することが可能なアミノ酸配列を含有する。

〔000238〕本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含有する、抗体分子の一部分を指す。抗体結合領域は、抗原結合残基の適切な立体構造を維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。抗原結合領域を提供するＨ又はＬ鎖の可変領域内には、異なる特異性の抗体間の極端な可変性の理由である、「超可変」と称されるより小さい配列が存在する。そのような超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」とも称される。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性を担う。

〔000239〕ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の非連続的な範囲を表すが、種に関わらず、可変重鎖及び軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列が配置される位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様の位置を有することが見出されている。全ての抗体の可変重鎖及び軽鎖は、各々３つのＣＤＲ領域を有し、各々が他と非連続である。全ての哺乳類種において、抗体ペプチドは、定常（すなわち、高度に保存された）領域及び可変領域を含有し、後者の中には、ＣＤＲと、重鎖又は軽鎖の可変領域内であるが、ＣＤＲの外側にある、アミノ酸配列で構成されるいわゆる「フレームワーク領域」とが存在する。

〔000240〕本発明は、上述の核酸のうちの少なくとも１つを含むベクターを更に提供する。遺伝子コードは劣化するので、特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが使用され得る。遺伝コードを使用して、１つ以上の異なるヌクレオチド配列が同定され得、これらの各々が、アミノ酸をコードすることが可能であろう。特定のオリゴヌクレオチドが実際に実際のコード配列を構成するであろう確率は、抗体又は部分を発現する真核細胞又は原核細胞における、異常な塩基対合関係、及び特定のコドンが（特定のアミノ酸をコードするために）実際に使用される頻度を考慮することによって推定することができる。そのような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１８３ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１－１２（１９８５）によって開示されている。Ｌａｔｈｅの「コドン使用規則」を使用して、ウシ科動物ＩｇＧ配列をコードすることが可能な理論的な「最も可能性の高い」ヌクレオチド配列を含有する、単一ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列のセットを同定することができる。また、本発明で使用するための抗体コード領域は、本明細書に記載の抗体及びペプチドのバリアントを生じる標準的な分子生物学的技法を使用して、既存の抗体遺伝子を改変することによっても提供され得ることが意図される。そのようなバリアントとしては、限定されないが、抗体又はペプチドのアミノ酸配列における欠失、付加、及び置換が挙げられる。

〔000241〕例えば、置換の１つの部類は、保存的アミノ酸置換である。そのような置換は、ウシ科動物抗体ペプチド中の所与のアミノ酸を、同様の特徴を有する別のアミノ酸によって置換するものである。保存的置換として典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びｌｉｅの間の互いの置き換え；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｉｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置き換えなどである。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，２４７Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０６－１０（１９９０）に見出される。

〔000242〕バリアントウシ科動物抗体又はペプチドは、完全に機能し得るか、又は１つ以上の活性において機能を欠き得る。完全に機能的なバリアントは、典型的には、保存的変異、又は重要ではない残基若しくは重要ではない領域における変異のみを含有する。機能的バリアントはまた、機能を変化させないか、又はわずかに変化させる同様のアミノ酸の置換も含有し得る。代替的に、そのような置換は、ある程度まで正又は負の影響を及ぼし得る。非機能的バリアントは、典型的には、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、若しくは切断、又は重要な残基又は重要な領域における置換、挿入、逆位、若しくは欠失を含有する。

〔000243〕機能に不可欠なアミノ酸は、部位指向性変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当該技術分野で既知の方法によって同定することができる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２４４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８１－８５（１９８９）。後者の手順は、分子中の全ての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異型分子を、エピトープ結合又はインビトロＡＤＣＣ活性などの生物学的活性について試験する。リガンド－受容体結合に重要な部位はまた、エピトープマッピング（例えば、ＨＤＸ）、結晶学、核磁気共鳴、又は光親和性標識などの構造分析によって決定することができる。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２２４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９－９０４（１９９２）、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，２５５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６－１２（１９９２）。

〔000244〕更に、ポリペプチドは、多くの場合、２０の「天然に存在する」アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。更に、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、又は当該技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾され得る。既知の修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質に対するアミノ酸のトランスファー－ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が挙げられる。かかる修飾は、当業者に周知であり、科学文献に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，１９９３）などの最も基本的な教本に記載されている。この主題について、Ｗｏｌｄ，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１－１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１８２ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６２６－４６（１９９０）、及びＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．６６３ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４８－６２（１９９２）などによる多くの詳細なレビューが入手可能である。

〔000245〕別の態様では、本発明は、抗体誘導体を提供する。抗体の「誘導体」は、通常、タンパク質の一部ではない追加の化学的部分を含有する。タンパク質の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入され得る。例えば、当該技術分野で周知の二官能性薬剤を用いる誘導体化は、抗体又は断片を水不溶性支持体マトリックス又は他の巨大分子担体に架橋するのに有用である。

〔000246〕誘導体はまた、標識される放射標識されたモノクローナル抗体を含む。例えば、放射性ヨウ素（２５１，１３１１）、炭素（４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、インジウム、トリチウム（Ｈ^３）など；ビオチン又はアビジンを含むモノクローナル抗体と、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボン酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又はグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素とのコンジュゲート；及びまたモノクローナル抗体と、生物発光剤（ルシフェラーゼなど）、化学発光剤（アクリジンエステルなど）、又は蛍光剤（フィコビルタンパク質など）とのコンジュゲートが用いられる。

〔000247〕本発明の別の誘導体二官能性抗体は、２つの異なる抗原基を認識する２つの別個の抗体の部分を組み合わせることによって生成される、二重特異性抗体である。これは、架橋又は組換え技法によって達成され得る。加えて、部分を、抗体又はその一部分に添加して、（例えば、血流からのクリアランスまでの時間を延長することによってインビボでの半減期を増加させることができる。そのような技法としては、例えば、ＰＥＧ部分を付加すること（ペグ化とも称される）が挙げられ、当該技術分野で周知である。米国特許出願公開第２００３／００３１６７１号を参照されたい。

〔000248〕いくつかの実施形態では、主題の抗体をコードする核酸は、宿主細胞に直接導入され、細胞は、コードされた抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。主題の核酸が細胞に導入された後、細胞は、典型的には、抗体の発現を可能にするために、通常、３７℃で、時には選択下で、約１～２４時間の期間の間インキュベートされる。一実施形態では、抗体は、細胞が成長している培地の上清に分泌される。従来的には、モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ株において天然分子として生成されている。その技術に加えて、本発明は、抗体の組換えＤＮＡ発現を提供する。これによって、選択された宿主種における抗体の生成、並びに抗体誘導体及び融合タンパク質のスペクトルの生成が可能になる。

〔000249〕本発明の少なくとも１つの抗体、部分、又はポリペプチドをコードする核酸配列は、ライゲーションのための平滑末端又は突出末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、粘着末端の適切な充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び適切なライガーゼによるライゲーションを含む従来の技法に従って、ベクターＤＮＡと組換えられ得る。そのような操作のための技法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８２ ａｎｄ １９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９３（上記）によって開示されており、これらを使用して、抗体分子又はその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築することができる。

〔000250〕ＤＮＡなどの核酸分子は、転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」場合、ポリペプチドを「発現することが可能である」と言われる。操作可能な連結は、調節ＤＮＡ配列と、発現させようとするＤＮＡ配列とが、回収可能な量でペプチド又は抗体部分としての遺伝子発現を可能にするような方式で接続される連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、類似の技術において周知であるように、生物によって変動し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上記）を参照されたい。

〔000251〕したがって、本発明は、原核細胞又は真核細胞のいずれかにおける抗体又はペプチドの発現を包含する。好適な宿主としては、インビボ若しくはインサイチュでの、又は哺乳類、昆虫、鳥類、若しくは酵母起源の宿主細胞のいずれかにおける細菌、酵母、昆虫、真菌、鳥類、及び哺乳類細胞を含む、細菌又は真核生物宿主が挙げられる。哺乳類細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、又はネコ起源のものであり得る。また、当該技術分野で既知の任意の他の好適な哺乳類細胞を使用してもよい。

〔000252〕一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、レシピエント宿主における自律複製が可能なプラスミド又はウイルスベクターに組み込まれるであろう。多種多様なベクターのうちのいずれかが、この目的のために用いられ得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上記）を参照されたい。特定のプラスミド又はウイルスベクターの選択に重要な要因としては、ベクターを含有するレシピエント細胞が認識され、ベクターを含有しないレシピエント細胞から選択されることができる容易さ；特定の宿主において望ましいベクターのコピーの数；及び異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」することが可能であることが望ましいかどうか、が挙げられる。

〔000253〕当該技術分野で既知の原核生物ベクターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ内で複製可能なもの（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏＩＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、．ｐｉ．ｖＸなど）などのプラスミドが挙げられる。そのようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａＩ．，１９８９（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９３（上記）によって開示されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。そのようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎによる、ＴＨＥ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯ．ＯＦ ＴＨＥ ＢＡＣＩＬＬＩ ３０７－３２９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８２）に開示されている。好適なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１６９ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４１７７－８３（１９８７）、及びｐｈＬＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＸＴＨ ＩＮＴ’Ｌ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＯＮ ＡＣＴＩＮＯＭＹＣＥＴＡＬＥＳ ＢＩＯ．４５－５４（Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ１９８６）などのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージが挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドは、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａＩ．，８ Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６９３－７０４（１９８６）、ｌｚａｋｉ，３３ Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７２９－４２（１９７８）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａＩ．，１９９３（上記）でレビューされている。

〔000254〕代替的に、ｃＤＮＡをコードする抗体又はペプチドの発現に有用な遺伝子発現要素としては、限定されないが、（ａ）ＳＶ４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａＩ．，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａＩ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ６７７７（１９８２）、及びＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａＩ．，４１ Ｃｅｌｌ ８８５（１９８５）などのウイルス転写プロモーター及びそのエンハンサー要素、（ｂ）ＳＶ４０後期領域に由来するもの（Ｏｋａｙａｒｅａ ｅｔ ａＩ．，１９８３）などのスプライス領域及びポリアデニル化部位、並びに（ｃ）ＳＶ４０（Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａＩ．，１９８３）などのポリアデニル化部位が挙げられる。

〔000255〕免疫グロブリンｃＤＮＡ遺伝子は、ＳＶ４０初期プロモーター及びそのエンハンサー、マウス免疫グロブリンＨ鎖プロモーターエンハンサー、ＳＶ４０後期領域ｍＲＮＡスプライシング、ウサギＳ－グロビン介入配列、免疫グロブリン、及びウサギＳ－グロビンポリアデニル化部位、及びＳＶ４０ポリアデニル化要素を発現要素として使用して、Ｗｅｉｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，５１Ｇｅｎｅ２１（１９８７）によって記載されるように発現され得る。ｃＤＮＡ部分、ゲノムＤＮＡ部分（Ｗｈｉｔｔｌｅ ｅｔ ａＩ．，１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．４９９（１９８７））で構成されている免疫グロブリン遺伝子では、転写プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスであり得、プロモーターエンハンサーは、サイトメガロウイルス及びマウス／ヒト免疫グロブリンであり得、ｍＲＮＡスプライシング及びポリアデニル化領域は、天然染色体免疫グロブリン配列であり得る。

〔000256〕一実施形態では、げっ歯類細胞におけるｃＤＮＡ遺伝子の発現では、転写プロモーターは、ウイルスＬＴＲ配列であり、転写プロモーターエンハンサーは、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサー及びウイルスＬＴＲエンハンサーのいずれか又は両方であり、スプライス領域は、３１ｂｐ超のイントロンを含有し、ポリアデニル化及び転写終結領域は、合成される免疫グロブリン鎖に対応する天然染色体配列に由来する。他の実施形態では、他のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、上に列挙された発現要素と組み合わせて、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現を達成する。

〔000257〕各融合遺伝子は、発現ベクターに組み立てられるか、又は発現ベクター内に挿入され得る。次いで、免疫グロブリン鎖遺伝子生成物を発現することが可能なレシピエント細胞は、ペプチド若しくはＨ若しくはＬ鎖コード遺伝子で単一でトランスフェクトされるか、又はＨ及びＬ鎖遺伝子と同時トランスフェクトされる。トランスフェクトされたレシピエント細胞は、組み込まれた遺伝子の発現を可能にする条件下で培養され、発現した免疫グロブリン鎖又はそのままの抗体又は断片が培養物から回収される。

〔000258〕一実施形態では、ペプチド若しくはＨ及びＬ鎖、又はそれらの部分をコードする融合遺伝子は、次いで、レシピエント細胞を同時トランスフェクションするために使用される別個の発現ベクターに組み立てられる。代替的に、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする融合遺伝子は、同じ発現ベクター上に組み立てられ得る。発現ベクターのトランスフェクション及び抗体の生成のためのレシピエント細胞株は、骨髄腫細胞であり得る。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成、組み立て、分泌することができ、免疫グロブリンのグリコシル化の機序を有する。骨髄腫細胞は、培養物中又は分泌された免疫グロブリンが、腹水から得られ得るマウスの腹腔内で増殖され得る。他の好適なレシピエント細胞としては、ウシ科動物若しくは非ウシ科動物起源のＢリンパ球などのリンパ球細胞、ウシ科動物若しくは非ウシ科動物起源のハイブリドーマ細胞、又は種間ヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられる。

〔000259〕本発明の抗体構築物又はポリペプチドを担持する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンとの適用としてのそのような生化学的手段、並びに電気穿孔、直接マイクロ注入、及びマイクロプロジェクターボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）としてのそのような機械的手段を含む、多様な好適な手段のうちのいずれかによって、適切な宿主細胞に導入され得る。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２４０ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３８（１９８８）。

〔000260〕酵母は、免疫グロブリンＨ及びＬ鎖の生成では、細菌を上回る実質的な利点を提供し得る。酵母は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実行する。酵母における所望のタンパク質の生成に使用することができる強力なプロモーター配列及び高コピー数プラスミドを利用する、いくつかの組換えＤＮＡ戦略が現在存在する。酵母は、クローニングされた哺乳類遺伝子生成物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を担持するペプチド（すなわち、前ペプチド）を分泌する。Ｈｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１１ｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｙｅａｓｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｎｔｐｅｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８２）。

〔000261〕酵母遺伝子発現系は、ペプチド、抗体、断片、及びそれらの領域の生成、分泌、及び安定性のレベルについて、定例通り評価することができる。グルコースを豊富に含む培地で酵母を増殖させる場合に大量に生成される解糖酵素をコードする能動発現遺伝子からのプロモーター及び終結要素を組み込んだ一連の酵母遺伝子発現系のうちのいずれかが、利用され得る。既知の解糖遺伝子はまた、非常に効率的な転写制御シグナルを提供し得る。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター及びターミネーターシグナルが、利用され得る。酵母におけるクローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡの発現に最適な発現プラスミドを評価するための、いくつかのアプローチが選択され得る。Ｖｏｌ．ＩＩ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，４５－６６，（Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ １９８５）を参照されたい。

〔000262〕細菌株はまた、本発明によって記載される抗体分子又はペプチドの生成のための宿主として利用され得る。宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び対照配列を含有するプラスミドベクターが、これらの細菌宿主と関連して使用される。ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型選択を提供することが可能である特定の遺伝子を担持する。細菌におけるクローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡによってコードされる抗体、断片、及び領域、又は抗体鎖の生成のための発現プラスミドを評価するための、いくつかのアプローチが選択され得る（Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９３（上記）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１（上記）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９４－２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９７－２００１）を参照されたい。

〔000263〕宿主哺乳類細胞は、インビトロ又はインビボで増殖され得る。哺乳類細胞は、リーダーペプチド除去、ハンドＬ鎖の折り畳み及び組み立て、抗体分子のグリコシル化、並びに機能的抗体タンパク質の分泌を含む、免疫グロブリンタンパク質分子への翻訳後修飾を提供する。抗体タンパク質の生成の宿主として有用であり得る哺乳類細胞としては、上記のリンパ系起源の細胞に加えて、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８１）又はＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ６１）細胞などの線維芽細胞起源の細胞が挙げられる。多くのベクター系は、哺乳類細胞におけるクローニングされたペプチドハンドＬ鎖遺伝子の発現に利用可能である（Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５（上記）を参照されたい）。完全なＨ２Ｌ２抗体を得るために、異なるアプローチに従ってもよい。同じ細胞内でハンドＬ鎖を同時発現させて、完全な四量体Ｈ２Ｌ２抗体及び／又はペプチドへのハンドＬ鎖の細胞内会合及び連結を達成することが可能である。同時発現は、同じ宿主内で同じか又は異なるプラスミドのいずれかを使用することによって行うことができる。ハンドＬ鎖及び／又はペプチドの両方の遺伝子を同じプラスミドに配置し、次いで、これを細胞にトランスフェクトし、それによって、両方の鎖を発現する細胞を直接選択することができる。代替的に、まず、１つの鎖、例えば、Ｌ鎖をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトし、続いて、生じた細胞株を第２の選択可能なマーカーを含有するＨ鎖プラスミドでトランスフェクトすることができる。組み立てられたＨ２Ｌ２抗体分子のより高い生成又はトランスフェクトされた細胞株の安定性の向上などの特性を向上させた細胞株を生成するために、いずれかの経路を介してペプチド及び／又はＨ２Ｌ２分子を生成する細胞株を、追加の選択可能なマーカーと併せて、ペプチド、Ｈ、Ｌ、又はＨプラスＬ鎖の追加のコピーをコードするプラスミドでトランスフェクトすることができる。

〔000264〕組換え抗体の長期的な高収率の生成のために、安定した発現が、使用され得る。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が、操作され得る。ウイルス起源の複製物を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞が、免疫グロブリン発現カセット及び選択可能なマーカーで形質転換されてもよい。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を濃縮培地で１～２日間増殖させてもよく、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定的に組み込み増殖して、ひいては細胞株にクローニング及び拡大することができるフォーカスを形成することを可能にする。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接又は間接的に相互作用する化合物／構成要素のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。

〔000265〕本発明の抗体が生成されると、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、吸収率較差溶解度によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製され得る。多くの実施形態では、抗体は、細胞から培養培地に分泌され、培養培地から採取される。

薬学的及び獣医学的用途
〔000266〕本発明はまた、本発明の分子及び１つ以上の薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。より具体的には、本発明は、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、有効成分として本発明による抗体又はペプチドと、を含む、薬学的組成物を提供する。

〔000267〕「薬学的に許容される担体」は、用いられる投薬量及び濃度で曝露される細胞又は動物に対して無毒である、任意の賦形剤を含む。薬学的組成物は、１つ又は追加の治療剤を含み得る。

〔000268〕「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は合理的な利益／リスク比に見合った他の問題の合併症を伴わずに、動物の組織との接触に好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。

〔000269〕薬学的に許容される担体としては、溶媒、分散媒、緩衝液、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、湿潤剤、保存剤、バガー（ｂｕｇｇｅｒ）、キレート剤、抗酸化剤、等張剤、並びに吸収遅延剤が挙げられる。

〔000270〕薬学的に許容される担体としては、水；生理食塩水；リン酸緩衝生理食塩水；デキストロース；グリセロール；エタノール及びイソプロパノールなどのアルコール；リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；並びに単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤；糖類などの等張剤、マンニトール及びソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウム；並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

〔000271〕本発明の薬学的組成物は、例えば、液体溶液（例えば、注射可能かつ注入可能な溶液）、分散液、又は懸濁液、リポソーム、坐剤、錠剤、丸剤、又は粉末などの液体、半固体、又は固体剤形を含む、多様な方式で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な又は注入可能な溶液の形態である。組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、非経口、経粘膜、経口、局所、又は経皮投与に好適な形態であり得る。組成物は、即時放出、制御放出、徐放、又は遅延放出組成物として製剤化され得る。

〔000272〕本発明の組成物は、個々の治療剤として、又は他の治療剤と組み合わせてのいずれかで投与され得る。それらは単独で投与することができるが、概して、選択された投与経路及び標準的な薬学的慣行に基づいて選択された薬学的担体とともに投与される。本明細書に開示の抗体の投与は、非経口注射（腹腔内、皮下、又は筋肉内注射など）を含む任意の好適な手段によって、経口的に、又は抗体の局所投与（典型的には薬学的製剤中で実行される）によって、気道表面に実行され得る。気道表面への局所投与は、鼻腔内投与（例えば、ドロッパー、綿棒、又は吸入器の使用による）によって実行され得る。気道表面への抗体の局所投与はまた、抗体をエアロゾル懸濁液として含有する薬学的製剤（固体及び液体粒子の両方を含む）の呼吸可能な粒子を作製し、次いで呼吸可能な粒子を対象に吸入させることなどによる、吸入投与によって実行され得る。薬学的製剤の呼吸可能な粒子を投与するための方法及び装置は、周知であり、任意の従来技法が用いられ得る。

〔000273〕いくつかの望ましい実施形態では、抗体は、非経口注射によって投与される。非経口投与では、抗体又は分子は、薬学的に許容される非経口ビヒクルと関連する、溶液、懸濁液、エマルション、又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。例えば、ビヒクルは、水性担体などの許容される担体に溶解された抗体又はそのカクテルの溶液であり得、そのようなビヒクルは、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、トレハロース若しくはスクロース溶液、又は５％血清アルブミン、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどである。不揮発性油などのリポソーム及び非水性ビヒクルも使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、概して、粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤、及び緩衝液、毒性調整剤などの生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の抗体の濃度は、例えば、約０．５重量％未満、通常、約１重量％以上～最大で１５重量％又は２０重量％と広範に変動し得、選択される特定の投与モードに従って、主に流体体積、粘度などに基づいて選択されるであろう。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝液及び防腐剤）を維持する添加剤を含有し得る。製剤は、一般的に使用される技法によって滅菌される。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知であるか、又は明らかであり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡ．ＳＣＩ．（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）により詳細に記載されている。

〔000274〕本発明の抗体又は分子は、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構築され得る。この技法は、従来の免疫グロブリンに対して有効であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥及び再構築技法が用いられ得る。凍結乾燥及び再構築が、多様な程度の抗体活性損失をもたらし得、使用レベルを調整して相殺する必要があることを、当業者は理解するであろう。本抗体又はそれらのカクテルを含有する組成物は、既存の疾患の再発の防止及び／又は治療的処置のために投与され得る。好適な薬学的担体は、当該技術分野で標準的な参照教本であるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳの最新版に記載されている。治療用途において、組成物は、疾患及びその合併症を治癒するか、又は少なくとも部分的に停止若しくは緩和するのに十分な量で、疾患に既に罹患している対象に投与される。

〔000275〕本明細書に記載の状態又は疾患の治療のための本発明の組成物の有効用量は、例えば、限定されないが、特定の薬剤の薬力学的特徴及びその投与モード及び経路；標的部位；動物の生理学的状態；投与される他の医薬品；治療が予防的であるか又は治療的であるか；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の種類の性質及び程度並行して行われる治療の種類、治療の頻度、並びに所望の効果を含む、多くの異なる要因に応じて変動する。

〔000276〕組成物の単回又は複数回の投与は、治療する獣医師によって選択される用量レベル及びパターンで実行され得る。いずれにせよ、薬学的製剤は、対象を効果的に治療するのに十分な量の本発明の抗体を提供すべきである。

〔000277〕治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために当業者に既知の定例的な方法を使用して滴定され得る。

〔000278〕本発明の薬学的組成物は、「治療有効量」を含み得る。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。治療有効量の分子は、個体における疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を分子が誘発する能力などの要因に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が分子の任意の毒性又は有害効果を上回る量である。

〔000279〕別の態様では、本発明の組成物は、例えば、ウシ科動物における様々な疾患及び障害の治療に使用され得る。本明細書で使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語は、予防又は防止措置を含む治療処置を指し、対象が、疾患又は状態と関連する望ましくない生理学的変化を防止又は減速（軽減）される対象である。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、症状の緩和、疾患又は状態の程度の減少、疾患又は状態の安定化（すなわち、疾患又は状態が悪化しない）、疾患又は状態の進行の遅延又は減速、疾患又は状態の改善又は緩和、及び疾患又は状態の寛解（部分的又は完全な）が挙げられる。治療を必要とする対象としては、既に疾患若しくは状態を有する対象、並びに疾患若しくは状態を有する傾向がある対象、又は疾患若しくは状態が防止される対象が挙げられる。

〔000280〕本明細書で引用される全ての特許及び参照文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

〔000281〕以下の実施例は、先行開示を補足し、本明細書に記載の主題のより良い理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載の主題を限定するものとみなされるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみを目的とし、それらの観点からの様々な修正又は変更が、当業者には明らかであり、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
実施例

ウシ科動物ＩｇＧ変異体
方法
インビトロＦｃ受容体結合アッセイ
〔000282〕組換えウシ科動物ＦｃＲｎ（ｂＦｃＲｎ）、ＦｃｇＲ１、ＦｃｇＲ２、ＦｃｇＲ３、及びＦｃｇ２Ｒ ＤＮＡを、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、表１のようにＮＣＢＩデータベースからの配列に基づいて合成した。ＤＮＡは、Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＢＡＰタグ（ＡＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号１１３）を用いて操作された、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングされた。全てのＦｃｇＲを、ＨＥＫ２９３又はＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし（ＦｃＲｎ－αサブユニット及びβ－マイクログロブリンを同時トランスフェクトした）、ＦｃｇＲ又はＦｃＲｎ複合体を、ｃ末端Ｈｉｓタグを介するＩＭＡＣ親和性精製によって精製した。

〔000283〕精製したＦｃＲを以下のようにビオチン化した。精製したＦｃ受容体タンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０に透析し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、１０ＫＭＷＣＯ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して濃縮した。受容体のｃ末端で発現されたビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）ＡＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１１３）は、ビオチンリガーゼＢｉｒＡを使用して、ビオチンをこの範囲のアミノ酸に移行させることを可能にした。ビオチン化反応を、製造業者のプロトコル（Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ、Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）に記載されるように実施した。次いで、受容体をＰＢＳ中に透析して、残留ビオチンを除去した。

〔000284〕ｂＦｃＲｎ、ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、ｂＦｃｇＲ３、ｂＦｃｇ２Ｒに対するウシ科動物ＩｇＧサブクラス及び変異体の親和性を試験するために、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ結合アッセイを設計した。

ｂＦｃＲｎのＢｉａｃｏｒｅ方法：
〔000285〕ウシ科動物ＦｃＲｎに対するウシ科動物Ｆｃベースの抗体又は融合タンパク質結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ＳＡセンサーを使用して、全ての報告されたＫＤをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。所望の表面密度のために、ウシ科動物ＦｃＲｎをセンサーの表面上に捕捉した。２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ６及び／又はＰＢＳ、０．０００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０、ｐＨ７．４の泳動用緩衝液を使用した。様々な濃度のウシ科動物ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物又はｍＡｂを、適切な泳動用緩衝液において滴定し、受容体表面上に流した。再生は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、０．００５％のｐ２０、及び０．５％のＢＳＡで実施した。二重参照の方法を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、動的結合親和性を分析した。参照フローセルを、固定化されたウシ科動物ＦｃＲｎを含有するフローセルから減算し、緩衝液のみを含有するブランク実験を、全ての実験から減算した。生じた曲線を、１：１結合モデルに適合させた。実験は、２５℃で実施した。

ビオチン化ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３のための方法：
〔000286〕ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３に対するウシ科動物ＩｇＧサブクラスの親和性を試験するために、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ結合アッセイを設計した。シリーズＳ ＳＡセンサーを使用して、全ての報告されたＫＤをＢｉａｃｏｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。所望の表面密度に達するために、修飾されたＳＡ捕捉方法を使用して、ビオチン化ウシ科動物ＦｃｇＲ１、Ｒ２、及びＲ３をセンサー表面上に捕捉した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４緩衝液を泳動用及び滴定の緩衝液として使用した。様々な濃度のウシ科動物ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物又はｍＡｂを滴定し、受容体表面上に流し、１：１の結合モデルを有するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、親和性を決定した。参照フローセルを固定化した受容体を含有するフローセルから減算し、緩衝液のみを含有するブランク実験を全ての実験から減算した、二重参照の方法を適用した。フローセルを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を使用して再生した。実験は、１５℃で実施した。

ｂＦｃｇ２Ｒのための方法：
〔000287〕シリーズＳ ＣＭ５センサーを使用して、全ての報告されたＫＤをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。所望の表面密度のために、アミンカップリング（ＥＤＣ－ＮＧＦ混合物によるカルボキシル基活性化及びエタノールアミンによる過剰反応性基の非活性化）によって固定化緩衝液を使用してセンサー表面にウシ科動物Ｆｃｇ２Ｒを固定した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳの泳動用緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４緩衝液を使用した。様々な濃度のウシ科動物ＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物又はｍＡｂを滴定し、受容体表面上に流し、１：１の結合モデルを有するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、親和性を決定した。参照フローセルを固定化した受容体を含有するフローセルから減算し、緩衝液のみを含有するブランク実験を全ての実験から減算した、二重参照の方法を適用した。フローセルを、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を使用して再生した。実験は、１５℃で実施した。

Ｆｃ融合タンパク質及びｍＡｂの再生
〔000288〕組換えＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物を、それぞれ、図６、図１４、及び図１８に示されるように、重鎖ヒンジ領域のすぐ上流から始まるｂＩｇＧ１ａ（ＮＣＢＩ１Ｓ８２４０９）、ｂＩｇＧ２ａ（Ｚｏｅｔｉｓで配列決定）、ｂＩｇＧ３ａ（ＮＣＢＩ ＢＴＵ６３６３８）Ｆｃを含有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）哺乳類発現ベクターへのイヌ科動物ＣＴＬＡ４遺伝子（ＮＣＢＩ ＮＭ＿００１００３１０６．１）の挿入を介して構築した。組換えＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物も、図６、図１４、及び図１８に示されるのと同じＦｃ位置で、ｂＩｇＧ１ｂ（Ｘ１６７０１）、ｂＩｇＧ２ｂ（Ｓ８２４０７）、及び又はｂＩｇＧ３ｂ（ＢＴＵ６３６３９）について構築した。追加のリンカーは必要なかった。

〔000289〕ｂＩｇＧ１ａ、ｂＩｇＧ１ｂ、ｂＩｇＧ２ａ、ｂＩｇＧ２ｂ、ｂＩｇＧ３ａ、及びｂＩｇＧ３ｂ Ｆｃ領域を有する組換えｍＡｂを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）哺乳類発現ベクター内の定常ドメインをコードするヌクレオチドの上流かつそれとインフレームでＶＨ配列を挿入することによって構築した。定常領域は、ｂＩｇＧ１ａ（ＮＣＢＩ １Ｓ８２４０９）、ｂＩｇＧ１ｂ（Ｘ１６７０１）、ｂＩｇＧ２ａ（Ｚｏｅｔｉｓで配列決定）、ｂＩｇＧ２ｂ（Ｓ８２４０７）、ｂＩｇＧ３ａ（ＮＣＢＩ ＢＴＵ６３６３８）、又はｂＩｇＧ３ｂ（ＢＴＵ６３６３９）のいずれかであった。同様に、軽鎖を、ウシ科動物カッパ対立遺伝子１定常領域（ＮＣＢＩ ＨＱ２１３９９４．１）の上流かつそれとインフレームでＶＬ配列を挿入することによって構築した。

〔000290〕変異を、ＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合及び完全ｍＡｂフォーマットの両方において、３つの野生型サブクラスに導入して、ＦｃｇＲへの結合をノックアウトするか、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰをノックアウトするか、安定性を改善するか、又はｂＦｃＲｎに対する親和性を増加させた。単一部位指向性変異誘発のために、ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ及び関連するＡｇｉｌｅｎｔプライマー設計ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）を使用して、各野生型プラスミド上の様々な位置に変異を組み込んだ。

〔000291〕全てのＣＴＬＡ４融合物及びｍＡｂ遺伝子のＤＮＡを、哺乳類発現のためにコドン最適化し、構築物を、ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）トランスフェクション試薬及びプロトコル（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用してＨＥＫ２９３細胞において、又はＥｘｐｉＣＨＯ一過性系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットプロトコルを使用してＣＨＯ細胞内のいずれかで一過性に発現させた。ＥｘｐｉＣＨＯ発現は、ｍＡｂ又はＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合トランスフェクションのいずれかで、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって概説されたプロトコルに従った。ｍＡｂでは、ＩｇＧカッパ軽鎖をコードする遺伝子配列を含有するプラスミドを、ＩｇＧ重鎖をコードするプラスミドで同時トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３発現では、等重量の重鎖プラスミド及びカッパ鎖プラスミドを同時トランスフェクトした。Ｆｃ融合物について、単一のプラスミドをトランスフェクトした。細胞を７日間（ＨＥＫ２９３）又は１２日間（ＣＨＯ）成長させ、その後、タンパク質精製のために上清を収集した。Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ定量化（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）を介して、プロテインＡ又はプロテインＧセンサーへの結合について、ＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合物及びｍＡｂをスクリーニングした。標準曲線を使用して、プロテインＡ又はプロテインＧセンサーを用いて、Ｏｃｔｅｔで発現を定量化し、ｍＡｂ／融合タンパク質をプロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ親和性クロマトグラフィーで精製した。全てのタンパク質構築物について、酢酸ナトリウムｐＨ５．５を結合及び洗浄緩衝液として使用し、ｐＨ３．４で溶出を実施した。精製したタンパク質を中和し、更なる分析のために、２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５、１４０ｍＭのＮａＣｌに透析した。ｍＡｂ及び融合タンパク質の濃度を、２８０ｎｍのＮａｎｏＤｒｏｐを介して測定した。タンパク質の質は、分析用ＳＥＣ及び標準クマシータンパク質ゲルを介して評価した。

〔000292〕表２は、３つのウシ科動物ＩｇＧ野生型サブクラス及び変異に対して生成されたＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合物を列挙する。表２に記載されるように、同一の位置でｍＡｂに対しても変異を行った。

〔000293〕ウシ科動物ＩｇＧに導入されたがＦｃ融合物に対して行われなかった追加の変異は、ｂＩｇＧ１ａの「ＤＰ」安定化変異体、ｂＦｃＲｎに対する親和性を増加させる変異、ｂＩｇＧ３ａ上のＲ４３３Ｈである。

以下の表３は、ヌクレオチド変異に起因するアミノ酸への変化を含む、ｂＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３ｂに対して行われた変異を説明する。表３はまた、変異に対する隣接配列を示す。表３の同じＦｃの変異を、ｂＩｇＧ１ａ、ｂＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ３ａに対して行い、変異は、ａ及びｂのアロタイプについて同一のアミノ酸配列をもたらした。

ｂＩｇＧ変異はエフェクター機能をノックアウトする
〔000294〕いくつかの変異を、ｂＩｇＧ１ａアロタイプのＦｃ領域に導入して、エフェクター機能をノックアウトした：１）ｂＩｇＧ１ａのｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３への結合、２）細胞ベースのアッセイにおける補体殺傷活性（ＣＤＣ）、及び３）ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイにおける食作用を排除するか、又は無視できるまで低減する。

〔000295〕「Ｗｉｎｔｅｒ」（又は「Ｗｉｎ」）部位は、ヒトＩｇＧ１について以前に報告されたように、ヒンジのすぐ下流にある。ヒトＩｇＧ１のこのＬＬＧＧ「Ｗｉｎｔｅｒ」部位は、種によって異なる。ウシ科動物ＩｇＧ１については、それは、ＬＰＧＧ（図２）である。ヒトＩｇＧ１について、一般的に「ＬＡＬＡ」と称される変異は、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａにある。ウシ科動物ＩｇＧ１について、対応するＷｉｎｔｅｒ変異は、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｐｒｏ２３５Ａｌａであるが、追加の残基も変異される。この追加の変異は、Ｇｌｙ２３７Ａｌａ（ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される）である。

〔000296〕ｂＩｇＧ１ａ上の「ＰＡＰからＳＡＳ」（Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ＿Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ）及び「ＰＡＰからＳＡＰ」（Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ）変異は、ｂＩｇＧ２が細胞ベースのアッセイにおいて補体活性を誘発しないため、ｂＩｇＧ２に基づいて考案された。ウシ科動物ＩｇＧ２ａは、ＣＨ２に天然に存在するＳＡＳ部位を有し、一方、図２に示すように、ｂＩｇＧ１ａは、この領域においてＰＡＰである。したがって、ｂＩｇＧ１ａにおけるＰＡＰをＳＡＳ又はＳＡＰのいずれかに変異させることは、ＣＤＣを排除するであろうと仮定された。

〔000297〕ｂＩｇＧ１ａ上の「ＳＳ」変異（Ａｌａ３３０Ｓｅｒ、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ）は、ｈＩｇＧ４サブクラスがＦｃｇＲに対して弱い親和性を有し、したがって無視できるエフェクター機能を有するため、この同じ領域におけるヒトＩｇＧ４に類似するヒトＩｇＧ１に対する変異、ＰＡＰからＰＳＳに基づいている。実際、ｈＩｇＧ１上の「ＳＳ」変異は、エフェクター機能をノックアウトする。ウシ科動物ＩｇＧ１は、この領域においてｈＩｇＧ１と同じＰＡＰ配列を有するため、ｂＩｇＧ１上のＰＡＰからＰＳＳへの変異がＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、及びＦｃｇＲ結合をノックアウトするであろうと仮定された。ＳＳ変異を、ｂＩｇＧ１上のＷｉｎｔｅｒ変異に追加した。

〔000298〕上述の変異を、ｂＩｇＧ１ａ Ｆｃ上に導入した：Ｗｉｎｔｅｒ変異のみ、Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ「Ｗｉｎ」（配列番号１６）、Ｗｉｎｔｅｒ変異＋ＳＳ変異、Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ＿Ａ３３０Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ「ＷｉｎＳＳ」（配列番号１８）、Ｗｉｎｔｅｒ変異＋ＳＡＳ変異、Ｌ２３４Ａ＿Ｐ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ＿Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ「ＷｉｎＳＡＳ」（配列番号１７）、ＳＡＳ変異のみ、Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ「ＳＡＳ」（配列番号１５）、及びＳＡＰ変異のみ、Ｐ３２９Ｓ「ＳＡＰ」（配列番号１４）。これらの変異を、図６に整列させる。

〔000299〕Ｆｃγ受容体についての上記変異の結合親和性を、ｂＩｇＧ１ａ野生型と比較した。変異体はまた、機能的細胞ベースのアッセイにおいて試験され、データは、ＳＡＳ及びＳＡＰ変異の両方が、ＣＤＣ活性を劇的に低減することを示す。ＳＡＳ及びＳＡＰの変異もＡＤＣＰを完全にノックアウトする。予想外に、「Ｗｉｎｔｅｒ」変異は、細胞ベースのＣＤＣアッセイにおいて、補体活性を低減するのではなく増強したようであり、細胞ベースのアッセイにおいて、ＡＤＣＰに対して無視できる効果を有する。また、予想外に、ｂＩｇＧ１ａ上の「ＳＳ」変異は、ｂＦｃｇＲ１及びｂＦｃｇＲ２への結合を完全にノックアウトしない。ｂＩｇＧ１上のＳＳ変異は、ＣＤＣ上でわずかな低減のみを有し、細胞ベースのアッセイにおけるＡＤＣＰを部分的にノックダウンするのみである。

ウシ科動物Ｆｃ受容体結合親和性に対するｂＩｇＧ Ｆｃ変異の効果
〔000300〕ｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ１ｂ野生型ＦｃのＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ ｂＦｃｇＲ親和性を、上述のｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ１ｂ変異と比較することにより、ウシ科動物Ｆｃγ受容体への結合をノックアウトする能力を評価した。ｂＩｇＧ１ａ野生型組換えｍＡｂの５つのＦｃ変異体との定常領域のアラインメントを図６に示す。ｂＩｇＧ１ａアロタイプのｂＩｇＧ１ｂアロタイプとのアラインメントを図３に示す。ｂＩｇＧ１に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である。実施例１に記載されるように、ｂＦｃｇＲ１、Ｒ２、及びＲ３のためのＢｉａｃｏｒｅ方法を実施した。

〔000301〕表４は、Ｆｃγ受容体へのｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ１ｂ結合に対するエフェクター機能Ｆｃ変異の結果を示す。ｂＩｇＧ１野生型について、２つのアロタイプは、ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３に類似した結合親和性を有する。Ｗｉｎｔｅｒ変異（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎ）は、ｂＦｃｇＲ３への結合をノックアウトしたが、ｂＦｃｇＲ１又はｂＦｃｇＲ２親和性に顕著に影響しなかった。ＳＳ変異をＷｉｎｔｅｒ（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎＳＳ）に加えると、ｂＦｃｇＲ１及びｂＦｃｇＲ２への結合がいくらか低減し、ｂＦｃｇＲ３への無視できる結合が維持された。Ｗｉｎｔｅｒ変異（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎＳＡＳ）、ＳＡＳ変異単独（ｂＩｇＧ１ａＳＡＳ）、又はＳＡＰ変異単独（ｂＩｇＧ１ａＳＡＰ）にＳＡＳを加えた場合のみ、３つ全てのＦｃγ受容体への結合がノックアウトされる。ウシ科動物ｂＦｃｇＲ１は、ＩｇＧ１ａＳＡＰへの非常に弱い結合を有し、したがって、効果的にノックアウトされる。２つを除いて、表４は、ｂＩｇＧ１ｂ野生型及びｂＩｇＧ１ｂ変異が、それぞれ、ｂＩｇＧ１ａ野生型及びｂＩｇＧ１ａ変異に類似した結合親和性を有したことを示す。したがって、２つのアロタイプは、１）ｂＦｃｇＲ２上のＷｉｎＳＳ、及び２）ｂＦｃｇＲ１上のＳＡＰを除いて、かなり比肩するが、これらの変異体の両方のＫＤは、野生型のＫＤよりも顕著に低い。

ＣＤＣアッセイ
〔000302〕ＣＤＣ細胞ベースのアッセイは、ＣＤＣの媒介において５つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ１ａ Ｆｃ融合タンパク質（図６）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＣＤＣ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。これらの標的細胞は、過去のイヌ科動物ＡＤＣＣアッセイで使用されており、それらの信頼性に起因してＣＤＣアッセイにおいて利用されている。

〔000303〕補体保存された血清との融合タンパク質結合標的細胞のインキュベーションは、融合タンパク質上のＦｃ結合をもたらして、構成要素Ｃ１ｑが補体カスケードを開始し、最終的に膜攻撃複合体を形成するのを補足することができる。細孔形成複合体は、細胞生存能の喪失によって測定される標的細胞の細胞溶解を媒介する。Ｃ１ｑへのＦｃ結合がない場合、結果として生じる細胞溶解／死はない。

〔000304〕簡潔に述べると、ＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞（標的細胞）を、丸底９６ウェルプレート中のＣＤ ＣＨＯ培地において４０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＣＤ ＣＨＯ培地中の滴定した融合タンパク質を、標的細胞に添加し、３７℃で６０分間結合させた。ウシ科動物補体保存された血清（ＣＤ ＣＨＯ培地中３０％）を、３７℃で４５分間プレートに添加した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用して細胞生存率を測定し、データを、融合タンパク質なし＋補体保存された血清対照を使用して計算された「対照の細胞生存率％」として表した。

〔000305〕図７及び表５に示されるように、Ｗｉｎ変異単独では、ｂＩｇＧ１ａ又はｂＩｇＧ１ｂ ＦｃのＣＤＣ活性をノックアウトしない。それは、ＣＤＣの活動を強化するようである。ＷｉｎＳＳ変異は、非常に弱いが、ＣＤＣを引き起こす。ＷｉｎＳＡＳ、ＳＡＳ単独、及びＳＡＰ変異は、ｂＩｇＧ１ａ Ｆｃ及びｂＩｇＧ１ｂ Ｆｃの両方についてのＣＤＣ活性を大幅に低減するか、又は完全にノックアウトする。

インシリコモデリング
〔000306〕ウシ科動物抗体のＦＡｂ配列を、それぞれのヒンジ領域を使用して、様々なウシ科動物骨格サブクラスのＦｃドメインの配列に連結した。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐが開発したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ２０１９．０１０２プログラム（ＭＯＥ２０１９．０１０２）の抗体相同性モデリング機能を実装して、各ウシ科動物骨格アロタイプの野生型（ＷＴ）及び変異型構築物の各々の３Ｄ構造をモデル化した。ＭＯＥ２０１９．０１０２は、抗体相同性モデリングのための柔軟で自動化されたグラフィカルユーザーインターフェイスを提供し、モデリング実験のためにデフォルトパラメータが選択された。

〔000307〕ｍＡｂ構造をモデル化するために、ＭＯＥ２０１９．０１０２の組み込みＰＤＢデータベースを使用して、知識ベースのアプローチを用いた。シーケンスツープロファイルアラインメントアルゴリズムは、スコアリングアルゴリズムを使用して重鎖及び軽鎖配列鋳型をランク付けし、８５％を超えるスコアは、物理的に現実的な構造を有する抗体鋳型の選択を確実にする。ＣＤＲ及びループの鋳型が結合されたら、次いで、モデルは同じパイプラインを使用して最適化された。モデルの構造安定性は、タンパク質構造の立体化学的品質をチェックするラマチャンドランプロットを使用して検証された。

〔000308〕変異した構築物全体にわたる構造活性関係を理解するために、上述の方法を、ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳに対して実施した。構造を重ね合わせ、変異した残基を矢印で示す（図８Ａ）。互いに対する４つの構造の平均二乗偏差を計算するために、ＲＭＳＤプロットを生成した（図８Ｂ）。２．０Å以下のＲＭＳＤ値は、２つの構造が同じであることを考慮するための標準と考えられる。結果は、＿ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ構築物が、そのＲＭＳＤが１．２４であったため、その他のアロタイプ対応物であるｂＩｇＧ１ｂ ＷＩＮＳＡＳと同一であったことを示した。これは、ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳが、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳと同じＣＤＣ活性の喪失を示したＣＤＣアッセイ（図７）においても支持された。これは、上述の方法によって生成された抗体モデルが、ウシ科動物骨格構造の正確な表現を提供することを示すためのより多くの支持を提供する。更に、ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳの抗体モデルをｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳと比較すると、ＲＭＳＤ値は０．９４～１．２４Åの範囲であり、したがって、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳが、ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳと同様の機能的活性の欠如（ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、及びＡＤＣＣ）を示すことを高度に確実に予測することができる。

ＡＤＣＰアッセイ
〔000309〕ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイは、ＡＤＣＰの媒介において５つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ１ａ Ｆｃ融合タンパク質（図６）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＡＤＣＰ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のイヌ科動物ＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。これらの標的細胞は、過去のイヌ科動物ＡＤＣＣアッセイで使用されており、それらの信頼性に起因してＣＤＣアッセイにおいて利用されている。

〔000310〕このアッセイのために、ウシ科動物肺胞マクロファージとのＦｃ融合タンパク質／標的細胞複合体のインキュベーションは、マクロファージ上のＦｃγ受容体へのＦｃ結合、ＣＨＯ標的細胞とマクロファージエフェクターとの架橋、及びそれによって標的細胞の食作用の開始をもたらすことができる。ＡＤＣＰは、共培養におけるエフェクターマクロファージの集団内のｐＨ感受性蛍光色素のシグナル強度及び周波数によって測定され、蛍光細胞は、標的細胞を酸性リソソームに良好に内在化したエフェクターを示す。

〔000311〕簡潔に述べると、イヌ科動物ＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞（ＣＤ８０標的細胞）又はＣＤ８０を発現しない親ＣＨＯ細胞（親標的細胞）を、３７℃で３０分間ｐＨｒｏｄｏ赤色染料で事前染色した。次いで、細胞をＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質とともに２０分間インキュベートして、ＣＴＬＡ４：ＣＤ８０結合を媒介し、その後、細胞マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で染色した事前にプレーティングされた接着性ウシ科動物肺胞マクロファージと共培養して、後の同定を補助した。６０，０００の標的細胞を、９６ウェルプレートにおいて、３０，０００のエフェクターマクロファージとともにプレーティングした。次いで、細胞を６時間共培養し、その後プレートから除去し、フローサイトメトリーによって分析して、ＡＤＣＰ（ｐＨｒｏｄｏ＋）を良好に実施したエフェクター細胞（ＣＴＶ＋）を同定した。図９及び表５に示されるように、野生型ｂＩｇＧ１ａは、ウシ科動物肺胞マクロファージにおけるＡＤＣＰの強力な活性化剤である。ｂＩｇＧ１ａＷｉｎ変異単独は、ｂＩｇＧ１ａ ＦｃのＡＤＣＰ活性に顕著に影響を及ぼさず、ＣＤＣ活性について見られるように、ＡＤＣＰをわずかに強化し得る。ＷｉｎＳＳ変異は部分的にＡＤＣＰをノックダウンし、一方、ＷｉｎＳＡＳ、ＳＡＳ単独、及びｂＩｇＧ１ａ上のＳＡＰ変異は、ＡＤＣＰ機能を完全に抑止する。

〔000312〕イヌ科動物ＣＤ８０（ＩｇＧ１親）を発現しない標的細胞との野生型ｂＩｇＧ１ａのインキュベーションもまた、ＡＤＣＰを誘発せず、観察された標的細胞内在化が融合タンパク質の特異的活性を必要とし、代替機序によって媒介されないことを示す。

〔000313〕食作用（ＡＤＣＰ）は、ＦｃｇＲ１を含む複数のヒトＦｃγ受容体によって媒介され、ＤＮＡ配列分析は、ウシ科動物ＦｃｇＲ１のＩｇＧ結合ドメインのモチーフが、そのヒト及びマウスの対応物と比較して高度に保存されていることを示す。図９及び表５の細胞ベースのＡＤＣＰデータは、表４のｂＦｃｇＲ１に対するｂＩｇＧ１ａ及び変異体の結合親和性に比肩する。Ｗｉｎｔｅｒ変異（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎ）は、ｂＦｃｇＲ１親和性に顕著に影響しなかった。ＳＳ変異をＷｉｎｔｅｒに加えること（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎＳＳ）は、ｂＦｃｇＲ１への結合をいくらかノックダウンしたが、結合を完全にノックアウトしなかった。Ｗｉｎｔｅｒ変異（ｂＩｇＧ１ａＷｉｎＳＡＳ）、ＳＡＳ変異単独（ｂＩｇＧ１ａＳＡＳ）、又はＳＡＰ変異単独（ｂＩｇＧ１ａＳＡＰ）にＳＡＳを加えた場合のみ、ｂＦｃｇＲ１への結合がノックアウトされる。ウシ科動物ｂＦｃｇＲ１は、ＩｇＧ１ａＳＡＰへの無視できる結合しか有さず、したがって、効果的にノックアウトされる。

安定化のためのｂＩｇＧ ＤＰ変異
〔000314〕ウシ科動物ＩｇＧ１ａ天然野生型サブクラスの分析調査では、図１０に示されるように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析で低分子量種（ＬＭＷＳ）が観察された。考えられる原因を調査するために、試料を質量スペクトル分析に供し、これは、Ｄ２１６とＰ２１７との間、及びＤ２７０とＰ２７１との間のウシ科動物ＩｇＧ１ａ定常重鎖に位置する２つのクリップ部位を同定した。これら２つの化学的切断部位は、ウシ科動物ＩｇＧ１ａ Ｆｃ（ＮＣＢＩ参照１Ｓ８２４０９）の天然アミノ酸配列に含まれる。ｂＩｇＧ１ａの定常ドメインにおける切断／クリッピング部位の排除は、ウシ科動物ＩｇＧ１サブクラスの立体構造安定性、そのままの単量体の割合、及び全体的な開発可能性を増加させるのに望ましい。これらの切断／クリッピング部位を排除するために、ウシ科動物ＩｇＧ１ａの定常ドメインに変異を行った（表６）。これらの同定された切断部位は、ＩｇＧタンパク質におけるＡｓｐ（Ｄ）とＰｒｏ（Ｐ）アミノ酸との間の結合の非酵素的破壊を誘発し得るアミノ酸配列に依存する。ＤＰ結合の意図的な切断は、酸及び熱を使用して文献に十分に記述されているが、全てのＤＰ部位が立体構造的にアクセス可能ではなく、高温であっても、酸への短時間の曝露下で切断されない。したがって、これらの配列部位の傾向が自動的にｂＩｇＧ１ａ Ｆｃのクリッピングにつながるかどうかは明らかではない。

〔000315〕上述のＤＰからＥＰへの変異は、ｂＩｇＧ１ａを含有する哺乳類発現ベクターの迅速な変化の変異誘発を介して構築した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）変異体を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから得た哺乳類懸濁細胞系ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞において発現させた。懸濁ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＥＸＰＩＣＨＯ発現培地（Ｇｉｂｃｏ）中で０．１４～８．０×１０ｅ６細胞／ｍｌで維持した。細胞を、－１日目及びトランスフェクション日にＥｘｐｉＣＨＯプロトコルユーザーマニュアルに従って希釈する。希釈した細胞を、Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ条件に従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ）から供給される試薬を使用して、プロトコルに記載されるようにトランスフェクトする。１２～１４日間のインキュベーションの後、培養物を採取し、清澄化する。ＰＢＳで事前に平衡化されているＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、条件培地をロードした。試料をロードした後、樹脂をＰＢＳ、次いで、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で洗浄した。試料を２０ｍＭの酢酸、ｐＨ３．５でカラムから溶出した。溶出後、プールを作製し、１Ｍの酢酸ナトリウムを添加して４％に中和した。利用可能な量及び使用目的に応じて、時には試料を最終緩衝液（例えば、ＰＢＳ、他）に交換した。濃度は、２８０ｎｍでの吸光度で測定した。

〔000316〕ＴＯＳＯＨ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅのＴＳＫゲルＳｕｐｅｒ ＳＷ３０００、４．６ｍｍ、１０ｘ３０ｃｍ、４μｍカラムを使用して、０．２５ｍｌ／分で、２００ｍＭのＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．２泳動用緩衝液において分析ＳＥＣを実施した。

〔000317〕質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃ）を、野生型天然ウシ科動物ＩｇＧ１ａ及び変異体に対して実施した。試料をＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して脱グリコシル化し、ＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ）で還元した。試料を、ｍａＸｉｓ＋ＥＳＩ器具（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析した。図１０は、同定されたＤＰクリップ部位の質量が、天然ｂＩｇＧ１ａ重鎖において明らかであることを確認する。ｂＩｇＧ１ａ二重変異Ｄ２１６Ｅ（部位１）及びＤ２７０Ｅ（部位２）もまた、天然のＦｃと同じ方法で質量分析により分析した。このデータから、ＤＰクリップはもはや存在しないことが明らかである。

〔000318〕導入されたＤ－ＰからＥ－Ｐへの変異（図１２）は、質量スペクトル分析によって証明されるように、ｂＩｇＧ１ａ Ｆｃから切断／クリップ部位を除去した（図１１）。これらの切断部位の除去は、治療用途のためのこのサブクラスの均質性、そのままのＩｇＧ純度、及び全体的な開発可能性を改善することができる。

インシリコモデリング
〔000319〕ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳについて前述した方法を、ｂＩｇＧ１ＤＰ１＿ＤＰ２アロタイプに対して実施した。図１３に示される結果は、ｂｏｖ＿Ｇ１ａ＿ＤＰ１＿ＤＰ２構築物が、その他のアロタイプ対応物であるｂＩｇＧ１ｂ＿ＤＰ１＿ＤＰ２、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＤＰ１＿ＤＰ２、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＤＰ１＿ＤＰ２と同一であり、ＲＭＳＤ値は０．７６～１．１４Åの範囲であったことを示した。したがって、実験結果及びモデル結果の両方に基づいて、アロタイプｂＩｇＧ１ｂ、ｂＩｇＧ１ｃ、及びｂＩｇＧ１ｄにおけるＤＰ１＿ＤＰ２変異体が、ｂＩｇＧ１ａ＿ＤＰ１＿ＤＰ２と同様の様式で機能することを高度に確実に予測する。

ｂＩｇＧ変異はエフェクター機能をノックアウトする
〔000320〕いくつかの変異を、ｂＩｇＧ２ａアロタイプのＦｃ領域に導入して、エフェクター機能をノックアウトした：１）ｂＩｇＧ２ａの、それが係合する唯一のＦｃγ受容体ｂＦｃｇ２Ｒへの結合、及び２）ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイにおける食作用を排除するか、又は無視できるまで低減する。

〔000321〕ウシ科動物ＩｇＧ２ａのｂＦｃｇ２ＲへのＨＤＸエピトープマッピングは、ｂＩｇＧ２ａ上の不連続エピトープを示した。ｂＦｃｇ２Ｒへの結合を排除するか、又は無視できるまで低減するためのキャンペーンでは、ｂＩｇＧ２ａのこの領域にアラニン変異パネルが作製された。新生仔Ｆｃ受容体親和性を保持しながら、Ｆｃγ受容体結合を劇的にノックダウンするのに有効であった変異を、図１４に図示する。これらの変異は、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａである。加えて、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａの以下の組み合わせは、ｂＦｃｇ２Ｒへの結合を良好にノックアウトした：Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ、Ｌ４３２Ａ＿Ｍ４３７Ａ、Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ、及びＬ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ。

ｂＦｃｇ２Ｒ及びｂＦｃＲｎ結合親和性に対するｂＩｇＧアラニン変異の効果
〔000322〕ｂＦｃＲｎに対する親和性を保持しながらｂＦｃｇ２Ｒへの結合をノックアウトする能力は、上述のｂＩｇＧ２ａ野生型ＦｃとｂＩｇＧ２ａアラニン変異との間のＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ親和性差を比較することによって評価した。ｂＩｇＧ２ａ野生型（ｗｔ）組換えｍＡｂの７つのＦｃ変異体との定常領域のアラインメントを図１４に示す。ｂＩｇＧ２ａアロタイプのｂＩｇＧ２ｂアロタイプとのアラインメントを図４に示す。ｂＩｇＧ２に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である。ｂＩｇＧ２ａ ｗｔ及び変異体をｍＡｂとして産生し、ウシ科動物Ｆｃγ受容体及びウシ科動物新生仔Ｆｃ受容体に対する結合親和性についてＢｉａｃｏｒｅで実験した。ｂＦｃｇ２Ｒ、ｂＦｃＲｎ、ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３のＢｉａｃｏｒｅ方法を、上記の実施例のセクションに記載されるように実施した。

〔000323〕表７に示されるように、ｂＩｇＧ２ａ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａ上の３つの単一点変異は、ｂＦｃｇ２Ｒへの結合を劇的にノックダウンし、結合のほぼ完全なノックアウトをもたらす。二重変異Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａは、野生型結合と比較して、ｂＦｃｇ２Ｒへの結合を４倍低減する。二重変異Ｌ４３２Ａ＿Ｍ４３７Ａ、Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ、及び三重変異Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａは、野生型Ｆｃと比較した場合、Ｆｃｇ２Ｒへの結合を完全にノックアウトする。

〔000324〕ウシ科動物Ｆｃｇ２Ｒノックアウト変異は、ウシ科動物ＦｃＲｎへの結合に対して様々な効果を有した。ｐＨ依存性ＦｃＲｎによるＩｇＧのリサイクルは、エンドソーム分解を避けるためにｐＨ６での強い親和性、及び救出されたＩｇＧを循環に戻すためにｐＨ７．４での弱い親和性を必要とする。３つの単一点変異は、ｐＨ６でのｂＦｃＲｎ結合に対する影響が最も小さく、野生型と同様の強い親和性を保持し、一方、二重変異及び三重変異は、ｐＨ７．４でのｂＦｃＲｎ親和性に対する影響が最も大きく、親和性を検出限界より下に低減した。

〔000325〕ｂＩｇＧ２ａ野生型及び全てのｂＩｇＧ２ａ Ｆｃｇ２Ｒノックアウト変異は、表８に示されるように、ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３に結合しなかったか、又は無視できる結合であった。

〔000326〕表７及び表８に示されるｂＩｇＧ２ａ野生型及び変異体のｍＡｂ試薬に加えて、ｂＩｇＧ２ａ及びｂアロタイプの両方についてのＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合バージョンを、上述のように調製した。野生型ｂＩｇＧ２ｂアロタイプＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物と比較した、野生型ｂＩｇＧ２ａアロタイプＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合物とのｂＦｃｇ２Ｒ親和性の調査は、ほぼ同一のＫＤ、４．１７Ｅ－０８対３．１４Ｅ－０８を示す（表９）。全てのＦｃ変異について２つのアロタイプの比較は、非常に類似したｂＦｃｇ２Ｒ結合親和性も示す。

ＣＤＣアッセイ
〔000327〕ＣＤＣ細胞ベースのアッセイは、ＣＤＣの媒介において７つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパク質（図１４）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＣＤＣ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。これらの標的細胞は、過去のイヌ科動物ＡＤＣＣアッセイで使用されており、それらの信頼性に起因してＣＤＣアッセイにおいて利用されている。アッセイ方法は、上記のｂＩｇＧ２ａ ＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合物について記載されるように実施した。

〔000328〕図１５及び表１０に示されるように、２つのウシ科動物ＩｇＧ２野生型アロタイプ、ｂＩｇＧ２ａ及びｂＩｇＧ２ｂのいずれも、細胞ベースのアッセイにおいてＣＤＣを誘発せず、一方、陽性対照ｂＩｇＧ１ａは、前回の実験と同様のＣＤＣ活性を有する。加えて、７つのアラニン変異のいずれも、ｂＩｇＧ１ａ ＣＤＣ機能を変化させない。

インシリコモデリング：
〔000329〕ｂＩｇＧ１ａ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ、ｂＩｇＧ１ｃ＿ＷＩＮＳＡＳ、及びｂＩｇＧ１ｄ＿ＷＩＮＳＡＳについて前述した方法を、ｂＩｇＧ２ａ変異体に対して実施した。このサブクラスでは、２Åを超えるＲＭＳＤの変化は観察されず、２つのアロタイプが同様に折り畳まれることを示した（図１６Ｂ）。前のサブクラスと同様に、単一構築物（Ｌ４３２、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａ）における全ての可能な変異を有することがタンパク質の折り畳みに顕著な変化をもたらさない場合、個々の変異もタンパク質モデルに影響を及ぼさないはずであることを合理的に説明した。これらのモデルは、ＣＤＣアッセイを使用して観察されるエフェクター機能データによっても支持される。表７のＳＰＲ結合データ（すなわち、実験データ）と一緒にこれらの抗体モデルは、ｂＩｇＧ２ａ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ、ｂＩｇＧ２ｂ＿Ｌ４３２Ａ＿Ｎ４３４Ａ＿Ｍ４３７Ａ、及びこれらの変異の様々な組み合わせ（表２及び表７に列挙される）が、同一の方法で折り畳まれて結合し、したがって、同様のＡＤＣＰ及びＡＤＣＣエフェクター機能の欠如を有するであろうことを示す。

ＡＤＣＰアッセイ
〔000330〕ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイは、ＡＤＣＰの媒介において７つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパク質（図１４）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＡＤＣＰ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。これらの標的細胞は、過去のイヌ科動物ＡＤＣＣアッセイで使用されており、それらの信頼性に起因してＣＤＣアッセイにおいて利用された。

〔000331〕このアッセイのために、ウシ科動物肺胞マクロファージとのＦｃ融合タンパク質／標的細胞複合体のインキュベーションは、マクロファージ上のＦｃγ受容体へのＦｃ結合、ＣＨＯ標的細胞とマクロファージエフェクターとの架橋、及びそれによって標的細胞の食作用の開始をもたらすことができる。ＡＤＣＰは、共培養におけるエフェクターマクロファージの集団内のｐＨ感受性蛍光色素のシグナル強度及び周波数によって測定され、蛍光細胞は、標的細胞を酸性リソソームに良好に内在化したエフェクターを示す。

〔000332〕簡潔に述べると、イヌ科動物ＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞（ＣＤ８０標的細胞）又はＣＤ８０を発現しない親ＣＨＯ細胞（親標的細胞）を、３７℃で３０分間ｐＨｒｏｄｏ赤色染料で事前染色する。次いで、細胞をＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質とともに２０分間インキュベートして、ＣＴＬＡ４：ＣＤ８０結合を媒介し、その後、細胞マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で染色した事前にプレーティングされた接着性ウシ科動物肺胞マクロファージと共培養して、後の同定を補助する。６０，０００の標的細胞を、９６ウェルプレートにおいて、３０，０００のエフェクターマクロファージとともにプレーティングする。細胞を６時間共培養し、その後プレートから除去し、フローサイトメトリーによって分析して、ＡＤＣＰ（ｐＨｒｏｄｏ＋）を良好に実施したエフェクター細胞（ＣＴＶ＋）を同定する。

〔000333〕図１７及び表１０に示されるように、ウシ科動物ＩｇＧ２サブクラスは、ウシ肺胞マクロファージにおけるＡＤＣＰの活性化にウシ科動物ＩｇＧ１サブクラスほど強力ではないが（図９及び表５を参照）、ｂＩｇＧ２は、より高い濃度でＡＤＣＰを誘発することができる。全てのｂＩｇＧ２ａアラニン変異は、野生型ｂＩｇＧ２ａのＡＤＣＰ活性を排除する。

ｂＩｇＧ変異はエフェクター機能をノックアウトする
〔000334〕いくつかの変異を、ｂＩｇＧ３ａアロタイプのＦｃ領域に導入して、エフェクター機能をノックアウトした：１）ｂＩｇＧ３ａのｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３への結合、２）細胞ベースのアッセイにおける補体殺傷活性（ＣＤＣ）、及び３）ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイにおける食作用を排除するか、又は無視できるまで低減する。

〔000335〕「Ｗｉｎｔｅｒ」（又は「Ｗｉｎ」）部位は、ヒトＩｇＧ１について上述したように、ヒンジのすぐ下流にある。ヒトＩｇＧ１のこのＬＬＧＧ「Ｗｉｎｔｅｒ」部位は、種によって異なる。ウシ科動物ＩｇＧ３については、それは、ＰＬＧＧ（図２）である。上記で論じたように、ヒトＩｇＧ１について、一般的に「ＬＡＬＡ」と称される変異は、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａにある。

〔000336〕ｂＩｇＧ３について、対応するＷｉｎｔｅｒ変異は、Ｐｒｏ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａであるが、追加の残基も変異される。この追加の変異は、Ｇｌｙ２３７Ａｌａ（ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される）である。

〔000337〕ｂＩｇＧ３ａ上の「ＰＡＰからＳＡＳ」（Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ）及び「ＰＡＰからＳＡＰ」（Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ）変異を、ｂＩｇＧ２に基づいて考案した。ウシ科動物ＩｇＧ２は、細胞ベースのアッセイにおいて補体活性を誘発しない。ウシ科動物ＩｇＧ２ａは、ＣＨ２に天然に存在するＳＡＳ部位を有し、一方、図２に示すように、ｂＩｇＧ３ａは、この領域においてＰＡＰである。したがって、ｂＩｇＧ３ａにおけるＰＡＰをＳＡＳ又はＳＡＰのいずれかに変異させることは、ＣＤＣを排除するであろうと仮定された。

〔000338〕上述の変異を、ｂＩｇＧ３ａ Ｆｃ上に導入した：Ｗｉｎｔｅｒ変異のみ、Ｐ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ「Ｗｉｎ」（配列番号２９）、Ｗｉｎｔｅｒ変異＋ＳＡＳ変異、Ｐ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｇ２３７Ａ＿Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ「ＷｉｎＳＡＳ」（配列番号３０）、ＳＡＳ変異のみ、Ｐ３２９Ｓ＿Ｐ３３１Ｓ「ＳＡＳ」（配列番号２８）、及びＳＡＰ変異のみ、Ｐ３２９Ｓ「ＳＡＰ」（配列番号２７）。これらの変異は、図１８で整列され、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番される。

〔000339〕Ｆｃγ受容体についての上記変異の結合親和性を、ｂＩｇＧ３ａ野生型と比較した。変異体はまた、機能的細胞ベースのアッセイで試験され、データは、Ｗｉｎ変異のみがＣＤＣをわずかに弱めたたが、ＷｉｎＳＡＳ、ＳＡＳのみ、及びＳＡＰのみの変異がＣＤＣ活性を完了したノックアウトしたことを示す。Ｗｉｎ、ＷｉｎＳＡＳ、ＳＡＳ、及びＳＡＰの４つ全ての変異は、ＡＤＣＰ機能を完全にノックアウトする。

ウシ科動物Ｆｃ受容体結合親和性に対するｂＩｇＧ Ｆｃ変異の効果
〔000340〕ｂＩｇＧ３ａ及びｂＩｇＧ３ｂ野生型ＦｃのＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ ｂＦｃｇＲ親和性を、上述のｂＩｇＧ３ａ及びｂＩｇＧ３ｂ変異と比較することにより、ウシ科動物Ｆｃγ受容体への結合をノックアウトする能力を評価した。ｂＩｇＧ３ａ野生型組換えｍＡｂの４つのＦｃ変異体との定常領域のアラインメントを図１８に示す。ｂＩｇＧ３ａアロタイプのｂＩｇＧ３ｂアロタイプとのアラインメントを図５に示す。ｂＩｇＧ３に対して行われた全ての変異は、ａ及びｂアロタイプと同一である

〔000341〕上記の実施例に記載されるように、ｂＦｃｇＲ１、Ｒ２、及びＲ３のためのＢｉａｃｏｒｅ方法を実施した。表１１は、Ｆｃγ受容体への結合に対するエフェクター機能ｂＩｇＧ３ａ及びｂＩｇＧ３ｂ Ｆｃ変異の結果を示す。ｂＩｇＧ３野生型について、２つのアロタイプは、１．２５Ｅ－０８と比較して、ｂＦｃｇＲ１、９．３６Ｅ－０９に類似した結合親和性を有する。２つのアロタイプは、ｂＦｃｇＲ２及びｂＦｃｇＲ３について異なるＫＤを有するが、両方の野生型アロタイプは結合する。ａ及びｂアロタイプの両方についてのｂＩｇＧ３Ｗｉｎ、ｂＩｇＧ３ＷｉｎＳＡＳ、ｂＩｇＧ３ＳＡＳ、及びｂＩｇＧ３ＳＡＰの全ての変異は、ｂＦｃｇＲ１、ｂＦｃｇＲ２、及びｂＦｃｇＲ３への結合を無視できる親和性にノックダウンした。したがって、受容体結合をノックアウトすることについて、２つのアロタイプは比肩する。

ＣＤＣアッセイ
〔000342〕ＣＤＣ細胞ベースのアッセイは、ＣＤＣの媒介において４つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ３ａ Ｆｃ融合タンパク質（図１８）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＣＤＣ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。これらの標的細胞は、過去のイヌ科動物ＡＤＣＣアッセイで使用されており、それらの信頼性に起因してＣＤＣアッセイにおいて利用された。

〔000343〕ｂＩｇＧ３ａ ＣＴＬＡ４ Ｆｃ融合物については、上記の実施例に記載されるように、アッセイ方法を実施した。

〔000344〕図１９及び表１２に示されるように、ｂＩｇＧ３ａ野生型Ｆｃ及びｂＩｇＧ３ｂ野生型Ｆｃは、ｂＩｇＧ１ａ野生型Ｆｃよりもわずかに弱いＣＤＣ活性を示した。Ｗｉｎ変異自体は、ｂＩｇＧ３ａ Ｆｃ又はｂＩｇＧ３ｂ ＦｃのＣＤＣ活性をノックアウトしない。Ｗｉｎ－ＳＡＳ、ＳＡＳのみ、又はＳＡＰのみの変異は全てＣＤＣ活性を完全にノックアウトする。

インシリコモデリング
〔000345〕サブクラスＩｇＧ１と同様に、ウシ科動物サブクラス３におけるＷＩＮＳＡＳ変異の効果を、上記と同じ方法論を使用して研究し、同じプロトコルを使用して重ね合わせた（図２０Ａ）。図１９に示されるように、ｂＩｇＧ３ａ及びｂＩｇＧ３ｂにおけるＷＩＮＳＡＳ変異は、両方ともに、ＣＤＣ機能を完全に抑止した。インシリコモデリングデータは、２つのアロタイプ、ｂＩｇＧ３ａ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ３ｂ＿ＷＩＮＳＡＳが１．１６ÅのＲＭＳＤを有することを示し、したがって、同様のタンパク質折り畳みを有することが予想される（図２０Ｂ）。表１１に列挙される結合データ及び図２０のインシリコモデリングデータは、ｂＩｇＧ３ａ＿ＷＩＮＳＡＳ及びｂＩｇＧ＿３ｂが同一の方法で折り畳まれて結合することを示しており、したがって、実験結果及びモデル結果の両方に基づいて、ＣＤＣ機能に加えて、ｂＩｇＧ３ｂ＿ＷＩＮＳＡＳ構築物が、ｂＩｇＧ３ａ＿ＷＩＮＳＡＳと同様のＡＤＣＰ及びＡＤＣＣ機能も排除することを高度に確実に予測する。

ＡＤＣＰアッセイ
〔000346〕ＡＤＣＰ細胞ベースのアッセイは、ＡＤＣＰの媒介において４つのＣＴＬＡ４ウシ科動物ＩｇＧ３ａ Ｆｃ融合タンパク質（図１８）の有効性を特徴付け、ウシ科動物ＩｇＧサブタイプのＡＤＣＰ活性を決定するＦｃ領域における重要な残基を定義するために開発され、用いられた。このアッセイは、Ｆｃ融合タンパク質上のＣＴＬＡ４に結合するイヌ科動物ＣＤ８０を発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞を利用する。

〔000347〕このアッセイのために、ウシ科動物肺胞マクロファージとのＦｃ融合タンパク質／標的細胞複合体のインキュベーションは、マクロファージ上のＦｃγ受容体へのＦｃ結合、ＣＨＯ標的細胞とマクロファージエフェクターとの架橋、及びそれによって標的細胞の食作用の開始をもたらすことができる。ＡＤＣＰは、共培養におけるエフェクターマクロファージの集団内のｐＨ感受性蛍光色素のシグナル強度及び周波数によって測定され、蛍光細胞は、標的細胞を酸性リソソームに良好に内在化したエフェクターを示す。

〔000348〕簡潔に述べると、イヌ科動物ＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞（ＣＤ８０標的細胞）又はＣＤ８０を発現しない親ＣＨＯ細胞（親標的細胞）を、３７℃で３０分間ｐＨｒｏｄｏ赤色染料で事前染色する。次いで、細胞をＣＴＬＡ４－Ｆｃ融合タンパク質とともに２０分間インキュベートして、ＣＴＬＡ４：ＣＤ８０結合を媒介し、その後、細胞マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で染色した事前にプレーティングされた接着性ウシ科動物肺胞マクロファージと共培養して、後の同定を補助する。６０，０００の標的細胞を、９６ウェルプレートにおいて、３０，０００のエフェクターマクロファージとともにプレーティングする。細胞を６時間共培養し、その後プレートから除去し、フローサイトメトリーによって分析して、ＡＤＣＰ（ｐＨｒｏｄｏ＋）を良好に実施したエフェクター細胞（ＣＴＶ＋）を同定する。

〔000349〕図２１及び表１２に示されるように、野生型ｂＩｇＧ３ａは、ウシ科動物肺胞マクロファージにおけるＡＤＣＰの強力な活性化剤である。ｂＩｇＧ３ａＷｉｎ単独、ＷｉｎＳＡＳ、ＳＡＳ単独、及びＳＡＰ単独の変異は全て、ＡＤＣＰ機能を排除する。

〔000350〕注目すべきことに、ｂＩｇＧ３ａのＷｉｎ変異は、最高濃度でいくつかの微量活性を示すが、この変異は、ｂＩｇＧ１ａ ＡＤＣＰ及びｂＩｇＧ３ａ ＣＤＣの両方における活性とは対照的に、ＡＤＣＰを駆動する際にほとんど効果がない。これは、ｂＩｇＧ３ａ ＡＤＣＰ活性は、Ｗｉｎｔｅｒ部位変異が結合することを必要とする肺胞マクロファージにおけるｂＦｃｇＲのサブセットを介してのみ媒介されるが、ｂＩｇＧ１ａは、Ｗｉｎｔｅｒ部位がこれらの細胞において結合することを必要としない別個のｂＦｃｇＲを介してＡＤＣＰを媒介することを示し得る。ＦｃｇＲの可変利用はまた、ｂＩｇＧ３ａと比較して野生型ｂＩｇＧ１ａの異なる観察されたＥＣ５０を説明することができる。逆に、ｂＩｇＧ１ａとｂＩｇＧ３ａとの間の異なる二次構造は、ＡＤＣＰを駆動する適切な受容体に結合する際のＷｉｎｔｅｒ部位の差異的な利用をもたらし得る。

ｂＩｇＧ変異は、ＦｃＲｎ親和性を改善する
〔000351〕表１３に示すように、ウシ科動物ＩｇＧ３ａは、ｂＩｇＧ２ａと比較して、ｐＨ６でｂＦｃＲｎに対する弱い結合親和性を有する。予想外に、ｂＩｇＧ２ａは、ｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ３ａよりも１０倍高い親和性を有するが、ウシ科動物ＦｃＲｎへのｐＨ７．４でのｂＩｇＧ２ａ結合は、他の２つのサブクラスと比較した場合、より強い。しかしながら、ｂＩｇＧ２ａベースのｍＡｂの実証された長い血清半減期のため、抗体を循環（ｐＨ７．４）に戻すために必要なｐＨでのｂＩｇＧ２ａのより堅固な結合は、懸念されない。

〔000352〕ｂＩｇＧ２ベースのｍＡｂは、仔ウシにおいて、ほとんどのヒト治療用ｍＡｂよりも非常に長く、最大２１日間の血清半減期を有する。ウシ科動物ＩｇＧ２ａは、ｂＩｇＧ１ａよりもｐＨ６でｂＦｃＲｎに強い親和性を有する。したがって、ｂＩｇＧ３ａサブクラスは、ｂＩｇＧ２ａよりも短い血清半減期を有し得る。したがって、ｂＩｇＧ３ａのｂＦｃＲｎに対する親和性を増加させて、ｂＩｇＧ２ａに匹敵するインビボ半減期を延長することが望ましい。

〔000353〕ｂＦｃＲｎに対する親和性を改善するために、ｂＩｇＧ３ａ（Ａｒｇ４３３Ｈｉｓ）に点変異を導入した。この変異は、図２に示すように、ｂＩｇＧ１ａ及びｂＩｇＧ２ａとのアラインメントに基づいた。加えて、Ｈｉｓ４３５を有するヒトＩｇＧ３アロタイプは、Ａｒｇ４３５を有するアロタイプよりも劇的に長い血清半減期を有し、この残基位置は、ｂＩｇＧ３におけるアルギニンと同じ領域にあり、ヒトアルギニンからたった２残基上流である：ｈＩｇＧ３についてはＨＥＡＬＨＮＲＹ及びｂＩｇＧ３についてはＨＥＡＬＲＮＨＹ（図２）。

〔000354〕ｂＦｃＲｎに対する親和性を改善するために、上述のように、Ｒ４３３Ｈ変異型ｂＩｇＧ３ａ ｍＡｂを生成した。ｂＩｇＧ３ａ野生型組換えｍＡｂのＲ４３３Ｈ変異との定常領域のアラインメントを図２２に示す。

〔000355〕上記の実施例に記載されるように、ウシ科動物ＩｇＧサブクラスのウシ科動物ＦｃＲｎに対する親和性を試験するために、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ結合アッセイを設計した。

〔000356〕ｂＩｇＧ３ａ＿Ｒ４３３Ｈ変異体は、ｐＨ６でｂＦｃＲｎに、ｂＩｇＧ３ａ野生型よりも５倍高い親和性で結合し、変異体は、ｐＨ７．４でｂＦｃＲｎへの無視できる結合を保持する（表１３）。したがって、Ｒ４３３Ｈ変異体は、血清半減期を改善し得る。

〔000357〕本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明は正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、当業者によって様々な変更及び修正が行われ得ることを理解されたい。

Claims (85)

1. 野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む、修飾されたＩｇＧであって、前記置換が、ＫａｂａｔにおけるＥｕインデックスに従って付番されたアミノ酸残基２１６、２３４、２３５、２３７、２７０、３２９、３３０、３３１、４３２、４３４、４３７、又は４３３にある、修飾されたＩｇＧ。
2. 前記修飾されたＩｇＧが、ウシ科動物又はウシ化ＩｇＧである、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
3. 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１である、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
4. 前記ＩｇＧ１が、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ１ｃ、又はＩｇＧ１ｄである、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
5. 前記置換が、アミノ酸残基３２９、３３０、３３１、又はそれらの組み合わせにある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
6. 前記置換が、前記アミノ酸残基のセリンとの置換である、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
7. 前記置換が、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、又は３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
8. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
9. 前記定常ドメインが、ＰＡＰからＳＡＰへの変異を含み、前記変異が、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）である、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
10. 前記定常ドメインが、ＰＡＰからＳＡＳへの変異を含み、前記変異が、３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
11. 前記定常ドメインがＳＳ変異を含み、前記変異が、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）及び３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項５に記載の修飾されたＩｇＧ。
12. 前記置換が、Ｗｉｎｔｅｒ部位の１つ以上のアミノ酸残基にある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
13. 前記置換が、アミノ酸残基２３４、２３５、２３７、又はそれらの組み合わせにある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
14. 前記置換が、前記アミノ酸残基のアラニンとの置換である、請求項１３に記載の修飾されたＩｇＧ。
15. 前記置換が、２３４位でのプロリンのアラニンとの置換（Ｐ２３４Ａ）、２３５位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ２３５Ａ）、又は２３５位でのグリシンのアラニンとの置換（Ｇ２３７Ａ）である、請求項１３に記載の修飾されたＩｇＧ。
16. 前記定常ドメインが、置換Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の修飾されたＩｇＧ。
17. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
18. 前記置換が、ＤＰ部位の１つ以上のアミノ酸残基にある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
19. 前記置換が、アミノ酸残基２１６、２７０、又はそれらの組み合わせにある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
20. 前記置換が、前記アミノ酸残基のグルタミン酸との置換である、請求項１９に記載の修飾されたＩｇＧ。
21. 前記置換が、２１６位でのアスパラギン酸のグルタミン酸との置換（Ｄ２１６Ｅ）又は２７０位でのアスパラギン酸のグルタミン酸との置換（Ｄ２７０Ｅ）である、請求項１９に記載の修飾されたＩｇＧ。
22. 前記定常ドメインが、置換Ｄ２１６Ｅ及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の修飾されたＩｇＧ。
23. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２１６Ｅ、及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
24. 前記置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにある、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
25. 前記置換が、前記アミノ酸残基のアラニンとの置換である、請求項２４に記載の修飾されたＩｇＧ。
26. 前記置換が、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、４３７位でのスレオニンのアラニンとの置換（Ｔ４３７Ａ）である、請求項２４に記載の修飾されたＩｇＧ。
27. 前記定常ドメインが、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項２４に記載の修飾されたＩｇＧ。
28. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２１６Ｅ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の修飾されたＩｇＧ。
29. 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ２である、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
30. 前記ＩｇＧ２が、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂである、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
31. 前記置換が、アミノ酸残基３３０にある、請求項３０に記載の修飾されたＩｇＧ。
32. 前記置換が、前記アミノ酸残基のセリンとの置換である、請求項３１に記載の修飾されたＩｇＧ。
33. 前記定常ドメインが、ＳＳ変異を含み、前記変異が、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）である、請求項３１に記載の修飾されたＩｇＧ。
34. 前記置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにある、請求項３０に記載の修飾されたＩｇＧ。
35. 前記置換が、前記アミノ酸残基のアラニンとの置換である、請求項３４に記載の修飾されたＩｇＧ。
36. 前記置換が、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、４３７位でのメチオニンのアラニンとの置換（Ｍ４３７Ａ）である、請求項３４に記載の修飾されたＩｇＧ。
37. 前記定常ドメインが、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項３４に記載の修飾されたＩｇＧ。
38. 前記定常ドメインが、置換Ａ３３０Ｓ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＭ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項３０に記載の修飾されたＩｇＧ。
39. 前記ＩｇＧが、ＩｇＧ３である、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
40. 前記ＩｇＧ３が、ＩｇＧ３ａ又はＩｇＧ３ｂである、請求項１に記載の修飾されたＩｇＧ。
41. 前記置換が、アミノ酸残基３２９、３３０、３３１、又はそれらの組み合わせにある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
42. 前記置換が、前記アミノ酸残基のセリンとの置換である、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
43. 前記置換が、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）、又は３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
44. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
45. 前記定常ドメインが、ＰＡＰからＳＡＰへの変異を含み、前記変異が、３２９位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３２９Ｓ）である、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
46. 前記定常ドメインが、ＰＡＰからＳＡＳへの変異を含み、前記変異が、３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
47. 前記定常ドメインがＳＳ変異を含み、前記変異が、３３０位でのアラニンのセリンとの置換（Ａ３３０Ｓ）及び３３１位でのプロリンのセリンとの置換（Ｐ３３１Ｓ）である、請求項４１に記載の修飾されたＩｇＧ。
48. 前記置換が、Ｗｉｎｔｅｒ部位の１つ以上のアミノ酸残基にある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
49. 前記置換が、アミノ酸残基２３４、２３５、２３７、又はそれらの組み合わせにある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
50. 前記置換が、前記アミノ酸残基のアラニンとの置換である、請求項４９に記載の修飾されたＩｇＧ。
51. 前記置換が、２３４位でのプロリンのアラニンとの置換（Ｐ２３４Ａ）、２３５位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ２３５Ａ）、又は２３５位でのグリシンのアラニンとの置換（Ｇ２３７Ａ）である、請求項４９に記載の修飾されたＩｇＧ。
52. 前記定常ドメインが、置換Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項４９に記載の修飾されたＩｇＧ。
53. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
54. 前記置換が、ＤＰ部位の１つ以上のアミノ酸残基にある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
55. 前記置換が、アミノ酸残基２７０にある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
56. 前記置換が、前記アミノ酸残基のグルタミン酸との置換である、請求項５５に記載の修飾されたＩｇＧ。
57. 前記置換が、２７０位でのアスパラギン酸のグルタミン酸との置換（Ｄ２７０Ｅ）である、請求項５５に記載の修飾されたＩｇＧ。
58. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＤ２７０Ｅのうちの１つ以上を含む、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
59. 前記置換が、アミノ酸残基４３２、４３４、４３７、又はそれらの組み合わせにある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
60. 前記置換が、前記アミノ酸残基のアラニンとの置換である、請求項５９に記載の修飾されたＩｇＧ。
61. 前記置換が、４３２位でのロイシンのアラニンとの置換（Ｌ４３２Ａ）、４３４位でのアスパラギンのアラニンとの置換（Ｎ４３４Ａ）、４３７位でのリジンのアラニンとの置換（Ｋ４３７Ａ）である、請求項６０に記載の修飾されたＩｇＧ。
62. 前記定常ドメインが、置換Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＫ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項６０に記載の修飾されたＩｇＧ。
63. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、及びＫ４３７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
64. 前記置換が、アミノ酸残基４３３にある、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
65. 前記置換が、前記アミノ酸残基のヒスチジンとの置換である、請求項６４に記載の修飾されたＩｇＧ。
66. 前記置換が、４３３位でのアルギニンのヒスチジンとの置換（Ｒ４３３Ｈ）である、請求項６４に記載の修飾されたＩｇＧ。
67. 前記定常ドメインが、置換Ｐ３２９Ｓ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｌ４３２Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、及びＲ４３３Ｈのうちの１つ以上を含む、請求項４０に記載の修飾されたＩｇＧ。
68. 前記修飾されたＩｇＧが、前記野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有する前記ＩｇＧよりも高い、ＦｃＲｎに対する親和性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
69. 前記修飾されたＩｇＧが、前記野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧと比較して、補体依存性細胞傷害性を排除又は低減する、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
70. 前記修飾されたＩｇＧが、前記野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧと比較して、抗体依存性細胞食作用を排除又は低減する、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
71. 前記修飾されたＩｇＧが、前記ＩｇＧの唯一のＦｃγ受容体（ｂＦｃｇＲ）への結合を排除又は低減する、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
72. 前記修飾されたＩｇＧが、前記野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して、増加した半減期を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
73. 前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＣＨ１ドメイン又はヒンジ領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
74. 前記ＩｇＧ定常ドメインが、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するＦｃ定常領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
75. 前記野生型ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインが、配列番号１～９に記載のアミノ酸配列のうちの１つを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧ。
76. 先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
77. 容器内に、先行請求項のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧと、使用指示書と、を含む、キット。
78. 請求項１～７５のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧを含む、ポリペプチド。
79. 請求項１～７５のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧを含む、抗体。
80. 配列番号１０～１２、１４～２５、及び２７～３１に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つをコードする核酸配列を含む、ベクター。
81. 請求項８０に記載のベクターを含む、単離された細胞。
82. 抗体又は分子を製造する方法であって、前記方法が、請求項８１に記載の細胞を提供することと、前記細胞を培養することと、を含む、方法。
83. 抗体を製造する方法であって、前記方法が、請求項７９に記載の抗体を提供することを含む、方法。
84. 家畜における抗体血清半減期を増加させるための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項７９に記載の抗体を前記家畜に投与することを含む、方法。
85. 薬剤に融合したウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインを含む融合分子であって、前記ウシ科動物ＩｇＧ定常ドメインが、請求項１～７５のいずれか一項に記載の修飾されたＩｇＧを含む、融合分子。