CN116615463A - 牛抗体变体 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及牛抗体变体和其用途。具体地，本发明涉及牛抗体的恒定区中的用于改进各种特性的突变。

Description

牛抗体变体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年11月20日提交的美国临时专利申请63/116491的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及牛抗体变体和其用途。具体地，本发明涉及牛抗体的Fc恒定区中的用于改进各种特性的一个或多个突变。

背景技术

牛IgG单克隆抗体(mAb)可以是兽医学的有效治疗剂。几年前，鉴定了三种牛IgG亚类。然而，并没有做太多工作来改进牛IgG的特性。

通过循环机制，新生儿Fc受体(FcRn)在与IgG片段可结晶(Fc)区的pH依赖性相互作用中延长了IgG的半衰期。具体地，跨越CH2结构域和CH3结构域的界面的Fc区与FcRn在细胞的表面上相互作用以调节IgG稳态。IgG胞饮后的酸性相互作用有利于这种相互作用，并且由此保护IgG免受降解。然后，内吞的IgG再循环回到细胞表面，并且在略微碱性pH下释放到血流中，由此维持足够的血清IgG以实现正常功能。因此，IgG的药代动力学谱取决于其Fc区的结构和功能特征。

Fc区还负责抗体效应功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。这些效应功能依赖于Fc区与FcγR的相互作用。因此，将Fc区工程化以调整其与FcγR的相互作用已成为用于增强治疗性抗体的活性的一种有希望的方法。

在人类健康方面，数十年的Fc工程化已经鉴定出改进了药代动力学和效应功能的许多突变。到目前为止，还没有报告在牛中进行这样的Fc工程化研究。

因此，需要用于改进牛IgG的各种特性的新颖牛IgG Fc区突变。

发明内容

本发明涉及相对于野生型牛IgG，表现出期望的特性的突变体牛IgG。具体地，本申请的诸位发明人发现，位置216、234、235、237、270、329、330、331、432、434、437或433(根据如Kabat中的Eu索引编号)处的氨基酸残基被另一个氨基酸取代令人惊讶且出人意料地表现出期望的效应。在一示例性实施例中，出人意料的期望的效应包含但不限于：对FcRn的亲和力增强；补体依赖性细胞毒性(CDC)减少；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)减少；抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)减少；与Fcγ受体(bFcgR)的结合减少；或其组合。

一方面，本发明提供了一种经修饰的IgG，其包括：牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括相对于野生型牛IgG恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基216、234、235、237、270、329、330、331、432、434、437或433处。

在一个示例性实施例中，所述牛IgG恒定结构域为IgG1恒定结构域，所述IgG1恒定结构域包括P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D216E、D270E、L432A、N434A和T437A的取代中的一个或多个取代。

在另一示例性实施例中，所述牛IgG恒定结构域为IgG2恒定结构域，所述IgG2恒定结构域包括A330S、L432A、N434A和M437A的取代中的一个或多个取代。

在又另一示例性实施例中，所述牛IgG恒定结构域为IgG3恒定结构域，所述IgG3恒定结构域包括P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D270E、L432A、N434A、T437A和R433H的取代中的一个或多个取代。

另一方面，本发明提供了一种多肽，其包括：牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括本文所述的本发明的一个或多个氨基酸取代。

在又另一方面，本发明提供了一种抗体或分子，其包括：牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括本文所述的本发明的一个或多个氨基酸取代。

在一另外的方面，本发明提供了一种用于产生或制备抗体或分子的方法，所述方法包括：提供具有编码抗体的核酸序列的载体或宿主细胞，其中所述抗体包括牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括本文所述的本发明的一个或多个氨基酸取代。

根据以下详细说明书实例和附图，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应理解，具体实施方式和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为本领域的技术人员将由此实施方式而变得显而易知本发明的精神和范围内的各种变化和修改。

附图说明

专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

图1展示了通过IgG Fc与Fcγ受体在效应细胞表面上的结合触发的靶细胞杀伤功能。

图2示出了牛IgG亚类的序列比对。示出了三种代表性同种异型。CH1、铰链、CH2、CH3结构域如下：CH1：残基1-98；铰链：99到竖直线；CH2：竖直线到243；CH3：244–351。参与重链间二硫键的半胱氨酸呈粗体并且是加下划线的。奶牛IgG3a中的CH1外显子的3'延伸部为斜体的。紧紧位于铰链下游的粗体的氨基酸表示“Winter”或“LALA”位点。对于bIgG1a和bIgG3a，这些位点分别为LPGG和PLGG。此位点不存在于bIgG2a中。框包含bIgG1a和bIgG3aCH2中的“PAP”区和bIgG2a中的“SAS”区。bIgG3a中的双下划线的精氨酸(R)为参与变为组氨酸(H)的点突变的残基。

图3示出了牛IgG1亚类的三个独特等位基因的序列比对。粗体：bIgG1a上突变的用于减轻蛋白酶剪切的氨基酸“DP”区。加下划线的：bIgG1a上突变的用于敲除效应功能的氨基酸突变。由于bIgG1d与bIgG1b具有同义的氨基酸序列，因此其不包含在bIgG1同种异型的比对中。对bIgG1进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。

图4示出了牛IgG2亚类的两个报告的等位基因bIgG2a(NCBI X16702.1)和bIgG2b(NCBI S82407)与从牛中分离的IgG2抗体的序列的序列比对。粗体：bIgG2a上突变的用于敲除效应功能的氨基酸突变。发明人已从奶牛中分离出IgG抗体，并且测序显示出与针对bIgG2a所报告的，如图4中示出为“来自奶牛序列的bIgG2a”的测序的2个残基偏差。此序列可以表示bIgG2的新同种异型，但出于本专利申请的目的，其由于与bIgG2a的接近相同的比对而将被称为“bIgG2a”。对bIgG2进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。

图5示出了牛IgG3亚类的两个等位基因的序列比对。粗体：bIgG3a上突变的用于敲除效应功能的氨基酸突变。加下划线的：bIgG3a上突变的用于增强与bFcRn的亲和力的残基。对bIgG3进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。

图6示出了用于敲除效应功能的牛IgG1a和bIgG1a Fc突变体。粗体：参与Winter突变L234A_P235A_G237A*的残基。框：参与PAP变为SAS(P329S_P331S*)、PAP变为SAP(P329S*)突变和PAP变为PSS(SS突变；A330S_P331S*)突变与Winter突变的组合的残基。竖直线：CTLA4-Fc融合蛋白中的Fc区的开始。*突变的氨基酸残基是根据如Kabat中的Eu索引编号的。

图7A和7B示出了牛IgG1a、IgG1b和两种同种异型的变体的基于细胞的补体依赖性细胞毒性活性。

图8示出了bIgG1a_WINSAS、bIgG1b_WINSAS、bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS的抗体同源性建模。A)蛋白质模型的叠加，其中放大的子图示出了WINSAS残基(箭头)。B)bIgG1a_WINSAS、bIgG1b_WINSAS、bIgG1c_WINSAS和bG1d_WINSAS同种异型的WINSAS突变体的均方根偏差(RMSD)比较(以埃为单位)。

图9示出了牛IgG1a亚类的用于消除基于细胞的测定中的抗体依赖性细胞吞噬的Fc突变。

图10示出了野生型牛IgG1a分子的分析SEC。

图11A示出了牛IgG1a野生型(WT)Fc的质谱分析。图11B示出了牛IgG1a双突变DP位点1和2的质谱分析。

图12示出了用于消除切割位点的牛IgG1a和bIgG1a DP变为EP Fc突变体。粗体：变为EP的“DP1”(位点1)突变；加下划线的：变为EP的“DP2”(位点2)突变。

图13示出了bIgG1a_DP1_DP2、bIgG1b_DP1_DP2、bIgG1c_DP1_DP2和bIgG1d_DP1_DP2的抗体同源性建模。A)蛋白质模型的叠加，其中放大的子图示出了DP1和DP2残基(箭头)。B)牛G1a、G1b、G1c和G1d同种异型的DP1_DP2突变体的均方根偏差(RMSD)比较。

图14示出了用于敲除效应功能的牛IgG2a和bIgG2a Fc突变体。第一行粗体：作为独立突变或组合的形式突变为丙氨酸的三个残基L432*、N434*和M437*。竖直线：CTLA4-Fc融合蛋白中的Fc区的开始。*突变的氨基酸残基是根据如Kabat中的Eu索引编号的。

图15A和15B示出，牛IgG2a和IgG2b亚类上的Fc突变消除了基于细胞的补体依赖性细胞毒性活性。

图16示出了bIgG2a_L432A_N434A_M437A和bIgG2b_L432A_N434A_M437A的抗体同源性建模。A)蛋白质模型的叠加，其中放大的子图示出了L432A_N434A_M437A残基(箭头)。B)牛IgG2a和IgG2b同种异型的L432A_N434A_M437A突变体的均方根偏差(RMSD)比较。

图17示出了牛IgG2a亚类的Fc突变消除基于细胞的测定中的抗体依赖性细胞吞噬。

图18示出了用于敲除效应功能的牛IgG3a和bIgG3a Fc突变体。粗体：参与Winter突变(P234A_L235A_G237A*)的残基。框：参与PAP变为SAS(P329S_P331S*)和PAP变为SAP(P329S*)突变的残基。竖直线：CTLA4-Fc融合蛋白中的Fc区的开始。*突变的氨基酸残基是根据如Kabat中的Eu索引编号的。

图19A和19B示出了牛IgG3a和IgG3b亚类的用于消除基于细胞的测定中的补体依赖性细胞毒性的Fc突变。

图20示出了bIgG3a_WINSAS和bIgG3b_WINSAS的抗体同源性建模。A)蛋白质模型的叠加，其中放大的子图示出了WINSAS残基(箭头)。B)牛IgG3a和IgG3b同种异型的WINSAS突变体的均方根偏差(RMSD)比较。

图21示出了牛IgG3a亚类的Fc突变消除基于细胞的测定中的抗体依赖性细胞吞噬。

图22示出了用于改进bFcRn结合的牛IgG3a和Fc突变体。粗体精氨酸(R)为参与变为组氨酸(H)的点突变的残基R433H，其是根据如Kabat中的Eu索引编号的。

图23示出了人IgG1、牛1gG1a、牛IgG2a和牛IgG3a的氨基酸序列的比对。氨基酸残基是根据如Kabat中的Eu索引编号的。IgG1(b、c、d)、IgG2(b)和IgG3(b)的其它等位基因的氨基酸残基也是根据图23所示的Eu索引编号的。

序列表简要说明

SEQ ID NO.:1是指IgG1a野生型的氨基酸序列(NCBI ID号1S82409)。

SEQ ID NO.:2是指IgG1b野生型的氨基酸序列(NCBI ID号X16701)。

SEQ ID NO.:3是指IgG1c野生型的氨基酸序列(NCBI ID号DQ452014.1)。

SEQ ID NO.:4是指IgG1d野生型的氨基酸序列(NCBI ID号X62916.1)。

SEQ ID NO.:5是指IgG2a野生型的氨基酸序列(NCBI ID号X16702.1)。

SEQ ID NO.:6是指IgG2b野生型的氨基酸序列(NCBI ID号S82407)。

SEQ ID NO.:7是指IgG3a野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:8是指IgG3b野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:9是指来自奶牛的IgG2a野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:10是指具有DP1突变的IgG1a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:11是指具有DP2突变的IgG1a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:12是指具有DP1突变和DP2突变的IgG1a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:13是指IgG1a野生型片段物理位置99-329的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:14是指具有SAP突变的IgG1a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:15是指具有SAS突变的IgG1a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:16是指具有Winter突变的IgG1a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:17是指具有Winter和SAS突变的IgG1a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:18是指具有Winter和SS突变的IgG1a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:19是指具有突变L432A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:20是指具有突变N434A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:21是指具有突变M437A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:22是指具有突变L432A和M437A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:23是指具有突变N434A和M437A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:24是指具有突变L432A、N434A和M437A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:25是指具有突变L432A和N434A的IgG2a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:26是指IgG3a野生型片段物理位置99-352的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:27是指具有SAP突变的IgG3a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:28是指具有SAS突变的IgG3a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:29是指具有Winter突变的IgG3a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:30是指具有Winter和SAS突变的IgG3a片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:31是指具有突变R433H的IgG3a的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:32是指人IgG1的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:33是指IgG1b野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:34是指IgG1b野生型的核酸序列。

SEQ ID NO.:35是指具有Winter突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:36是指具有Winter突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:37是指具有WinSS突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:38是指具有WinSS突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:39是指具有WinSAS突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:40是指具有WinSAS突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:41是指具有SAS突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:42是指具有SAS突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:43是指具有SAP突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:44是指具有SAP突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:45是指具有D216E突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:46是指具有D216E突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:47是指具有D270E突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:48是指具有D270E突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:49是指具有D216E突变和D270E突变的IgG1b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:50是指具有D216E突变和D270E突变的IgG1b的核酸序列。

SEQ ID NO.:51是指IgG2b野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:52是指IgG2b野生型的核酸序列。

SEQ ID NO.:53是指具有L432A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:54是指具有L432A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:55是指具有N434A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:56是指具有N434A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:57是指具有M437A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:58是指具有M437A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:59是指具有L432A突变和N434A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:60是指具有L432A突变和N434A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:61是指具有L432A突变和M437A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:62是指具有L432A突变和M437A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:63是指具有N434A突变和M437A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:64是指具有N434A突变和M437A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:65是指具有L432A突变、N434A突变和M437A突变的IgG2b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:66是指具有L432A突变、N434A突变和M437A突变的IgG2b的核酸序列。

SEQ ID NO.:67是指IgG3b野生型的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:68是指IgG3b野生型的核酸序列。

SEQ ID NO.:69是指具有Winter突变的IgG3b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:70是指具有Winter突变的IgG3b的核酸序列。

SEQ ID NO.:71是指具有WinSAS突变的IgG3b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:72是指具有WinSAS突变的IgG3b的核酸序列。

SEQ ID NO.:73是指具有SAS突变的IgG3b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:74是指具有SAS突变的IgG3b的核酸序列。

SEQ ID NO.:75是指具有SAP突变的IgG3b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:76是指具有SAP突变的IgG3b的核酸序列。

SEQ ID NO.:77是指具有R433H突变的IgG3b的氨基酸序列。

SEQ ID NO.:78是指具有R433H突变的IgG3b的核酸序列。

SEQ ID NO.:79是指bIgG1bWin(L234A_P235A_G237A)：LPGG变为AAGA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:80是指bIgG1bWin(L234A_P235A_G237A)：LPGG变为AAGA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:81是指bIgG1bWinSS(A330S_P331S)：PAP变为PSS的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:82是指bIgG1bWinSS(A330S_P331S)：PAP变为PSS的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:83是指bIgG1bSAS(P329S_P331S)：PAP变为SAS的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:84是指bIgG1bSAS(P329S_P331S)：PAP变为SAS的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:85是指bIgG1bSAP(P329S)：PAP变为SAP的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:86是指bIgG1bSAP(P329S)：PAP变为SAP的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:87是指bIgG1b_DP1(D216E)：DP1变为EP1的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:88是指bIgG1b_DP1(D216E)：DP1变为EP1的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:89是指bIgG1b_DP2(D270E)：DP2变为EP2的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:90是指bIgG1b_DP2(D270E)：DP2变为EP2的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:91是指bIgG2b_L432A：LHNHYM变为AHNHYM的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:92是指bIgG2b_L432A：LHNHYM变为AHNHYM的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:93是指bIgG2b_N434A：LHNHYM变为LHAHYM的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:94是指bIgG2b_N434A：LHNHYM变为LHAHYM的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:95是指bIgG2b_M437A：LHNHYM变为LHNHYA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:96是指bIgG2b_M437A：LHNHYM变为LHNHYA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:97是指bIgG2b_L432A_N434A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHAHYM的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:98是指bIgG2b_L432A_N434A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHAHYM的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:99是指bIgG2b_L432A_M437A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:100是指bIgG2b_L432A_M437A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:101是指bIgG2b_N434A_M437A：LHNHYM变为LHAHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:102是指bIgG2b_N434A_M437A：LHNHYM变为LHAHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:103是指bIgG2b_L432A_N434A_M437A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHAHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:104是指bIgG2b_L432A_N434A_M437A：LHNHYM变为AHNHYM；LHNHYM变为LHAHYM；LHNHYM变为LHNHYA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:105是指bIgG3bWin(P234A_L235A_G237A)：PLGG变为AAGA的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:106是指bIgG3bWin(P234A_L235A_G237A)：PLGG变为AAGA的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:107是指bIgG3bSAS(P329S_P331S)：PAP变为SAS的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:108是指bIgG3bSAS(P329S_P331S)：PAP变为SAS的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:109是指bIgG3bSAP(P329S)：PAP变为SAP的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:110是指bIgG3bSAP(P329S)：PAP变为SAP的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:111是指bIgG3b_R433H：ALRNH变为ALHNH的侧翼氨基酸序列。

SEQ ID NO.:112是指bIgG3b_R433H：ALRNH变为ALHNH的侧翼核酸序列。

SEQ ID NO.:113是指生物素受体肽(BAP)的氨基酸序列。

具体实施方式

可以通过参考形成本公开的一部分的以下详细描述更容易地理解本发明主题。应当理解，本发明不限于本文描述和/或示出的具体产物、方法、条件或参数，并且本文使用的术语仅出于通过举例描述特定实施例的目的，并且不旨在限制要求保护的本发明。

除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学术语和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。

如上文和整个公开中采用的，除非另有指示，以下术语和缩写应被理解为具有以下含义。

定义

在本公开中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数参考物，并且除非上下文另有明确指示，否则对特定数值的引用至少包含所述特定值。因此，例如，提及“分子”或“化合物”是提及本领域的技术人员已知的此类分子或化合物和其等效物中的一种或多种等等。如本文所用，术语“多个”意指多于一个。当表达值的范围时，另一个实施例包含从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施例。所有范围都是包含性的且可组合的。

在说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中的氨基酸残基的编号为如Kabat,《免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院公共卫生服务部(Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1991)中的Eu索引编号的。“如Kabat中的Eu索引”是指IgG抗体的残基编号，并且在本文在图23中反映。

当相对于核酸使用时，术语“分离的”是被鉴定并且从在其天然来源中通常与其相关联的至少一种污染物核酸中分离的核酸。分离的核酸处于与其在自然界中存在的形式或环境不同的形式或环境中。因此，分离的核酸分子有别于其存在于自然细胞中的核酸分子。分离的核酸分子包含通常表达在其中编码的多肽的细胞中所含有的核酸分子，其中，例如，所述核酸分子位于与天然细胞的位置不同的质粒或染色体位置中。分离的核酸可以以单链或双链的形式存在。当分离的核酸分子用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸将至少含有有义链或编码链，但可以含有有义链和反义链两者(即，可以是双链的)。

当一个核酸分子与另一个核酸分子处于功能关系时，所述核酸分子是“可操作地连接的”或“可操作地附接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与核酸的编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则其与核酸的编码序列可操作地连接。如果编码变体Fc区的核酸分子被定位成使得所表达的融合蛋白包括在上游或在下游抵接变体Fc区多肽的异源蛋白或其功能片段，则所述核酸分子与编码所述异源蛋白(即，在其存在于自然界中时不包括Fc区的蛋白质或其功能片段)的核酸分子可操作地连接；所述异源蛋白可以与变体Fc区多肽直接相邻，或者可以通过任何长度和组成的接头序列与所述多肽分离。类似地，当多肽(在本文中与“蛋白质”同义地使用)分子与另一多肽处于功能关系时，其是“可操作地连接的”或“可操作地附接的”。

如本文所用，当涉及多肽或蛋白质(例如，变体Fc区或单克隆抗体)时，术语“功能片段”是指所述蛋白质的保留全长多肽的至少一个功能的片段。片段的大小可以在六个氨基酸至全长多肽的整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内。本发明的变体Fc区多肽的功能片段保留本文所定义的至少一个“氨基酸取代”。变体Fc区域多肽的功能片段保留本领域已知与Fc区相关的至少一个功能(例如，ADCC、CDC、Fc受体结合、Clq结合、细胞表面受体下调，或者可以，例如，增加其可操作地附接到的多肽的体内或体外半衰期)。

术语“经纯化的”或“纯化”是指从样品中大量去除至少一种污染物。例如，抗原特异性抗体可以通过完全或大量去除(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或更优选地，至少96％、97％、98％或99％)至少一种污染性非免疫球蛋白来纯化；其还可以通过去除不与同一抗原结合的免疫球蛋白来纯化。去除非免疫球蛋白和/或去除不与特定抗原结合的免疫球蛋白使样品中的抗原特异性免疫球蛋白的百分比提高。在另一实例中，在细菌宿主细胞中表达的多肽(例如，免疫球蛋白)是通过完全或大量去除宿主细胞蛋白纯化的；样品中的多肽的百分比由此提高。

术语“天然的”在其指代多肽(例如，Fc区)时在本文中用于表示，所述多肽具有由多肽的氨基酸序列(在多肽通常在自然界中出现的情况下)或其天然存在的多态性组成的氨基酸序列。天然多肽(例如，天然Fc区)可以通过重组方式产生，或者可以从天然存在的来源中分离。

如本文所用，术语“表达载体”是指含有期望的编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列的重组DNA分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、CHO细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论其是位于体外还是原位，还是位于体内。

如本文所用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的普遍公认的边界可能会有所不同，但牛IgG重链Fc区通常被定义为拉伸，例如，从竖直线到图2中的c末端。在一些实施例中，变体仅包括Fc区的部分并且可以包含或不包含羧基末端。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域，即CH2和CH3。在一些实施例中，设想了具有恒定结构域中的一个或多个恒定结构域的变体。在其它实施例中，设想了没有此类恒定结构域(或仅具有此类恒定结构域的部分)的变体。

例如，牛IgG Fc区的“CH2结构域”是指图2中从竖直线开始并且延伸到残基243的残基。CH2结构域的独特之处在于其不与另一个结构域紧密配对。两个N连接的支链化的碳水化合物链被插置在一个完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。

牛IgG Fc区的“CH3结构域”通常是Fc区中的残基C末端到CH2结构域，例如图2中的残基244到c末端的拉伸。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。效应功能的实例包含但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)下调等。此类效应功能可能需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)可操作地连接，并且可以使用各种测定(例如，Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定、ADCP测定、从完整或分馏的血液样品中的靶细胞耗尽等)进行评估。

“天然序列Fc区”或“野生型Fc区”是指与通常存在于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。示例性天然序列牛Fc区为图2中的竖直线到c末端。

“变体Fc区”包括通过本文所定义的至少一个“氨基酸取代”而与天然序列Fc区(或其片段)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在优选实施例中，相比于天然序列Fc区或在亲本多肽的Fc区中，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，优选地在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。在一替代性实施例中，变体Fc区可以根据本文公开的方法产生，并且此变体Fc区可以与所选的异源多肽，如抗体可变结构域或非抗体多肽，例如受体或配体的结合结构域融合。

如本文所用，在多肽的上下文中，术语“衍生物”是指包括已通过引入氨基酸残基取代改变的氨基酸序列的多肽。如本文所用，术语“衍生物”还是指已通过任何类型的分子与多肽的共价附接进行修饰的多肽。例如，但不是通过限制的方式，抗体可以，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接等进行修饰。衍生物多肽可以使用本领域的技术人员已知的技术通过化学修饰产生，所述技术包含但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。进一步地，衍生物多肽具有与其所衍生的多肽的功能相似或相同的功能。应当理解，包括本发明的变体Fc区的多肽可以是本文所定义的衍生物，优选地衍生化发生在Fc区内。

本文中参考多肽(例如，Fc区或单克隆抗体)使用的“基本上牛来源的”表示，多肽具有与天然牛氨基多肽的氨基酸序列至少80％、至少85％、更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％或甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与Fc区(例如，抗体的Fc区)结合的受体。优选的FcR为天然序列FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体Fc区、Fcγ受体或“FcgR”结合的FcR，并且包含FcγRI(FcgR1)、FcγRII(FcgR2)、FcγRIII(FcgR3)亚类的受体，包含等位基因变体和这些受体的可替代地剪接的形式，以及新型牛Fcγ2R(bFcg2R或bFcg2R)。另一种优选的FcR包含负责将母体IgG转移到胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》117:587(1976)以及Kim等人,《免疫学杂志》24:249(1994))。本文中的术语“FcR”涵盖了其它FcR，包含将来要鉴定的那些。

短语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达FcgR的非特异性细胞毒性细胞(例如，非特异性)(例如，自然杀伤(“NK”)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合的抗体并且随后引起靶细胞的裂解的细胞介导的反应。用于介导人体内的ADCC的原代细胞，即NK细胞，仅表达FcgR3，而单核细胞表达FcgR1、FcgR2和FcgR3。文献报告，牛单核细胞和巨噬细胞表达IgG1和IgG2同种型的FcgR，而中性粒细胞表达IgG2的大量受体Fcg2R，但很少表达或不表达bIgG1的受体。

短语“抗体依赖性细胞介导的吞噬”和“ADCP”是指其中表达FcgR(例如，FcgR1、FcgR2a和FcgR3)的吞噬细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞)识别靶细胞上的结合的IgG抗体Fc区，并且随后触发信号传导级联，从而导致吞噬IgG调理的颗粒(例如，细菌、死亡组织细胞)的细胞介导的反应。

如本文所用，短语“效应细胞”是指表达一个或多个FcR并且执行效应功能的白细胞(优选地牛)。优选地，细胞至少表达FcgR3并且进行ADCC效应功能。介导ADCC的白细胞的实例包含PBMC、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源(例如，从血液或PBMC)中分离。在一个实例中，白细胞表达FcgR1或其它相关Fcγ受体，并且触发ADCP功能。

具有“改变的”Fc受体结合亲和力的变体多肽是与变体的亲本多肽或包括天然Fc的多肽相比，Fc受体结合亲和力增强(即，增加、更大或更高)或减弱(即，减少、降低或减小)的变体多肽。表现出与Fc受体的结合增加或结合亲和力增加的变体多肽以与亲本多肽的亲和力相比更大的亲和力与Fc受体结合。表现出对Fc受体的结合减少或结合亲和力减少的变体多肽以与其亲本多肽的亲和力相比更低的亲和力与Fc受体结合。表现出与Fc受体的结合减少的此类变体与Fc受体具有很少的结合或没有可察觉到的结合，例如与亲本多肽相比，与Fc受体所述Fc受体的结合为0-20％。与Fc受体以与其亲本多肽的亲和力相比“增强的亲和力”结合的变体多肽是在变体多肽和亲本多肽的量在结合测定中基本上相同，并且所有其它条件相同时，与Fc受体以与亲本多肽的亲和力相比更高的结合亲和力结合的变体多肽。例如，具有增强的Fc受体结合亲和力的变体多肽可以表现出Fc受体结合亲和力比亲本多肽的结合亲和力增加了约1.10倍至约100倍(更典型地约1.2倍至约50倍)，其中Fc受体结合亲和力例如是在ELISA测定或本领域的普通技术人员可用的其它方法确定的。

如本文所用，“氨基酸取代”是指给定氨基酸序列中的至少一个现有氨基酸残基被另一个不同的“替代”氨基酸残基替代。一个或多个替代残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即，由遗传密码编码)，并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；以及缬氨酸(Val)。具有一个或多个非天然存在的氨基酸残基的取代也涵盖在本文的氨基酸取代的定义中。“非天然存在的氨基酸残基”是指除以上列出的那些天然存在的氨基酸残基之外，能够与多肽链中的相邻氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包含正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如Ellman等人《酶学方法(Meth.Enzym.)》202:301-336(1991)中描述的那些。

术语“测定信号”是指从检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法，包含但不限于来自比色测定的吸光度测量、荧光强度或每分钟崩解的输出。测定格式可以包含ELISA、FACS或其它方法。“测定信号”的变化可以反映细胞活力的变化和/或动力学解离速率、动力学缔合速率或两者的变化。“较高测定信号”是指测得的输出数大于另一个数(例如，在ELISA测定中，与亲本多肽相比，变体的测得的数可以更高(更大))。“较低测定信号”是指测得的输出数小于另一个数(例如，在ELISA测定中，与亲本多肽相比，变体的测得的数可以更低(更小))。

术语“结合亲和力”是指与每个Fc受体-Fc结合相互作用相关的平衡解离常数(以浓度为单位表示)。结合亲和力与动力学解离速率(通常以逆时为单位，例如秒^-1报告)除以动力学缔合速率(通常以每单位时间的浓度为单位，例如摩尔/秒报告)的比率直接相关。一般来说，不可能明确地说明平衡解离常数(K_D或KD)的变化是否是由于缔合速率、解离速率或两者的差异引起的，除非这些参数中的每个参数都是实验上确定的(例如，通过BIACORE或SAPIDYNE测量)。

如本文所用，术语“铰链区”是指将Fab抗原结合区与抗体的Fc区连接的氨基酸的拉伸。IgG亚类的铰链区可以通过将形成重链间二硫(S—S)键的第一半胱氨酸残基和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置中来进行比对。如图2所示，例如牛IgG恒定区中的铰链区开始于残基99，并且延伸到竖直线。

“C1q”是包含免疫球蛋白的Fc区的结合位点的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，这是CDC通路的第一组分。

如本文所用，术语“抗体”可与“免疫球蛋白”或“Ig”互换使用，在最广泛的意义上使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出期望的生物活性或功能活性即可。单链抗体和嵌合、牛或牛化抗体以及嵌合或CDR接枝的单链抗体等，包括源自不同物种的部分，也涵盖在本发明和术语“抗体”中。这些抗体的各个部分可以通过常规技术合成地在化学上连接在一起，或者可以使用基因工程化技术制备为连续的蛋白质。例如，编码嵌合链或牛化链的核酸可以表达为产生连续蛋白质。参见，例如，美国专利第4,816,567号；美国专利第4,816,397号；WO 86/01533；美国专利第5,225,539号；以及美国专利第5,585,089号和第5,698,762号。关于灵长动物化抗体，还参见Newman,R.等人《生物技术(BioTechnology)》,10:1455-1460,1993，并且关于单链抗体，还参见Ladner等人,美国专利第4,946,778号和Bird,R.E.等人,《科学(Science)》,242:423-426,1988。应当理解，包括Fc区(或其部分)的抗体的所有形式在本文中涵盖在术语“抗体”内。此外，抗体可以用可检测标记进行标记，可以根据本领域已知的方法固定在固相上和/或与异源化合物(例如，酶或毒素)缀合。

如本文所用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包含但不限于线性抗体；单链抗体分子；Fc或Fc'肽、Fab和Fab片段以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选地保留IgG重链的铰链和任选地CH1区的至少一部分。在其它优选实施例中，抗体片段包括CH2区的至少一部分或整个CH2区。

如本文所用，术语“功能片段”，在参考单克隆抗体使用时，旨在指代仍保留功能活性的单克隆抗体的一部分。功能活性可以是例如抗原结合活性或特异性、受体结合活性或特异性、效应功能活性等。单克隆抗体功能片段包含，例如，单独重链或轻链以及其片段，如VL、VH和Fd；单价片段，如Fv、Fab和Fab'；二价片段，如F(ab')2；单链Fv(scFv)；以及Fc片段。此类术语描述于例如，Harlowe和Lane,《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》,纽约的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York)(1989)；《分子生物学和生物技术：全面桌面参考(Molec.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference)》(Myers,R.A.(编辑),纽约(New York)：VCH出版公司(VCH Publisher,Inc.)；Huston等人,《细胞生物物理学(Cell Biophysics)》,22:189-224(1993)；Pluckthun和Skerra,《酶学方法》178:497-515(1989)和Day,E.D.,《先进免疫化学(Advanced Immunochemistry)》,第二版,纽约州纽约的Wiley-Liss公司(Wiley-Liss,Inc.,New York,N.Y.)(1990)中。术语功能片段旨在包含例如通过蛋白酶消化或单克隆抗体的还原以及通过本领域的技术人员已知的重组DNA方法产生的片段。

如本文所用，术语“片段”是指包括另一多肽的氨基酸序列的至少5个、15个、20个、25个、40个、50个、70个、90个、100个或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在一优选实施例中，多肽的片段保留全长多肽的至少一个功能。

如本文所用，术语“嵌合抗体”包含单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合重链通过二硫桥与嵌合轻链缔合形成的二聚体。二价嵌合抗体是由两个重链-轻链二聚体通过至少一个二硫桥缔合而形成的四聚体。用于牛的抗体的嵌合重链包括衍生自非牛抗体的重链的抗原结合区，所述抗原结合区与牛重链恒定区，如CH1或CH2的至少一部分连接。用于牛的抗体的嵌合轻链包括衍生自非牛抗体的轻链的抗原结合区，所述抗原结合区与牛轻链恒定区(CL)的至少一部分连接。具有相同或不同可变区结合特异性的嵌重链和轻链的抗体、片段或衍生物还可以根据已知的方法步骤通过单独多肽链的适当缔合制备。利用这种方法，表达嵌合重链的宿主与表达嵌合轻链的宿主是单独培养的，并且免疫球蛋白链是单独回收，并且然后缔合的。可替代地，宿主可以共培养，并且允许链在培养基中自发缔合，之后回收组装的免疫球蛋白或片段、片段，或者重链和轻链两者可以在同一宿主细胞中表达。用于产生嵌合抗体的方法在本领域是众所周知的(参见例如，美国专利第6,284,471号；第5,807,715号；第4,816,567号；以及第4,816,397号)。

如本文所用，非牛(例如，鼠)抗体的“牛化”形式(即，牛化抗体)是含有衍生自非牛免疫球蛋白的最小序列或不含有所述序列的抗体。对于大多数情况，牛化抗体是牛免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等具有期望的特异性、亲和力和能力的非牛物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，牛免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应非牛残基替代。此外，牛化抗体可以包括接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。通常进行这些修饰以进一步优化抗体性能。通常，牛化抗体将包括基本上所有至少一个以及典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环(CDR)对应于非牛免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR残基是牛免疫球蛋白序列的那些区。牛化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是牛免疫球蛋白的至少一部分。

如本文所用，术语“免疫粘附素”是指将异源“粘附素”蛋白(例如，受体、配体或酶)的结合结构域和免疫球蛋白恒定结构域组合的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不是抗体的抗原识别和结合位点(抗原组合位点)(即，异源)的粘附素氨基酸序列以期望的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。

如本文所用，术语“配体结合结构域”是指任何天然受体或至少保留对应天然受体的定性配体结合能力的其任何区或衍生物。在某些实施例中，受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族的成员同源的胞外结构域的细胞表面多肽。不是免疫球蛋白超基因家族的成员但仍然具体地涵盖在此定义内的其它受体是细胞因子的受体，并且具体地是具有酪氨酸激酶活性(受体酪氨酸激酶)的受体、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员以及细胞粘附分子(例如，E-、L-和P-选择素)。

如本文所用，术语“受体结合结构域”是指受体的任何天然配体，包含例如细胞粘附分子，或此类天然配体的至少保留对应天然配体的定性受体结合能力的任何区或衍生物。

如本文所用，“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的多肽。其天然环境中的污染物组分是将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包含酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施例中，分离的多肽(1)被纯化到大于95重量％的多肽，如通过Lowry方法(Lowry method)确定的，并且优选地大于99重量％，(2)被纯化到足以通过使用旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)被纯化到使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下通过SDS-page进行的均质性。分离的多肽包含重组细胞内原位的多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。

如本文所用，术语“病症”和“疾病”可互换地用于指代将受益于用变体多肽(包括本发明的变体Fc区的多肽)治疗的任何病状，包含慢性和急性病症或疾病(例如，使患者易于患上具体病症的病理病状)。

如本文所用，术语“受体”是指能够与至少一种配体结合的多肽。优选受体是具有胞外配体结合结构域和任选地其它结构域(例如，跨膜结构域、胞内结构域和/或膜锚)的细胞表面受体或可溶性受体。要在本文所述的测定中评估的受体可以是完整受体或其片段或衍生物(例如，包括与一个或多个异源多肽融合的受体的结合结构域的融合蛋白)。此外，要对其结合特性进行评估的受体可以存在于细胞中或被分离，并且可以任选地涂覆在测定板或某种其它固相上，或直接标记并且用作探针。

如本文所用，当测定中使用的变体多肽和亲本抗体的量基本上相同时，在存在牛效应细胞的情况下敲除或敲低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的变体多肽与亲本抗体相比是在介导ADCC、ADCP和/或CDC方面在体外或体内显著不太活跃的多肽。例如，在给定的ADCC、ADCP或CDC测定中，与相同的ADCC测定中的亲本多肽相比，这样的变体引起更低的、优选地可忽略的量的靶细胞裂解或吞噬。此类变体可以，例如，使用ADCC、ADCP或CDC测定来鉴定，但还可以采用用于确定ADCC、ADCP或CDC活性的其它测定或方法(例如，动物模型)。在优选实施例中，变体多肽在介导ADCC、ADCP和CDC方面的活性比亲本多肽的活性低约100％、75％、50％或25％。

牛野生型IgG

牛IgG在本领域是众所周知的并且完整描述于，例如，Symons等人,1989《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,第26(9)卷,第841-850页；Kacskovics等人,1996,《分子免疫学》第33(2)卷,第189-195页；Saini等人,2007,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》,第65(1)卷,第32-38页；以及Rabbani等人,1997,《免疫遗传学(Immunogenetics)》,第46(4)卷,第326-331页。

在一个实施例中，牛IgG为IgG1。在另一实施例中，牛IgG为IgG2。在又另一实施例中，牛IgG为IgG3。在一个实例中，IgG1为IgG1a、IgG1b、IgG1c或IgG1d。在另一实例中，IgG2为IgG2a或IgG2b。在又另一实例中，IgG3为IgG3a或IgG3b。

IgG1a、IgG1b、IgG1c、IgG1d、IgG2a、IgG2b、IgG3a和IgG3b的氨基酸和核酸序列在本领域也是众所周知的。

在一个实例中，本发明的IgG包括恒定结构域，例如CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域，或其组合。在另一实例中，本发明的恒定结构域包括Fc区，所述Fc区包含，例如，CH2结构域或CH3结构域或其组合。

在一具体实例中，野生型恒定结构域包括SEQ ID NO.:1-8中所示的氨基酸序列中的任一个。在一具体实例中，IgG1a、IgG1b、IgG1c、IgG1d、IgG2a、IgG2b、IgG3a和IgG3b的野生型恒定结构域分别包括SEQ ID NO.:1、2、3、4、5、6、7和8中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型IgG恒定结构域为SEQ ID NO.:1-8中的任一项的同源物、变体、异构体或功能片段，但没有本文描述的任何突变。每种可能性表示本发明的单独实施例。例如，在一个实施例中，在一具体实施例中，IgG2a的野生型恒定结构域包括SEQ ID NO.:9中所示的氨基酸序列。

IgGs恒定结构域还包含具有与重链和/或轻链的氨基酸序列基本上相似的氨基酸序列的多肽。基本上相同的氨基酸序列在本文中被定义为与比较氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，如通过根据以下的FASTA搜索方法确定的：Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:2444-2448(1988)。

本发明还包含编码本文所述的IgG或其部分的核酸分子。在一个实施例中，核酸可以编码包括例如CH1区、CH2区、CH3区或其组合的抗体重链。在另一实施例中，核酸可以编码包括，例如，VH区或其一部分中的任一者或VH CDR中的任一者，包含其任何变体的抗体重链。本发明还包含编码抗体轻链的核酸分子，所述抗体轻链包括例如，CL区或其一部分中的任一者、VL区或其一部分中的任一者或VL CDR中的任一者，包含其任何变体。在某些实施例中，核酸编码重链和轻链两者或其部分。

SEQ ID NO.:1、2、3、4、5、6、7、8或9中所示的野生型恒定结构域的氨基酸序列是由其对应核酸序列编码的。

经修饰的牛IgG

本申请的发明人已经发现，位置216、234、235、237、270、329、330、331、432、434、437或433处的氨基酸残基被另一个氨基酸取代令人惊讶且出人意料地表现出期望的效应。如本文所用，术语位置是指根据如Kabat中的Eu索引编号的位置(Kabat等人,《免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院公共卫生服务部(1991))。在一个实施例中，期望的效应是相对于具有野生型牛IgG恒定结构域的IgG消除或减少补体依赖性细胞毒性。在另一实施例中，期望的效应是相对于具有野生型牛IgG恒定结构域的IgG消除或减少抗体依赖性细胞吞噬。在又另一实施例中，期望的效应是消除或减少IgG与Fcγ受体(bFcgR)的结合。

在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG，其包括：牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括相对于野生型牛IgG恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于根据如Kabat中的Eu索引编号的氨基酸残基216、234、235、237、270、329、330、331、432、434、437或433。这些位置处的氨基酸可以被任何其它氨基酸取代。取代氨基酸的实例包含，例如但不限于，天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，取代氨基酸为非天然氨基酸。

本发明的经修饰的牛IgG可以是本领域的技术人员已知的任何合适的牛IgG。经修饰的牛IgG的实例包含IgG1的经修饰的变体(例如，IgG1a、IgG1b、IgG1c或IgG1d)、IgG2(例如，IgG2a或IgG2b)或IgG3(IgG3a或IgG3b)。

IgG1

在一个示例性实施例中，经修饰的牛IgG为经修饰的牛IgG1，包含，例如，经修饰的IgG1a、经修饰的IgG1b、经修饰的IgG1c或经修饰的IgG1d。

在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG1，其包括：牛IgG1恒定结构域，所述牛IgG1恒定结构域包括相对于野生型牛IgG1恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基329、330、331或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置329、330或331处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丝氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)、位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)或位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括取代P329S、A330S和P331S中的一个或多个取代。

一方面，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括PAP变为SAP突变、PAP变为SAS突变、SS突变、Winter位点突变或其组合。PAP变为SAP突变包含位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)。SS突变包含位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)和位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

Winter位点可以包含氨基酸残基234、235、237处的取代或其组合。因此，在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG1，其包括：牛IgG1恒定结构域，所述牛IgG1恒定结构域包括相对于野生型牛IgG1恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基234、235或237或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置234、235或237处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丙氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置234处的脯氨酸被丙氨酸取代(P234A)、位置235处的亮氨酸被丙氨酸取代(L235A)或位置235处的甘氨酸被丙氨酸取代(G237A)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括取代P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

在一示例性实施例中，牛IgG1恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

一方面，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括DP位点的氨基酸残基中的取代。因此，在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG1，其包括：牛IgG1恒定结构域，所述牛IgG1恒定结构域包括相对于野生型牛IgG1恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基216、270或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置216或270处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被谷氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置216处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D216E)或位置270处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D270E)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括取代D216E和D270E中的一个或多个取代。

在一示例性实施例中，牛IgG1恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D216E和D270E中的一个或多个取代。

在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG1，其包括：牛IgG1恒定结构域，所述牛IgG1恒定结构域包括相对于野生型牛IgG1恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置432、434或437处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丙氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)、位置437处的苏氨酸被丙氨酸取代(T437A)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括取代L432A、N434A和T437A中的一个或多个取代。

在另一示例性实施例中，牛IgG1恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D216E、D270E、L432A、N434A和T437A中的一个或多个取代。

IgG2

在另一示例性实施例中，经修饰的牛IgG为经修饰的牛IgG2，包含，例如，经修饰的IgG2a或经修饰的IgG2b。经修饰的牛IgG2可以包括SS突变，所述SS突变包含位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)和位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG2，其包括：牛IgG2恒定结构域，所述牛IgG2恒定结构域包括相对于野生型牛IgG2恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基330、331或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置330或331处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丝氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)或位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG2恒定结构域包括取代A330S和P331S中的一个或多个取代。

在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG2，其包括：牛IgG2恒定结构域，所述牛IgG2恒定结构域包括相对于野生型牛IgG2恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置432、434或437处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丙氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)或位置437处的甲硫氨酸被丙氨酸取代(M437A)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG2恒定结构域包括取代L432A、N434A和M437A中的一个或多个取代。

在另一示例性实施例中，牛IgG2恒定结构域包括取代A330S、L432A、N434A和M437A中的一个或多个取代。

IgG3

在另一示例性实施例中，经修饰的牛IgG为经修饰的牛IgG3，包含，例如，经修饰的IgG3a或经修饰的IgG3b。

在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG3，其包括：牛IgG3恒定结构域，所述牛IgG3恒定结构域包括相对于野生型牛IgG3恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基329、330、331或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置329、330或331处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丝氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)、位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)或位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG3恒定结构域包括取代P329S、A330S和P331S中的一个或多个取代。

一方面，经修饰的牛IgG3恒定结构域包括PAP变为SAP突变、PAP变为SAS突变、SS突变、Winter位点突变或其组合。如以上讨论的，PAP变为SAP突变包含位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)；PAP变为SAS突变包含位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)；并且SS突变包含位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)与位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)的组合。

如以上讨论的，Winter位点可以包含氨基酸残基234、235、237处的取代或其组合。因此，在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG3，其包括：牛IgG3恒定结构域，所述牛IgG3恒定结构域包括相对于野生型牛IgG3恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基234、235或237或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置234、235或237处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丙氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置234处的脯氨酸被丙氨酸取代(P234A)、位置235处的亮氨酸被丙氨酸取代(L235A)或位置235处的甘氨酸被丙氨酸取代(G237A)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG3恒定结构域包括取代P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

在一示例性实施例中，牛IgG3恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

一方面，经修饰的牛IgG3恒定结构域包括DP位点的氨基酸残基中的取代。因此，在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG3，其包括：牛IgG3恒定结构域，所述牛IgG3恒定结构域包括相对于野生型牛IgG3恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基270处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置270处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被谷氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置处的天冬氨酸位置270处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D270E)。

在一示例性实施例中，牛IgG3恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A和D270E中的一个或多个取代。

在另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG3，其包括：牛IgG3恒定结构域，所述牛IgG3恒定结构域包括相对于野生型牛IgG3恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置432、434或437处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被丙氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)或位置437处的赖氨酸被丙氨酸取代(K437A)。在一些实施例中，经修饰的牛IgG1恒定结构域包括取代L432A、N434A和K437A中的一个或多个取代。

在另一示例性实施例中，牛IgG3恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D270E、L432A、N434A和K437A中的一个或多个取代。

在又另一实施例中，本发明提供了一种经修饰的IgG3，其包括：牛IgG3恒定结构域，所述牛IgG3恒定结构域包括相对于野生型牛IgG3恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基433处，并且其中氨基酸残基位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的。位置433处的氨基酸残基可以被任何其它氨基酸取代。在一具体实施例中，取代为被组氨酸替代。具体地，在一个实例中，取代为位置433处的精氨酸被组氨酸取代(R433H)。

在又另一示例性实施例中，牛IgG3恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D270E、L432A、N434A、K437A和R433H中的一个或多个取代。

在一具体实例中，本发明的突变体IgG1恒定结构域包括SEQ ID NO.:10-12和14-18中示出的氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，突变体IgG1恒定结构域为SEQ IDNO.:10-12和14-18中的任一项的同源物、变体、异构体或功能片段，但具有本文所述的本发明的突变。每种可能性表示本发明的单独实施例。

在另一实例中，本发明的突变体IgG2恒定结构域包括SEQ ID NO.:19-25中所示的氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，突变体IgG2恒定结构域为SEQ ID NO.:19-25中的任一项的同源物、变体、异构体或功能片段，但具有本文所述的本发明的突变。每种可能性表示本发明的单独实施例。

在一具体实例中，本发明的突变体IgG3恒定结构域包括SEQ ID NO.:27-31中所示的氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，突变体IgG3恒定结构域为SEQ ID NO.:27-31中的任一项的同源物、变体、异构体或功能片段，但具有本文所述的本发明的突变。每种可能性表示本发明的单独实施例。

SEQ ID NO.:10-12、14-25和27-31中所示的突变体恒定结构域的氨基酸序列是由其对应突变体核酸序列编码的。

用于制备本发明的抗体分子的方法

用于制备抗体分子的方法在本领域是众所周知的并且完整描述于美国专利8,394,925；8,088,376；8,546,543；10,336,818；以及9,803,023以及美国专利申请公开20060067930中，所述文献通过引用以其整体并入本文。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的方法、过程或技术。具有本发明的变体Fc区的抗体分子可以根据本领域众所周知的方法产生。在一些实施例中，变体Fc区可以与所选的异源多肽，如抗体可变结构域或受体或配体的结合结构域融合。

随着分子生物学方法和重组技术的出现，本领域的技术人员可以通过重组手段产生抗体和抗体样分子，并且由此产生编码抗体的多肽结构中存在的具体氨基酸序列的基因序列。此类抗体可以通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或通过所述多肽链的直接合成来产生，其中合成的链组装以形成对特异性表位和抗原决定簇具有亲和力的活性四聚体(H2L2)结构。这允许随时生产具有来自不同物种和来源的中和抗体的序列特性的抗体。

不管抗体的来源，或其如何重组地构建，或其如何使用转基因动物、实验室或商业规模的大型细胞培养物、使用转基因植物或通过在过程的任何阶段不采用活生物体进行的直接化学合成在体外或体内合成，所有抗体都具有类似的整体3维结构。此结构通常以H2L2给出，并且是指抗体通常包括两条轻(L)氨基酸链和2条重(H)氨基酸链的事实。两条链都具有能够与结构上互补的抗原靶标相互作用的区。与靶标相互作用的区被称为“可变”或“V”区，并且其特征在于，在来自不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列方面存在差异。H或L链的可变区含有能够与抗原靶标特异地结合的氨基酸序列。

如本文所用，术语“抗原结合区”是指抗体分子的含有与抗原相互作用并且赋予抗体其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。在提供抗原结合区的H或L链的可变区内是被称为“高变”的较小序列，因为其在不同特异性的抗体之间具有极大的可变性。此类高变区也称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区说明了抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。

CDR表示可变区内氨基酸的非连续段，但无论物种如何，已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置在可变链的氨基酸序列内具有类似位置。所有抗体的可变重链和轻链各具有三个CDR区，每个都与其它区不连续。在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定区(即，高度保守的)和可变区，并且在后者内，存在CDR和由重链或轻链的可变区内但在CDR外的氨基酸序列构成的所谓“框架区”。

本发明进一步提供了一种载体，所述载体包含以上所描述的核酸中的至少一种核酸。由于遗传密码的简并性，可以使用超过一个密码子来编码特定氨基酸。使用遗传密码，可以鉴定一个或多个不同的核苷酸序列，其中每一个都能够编码氨基酸。通过考虑异常碱基配对关系和在表达抗体或部分的真核或原核细胞中实际使用具体密码子(以编码具体氨基酸)的频率，可以估计具体寡核苷酸实际上将构成实际编码序列的概率。此类“密码子使用规则”由Lathe等人,183《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》1-12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以鉴定含有能够编码牛IgG序列的理论上“最可能的”核苷酸序列的单个核苷酸序列或核苷酸序列的集合。目标还在于，还可以通过使用标准分子生物学技术改变现有抗体基因来提供用于本发明的抗体编码区，所述标准分子生物学技术产生本文所述的抗体和肽的变体。此类变体包含但不限于抗体或肽的氨基酸序列中的缺失、添加和取代。

例如，一种类别的取代为保守氨基酸取代。这种取代为牛抗体肽中的给定氨基酸被类似特性的另一种氨基酸取代的那些取代。通常被视为保守取代的是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和lie之间彼此的替代；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn与Gin之间的取代；碱性残基Lys与Arg之间的交换；芳香族残基Phe、Tyr等之间的替代。关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指导在Bowie等人,247《科学》1306-10(1990)中找到。

变体牛抗体或肽可以是完全功能性的，或者可以在一种或多种活性中缺乏功能。全功能变体通常仅含有保守变异或非关键残基或非关键区中的变异。功能变体也可含有导致功能无变化或不显著变化的相似氨基酸的取代。可替代地，这样的取代可以在一定程度上正面或负面地影响功能。非功能性变体通常含有一个或多个非保守氨基酸取代、缺失、插入、倒位或截短，或关键残基或关键区中的取代、插入、倒位或缺失。

功能必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定。Cunningham等人,244《科学》1081-85(1989)。后一种程序在分子中的每个残基处引入了单个丙氨酸突变。然后测试所产生的突变体分子的生物活性，如表位结合或体外ADCC活性。对于配体-受体结合至关重要的位点也可以通过结构分析，如表位作图(例如，HDX)、晶体学、核磁共振或光亲和标记来确定。Smith等人,224《分子生物学杂志》899-904(1992)；deVos等人,255《科学》306-12(1992)。

此外，多肽通常含有二十种“天然存在的”氨基酸以外的氨基酸。此外，许多氨基酸，包含末端氨基酸，可以通过天然过程修饰，如加工和其它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。已知的修饰包含但不限于乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的加成如精氨酰化以及泛素化。此类修饰是本领域的技术人员众所周知的，并且已经在科学文献中进行了详细描述。例如，几个特别常见的修饰，糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP核糖基化描述于大多数基本文本中，如《蛋白质结构和分子特性(Proteins-Structure and Molecular Properties)》(第2版,T.E.Creighton,纽约的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)1993)。关于此主题有许多详细的综述，如Wold,《蛋白质的翻译后共价修饰(Posttranslational CovalentModification of proteins)》,1-12(Johnson编辑,纽约的学术出版社(Academic Press,N.Y.),1983)；Seifter等人182《酶学方法》626-46(1990)；以及Rattan等人(663)《纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)》48-62(1992)。

另一方面，本发明提供了抗体衍生物。抗体的“衍生物”含有通常不是蛋白的一部分的另外的化学部分。蛋白的共价修饰包含在本发明的范围内。此类修饰可以通过抗体的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而引入到分子中。例如，用本领域众所周知的双功能剂衍生化可用于使抗体或片段与不溶于水的载体基质或其它大分子载体交联。

衍生物还包含被标记的放射性地标记的单克隆抗体。例如，用放射性碘(251、1311)、碳(4C)、硫(35S)、铟、氚(H³)等；单克隆抗体与生物素或亲和素、与酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖淀粉酶、羧酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡糖6-磷酸脱氢酶等的缀合物；以及还有单克隆抗体与生物发光剂(如荧光素酶)、化学发光剂(如吖啶酯)或荧光剂(如藻胆蛋白)的缀合物。

本发明的另一衍生物双功能抗体为通过将识别两种不同的抗原群的两种单独的抗体的部分组合产生的双特异性抗体。这可以通过交联或重组技术来实现。另外，可向抗体或其一部分添加部分以增加体内半衰期(例如，通过延长从血流中清除的时间)。此类技术包含例如添加PEG部分(也被称为聚乙二醇化)，并且在本领域是众所周知的。参见美国专利申请公开第20030031671号。

在一些实施例中，编码主体抗体的核酸被直接引入到宿主细胞中，并且所述细胞在足以诱导经编码的抗体的表达的条件下温育。在将主体核酸引入到细胞中之后，将细胞典型地进行温育，通常在37℃下，有时在选择下温育，持续约1-24小时的时间段，以使抗体进行表达。在一个实施例中，抗体分泌到细胞生长的培养基的上清液中。传统上，单克隆抗体是作为鼠类杂交瘤系中的天然分子产生的。除了所述技术外，本发明提供了抗体的重组DNA表达。这允许产生抗体，以及所选的宿主物种中的抗体衍生物和融合蛋白的光谱。

编码本发明的至少一种抗体、部分或多肽的核酸序列可以根据常规技术与载体DNA重新组合，所述常规技术包含用于连接的齐平端或交错端的末端、用于提供适当的末端的限制酶消化、在适当时进行的粘性端的填充、用于避免不希望的连接的碱性磷酸酶处理以及与适当的连接酶的连接。此类操作的技术例如由Maniatis等人,《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING,LAB.MANUAL)》,(纽约的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Lab.Press,NY),1982和1989)以及Ausubel等人1993同上公开，可以用于构建编码抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。

如果核酸分子，如DNA，含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且此类序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则所述核酸分子被称为“能够表达”所述多肽。可操作的连接是其中调节DNA序列和寻求表达的DNA序列以这样的方式连接，以允许作为多肽或抗体部分以可恢复量进行基因表达的连接。基因表达所需的调节区的精确性质可能因生物体而异，如类似领域中众所周知的。参见例如Sambrook等人,2001同上；Ausubel等人,1993同上。

因此，本发明涵盖抗体或肽在原核细胞或真核细胞中的表达。合适的宿主包含细菌或真核宿主，所述细菌或真核宿主包含体内或原位的细菌、酵母、昆虫、真菌、鸟和哺乳动物细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以具有人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源。也可以使用本领域已知的任何其它合适的哺乳动物细胞。

在一个实施例中，本发明的核苷酸序列将并入到能够在接受者宿主中进行自主复制的质粒或病毒载体中。出于此目的，可以采用多种载体中的任何载体。参见例如Ausubel等人,1993同上。选择具体质粒或病毒载体的重要因素包含：含有载体的接受者细胞可以被识别并且可以从不含有载体的那些接受者细胞中选择的方便性；具体宿主中期望的载体的拷贝数；以及是否期望能够使载体在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。

本领域已知的示例原核载体包含质粒，如能够在大肠杆菌中进行复制的那些(例如，pBR322、CoIE1、pSC101、pACYC 184、.pi.vX)。此类质粒例如由Maniatis等人,1989同上；Ausubel等人,1993同上公开。芽孢杆菌质粒(Bacillus plasmid)包含pC194、pC221、pT127等。此类质粒由Gryczan公开于《芽胞杆菌的分子生物学(THE MOLEC.BIO.OF THEBACILLI)》307-329(纽约的学术出版社(Academic Press,NY),1982)中。合适的链霉菌属质粒包含p1J101(Kendall等人,169《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》4177-83(1987))和链霉菌属噬菌体，如phLC31(Chater等人,于《第六届国际放线菌生物学研讨会(SIXTH INT'LSYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO.)》45-54(匈牙利布达佩斯的匈牙利科学院出版社(Akademiai Kaido,Budapest,Hungary)1986)中)。假单胞菌质粒(Pseudomonas plasmid)在John等人,8《传染病综述(Rev.Infect.Dis.)》693-704(1986)；lzaki,33《日本细菌学杂志(Jpn.J.Bacteriol.)》729-42(1978)；以及Ausubel等人,1993同上中进行了评论。

可替代地，可用于表达编码抗体或肽的cDNA的基因表达元件包含但不限于(a)病毒转录启动子和其增强子元件，如SV40早期启动子(Okayama等人,3《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》280(1983))、劳斯肉瘤病毒LTR(Rous sarcoma virus LTR)(Gorman等人,79《美国国家科学院院刊》6777(1982))以及莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Moloney murineleukemia virus LTR)(Grosschedl等人,41《细胞(Cell)》885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，如源自SV40晚期区的那些(Okayarea等人,1983)；以及(c)如SV40中的聚腺苷酸化位点(Okayama等人,1983)。

免疫球蛋白cDNA基因可以如Weidle等人.51《基因(Gene)》21(1987)所描述的使用作为表达元件的SV40早期启动子和其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区mRNA剪接、兔S-球蛋白干预序列、免疫球蛋白和兔S-球蛋白聚腺苷酸化位点以及SV40聚腺苷酸化元件进行表达。对于包括部分cDNA、部分基因组DNA的免疫球蛋白基因(Whittle等人,1《蛋白质工程(Protein Engin.)》499(1987))，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白，并且mRNA剪接和聚腺苷酸化区可以是天然染色体免疫球蛋白序列。

在一个实施例中，为了在啮齿类动物细胞中表达cDNA基因，转录启动子是病毒LTR序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子中的任一者或两者，剪接区含有大于31bp的内含子，并且聚腺苷酸化和转录终止区来源于与正在合成的免疫球蛋白链相对应的天然染色体序列。在其它实施例中，将编码其它蛋白质的cDNA序列与上述表达元件组合以实现蛋白质在哺乳动物细胞中的表达。

每个融合的基因都可以组装在表达载体中或插入到表达载体中。能够表达免疫球蛋白链基因产物的接受者细胞然后用编码肽或H链或L链的基因单独转染，或者与H和L链基因一起共转染。经转染的接受者细胞在允许并入的基因表达的条件下培养，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整抗体或片段。

在一个实施例中，编码肽或H和L链的融合的基因或其部分组装在单独的表达载体中，所述单独的表达载体然后用于共转染接受者细胞。可替代地，编码H和L链的融合的基因可以组装在同一表达载体上。对于表达载体的转染和抗体的产生，接受者细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由经转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有用于免疫球蛋白糖基化的机制。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹膜腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可以从腹水液中获得。其它合适的接受者细胞包含淋巴样细胞，如牛或非牛来源的B淋巴细胞、牛或非牛来源的杂交瘤细胞或种间异杂交瘤细胞。

承载本发明的抗体构建物或多肽的表达载体可以通过多种合适的方式中的任何方式引入到适当的宿主细胞中，包含如转化、转染、缀合、原生质体融合、磷酸钙沉淀等生化方式，以及与如二乙基氨基乙基(DEAE)右旋糖酐等聚阳离子一起应用，以及如电穿孔、直接显微注射和微弹轰击等机械方法。Johnston等人，240《科学》1538(1988)。

对于免疫球蛋白H和L链的产生，酵母可以提供优于细菌的实质性优势。酵母进行包含糖基化的翻译后肽修饰。现在存在许多重组DNA策略，所述策略利用可以用于在酵母中产生期望的蛋白质的强启动子序列和高拷贝数质粒。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌带有前导序列的肽(即前肽)。Hitzman等人,第11期《国际酵母遗传学和分子生物学会议(Int'l Conference on Yeast,Genetics&Molec.Biol.)》(法国蒙彼利埃(Montpelier,France),1982)。

可以常规地评估酵母基因表达系统的肽、抗体、片段以及其区的产生、分泌和稳定的水平。可以利用并入来自编码当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时大量产生的糖酵解酶的活跃表达的基因的启动子和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任何系统。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可以采用多种方法来评估用于在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。参见第II卷《DNA克隆(DNA Cloning)》,45-66,(Glover编)英国牛津的IRL出版社(IRL Press,Oxford,UK)1985。

细菌菌株也可用作用于产生本发明所述的抗体分子或肽的宿主。含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用。所述载体承载复制位点和能够在转化的细胞中提供表型选择的具体基因。可以采取许多方法来评估表达质粒对由细菌中的克隆的免疫球蛋白cDNA编码的抗体、片段和区或抗体链的产生(参见Glover,1985同上；Ausubel,1993同上；Sambrook,2001同上；Colligan等人编辑《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》,纽约州纽约的约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,NY,N.Y.)(1994-2001)；Colligan等人编辑《蛋白科学实验指南(CurrentProtocols in Protein Science)》,纽约州纽约的约翰威利父子公司(1997-2001)。

宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞提供了对免疫球蛋白蛋白分子的翻译后修饰，包含前导肽去除、H和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白的分泌。除了上述淋巴来源的细胞外，可以用作用于产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞还包含成纤维细胞来源的细胞，如Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCC CRL 61)细胞。许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆的肽H和L链基因(参见Glover,1985同上)。可以采用不同的方法以获得完整的H2L2抗体。可以在相同的细胞中共表达H和L链，以实现H和L链细胞内缔合和连接到完整的四聚体H2L2抗体和/或肽中。可以通过在同一宿主中使用相同或不同的质粒来进行共表达。H和L链和/或肽的基因可以被置于同一质粒中，所述质粒然后被转染到细胞中，由此直接选择表达两条链的细胞。可替代地，可以首先用编码一条链，例如L链的质粒转染细胞，然后用含有第二可选标志物的H链质粒转染所产生的细胞系。可以用编码肽、H、L或H加L链的另外的拷贝的质粒与另外的可选择标志物的结合对通过任一途径产生肽和/或H2L2分子的细胞系进行转染，以产生具有增强的特性，如经组装的H2L2抗体分子的更高产量或经转染的细胞系的增强的稳定性的细胞系。

为了长期、高产率地产生重组抗体，可以使用稳定表达。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。可以用免疫球蛋白表达盒和可选标志物转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制来源的表达载体。引入外来DNA后，可以使经工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，并且然后切换成选择性培养基。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞稳定地将质粒整合到染色体中并且生长以形成病灶，所述病灶进而可以被克隆并且扩展成细胞系。此类经工程化的细胞系可以特别用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物/组分。

一旦产生了本发明的抗体，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是在蛋白A后对具体抗原的亲和力，和分级柱色谱法)、离心、差别溶解度，或通过任何其它用于纯化蛋白的标准技术。在许多实施例中，抗体从细胞分泌到培养基中并且从培养基中收获。

药物和兽医应用

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的分子和一种或多种药学上可接受的载体。更具体地，本发明提供了一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体或稀释剂，以及作为活性成分的根据本发明的抗体或肽。

“药学上可接受的载体”包含在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或动物无毒的任何赋形剂。所述药物组合物可以包含一种或另外的治疗剂。

“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合于与动物的组织接触而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

药学上可接受的载体包含溶剂、分散介质、缓冲液、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、润湿剂、防腐剂、虫剂、螯合剂、抗氧化剂、等渗剂和吸收延缓剂。

药学上可接受的载体包含水；盐水；磷酸盐缓冲盐水；右旋糖；甘油；醇，如乙醇和异丙醇；磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；EDTA；形成反离子的盐，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和普郎尼克(PLURONICS)；等渗剂，如糖；多醇，如甘露醇和山梨醇；以及氯化钠；以及其组合。

本发明的药物组合物可以以多种方式调配，包含例如液体、半固体或固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、脂质体、栓剂、片剂、丸剂或粉末。在一些实施例中，组合物呈可注射或可输注溶液的形式。所述组合物可以呈适于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、经黏膜、口服、局部或经皮施用的形式。所述组合物可以被调配为即释、控释、缓释或迟释组合物。

本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用，也可以与其它治疗剂组合施用。其可以单独施用，但通常与基于所选施用途径和标准药学实践选择的药物载体一起施用。本文公开的抗体的施用可以通过任何合适的方式进行，包含肠胃外注射(如腹膜内、皮下或肌肉内注射)、口服或通过将抗体(通常承载在药物调配物中)局部施用至气道表面。局部施用于气道表面可以通过鼻内施用(例如通过使用滴管、拭子或吸入器)进行。将抗体局部施用于气道表面也可以通过吸入施用来进行，如通过产生呈气溶胶悬浮液形式的含有抗体的药物调配物的可吸入颗粒(包含固体克隆和液体颗粒两者)，且然后使受试者吸入可吸入颗粒。用于施用药物调配物的可吸入颗粒的方法和设备是众所周知的，并且可以采用任何常规技术。

在一些期望的实施例中，抗体通过肠胃外注射施用。对于肠胃外施用，抗体或分子可以被调配为与药学上可接受的肠胃外媒剂缔合的溶液、悬浮液、乳液、或冻干粉末。例如，媒剂可以是溶解在可接受的载体，如水性载体中的抗体或其混合物的溶液，此类媒剂是水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液、或5％血清白蛋白、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可以使用脂质体和非水性媒剂，如固定油。这些溶液是无菌的并且通常不含颗粒物质。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些调配物中的抗体的浓度可以广泛地变化，例如小于约0.5重量％，通常为或至少约1重量％至多达15重量％或20重量％，并且将主要基于流体体积、粘度等根据所选择的特定施用模式来选择。媒剂或冻干粉可以含有维持等渗性的添加剂(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性的添加剂(例如，缓冲剂和防腐剂)。调配物通过常用技术灭菌。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法将是本领域的技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述于例如《雷明顿药物科学(REMINGTON'S PHARMA.SCI.)》(第15版,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(MackPub.Co.,Easton,Pa.),1980)中。

本发明的抗体或分子可以冻干以供储存并且在使用前在合适的载体中重组。此技术已经显示出对常规免疫球蛋白有效。可以采用任何合适的冻干和重组技术。本领域的技术人员将理解，冻干和重组可以导致不同程度的抗体活性损失，并且可能必须调节使用水平以进行补偿。可以施用含有本发明抗体或其混合物的组合物以预防现有疾病的复发和/或治疗性治疗现有疾病。合适的药物载体描述于最新版的《雷明顿药物科学》中，这是此技术领域中的标准参考文本。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分地遏制或减轻疾病和其并发症的量向已患有疾病的受试者施用组合物。

本发明的组合物治疗本文所述的病状或疾病的有效剂量根据许多不同的因素而变化，包含，例如，但不限于，特定药剂的药效动力学特性以及其施用模式和途径；目标位点；动物的生理状态；施用的其它药物；治疗是预防性的还是治疗性的；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗的频率和期望的效果。

可以通过治疗兽医选择剂量水平和模式来进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，药物调配物应提供足以有效地治疗受试者的本发明抗体的量。

可以使用本领域的技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。

本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现期望的治疗结果的有效量。分子的治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和重量等因素以及分子在个体中引发期望应答的能力而变化。治疗有效量还是治疗有益效果超过分子的任何毒性或有害效果的量。

另一方面，本发明的组合物可以用于，例如，治疗牛的各种疾病和病症。如本文所用，术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，包含预防性或防治性措施，其中目的是防止或减缓(减轻)与疾病或病状相关的不期望的生理变化。有益的或期望的临床结果包含但不限于症状的缓解、疾病或病状程度的减轻、疾病或病状的稳定(即，疾病或病状没有恶化的情况)、疾病或病状进展的延迟或减缓、疾病或病状的改善或缓和以及疾病或病状的缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的人包含已经患有所述疾病或病状的那些人以及易于患有所述疾病或病状的那些人或者需要预防所述疾病或病状的那些人。

本说明书中引用的所有专利和参考文献通过引用以其整体并入本文。

提供以下实例以补充先前公开并提供对本文描述的主题的更好理解。这些实例不应被视为限制所描述的主题。应理解，本文中所描述的实例和实施例是仅出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变对本领域的技术人员而言将是显而易见的并被包含在本发明的真实范围内，并且可以在不脱离本发明的真实范围的情况下做出。

实例

实例1

牛IgG突变体

方法

体外Fc受体结合测定

将重组牛FcRn(bFcRn)、FcgR1、FcgR2、FcgR3和Fcg2R DNA针对哺乳动物表达进行密码子优化，并且基于如表1中的来自NCBI数据库的序列合成。将DNA克隆到用c末端6x His+BAP标签(AGLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO.:113)工程化的pcDNA3.1(+)载体中。将所有FcgR转染(FcRn-α亚基和β-微球蛋白共转染)到HEK 293或Expi-CHO细胞中，并且通过c末端His标签进行IMAC亲和纯化来纯化FcgR或FcRn复合物。

将经纯化的FcR如下生物素化。将经纯化的Fc受体蛋白透析到pH为8.0的10mMTris-HCl中，并且使用Amicon Ultra,10K MWCO(马萨诸塞州比尔里卡的EMD密理博公司(EMD Millipore,Billerica,MA))进行浓缩。在受体的c末端处表达的生物素受体肽(BAP)AGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.:113)允许使用生物素连接酶BirA将生物素转移到氨基酸的此拉伸。生物素化反应是如制造商方案(科罗拉多州奥罗拉的Avidity公司(Avidity,LLC,Aurora,CO))中描述的进行的。然后将受体透析到PBS中以去除残余生物素。

Biacore SPR结合测定被设计成测试牛IgG亚类和突变体与bFcRn、bFcgR1、bFcgR2、bFcgR3、bFcg2R的亲和力。

表1：重组牛Fc受体的序列参考

bFcRn的Biacore方法：

通过表面等离子体共振(SPR)确定了基于牛Fc的抗体或融合蛋白与牛FcRn的结合亲和力。所有报告的KD均是使用SA传感器在Biacore T200(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司(Cytiva,Marlborough,MA,USA))中测量的。将牛FcRn捕获在传感器的表面上以获得期望的表面密度。使用了20mM MES、150mM NaCl、0.005％ Tween 20、pH为6的0.5mg/mLBSA和/或PBS、pH为7.4的0.0005％ Tween20的运行缓冲液。将各种浓度的牛CTLA4-Fc融合体或mAb滴定在适当的缓冲液中，并且使其在受体表面之上流动。用pH为8的50mM Tris-HCl、0.005％p20和0.5％ BSA进行再生。使用Biacore T200评估软件(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司)采用以下双参考方法对动力学结合亲和力进行分析：从含有固定化的牛FcRn的流通池中减去参考流通池，并且从所有运行中减去仅含有缓冲液的空白运行。将所产生的曲线用1:1结合模型拟合。运行在25℃下进行。

用于生物素化的bFcgR1、bFcgR2、bFcgR3的方法：

Biacore SPR结合测定被设计成测试牛IgG亚类与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的亲和力。所有报告的KD均是使用S系列SA传感器通过Biacore(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司)测量的。将生物素化的牛FcgR1、R2和R3使用经修改的SA捕获方法捕获在传感器表面上，以达到期望的表面密度。使用10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05v/v％表面活性剂P20、pH为7.4的缓冲液作为运行和滴定缓冲液。将各种浓度的牛CTLA4-Fc融合体或mAb滴定并且使其在受体表面之上流动，并且使用Biacore T200评估软件(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司)以1:1结合模型确定亲和力。已经应用了双参考方法，在所述方法中从含有固定化的受体的流通池中减去参考流通池，并且从所有运行中减去仅含有缓冲液的空白运行。使用pH为1.5的10mM甘氨酸再生流通池。运行在15℃下进行。

用于bFcg2R的方法：

所有报告的KD均是使用S系列CM5传感器在Biacore T200(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司)中测量的。将牛Fcg2R通过胺偶联(通过EDC-NGF混合物激活羧基，并且通过乙醇胺灭活过量反应基团)固定在传感器表面上，以达到期望的表面密度。使用了10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05v/v％表面活性剂P20、pH为7.4的缓冲液的运行缓冲液。将各种浓度的牛CTLA4-Fc融合体或mAb滴定并且使其在受体表面之上流动，并且使用Biacore T200评估软件(美国马萨诸塞州马尔伯勒的思拓凡公司)以1:1结合模型确定亲和力。已经应用了双参考方法，在所述方法中从含有固定化的受体的流通池中减去参考流通池，并且从所有运行中减去仅含有缓冲液的空白运行。使用pH为1.5的10mM甘氨酸再生流通池。运行在15℃下进行。

产生Fc融合蛋白和mAb

通过将犬CTLA4基因(NCBI NM_001003106.1)插入到pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体中构建了重组CTLA4-Fc融合体，所述表达载体含有分别从仅在图6、14和18中所示的重链铰链区上游开始的bIgG1a(NCBI 1S82409)、bIgG2a(在硕腾公司(Zoetis)测序)、bIgG3a(NCBI BTU63638)。还在图6、14和18中所示的相同Fc位置处构建了bIgG1b(X16701)、bIgG2b(S82407)和或bIgG3b(BTU63639)的重组CTLA4-Fc融合体。不需要另外的接头。

通过插入位于编码pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体中的恒定结构域的核苷酸上游并与其使用相同读框的VH序列来构建具有bIgG1a、bIgG1b、bIgG2a、bIgG2b、bIgG3a和bIgG3b Fc区的重组mAb。恒定区为bIgG1a(NCBI 1S82409)、bIgG1b(X16701)、bIgG2a(在硕腾公司测序)、bIgG2b(S82407)、bIgG3a(NCBI BTU63638)或bIgG3b(BTU63639)。类似地，通过插入位于牛κ等位基因1恒定区(NCBI HQ213994.1)上游并与其使用相同读框的VL序列来构建轻链。

在CTLA4 Fc融合体和完整mAb格式中，将突变引入到三个野生型亚类中，以敲除与FcgR的结合，敲除CDC和/或ADCP，提高稳定性或增加与bFcRn的亲和力。使用安捷伦公司(Agilent)的QuikChange II诱变和用于单位点定向诱变的相关联的安捷伦公司引物设计工具(https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp)将突变并入到每个野生型质粒上的各个位置中。

将所有CTLA4融合基因和mAb基因的DNA针对哺乳动物表达进行密码子优化，并且使用转染试剂和方案(美国纽约州纽约的Polyplus Transfection公司(Polyplus Transfection,New York,NY,USA))使构建体在HEK 293细胞中瞬时表达，或使用ExpiCHO瞬时系统(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))试剂盒方案使其在CHO细胞中瞬时表达。ExpiCHO表达遵循赛默飞世尔科技公司制定的用于mAb或CTLA4 Fc融合转染的方案。对于mAb，将含有编码IgGκ轻链的基因序列的质粒与编码IgG重链的质粒共转染。为了进行HEK293表达，将按重量计相等量的重链质粒和κ链质粒共转染。对于Fc融合体，将单个质粒转染。允许细胞生长7天(HEK293)或12天(CHO)，之后收集上清液以进行蛋白质纯化。通过Octet QKe定量(美国加利福尼亚州门洛帕克的颇尔公司(Pall ForteBioCorp,Menlo Park,CA,USA))针对与蛋白A或蛋白G传感器的结合对CTLA4 Fc融合体和mAb进行筛选。用蛋白A或蛋白G传感器使用标准曲线在Octet上对表达进行定量，并且用蛋白G或蛋白A/G亲和色谱对mAb/融合蛋白进行纯化。对于所有蛋白质构建体，使用pH为5.5的乙酸钠作为结合和洗涤缓冲液，并且在pH 3.4下进行洗脱。将经纯化的蛋白质中和并且透析到pH为5.5的20mM乙酸钠、140mM NaCl中，以供进一步分析。通过NanoDrop在280nm下测量mAb和融合蛋白的浓度。通过分析SEC和标准考马斯蛋白质凝胶评估蛋白质质量。

表2列出了针对三种牛IgG野生型亚类和突变产生的CTLA4 Fc融合体。还对表2中所述的相同位置处的mAb进行了突变。

引入到牛IgG中但未对Fc融合体进行的另外的突变为：bIgG1a的“DP”稳定突变体；用于增加对bFcRn的亲和力的突变；bIgG3a上的R433H。

表2：具有CTLA4的牛Fc融合体。

*位置是根据如Kabat中的Eu索引编号的(参见图23)。

以下表3描述了对bIgG1b、IgG2b和IgG3b进行的突变，包含由核苷酸突变引起的氨基酸的变化。表3还示出突变的侧翼序列。对bIgG1a、bIgG2a和IgG3a进行了表3中的相同Fc突变，并且突变使a和b同种异型的氨基酸序列相同。

表3：牛IgG1b、IgG2b和IgG3b的Fc突变。

/>

/>

粗体和加下划线的：氨基酸变化和对应经突变的密码子。核苷酸序列翻译为示出的氨基酸序列。

实例2

bIgG突变敲除效应功能

将几个突变引入到bIgG1a同种异型的Fc区以敲除效应功能：将以下消除或减少到可忽略：1)bIgG1a与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的结合；2)基于细胞的测定中的补体杀伤活性(CDC)；以及3)基于ADCP细胞的测定中的吞噬。

“Winter”(或“Win”)位点仅位于先前报告的人IgG1的铰链下游。人IgG1的此LLGG“Winter”位点在物种之间有所变化。对于牛IgG1，其为LPGG(图2)。人IgG1的通常被称为“LALA”的突变位于Leu234Ala和Leu235Ala处。对于牛IgG1，对应Winter突变为Leu234Ala、Pro235Ala，但是另外的残基也发生了突变。这种另外的突变为Gly237Ala(根据如Kabat中的Eu指数编号)。

bIgG1a上的“PAP变为SAS”(Pro329Ser_Pro331Ser)和“PAP变为SAP”(Pro329Ser)突变是基于bIgG2设想的，因为bIgG2在基于细胞的测定中不会触发补体活性。牛IgG2a在CH2中具有天然存在的SAS位点，而bIgG1a在如图2所示的此区中为PAP。因此，假设使bIgG1a中的PAP突变为SAS或SAP将消除CDC。

bIgG1a上的“SS”突变(Ala330Ser、Pro331Ser)基于在此同一区中类似于人IgG4的人IgG1的突变，PAP变为PSS，因为hIgG4亚类对FcgR的亲和力弱，并且因此效应功能可忽略。事实上，hIgG1上的“SS”突变敲除了效应功能。牛IgG1在此区中具有与hIgG1的序列相同的PAP序列，因此假设了bIgG1上的PAP变为PSS突变将敲除ADCC、ADCP、CDC和FcgR结合。将SS突变添加到bIgG1上的Winter突变中。

将以上所述的突变引入在bIgG1a Fc上：单独的Winter突变L234A_P235A_G237A，“Win”(SEQ ID NO.16)；Winter突变加SS突变L234A_P235A_G237A_A330S_P331S，“WinSS”(SEQ ID NO.18)；Winter突变加SAS突变L234A_P235A_G237A_P329S_P331S，“WinSAS”(SEQID NO.17)；单独的SAS突变P329S_P331S，“SAS”(SEQ ID NO.15)；以及单独的SAP突变P329S，“SAP”(SEQ ID NO.14)。这些突变在图6中进行比对。

将以上突变对Fcγ受体的结合亲和力与bIgG1a野生型的结合亲和力进行比较。还在基于功能细胞的测定中对突变体进行了测试，并且数据表明SAS突变和SAP突变两者都显著降低了CDC活性。SAS突变和SAP突变也完全敲除ADCP。出乎意料的是，“Winter”突变似乎增强了而不是降低了在基于细胞的CDC测定中的补体活性，并且在基于细胞的测定中对ADCP的影响可忽略不计。而且，出乎意料的是，bIgG1a上的“SS”突变并没有完全敲除与bFcgR1和bFcgR2的结合。在基于细胞的测定中，bIgG1上的SS突变仅轻微降低CDC，并且仅部分敲低ADCP。

实例3

bIgG Fc突变对牛Fc受体结合亲和力的影响

通过比较bIgG1a和bIgG1b野生型Fc与以上所述的bIgG1a和bIgG1b突变的SPRBiacore bFcgR亲和力评估了敲除与牛Fcγ受体的结合的能力。bIgG1a野生型重组mAb与五个Fc突变体的恒定区的比对在图6中示出。bIgG1a同种异型与bIgG1b同种异型的比对在图3中示出。对bIgG1进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。用于bFcgR1、R2和R3的Biacore方法如实例1中所述的进行。

表4示出了效应功能Fc突变在bIgG1a和bIgG1b与Fcγ受体的结合方面的结果。对于bIgG1野生型，两种同种异型与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3具有相似的结合亲和力。虽然Winter突变(bIgG1aWin)敲除了与bFcgR3的结合，但其没有显著影响bFcgR1或bFcgR2亲和力。将SS突变添加到Winter(bIgG1aWinSS)中使与bFcgR1和bFcgR2的结合某种程度降低，并且保留了与bFcgR3的可忽略的结合。仅在将SAS添加到Winter突变(bIgG1aWinSAS)、单独的SAS突变(bIgG1aSAS)或单独的SAP突变(bIgG1aSAP)的情况下，与所有三种Fcγ受体的结合才会被敲除。牛bFcgR1与IgG1aSAP具有相当弱的结合，并且因此被有效敲除。除了两个例外，表4示出了bIgG1b野生型和bIgG1b突变分别与bIgG1a野生型和bIgG1a突变具有相似的结合亲和力。因此，除了1)bFcgR2上的WinSS和2)bFcgR1上的SAP外，两种同种异型相当有利地进行了比较；然而，这两种突变体的KD显著低于野生型的KD。

表4：bIgG1a和bIgG1b效应功能Fc突变对与牛Fcγ受体结合的影响。

NBO＝未观察到结合。LS＝低信号，其表明非常弱的结合。

CDC测定：

基于CDC细胞的测定被开发并且用于表征五种CTLA4牛IgG1a Fc融合蛋白(图6)在介导CDC方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的CDC活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的CTLA4结合的CHO靶细胞。这些靶细胞由于其可靠性已在过去的犬ADCC测定中使用，并且在CDC测定中使用。

将融合蛋白结合的靶细胞与保存补体的血清一起温育可以引起融合蛋白上与启动补体级联的补体组分C1q的Fc结合，最终形成膜攻击复合物。成孔复合物介导靶细胞的细胞裂解，所述细胞裂解是通过细胞活力的丧失测量的。如果没有Fc与C1q的结合，则不会导致细胞裂解/死亡。

简而言之，将表达CD80的CHO细胞(靶细胞)以40,000个细胞/孔在CD CHO培养基中铺板在圆底96孔板中。将CD CHO培养基中的滴定的融合蛋白添加到靶细胞中，并且允许在37℃下结合60分钟。将牛补体保存的血清(30％于CD CHO培养基中)添加到37℃的板中持续45分钟。然后使用CellTiter-Glo测量细胞活力，并且数据表示为使用无融合蛋白+补体保存的血清对照计算的“相对于对照的细胞活力％”。

如图7和表5所示，单独的Win突变不会敲除bIgG1a Fc或bIgG1b Fc的CDC活性。其似乎加强了CDC活性。WinSS突变触发了CDC，但是相当弱。WinSAS、单独的SAS和SAP突变大大降低或完全敲除bIgG1a Fc和bIgG1b Fc两者的CDC活性。

计算机建模(In silico modeling)

使用其相应铰链区将牛抗体的FAb序列与各种牛骨架亚类的Fc结构域的序列拴系在一起。实施了由化学计算组开发的分子操作环境2019.0102程序(Molecular OperatingEnvironment 2019.0102program，MOE2019.0102)的抗体同源性建模特征，以对每种牛骨架同种异型的野生型(WT)和突变体构建体中的每一者的3D结构进行建模。MOE2019.0102为抗体同源性建模提供了灵活且自动化的图形用户界面，并且选择了用于建模运行的默认参数。

为了对mAb进行建模，采用了使用MOE2019.0102的内置PDB数据库的基于知识的方法。序列与谱比对算法使用评分算法以对重链和轻链序列模板进行排序，并且高于85％的评分确保选择具有物理上真实的结构的抗体模板。一旦CDR和环模板连接在一起，就可以使用相同的流水线对模型进行优化。使用拉氏图(Ramachandran Plot)验证了模型的结构稳定性，所述图检查蛋白质结构的立体化学质量。

为了了解跨经突变的结构之间的结构-活性关系，对bIgG1a_WINSAS、bIgG1b_WINSAS、bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS进行了以上所述的方法。所述结构重叠，并且经突变的残基用箭头表示(图8A)。生成了RMSD图，以计算四个结构相对于彼此的均方根偏差(图8B)。或更低的RMSD值被视为是考虑两个结构相似的标准。结果表明，_bIgG1a_WINSAS构建体与其它同种异型对应物bIgG1b WINSAS相同，因为其RMSD为/>这在CDC测定中也得到了支持(图7)，在所述测定中，bIgG1a_WINSAS显示出与bIgG1b_WINSAS的活性丧失相同的CDC活性丧失。这提供了更多的支持，以表明由以上所述的方法产生的抗体模型提供了牛骨架结构的准确表示。进一步地，将bIgG1a_WINSAS和bIgG1b_WINSAS与bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS的抗体模型进行比较，RMSD值的范围介于/>之间，并且因此可以以高度确定性预测，bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS表现出与bIgG1a_WINSAS相同的功能活性缺乏(CDC、ADCP和ADCC)。

ADCP测定：

基于ADCP细胞的测定被开发并且用于表征五种CTLA4牛IgG1a Fc融合蛋白(图6)在介导ADCP方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的ADCP活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的犬CTLA4结合的CHO靶细胞。这些靶细胞由于其可靠性已在过去的犬ADCC测定中使用，并且在CDC测定中使用。

对于本测定，将Fc融合蛋白/靶细胞复合物与牛肺泡巨噬细胞一起温育可以使Fc与Fcγ受体在巨噬细胞上结合，从而桥接CHO靶细胞和巨噬细胞效应子，并且由此启动靶细胞的吞噬。ADCP是通过pH敏感性荧光染料在共培养物中的效应巨噬细胞的群体内的信号强度和频率来测量的，其中荧光细胞表示已成功地将靶细胞内化到酸性溶酶体中的效应子。

简单地说，将犬表达CD80的CHO细胞(CD80靶细胞)或不表达CD80的亲本CHO细胞(亲本靶细胞)用pHrodo红染料在37℃下预染色30分钟。然后将细胞与CTLA4-Fc融合蛋白一起温育20分钟，以介导CTLA4:CD80结合，并且随后与用细胞标志物(CellTrace紫，CTV)染色的预先铺板的粘附牛肺泡巨噬细胞一起共培养，以帮助后期鉴定。将60,000个靶细胞与30,000个效应巨噬细胞一起铺板在96孔板中。然后将细胞共培养6小时，并且随后从板中取出，并且通过流式细胞术进行分析以鉴定已成功进行ADCP(pHrodo+)的效应细胞(CTV+)。如图9和表5中所示，野生型bIgG1a是牛肺泡巨噬细胞中的ADCP的有效激活子。单独的bIgG1aWin突变不会显著影响bIgG1a Fc的ADCP活性，并且可能略微增强ADCP，正如CDC活性所看到的。WinSS突变部分地敲除ADCP，而bIgG1a上的WinSAS、单独的SAS和SAP突变完全废除ADCP功能。

野生型bIgG1a与不表达犬CD80的靶细胞(IgG1亲代)一起温育也不触发ADCP，这表明观察到的靶细胞内化需要特定活性的融合蛋白，并且不是由其它机制介导的。

吞噬(ADCP)是由包含FcgR1在内的多种人Fcγ受体介导的，并且DNA序列分析表明，与其人和小鼠对应物相比，牛FcgR1的IgG结合结构域的基序是高度保守的。图9和表5中的基于细胞的ADCP数据与表4中的bIgG1a和突变体对bFcgR1的结合亲和力有利地进行了比较。Winter突变(bIgG1aWin)未显著影响bFcgR1亲和力。将SS突变添加到Winter(bIgG1aWinSS)中在某种程度上敲低了与bFcgR1的结合，但没有完全敲除结合。仅在将SAS添加到Winter突变(bIgG1aWinSAS)、单独的SAS突变(bIgG1aSAS)或单独的SAP突变(bIgG1aSAP)的情况下，与bFcgR1的结合被敲除。牛bFcgR1与IgG1aSAP具有仅可忽略的结合，并且因此被有效敲除。

表5：牛IgG1a和IgG1b Fc野生型和突变诱导的CDC和ADCP效应。

实例4

用于稳定的bIgG DP突变

关于对牛IgG1a天然野生型亚类的分析研究，在分析时通过尺寸排阻色谱(SEC)观察到低分子量物种(LMWS)，如图10所示。为了研究可能的原因，使样品经受质谱分析，所述质谱分析鉴定出在牛IgG1a恒定重链中位于D216与P217之间以及D270与P271之间的两个剪切的位点。这两个化学切割的位点包含在牛IgG1aFc的天然氨基酸序列中(NCBI参考1S82409)。消除bIgG1a的恒定结构域中的切割/剪切位点对于提高牛IgG1亚类的构象稳定性、完整单体百分比和整体可开发性是期望的。使牛IgG1a的恒定结构域进行了突变以消除这些切割/剪切位点(表6)。这些经鉴定的切割位点依赖于可以触发IgG蛋白中的Asp(D)与Pro(P)氨基酸之间的键的非酶断裂的氨基酸序列。虽然对DP键的有意切割在文献中被充分记录为使用酸和热，但并非所有DP位点都是可构象地达到的，并且在短时间暴露于酸时也不会切割，即使在高温下也是如此。因此，尚不清楚这些序列位点倾向性是否将自动导致bIgG1a Fc的剪切。

表6：DP位点在牛IgG1a恒定重链中的突变

鉴定	进行的突变
		单突变DP位点1	D216E
单突变DP位点2	D270E
		双突变DP位点1&2	D216E和D270E

以上所述的DP变为EP的突变是通过对含有bIgG1a的哺乳动物表达载体进行的快速变化的诱变构建的。使单克隆抗体(mAb)突变体在从赛默飞世尔公司获得的哺乳动物悬浮细胞系统EXPICHO-S(中国仓鼠卵巢)细胞中表达。将悬浮EXPICHO-S细胞在EXPICHO表达培养基(Gibco公司(Gibco))中维持在0.14与8.0x 10e6个细胞/ml之间。在第-1天和转染日，按照ExpiCHO方案用户手册稀释细胞。如方案中描述的使用源自ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Gibco公司)的试剂按照最大滴度条件对经稀释的细胞进行转染。在12-14天温育后，收获培养物并对培养物进行澄清。将条件培养基上样到已经用PBS预平衡的MabSelectSure LX(GE医疗公司(GE Healthcare))上。样品上样后，将树脂用PBS洗涤，并且然后用pH为5.5的20mM乙酸钠洗涤。将样品从柱中用pH为3.5的20mM乙酸洗脱。洗脱后，制备池并且在添加1M乙酸钠的情况下将池中和至4％。根据可用体积和预期用途，有时将样品交换到最终缓冲剂(例如PBS、其它)中。通过280nm处的吸光度测量浓度。

使用来自东曹生命科学公司(TOSOH BioScience)的TSK凝胶Super SW3000、4.6mm、10x 30cm、4μm柱，在pH为7.2的200mM磷酸钠运行缓冲液中以0.25ml/分钟进行分析SEC。

对野生型天然牛IgG1a和突变体进行了质谱(Mass spectrometric、mass spec)分析。将样品使用PNG酶F(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))去糖基化，并且用DTT(赛默公司)还原。使用maXis plus ESI仪器(布鲁克公司(Bruker))对样品进行分析。图10证实了，经鉴定的DP剪切位点的质量在天然bIgG1a重链中是明显的。bIgG1a双突变D216E(位点1)和D270E(位点2)也通过质谱以与天然Fc的方式相同的方式进行了分析。从这个数据可以明显看出，DP剪切不再存在。

引入的D-P变为E-P突变(图12)从bIgG1a Fc中去除了切割/剪切位点，如通过质谱分析证明的(图11)。去除这些切割位点可以改进此亚类对于治疗用途的均质性、完整IgG纯度和整体可开发性。

计算机建模

在bIgG1DP1_DP2同种异型上进行了先前针对bIgG1a_WINSAS、bIgG1b_WINSAS、bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS描述的方法。图13中示出的结果表明，在RMSD值的范围介于之间的情况下，bov_G1a_DP1_DP2构建体与其它同种异型对应物bIgG1b_DP1_DP2、bIgG1c_DP1_DP2和bIgG1d_DP1_DP2相同。因此，基于实验结果和模型结果两者，以高度确定性预测，同种异型bIgG1b、bIgG1c和bIgG1d中的DP1_DP2突变体将以与bIgG1a_DP1_DP2类似方式表现。

实例5

bIgG突变敲除效应功能

将几个突变引入到bIgG2a同种异型的Fc区以敲除效应功能：将以下消除或减少到可忽略：1)bIgG2a与其接合的唯一Fcγ受体bFcg2R的结合；以及2)基于ADCP细胞的测定中的吞噬。

牛IgG2a与bFcg2R的HDX表位作图表明bIgG2a上的表位是不连续的。为了将与bFcg2R的结合消除或减少到可忽略，在bIgG2a的此区中创建了丙氨酸突变套组。在显著敲低Fcγ受体结合同时保留新生儿Fc受体亲和力方面有效的突变在图14中展示。这些突变为L432A、N434A和M437A。另外，L432A、N434A和M437A的以下组合成功地敲除了与bFcg2R的结合：L432A_N434A；L432A_M437A；N434A_M437A；以及L432A_N434A_M437A。

实例6

bIgG丙氨酸突变对bFcg2R和bFcRn结合亲和力的影响

通过比较以上所述的bIgG2a野生型Fc与bIgG2a丙氨酸突变之间的SPR Biacore亲和力差异，评估了敲除与bFcg2R结合而保留与bFcRn的亲和力的能力。bIgG2a野生型(wt)重组mAb与七个Fc突变体的恒定区的比对在图14中示出。bIgG2a同种异型与bIgG2b同种异型的比对在图4中示出。对bIgG2进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。bIgG2a wt和突变体作为mAb产生，并且在Biacore上针对与牛Fcγ受体和牛新生儿Fc受体的结合亲和力运行。用于bFcg2R、bFcRn、bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的Biacore方法如以上示例部分中的描述进行。

如表7中所示，bIgG2a、L432A、N434A和M437A上的三个单点突变显著敲低了与bFcg2R的结合，从而导致几乎完全敲除了结合。与野生型结合相比，双突变L432A_N434A将与bFcg2R的结合减少了4倍。双突变L432A_M437A；与野生型Fc相比，N434A_M437A和三重突变L432A_N434A_M437A完全敲除了与Fcg2R的结合。

牛Fcg2R敲除突变对牛FcRn的结合有不同的影响。使IgG通过pH依赖性FcRn循环需要在pH 6下具有强亲和力以避免内体降解，并且在pH 7.4下具有弱亲和力以将获救的IgG释放回到循环中。三个单点突变在pH 6下对bFcRn结合具有最小影响，这保留了与野生型相似的强亲和力，而双突变和三突变在pH7.4下对bFcRn亲和力具有最大影响，这将亲和力降低到检测限以下。

表7：bIgG2a wt和丙氨酸突变体mAb与bFcg2R和bFcRn的结合亲和力。

NBO＝未观察到结合。LS＝低信号，其表明非常弱的结合。

bIgG2a野生型和所有bIgG2a Fcg2R敲除突变与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3没有结合或结合可以忽略，如表8中所示。

表8：bIgG2a wt和丙氨酸突变体与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的结合亲和力。

NBO＝未观察到结合。

除了表7和8中所示的用于bIgG2a野生型和突变体的mAb试剂外，如以上所述制备了bIgG2 a和b同种异型两者的CTLA4-Fc融合版本。与野生型bIgG2b同种异型CTLA4-Fc融合体相比，对与野生型bIgG2a同种异型CTLA4-Fc融合体的bFcg2R亲和力的检查显示出几乎相同的KD，即4.17E-08与3.14E-08(表9)。比较所有Fc突变的两种同种异型也显示出非常相似的bFcg2R结合亲和力。

表9：针对bFcg2R的bIgG2a wt和丙氨酸突变体Fc融合体与bIgG2b wt和丙氨酸突变体Fc融合体的比较。

NBO＝未观察到结合。WB＝弱结合。

LS＝低信号，其表明非常弱的结合。

CDC测定：

基于CDC细胞的测定被开发并且用于表征七种CTLA4牛IgG2a Fc融合蛋白(图14)在介导CDC方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的CDC活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的CTLA4结合的CHO靶细胞。这些靶细胞由于其可靠性已在过去的犬ADCC测定中使用，并且在CDC测定中使用。测定方法如以上针对bIgG2a CTLA4 Fc融合体所述的进行。

如图15和表10所示，两种牛IgG2野生型同种异型bIgG2a和bIgG2b在基于细胞的测定中都不触发CDC，而阳性对照bIgG1a具有与先前的运行的活性相似的CDC活性。另外，七个丙氨酸突变都没有改变bIgG1a CDC功能。

计算机建模：

在bIgG2a突变体上进行了先前针对bIgG1a_WINSAS、bIgG1b_WINSAS、bIgG1c_WINSAS和bIgG1d_WINSAS描述的方法。对于此亚类高于的RMSD中没有变化，这表明两种同种异型类似地折叠(图16B)。与先前的亚类一样，合理化的是，如果在单个构建体(L432、N434A和M437A)中具有所有可能的突变都没有使蛋白质折叠发生显著变化，则单独突变也不应影响蛋白质模型。这些模型也得到使用CDC测定观察到的效应功能数据的支持。这些抗体模型与表7中的SPR结合数据(即，实验数据)一起表明，bIgG2a_L432A_N434A_M437A、bIgG2b_L432A_N434A_M437A以及这些突变的各种组合(列示在表2和7中)以相同的方式折叠和结合，并且因此将具有类似的ADCP和ADCC效应功能的缺乏。

ADCP测定：

基于ADCP细胞的测定被开发并且用于表征七种CTLA4牛IgG2a Fc融合蛋白(图14)在介导ADCP方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的ADCP活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的CTLA4结合的CHO靶细胞。这些靶细胞由于其可靠性已在过去的犬ADCC测定中使用，并且在CDC测定中使用。

对于本测定，将Fc融合蛋白/靶细胞复合物与牛肺泡巨噬细胞一起温育可以使Fc与Fcγ受体在巨噬细胞上结合，从而桥接CHO靶细胞和巨噬细胞效应子，并且由此启动靶细胞的吞噬。ADCP是通过pH敏感性荧光染料在共培养物中的效应巨噬细胞的群体内的信号强度和频率来测量的，其中荧光细胞表示已成功地将靶细胞内化到酸性溶酶体中的效应子。

简单地说，将犬表达CD80的CHO细胞(CD80靶细胞)或不表达CD80的亲本CHO细胞(亲本靶细胞)用pHrodo红染料在37℃下预染色30分钟。然后将细胞与CTLA4-Fc融合蛋白一起温育20分钟，以介导CTLA4:CD80结合，并且随后与用细胞标志物(CellTrace紫，CTV)染色的预先铺板的粘附牛肺泡巨噬细胞一起共培养，以帮助后期鉴定。将60,000个靶细胞与30,000个效应巨噬细胞一起铺板在96孔板中。将细胞共培养6小时，并且随后从板中取出，并且通过流式细胞术进行分析以鉴定已成功进行ADCP(pHrodo+)的效应细胞(CTV+)。

如图17和表10所示，虽然牛IgG2亚类在激活牛肺泡巨噬细胞中的ADCP方面不如牛IgG1亚类有效(参见图9和表5)，但bIgG2能够以更高浓度触发ADCP。所有bIgG2a丙氨酸突变均消除野生型bIgG2a的ADCP活性。

表10：牛IgG2a和IgG2b Fc野生型以及突变诱导的CDC和ADCP效应。

实例7

bIgG突变敲除效应功能

将几个突变引入到bIgG3a同种异型的Fc区以敲除效应功能：将以下消除或减少到可忽略：1)bIgG3a与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的结合；2)基于细胞的测定中的补体杀伤活性(CDC)；以及3)基于ADCP细胞的测定中的吞噬。

“Winter”(或“Win”)位点仅位于以上所述的人IgG1的铰链下游。人IgG1的此LLGG“Winter”位点在物种之间有所变化。对于牛IgG3，其为PLGG(图2)。如以上讨论的，人IgG1的通常被称为“LALA”的突变位于Leu234Ala和Leu235Ala处。

对于bIgG3，对应Winter突变为Pro234Ala、Leu235Ala，但是另外的残基也发生了突变。这种另外的突变为Gly237Ala(根据如Kabat中的Eu指数编号)。

bIgG3a上的“PAP变为SAS”(Pro329Ser、Pro331Ser)和“PAP变为SAP”(Pro329Ser)突变是基于bIgG2设想的。牛IgG2不触发基于细胞的测定中的补体活性。牛IgG2a在CH2中具有天然存在的SAS位点，而bIgG3a在如图2所示的此区中为PAP。因此，假设使bIgG3a中的PAP突变为SAS或SAP将消除CDC。

将以上所述的突变引入在bIgG3a Fc上：单独的Winter突变P234A_L235A_G237A，“Win”(SEQ ID NO.29)；Winter突变加SAS突变P234A_L235A_G237A_P329S_P331S，“WinSAS”(SEQ ID NO.30)；单独的SAS突变P329S_P331S，“SAS”(SEQ ID NO.28)；以及单独的SAP突变P329S，“SAP”(SEQ ID NO.27)。这些突变在图18中进行比对并且根据如Kabat中的Eu索引编号。

将以上突变对Fcγ受体的结合亲和力与bIgG3a野生型的结合亲和力进行比较。在基于功能细胞的测定中还对突变体进行了测试，并且数据表明，虽然单独的Win突变略微地减弱了CDC，但完成的WinSAS、仅SAS和仅SAP突变敲除了CDC活性。所有四个Win、WinSAS、SAS和SAP突变完全敲除了ADCP功能。

实例8

bIgG Fc突变对牛Fc受体结合亲和力的影响

通过比较bIgG3a和bIgG3b野生型Fc与以上所述的bIgG3a和bIgG3b突变的SPRBiacore bFcgR亲和力评估了敲除与牛Fcγ受体的结合的能力。bIgG3a野生型重组mAb与四个Fc突变体的恒定区的比对在图18中示出。bIgG3a同种异型与bIgG3b同种异型的比对在图5中示出。对bIgG3进行的所有突变对于a和b同种异型来说是相同的。

用于bFcgR1、R2和R3的Biacore方法如以上实例中所述的进行。表11示出了效应功能bIgG3a和bIgG3b Fc突变在与Fcγ受体结合方面的结果。对于bIgG3野生型，两种同种异型与bFcgR1、9.36E-09的结合亲和力与1.25E-08的结合亲和力相似。尽管两种同种异型对bFcgR2和bFcgR3具有不同的KD，但两种野生型同种异型确实结合。a和b同种异型两者的所有突变bIgG3Win、bIgG3WinSAS、bIgG3SAS和bIgG3SAP将与bFcgR1、bFcgR2和bFcgR3的结合敲低到可忽略的亲和力。因此，对于敲除受体结合，两种同种异型类似地进行比较。

表11：bIgG3a和bIgG3b野生型和突变体CTLA4-Fc融合体与牛Fcγ受体的结合亲和力。

NBO＝未观察到结合。WB＝弱结合。LS＝低信号，其表明非常弱的结合。

CDC测定：

基于CDC细胞的测定被开发并且用于表征四种CTLA4牛IgG3a Fc融合蛋白(图18)在介导CDC方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的CDC活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的CTLA4结合的CHO靶细胞。这些靶细胞由于其可靠性已在过去的犬ADCC测定中使用，并且在CDC测定中使用。

对于bIgG3a CTLA4 Fc融合体，测定方法如以上实例中所述的进行。

如图19和表12所示，与bIgG1a野生型Fc相比，bIgG3a野生型Fc和bIgG3b野生型Fc显示出略微不太有效的CDC活性。Win突变本身不敲除bIgG3a Fc或bIgG3b Fc的CDC活性。Win-SAS、仅SAS或仅SAP突变均完全敲除CDC活性。

计算机建模

与亚类IgG1一样，WINSAS突变在牛亚类3中的影响使用与以上相同的方法进行了研究，并且使用相同的方法进行叠加(图20A)。如图19中所示，bIgG3a和bIgG3b两者中的WINSAS突变完全废除了CDC功能。计算机建模数据显示出，两种同种异型bIgG3a_WINSAS和bIgG3b_WINSAS的RMSD为并且因此其预期具有相似的蛋白质折叠(图20B)。表11中列示的结合数据和图20中的计算机建模数据表明，bIgG3a_WINSAS和bIgG_3b以相同方式折叠和结合，并且因此，基于实验结果和模型结果两者，以高度确定性预测，除了CDC功能外，bIgG3b_WINSAS构建体还将消除与bIgG3a_WINSAS的功能类似的ADCP和ADCC功能。

ADCP测定：

基于ADCP细胞的测定被开发并且用于表征四种CTLA4牛IgG3a Fc融合蛋白(图18)在介导ADCP方面的有效性，并且定义Fc区中决定牛IgG亚型的ADCP活性的关键残基。所述测定利用被工程化为表达犬CD80的与Fc融合蛋白上的CTLA4结合的CHO靶细胞。

对于本测定，将Fc融合蛋白/靶细胞复合物与牛肺泡巨噬细胞一起温育可以使Fc与Fcγ受体在巨噬细胞上结合，从而桥接CHO靶细胞和巨噬细胞效应子，并且由此启动靶细胞的吞噬。ADCP是通过pH敏感性荧光染料在共培养物中的效应巨噬细胞的群体内的信号强度和频率来测量的，其中荧光细胞表示已成功地将靶细胞内化到酸性溶酶体中的效应子。

简单地说，将犬表达CD80的CHO细胞(CD80靶细胞)或不表达CD80的亲本CHO细胞(亲本靶细胞)用pHrodo红染料在37℃下预染色30分钟。然后将细胞与CTLA4-Fc融合蛋白一起温育20分钟，以介导CTLA4:CD80结合，并且随后与用细胞标志物(CellTrace紫，CTV)染色的预先铺板的粘附牛肺泡巨噬细胞一起共培养，以帮助后期鉴定。将60,000个靶细胞与30,000个效应巨噬细胞一起铺板在96孔板中。将细胞共培养6小时，并且随后从板中取出，并且通过流式细胞术进行分析以鉴定已成功进行ADCP(pHrodo+)的效应细胞(CTV+)。

如图21和表12中所示，野生型bIgG3a是牛肺泡巨噬细胞中的ADCP的有效激活子。单独的bIgG3aWin、WinSAS、单独的SAS和单独的SAP突变均消除ADCP功能。

值得注意的是，尽管bIgG3a的Win突变在最高浓度下确实显示出一些微量活性，但与其在bIgG1a ADCP以及bIgG3a CDC中的活性相比，此突变在驱动ADCP方面在很大程度上是无效的。这可能表明，bIgG3a ADCP活性仅通过肺泡巨噬细胞中需要Winter位点突变以结合的bFcgR的子集介导，而bIgG1a通过不需要Winter位点以在这些细胞中结合的单独的bFcgR介导ADCP。对FcgR的不同利用度也可以解释野生型bIgG1a相比于bIgG3a的不同的观察到的EC50。相反地，bIgG1a与bIgG3a之间的不同的二级结构可能使Winter位点在与驱动ADCP的适当受体结合时的利用度不同。

表12：由牛IgG3a Fc野生型、IgG3b Fc野生型和突变诱导的CDC和ADCP效应。

实例9

bIgG突变提高FcRn亲和力

如表13中所示，与bIgG2a相比，牛IgG3a在pH 6下与bFcRn的结合亲和力弱。出乎意料地，bIgG2a的亲和力为bIgG1a和bIgG3a的亲和力的10x，但是与其它两个亚类相比，在pH7.4下与牛FcRn的bIgG2a结合更强。然而，由于基于bIgG2a的mAb表现出长血清半衰期，因此在将抗体释放回到循环中所需的pH(pH 7.4)下对bIgG2a的更紧密的结合不是一个问题。

基于bIgG2的mAb在小牛中的血清半衰期显著长于大多数人治疗性mAb的血清半衰期，长达21天。牛IgG2a在pH 6下与bFcRn的亲和力比bIgG1a的亲和力强。因此，bIgG3a亚类的血清半衰期可以比bIgG2a的血清半衰期短。因此，期望的是提高bIgG3a与bFcRn的亲和力，以延长与bIgG2a相当的体内半衰期。

表13：bIgG3a野生型和bIgG3a_R433H突变体与bFcRn的结合亲和力。

NBO＝未观察到结合。

为了提高与bFcRn的亲和力，在bIgG3a(Arg433His)上引入了点突变。此突变基于与bIgG1a和bIgG2a的比对，如图2所示。另外，具有His435的人IgG3同种异型的血清半衰期比具有Arg435的同种异型的血清半衰期显著更长，并且此残基位置在bIgG3中与精氨酸位于同一区，距人精氨酸上游仅两个残基：即hIgG3的HEALHNRY以及bIgG3的HEALRNHY(图2)。

如以上所述，针对与bFcRn的提高的亲和力产生了R433H突变体bIgG3a mAb。bIgG3a野生型重组mAb与R433H突变的恒定区的比对在图22中示出。

Biacore SPR结合测定被设计成测试牛IgG亚类与牛FcRn的亲和力，如以上实例所述。

bIgG3a_R433H突变体在pH 6下以比bIgG3a野生型的亲和力高5x的亲和力与bFcRn结合，并且突变体在pH 7.4下保留与bFcRn的可忽略的结合(表13)。因此，R433H突变体可以提高血清半衰期。

已经描述了本发明的优选实施例，应当理解，本发明不限于精确的实施例，并且本领域的技术人员可以在不脱离所附权利要求书中所定义的本发明的范围或精神的情况下，在其中实现各种改变和修改。

Claims (85)

1.一种经修饰的IgG，其包括：牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括相对于野生型牛IgG恒定结构域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代位于根据如Kabat中的Eu索引编号的氨基酸残基216、234、235、237、270、329、330、331、432、434、437或433处。

2.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG为牛或牛化IgG。

3.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG为IgG1。

4.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG1为IgG1a、IgG1b、IgG1c或IgG1d。

5.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基329、330、331或其组合处。

6.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丝氨酸替代。

7.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)、位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)或位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

8.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S和P331S中的一个或多个取代。

9.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括PAP变为SAP突变，其中所述突变为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)。

10.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括PAP变为SAS突变，其中所述突变为位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

11.根据权利要求5所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括SS突变，其中所述突变为位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)和位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

12.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于Winter位点的一个或多个氨基酸残基处。

13.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基234、235、237或其组合处。

14.根据权利要求13所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丙氨酸替代。

15.根据权利要求13所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置234处的脯氨酸被丙氨酸取代(P234A)、位置235处的亮氨酸被丙氨酸取代(L235A)或位置235处的甘氨酸被丙氨酸取代(G237A)。

16.根据权利要求13所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

17.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

18.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于DP位点的一个或多个氨基酸残基处。

19.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基216、270或其组合处。

20.根据权利要求19所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被谷氨酸替代。

21.根据权利要求19所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置216处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D216E)或位置270处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D270E)。

22.根据权利要求19所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代D216E和D270E中的一个或多个取代。

23.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D216E和D270E中的一个或多个取代。

24.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处。

25.根据权利要求24所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丙氨酸替代。

26.根据权利要求24所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)、位置437处的苏氨酸被丙氨酸取代(T437A)。

27.根据权利要求24所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代L432A、N434A和T437A中的一个或多个取代。

28.根据权利要求4所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D216E、D270E、L432A、N434A和T437A中的一个或多个取代。

29.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG为IgG2。

30.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG2为IgG2a或IgG2b。

31.根据权利要求30所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基330处。

32.根据权利要求31所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丝氨酸替代。

33.根据权利要求31所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括SS突变，其中所述突变为位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)。

34.根据权利要求30所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处。

35.根据权利要求34所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丙氨酸替代。

36.根据权利要求34所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)、位置437处的甲硫氨酸被丙氨酸取代(M437A)。

37.根据权利要求34所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代L432A、N434A和M437A中的一个或多个取代。

38.根据权利要求30所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代A330S、L432A、N434A和M437A中的一个或多个取代。

39.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG为IgG3。

40.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG3为IgG3a或IgG3b。

41.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基329、330、331或其组合处。

42.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丝氨酸替代。

43.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)、位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)或位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

44.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S和P331S中的一个或多个取代。

45.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括PAP变为SAP突变，其中所述突变为位置329处的脯氨酸被丝氨酸取代(P329S)。

46.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括PAP变为SAS突变，其中所述突变为位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

47.根据权利要求41所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括SS突变，其中所述突变为位置330处的丙氨酸被丝氨酸取代(A330S)和位置331处的脯氨酸被丝氨酸取代(P331S)。

48.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于Winter位点的一个或多个氨基酸残基处。

49.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基234、235、237或其组合处。

50.根据权利要求49所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丙氨酸替代。

51.根据权利要求49所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置234处的脯氨酸被丙氨酸取代(P234A)、位置235处的亮氨酸被丙氨酸取代(L235A)或位置235处的甘氨酸被丙氨酸取代(G237A)。

52.根据权利要求49所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

53.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A和G237A中的一个或多个取代。

54.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于DP位点的一个或多个氨基酸残基处。

55.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基270处。

56.根据权利要求55所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被谷氨酸替代。

57.根据权利要求55所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置270处的天冬氨酸被谷氨酸取代(D270E)。

58.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A和D270E中的一个或多个取代。

59.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基432、434、437或其组合处。

60.根据权利要求59所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被丙氨酸替代。

61.根据权利要求60所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置432处的亮氨酸被丙氨酸取代(L432A)、位置434处的天冬酰胺被丙氨酸取代(N434A)、位置437处的赖氨酸被丙氨酸取代(K437A)。

62.根据权利要求60所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代L432A、N434A和K437A中的一个或多个取代。

63.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D270E、L432A、N434A和K437A中的一个或多个取代。

64.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述取代位于氨基酸残基433处。

65.根据权利要求64所述的经修饰的IgG，其中所述取代为所述氨基酸残基被组氨酸替代。

66.根据权利要求64所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置433处的精氨酸被组氨酸取代(R433H)。

67.根据权利要求40所述的经修饰的IgG，其中所述恒定结构域包括取代P329S、A330S、P331S、P234A、L235A、G237A、D270E、L432A、N434A、T437A和R433H中的一个或多个取代。

68.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG对FcRn的亲和力高于具有所述野生型牛IgG恒定结构域的IgG的亲和力。

69.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中相对于具有所述野生型牛IgG恒定结构域的IgG，所述经修饰的IgG消除或减少补体依赖性细胞毒性。

70.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中相对于具有所述野生型牛IgG恒定结构域的IgG，所述经修饰的IgG消除或减少抗体依赖性细胞吞噬。

71.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG消除或减少所述IgG与唯一的Fcγ受体(bFcgR)的结合。

72.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中相比于具有所述野生型牛IgG恒定结构域的IgG的半衰期，所述经修饰的IgG的半衰期有所增加。

73.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定结构域包括CH1结构域或铰链区。

74.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定结构域包括具有CH2结构域和CH3结构域的Fc恒定区。

75.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG，其中所述野生型牛IgG恒定结构域包括SEQ ID NO.:1-9中所示的氨基酸序列之一。

76.一种药物组合物，其包括根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG以及药学上可接受的载体。

77.一种试剂盒，其包括处于容器中的根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的IgG以及使用说明书。

78.一种多肽，其包括根据权利要求1至75中任一项所述的经修饰的IgG。

79.一种抗体，其包括根据权利要求1至75中任一项所述的经修饰的IgG。

80.一种载体，其包括编码SEQ ID NO.:10-12、14-25和27-31中所示的氨基酸序列中的任一项的核酸序列。

81.一种分离的细胞，其包括根据权利要求80所述的载体。

82.一种制备抗体或分子的方法，所述方法包括：提供根据权利要求81所述的细胞；以及培养所述细胞。

83.一种制备抗体的方法，所述方法包括：提供根据权利要求79所述的抗体。

84.一种用于增加家畜的抗体血清半衰期的方法，所述方法包括：向所述家畜施用治疗有效量的根据权利要求79所述的抗体。

85.一种融合分子，其包括：与药剂融合的牛IgG恒定结构域，所述牛IgG恒定结构域包括根据权利要求1至75中任一项所述的经修饰的IgG。