CN116438196A - 犬抗体变体 - Google Patents

Abstract

本发明大体上涉及犬抗体变体和其用途。确切地说，本发明涉及犬抗体恒定区中用于改良其半衰期和其它特征的突变。

Description

犬抗体变体

相关申请的交叉参考

本申请要求2020年9月28日申请的美国临时专利申请第63/084241号的优先权和权益，所述美国临时专利申请特此以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及犬抗体变体和其用途。确切地说，本发明涉及犬抗体的Fc恒定区中用于改良半衰期的突变。

背景技术

犬IgG单克隆抗体(mAb)将研发作为兽医学中的有效治疗剂。几年前，鉴别且表征四种犬IgG子类(Bergeron等人，2014，Vet Immunol Immunopathol.第157(1-2)卷，第31至41页)。然而，并未对延长犬IgG的半衰期的进行足够研究。

经由再循环机制，新生儿Fc受体(FcRn)以与其片段可结晶(Fc)区的pH依赖性相互作用延长IgG的半衰期。确切地说，跨越CH2和CH3域的界面的Fc区与细胞表面上的FcRn相互作用以调节IgG内环境稳定。IgG胞饮作用之后的酸性相互作用有助于此相互作用且因此避免IgG降解。内吞IgG接着再循环回至细胞表面且以碱性pH经释放进入血流中，从而保持足够的血清IgG以发挥恰当功能。因此，IgG的药物动力学概况视其Fc区的结构和功能特性而定。

三种犬IgG子类结合犬FcRn且已经与人类IgG类似物进行比较。犬IgG的半衰期仍需要进行充分研究，因为在无任何实验支持的情况下，我们不能预期或预测其是否将与人类IgG紧密对准。

延长IgG的半衰期可允许抗体药物的不太频繁给药和/或较低剂量，其继而减少兽医问诊，提高患者顺应性，且降低浓度依赖性细胞毒性/不良事件。

因此，需要鉴别Fc恒定区中用以提高半衰期的突变。

发明内容

本发明涉及突变犬IgG，相对于野生型犬IgG，所述突变犬IgG提供更高的FcRn亲和力和更高的半衰期。确切地说，本申请的本发明人已发现用另一氨基酸取代位置434的氨基酸残基天冬酰胺(Asn或N)出人意料地且未预期地增强针对FcRn的亲和力，且从而延长IgG的半衰期。

在一个方面中，本发明提供一种经修饰的IgG，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。在一个示例性实施例中，所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代。

在另一方面中，本发明提供一种多肽，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

在又一方面中，本发明提供一种抗体或分子，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

在另一方面中，本发明提供一种用于产生或制造抗体或分子的方法，所述方法包含：提供具有包含犬IgG恒定域的抗体的载体或宿主细胞，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代。其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

在另一方面中，本发明提供一种用于延长犬的抗体血清半衰期的方法，所述方法包含：向所述犬施用治疗有效量的包含犬IgG恒定域的抗体，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。在一个示例性实施例中，所述抗体使半衰期延长约30天。

在另一方面中，本发明提供一种用于保持抗体于犬体内的治疗性血清水平的方法，所述方法包含：向所述犬施用治疗有效量的包含犬IgG恒定域的抗体，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。在一个示例性实施例中，所述抗体在范围介于约1个月至约7个月的时间段内保持所述抗体于所述犬体内的治疗性血清水平。

本发明的其它特征和优势将自以下详细描述实例和图式变得显而易知。然而，应理解，详细描述和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为本领域技术人员将由此详细描述而对本发明的精神和范围内的各种改变和修正变得显而易知。

附图说明

专利或申请文件含有至少一个彩制图式。在申请且支付必要费用后，专利局将提供附有彩图的此专利或专利申请公开案的拷贝。

图1展示IgG的域结构。在CH3域中进行Fc突变N434H以通过在pH6下增加针对FcRn的亲和力来延长IgG半衰期。

图2A展示具有N434H的犬IgGB和野生型(WT)犬IgGB的氨基酸序列。

图2B展示野生型(WT)人类IgG1 WT犬1gGA、WT犬IgGB、WT犬IgGC和WT犬IgGD的氨基酸序列的比对。氨基酸残基根据如Kabat中的EU索引进行编号。CH1、铰链、CH2和CH3氨基酸残基分别呈红色、紫色、蓝色和绿色。

图2C展示WT IgGB 65的Fc核苷酸序列。

图3展示在56天时间段内测量的4只犬(2只雄性(01M、02M)和2只雌性(03F、04F))在单次注射2mg/kg之后，其体内的WT mAb1 IgG的对应血清浓度。

图4展示在56天时间段内测量的4只犬(2只雄性(17M、18M)和2只雌性(19F、20F))在单次注射2mg/kg之后，其体内的N434H mAb1 IgG的对应血清浓度。

图5展示在98天时间段内测量的8只犬(4只雄性(H03433、H03434、H03435、H03436)和4只雌性(H03453、H03454、H03455、H03456)在三次注射2mg/kg(SC/SC/IV)之后，其体内的WT mAb2 IgG的对应血清浓度。

图6展示在98天时间段内测量的8只犬(4只雄性(H03433、H03434、H03435、H03436)和4只雌性(H03453、H03454、H03455和H03456)在三次注射2mg/kg(SC/SC/IV)之后，其体内的N434H mAb2 IgG的对应血清浓度。

图7展示在单次4mg/kg皮下施用之后，犬体内的ZTS-00008183的血清概况。各颜色表示不同的动物识别号。

图8展示在单次4mg/kg皮下施用之后，犬体内的ZTS-00008183的平均血清概况。

图9展示处理组随时间点(3至5个月)的最小平方均值曲线图。α水平：第84天＝0.07085，第112天＝0.04575，第140天＝0.04352。

图10展示处理组随时间点(3至5个月)的最小平方均值和百分比变化曲线图。均值变化％＝100×[均值(T01)-均值(T02)/均值(T01)]。

图11展示所有时间点的瘙痒评分盒状图。T01＝安慰剂0mg/kg，T02＝ZTS-00008183 4mg/kg。

图12展示处理组在所有时间点的算术均值瘙痒评分图。误差杠表示标准误差。

图13展示处理组在所有时间点的算术均值瘙痒评分图和百分比变化。均值变化％＝100×[均值(T01)-均值(T0X)/均值(T01)]，X＝2、3。

序列表的简要说明

SEQ ID NO.:1为具有N434H突变的突变犬IgGB恒定域的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:2为野生型犬IgGB恒定域的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:3为经密码子最佳化的野生型犬IgG恒定域(IgGB_65_WT)的核酸序列；

SEQ ID NO.:4为野生型犬IgGB恒定域的核酸序列；

SEQ ID NO.:5为IgGB CH1域位置118-215的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:6为IgGB铰链域位置217-230的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:7为野生型IgGB CH2域位置231-340的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:8为野生型IgGBCH3域位置341-447的氨基酸序列；

SEQ ID NO.:9为IgGB CH1域的核酸序列；

SEQ ID NO.:10为IgGB铰链域的核酸序列；

SEQ ID NO.:11为野生型IgGB CH2域的核酸序列；

SEQ ID NO.:12为野生型IgGBCH3域的核酸序列；

SEQ ID NO:13为抗IL31抗体的可变重链CDR1，在本文中称为11E12-VH-CDR1；

SEQ ID NO:14为抗IL31抗体的可变重链CDR1，在本文中称为34D03-VH-CDR1；

SEQ ID NO:15为抗IL31抗体的可变重链CDR2，在本文中称为11E12-VH-CDR2；

SEQ ID NO:16为抗IL31抗体的可变重链CDR2，在本文中称为34D03-VH-CDR2；

SEQ ID NO:17为抗IL31抗体的可变重链CDR3，在本文中称为11E12-VH-CDR3；

SEQ ID NO:18为抗IL31抗体的可变重链CDR3；在本文中称为34D03-VH-CDR3；

SEQ ID NO:19为抗IL31抗体的可变轻链CDR1，在本文中称为11E12-VL-CDR1；

SEQ ID NO:20为抗IL31抗体的可变轻链CDR1，在本文中称为34D03-VL-CDR1；

SEQ ID NO:21为抗IL31抗体的可变轻链CDR2，在本文中称为11E12-VL-CDR2；

SEQ ID NO:22为抗IL31抗体的可变轻链CDR2，在本文中称为34D03-VL-CDR2；

SEQ ID NO:23为抗IL31抗体的可变轻链CDR3，在本文中称为11E12-VL-CDR3；

SEQ ID NO:24为抗IL31抗体的可变轻链CDR3，在本文中称为34D03-VL-CDR3；

SEQ ID NO:25为抗IL31抗体的可变轻链序列，在本文中称为MU-11E12-VL；

SEQ ID NO:26为抗IL31抗体的可变轻链序列，在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-FW2；

SEQ ID NO:27为抗IL31抗体的可变轻链序列，在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-13；

SEQ ID NO:28为抗IL31抗体的可变轻链序列，在本文中称为MU-34D03-VL；

SEQ ID NO:29为抗IL31抗体的可变轻链序列，在本文中称为CAN-34D03-VL-998-1；

SEQ ID NO:30为抗IL31抗体的可变重链序列，在本文中称为MU-11E12-VH；

SEQ ID NO:31为抗IL31抗体的可变重链序列，在本文中称为CAN-11E12-VH-415-1；

SEQ ID NO:32为抗IL31抗体的可变重链序列，在本文中称为MU-34D03-VH；

SEQ ID NO:33为抗IL31抗体的可变重链序列，在本文中称为CAN-34D03-VH-568-1；

SEQ ID NO:34为与Genbank登录号C7G0W1相对应的氨基酸序列且对应于犬IL-31全长蛋白质；

SEQ ID NO:35为与Genbank登录号C7G0W1相对应的核苷酸序列且对应于编码犬IL-31全长蛋白质的核苷酸序列；

SEQ ID NO:36为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为MU-11E12-VL)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:37为编码抗IL31抗体的可变重链序列(本文中称为MU-11E12-VH)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:38为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为MU-34D03-VL)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:39为编码抗IL31抗体的可变重链序列(本文中称为MU-34D03-VH)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:40为本文中称为HC-64的犬野生型重链恒定区的氨基酸序列(Genbank登录号AF354264)；

SEQ ID NO:41为编码本文中称为HC-64的犬野生型重链恒定区的核苷酸序列(Genbank登录号AF354264)；

SEQ ID NO:42为本文中称为HC-65的犬野生型重链恒定区的氨基酸序列(Genbank登录号AF354265)；

SEQ ID NO:43为编码本文中称为HC-65的犬野生型重链恒定区的核苷酸序列(Genbank登录号AF354265)；

SEQ ID NO:44为本文中称为κ的犬轻链恒定区的氨基酸序列(Genbank登录号XP_532962)；

SEQ ID NO:45为编码称为κ的犬轻链恒定区的核苷酸序列(Genbank登录号XP_532962)；

SEQ ID NO:46为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为CAN-34D03-VL-998-1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:47为编码抗IL31抗体的可变重链序列(本文中称为CAN-34D03-VH-568-1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:48为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-FW2)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:49为编码抗IL31抗体的可变重链序列(本文中称为CAN-11E12-VH-415-1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:50为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-13)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:51为抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为CAN-11E12_VL_cUn_1)；

SEQ ID NO:52为编码抗IL31抗体的可变轻链序列(本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO:53对应于用于大肠杆菌(E.coli)表达的犬IL-31全长构建体的氨基酸序列；

SEQ ID NO:54为与用于大肠杆菌表达的犬IL-31全长构建体相对应的核苷酸序列；

SEQ ID NO:55为编码本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:56为编码本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变重链序列的氨基酸序列；

SEQ ID NO:57为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:58为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:59为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:60为编码本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:61为编码本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变轻链序列的氨基酸序列；

SEQ ID NO:62为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:63为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:64为本文中称为ZTS-841的抗NGF抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:65为IgGB位置341-447的突变CH3域的氨基酸序列；

SEQ ID NO:66为IgGB的CH3域内的突变区的氨基酸序列；

SEQ ID NO:67为本文中称为ZTS-00008183的抗IL31抗体的轻链的核酸序列；

SEQ ID NO:68为本文中称为ZTS-00008183的抗IL31抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:69为本文中称为ZTS-00008183的抗IL31抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:70为本文中称为ZTS-00008183的抗IL31抗体的重链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:71为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:72为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变重链CDR2。

SEQ ID NO:73为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:74为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:75为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:76为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:77为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的重链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:78为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:79为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:80为本文中称为ZTS-426的抗TGFβ1,3抗体的轻链的核酸序列；

SEQ ID NO:81为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:82为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:83为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:84为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:85为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:86为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:87为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的重链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:88为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:89为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:90为本文中称为ZTS-501的抗TGFβ1抗体的轻链的核酸序列；

SEQ ID NO:91为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:92为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:93为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:94为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:95为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:96为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:97为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:98为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:99为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:100为本文中称为ZTS-4155的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的核酸序列；

SEQ ID NO:101为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:102为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:103为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:104为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:105为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:106为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:107为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:108为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:109为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:110为本文中称为ZTS-122的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的核酸序列；

SEQ ID NO:111为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:112为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:113为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:114为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:115为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:116为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:117为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:118为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的重链的核酸序列；

SEQ ID NO:119为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的氨基酸序列；

SEQ ID NO:120为本文中称为ZTS-207的抗TGFβ1,2,3抗体的轻链的核酸序列。

具体实施方式

参考形成本发明的一部分的以下详细描述，可更容易地理解本发明的主题。应理解，本发明不限于本文所描述和/或展示的具体产物、方法、条件或参数，且本文所用的术语仅借助于实例出于描述特定实施例的目的，且不意图限制任何所要求的本发明。

除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有一般技术者通常所理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数形式且复数术语应包括单数形式。

如在本发明中使用，除非另外指明，否则以下术语和缩写应理解具有以下含义。

定义

在本发明中，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数个参考物，且特定数值的引用包括至少所述特定值。因此，举例来说，提及“分子(amolecule)”或“化合物(a compound)”是提及一种或多种此类分子或化合物和本领域技术人员已知的其等效物等。如本文所用，术语“复数个(种)”意谓多于一个(种)。当表示值范围时，另一实施例包括自一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过在前面使用“约”以近似值表示值时，应理解，所述特定值形成另一实施例。所有范围均为包括性和可组合的。

在说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中的氨基酸残基的编号是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的Eu索引的编号。“如Kabat中的Eu索引”是指IgG抗体的残基编号且反映于本文中的图2中。

术语“经分离”在结合核酸使用时为自其天然来源中通常与其相关的至少一种污染物核酸中鉴别且分离出的核酸。经分离的核酸可以与自然界中发现的形式或环境不同的形式或环境存在。因此，经分离的核酸分子区别于在天然细胞中存在的核酸分子。经分离的核酸分子包括细胞中含有的通常表达本文中所编码的多肽的核酸分子，其中例如所述核酸分子处于与天然细胞的质粒或染色体位置不同的质粒或染色体位置。经分离的核酸可以单股或双股形式存在。当利用经分离的核酸分子表达蛋白质时，寡核苷酸或聚核苷酸将含有最小有义股或编码股，但可含有有义股和反义股两者(即，可为双股)。

当核酸分子与另一核酸分子处于功能关系时，所述核酸分子经“可操作地连接(operably linked/operably attached)”。举例来说，如果启动子或强化子影响序列的转录，则所述启动子或强化子是可操作地连接至核酸的编码序列；或如果核糖体结合位点经定位以促进翻译，则核糖体结合位点是可操作地连接至核酸的编码序列。如果编码变异Fc区的核酸分子经定位而使得经表达的融合蛋白包含与变异Fc区多肽上游或下游邻接的异源蛋白质或其功能片段，则其可操作地连接于编码异源蛋白质(即，当其存在于自然界中时不包含Fc区的蛋白质或其功能片段)的核酸分子；异源蛋白质可紧邻变异Fc区多肽或可通过任何长度和组成的连接子序列与其间隔开。同样地，当多肽(在本文中与“蛋白质”同义地使用)分子与另一多肽处于功能关系时，所述多肽分子经“可操作地连接”。

如本文中所使用，术语“功能片段”参考多肽或蛋白质(例如，变异Fc区或单克隆抗体)时，是指保留全长多肽的至少一个功能的所述蛋白质片段。片段的大小可介于六个氨基酸至全长多肽的全部氨基酸序列减一个氨基酸的范围内。本发明的变异Fc区多肽的功能片段保留至少一种如本文所定义的“氨基酸取代”。变异Fc区多肽的功能片段保留本领域中已知的与Fc区相关的至少一个功能(例如，ADCC、CDC、Fc受体结合、Clq结合、细胞表面受体的下调或可例如增加与其可操作连接的多肽的活体内或活体外半衰期)。

术语“经纯化”或“纯化”是指自样品实质性移除至少一种污染物。举例来说，抗原特异性抗体可通过完全或实质性移除(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％，或更优选至少96％、97％、98％或99％)至少一种污染性非免疫球蛋白蛋白质来纯化；其也可通过移除并未结合于相同抗原的免疫球蛋白蛋白质来纯化。移除非免疫球蛋白蛋白质和/或移除并未结合特定抗原的免疫球蛋白使得样品中抗原特异性免疫球蛋白的百分比增加。在另一实施例中，细菌性宿主细胞中表达的多肽(例如，免疫球蛋白)通过完全或实质性移除宿主细胞蛋白质来纯化；从而增加样品中多肽的百分比。

术语“天然的”在指代多肽(例如，Fc区)时在本文中用以指示所述多肽具有由自然界中通常存在的多肽或其天然存在的多晶型的氨基酸序列组成的氨基酸序列。天然多肽(例如，天然Fc区)可通过重组方式制备或可自天然存在源分离。

如本文所使用，术语“表达载体”是指含有所需编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列的重组DNA分子。

如本文中所使用，术语“宿主细胞”是指位于活体外或原位或活体内的任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞，例如大肠杆菌；CHO细胞、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)。

如本文中所使用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C端区。“Fc区”可为天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的一般可接受的边界可不同，但犬IgG重链Fc区通常被限定以例如自位置231的氨基酸残基延伸至其羧基端。在一些实施例中，变体仅包含Fc区的部分且可包括或不包括羧基端。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域：CH2和CH3。在一些实施例中，涵盖具有一个或多个恒定域的变体。在其它实施例中，涵盖不含此类恒定域(或仅含此类恒定域的部分)的变体。

犬IgG Fc区的“CH2域”通常自例如约氨基酸231延伸至约氨基酸340(参见图2B)。CH2域的独特的处在于其不与另一域紧密配对。两个N连接的分支链碳水化合物链插入于完整天然IgG分子的两个CH2域之间。

犬IgG Fc区的“CH3域”通常为Fc区延伸中的CH2域的C端残基延伸段，例如自约氨基酸残基341至约氨基酸残基447(参见图2B)。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。相对于包含天然Fc区或变体的亲本Fc区的多肽，包含本发明的变异Fc区的多肽的至少一种效应功能可增强或减弱。效应功能的实例包括(但不限于)：Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应功能可能需要可操作地连接于结合域(例如抗体可变域)的Fc区且可使用各种分析(例如，Fc结合分析、ADCC分析、CDC分析、全血样品或分级分离的血液样品的目标细胞消耗等)来评估。

“天然序列Fc区”或“野生型Fc区”是指与在自然界中通常发现的Fc区的氨基酸序列具有一致性的氨基酸序列。示例性天然序列犬Fc区展示于图2中且包括犬IgGB_65Fc区的天然序列。

“变异Fc区”包含与天然序列Fc区(或其片段)的氨基酸序列相差至少一个如本文所定义的“氨基酸取代”的氨基酸序列。在优选实施例中，变异Fc区相比于天然序列Fc区或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，优选地在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一个替代实施例中，变异Fc区可根据本文中所公开的方法产生且此变异Fc区可与所选异源多肽(例如抗体可变域或非抗体多肽(例如，受体或配体的结合域))融合。

如本文中所使用，在多肽的上下文中的术语“衍生物”是指包含已通过引入氨基酸残基取代而变异的氨基酸序列的多肽。如本文中所使用，术语“衍生物”还指已通过任何类型的分子与多肽的共价附接经修饰的多肽。举例来说(但不以限制方式)，抗体可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白连接等来修饰。衍生物多肽可通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰来制备，所述技术包括(但不限于)特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物多肽具有与衍生其的多肽类似或相同的功能。应了解包含本发明的变异Fc区的多肽可为如本文所定义的衍生物，优选地，衍生化发生在Fc区内。

如本文中所使用，关于多肽(例如，Fc区或单克隆抗体)的“大体上的犬来源”指示所述多肽具有与天然犬氨基多肽的氨基酸序列至少80％、至少85％、更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或甚至更优选至少95％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合至Fc区(例如，抗体的Fc区)的受体。优选FcR是天然序列FcR。此外，优选FcR为结合IgG抗体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体(包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式)的FcR。另一优选FcR包括新生受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。本文中的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括将来鉴别的FcR。

短语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如，非特异性)(例如，自然杀手(“NK”)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别目标细胞上的经结合抗体且随后使得目标细胞裂解。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。

如本文中所使用，短语“效应细胞”是指表达一种或多种FcR且执行效应功能的白血球(优选为犬)。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII且执行ADCC效应功能。介导ADCC的白血球的实例包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可自天然来源(例如自血液或PBMC)分离。

具有“变化”FcRn结合亲和力的变异多肽为在pH 6.0下测量时，与变体的亲本多肽或包含天然Fc区的多肽相比，具有增强(即，增加的、更大的或更高的)或减弱(即降低的、更小的或更低的)FcRn结合亲和力的多肽。显示与FcRn的结合增加或结合亲和力增加的变异多肽以相比于亲本多肽更大的亲和力结合FcRn。显示与FcRn的结合减小或结合亲和力减小的变异多肽以相比于其亲本多肽更低的亲和力结合FcRn。显示与FcRn的结合减小的此类变体可具有与FcRn很少或没有可观的结合，例如与亲本多肽相比，0％至20％与FcRn的结合。与其亲本多肽相比，以“增强亲和力”结合FcRn的变异多肽为当结合分析中变异多肽和亲本多肽的量基本上相同，且所有其它条件一致时，以比亲本多肽更高的结合亲和力结合FcRn的多肽。举例来说，具有增强FcRn结合亲和力的变异多肽可显示相比于亲本多肽，FcRn结合亲和力增加约1.10倍至约100倍(更通常约1.2倍至约50倍)，其中例如在ELISA分析或一般本领域技术人员可用的其它方法中测定FcRn结合亲和力。

如本文中所使用，“氨基酸取代”是指给定氨基酸序列中的至少一个现有氨基酸残基经另一不同“置换”氨基酸残基置换。所述或所述置换残基可为“天然存在的氨基酸残基”(即，由遗传密码编码)且选自由以下组成的群：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。本文中的氨基酸取代定义还涵盖一个或多个非天然存在的氨基酸残基取代。“非天然存在的氨基酸残基”是指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基以外的能够共价结合多肽链中的一个或多个相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例为正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等人，Meth.Enzym.202:301-336(1991)中所述的那些。

术语“分析信号”是指检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法的输出，包括(但不限于)比色分析的吸光度测量、荧光强度或衰变数/分钟。分析格式可包括ELISA、facs或其它方法。“分析信号”的变化可反映细胞存活率的变化和/或动力学解离速率、动力学缔合速率或两者的变化。“更高分析信号”是指所测量的大于另一数值的输出数值(例如，在ELISA分析中，与亲本多肽相比，变体可以具有更高(更大)的测量数值)。“更低”分析信号是指所测量的小于另一数值的输出数值(例如，在ELISA分析中，与亲本多肽相比，变体可以具有更低的(较小)测量数值)。

术语“结合亲和力”是指与各Fc受体-Fc结合相互作用相关的平衡解离常数(以浓度单位表述)。结合亲和力直接与动力学解离速率(通常以倒数时间单位报告，例如秒^-1)除以动力学缔合速率(通常以每单位时间的浓度单位报告，例如摩尔/秒)的比率相关。一般而言，不可能明确地表明平衡解离常数的变化是否是由于缔合速率、解离速率或两者的差异而导致，除非这些参数中的每一者以实验方式经测定(例如，通过BIACORE或SAPIDYNE测量)。

如本文中所使用，术语“铰链区”是指犬IgG延伸中的氨基酸延伸，例如犬IgG的位置216至位置230。其它IgG同型的铰链区可通过将形成重链间二硫(S-S)键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG序列对齐。

“Clq”为包括针对免疫球蛋白的Fc区的结合位点的多肽。Clq连同两种丝氨酸蛋白酶Clr和Cls形成复合体Cl(CDC路径的第一组分)。

如本文中所使用，术语“抗体”可与“免疫球蛋白”互换使用或“Ig”以最广泛的意义使用且特定地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现所需生物活性或功能活性。本发明和术语“抗体”还涵盖包含来源于不同物种的部分的单链抗体和嵌合、犬或犬类化抗体，以及嵌合或CDR移植的单链抗体等。这些抗体的各种部分可通过常规技术化学地、合成地连接在一起或可使用基因工程改造技术制备为连续蛋白。举例来说，编码嵌合或犬类化链的核酸可表达以产生连续蛋白质。参见例如美国专利第4,816,567号；美国专利第4,816,397号；WO 86/01533；美国专利第5,225,539号；和美国专利第5,585,089号和第5,698,762号。关于灵长类化抗体还参见Newman,R.等人，BioTechnology,10:1455-1460,1993，且关于单链抗体，参见Ladner等人，美国专利第4,946,778号和Bird,R.E.等人，Science,242:423-426,1988。应了解，包含Fc区(或其部分)的抗体的所有形式涵盖于本文中的术语“抗体”中。此外，抗体可用可检测标记来标记，固定于固相上和/或根据本领域中已知的方法与异源化合物(例如，酶或毒素)共轭。

如本文中所使用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括(但不限于)直链抗体；单链抗体分子；Fc或Fc的肽、Fab和Fab片段，和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选地保留铰链的至少一部分且任选地IgG重链的CH1区。在其它优选实施例中，抗体片段包含CH2区的至少一部分或整个CH2区。

如本文中所使用，当术语“功能片段”关于单克隆抗体使用时意图指代单克隆抗体仍保留功能活性的部分。功能活性可为例如抗原结合活性或特异性、受体结合活性或特异性、效应功能活性等。单克隆抗体功能片段包括例如单独的重链或轻链和其片段，例如VL、VH和Fd；单价片段，例如Fv、Fab和Fab'；二价片段，例如F(ab')2；单链Fv(scFv)；和Fc片段。此类术语描述于例如Harlowe和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(1989)；Molec.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference(Myers,R.A.(编),New York:VCH Publisher,Inc.)；Huston等人,Cell Biophysics,22:189-224(1993)；Pluckthun和Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)和Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,第二版,Wiley-Liss,Inc.,New York,N.Y.(1990)中。术语功能片段意图包括例如通过蛋白酶消化或人类单克隆抗体的还原和通过本领域技术人员已知的重组DNA方法产生的片段。

如本文中所使用，术语“片段”是指包含另一多肽的氨基酸序列的至少5、15、20、25、40、50、70、90、100或更多个相邻氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在一优选实施例中，多肽的片段保留全长多肽的至少一个功能。

如本文中所使用，术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体为由嵌合重链经由与嵌合轻链的二硫桥键缔合形成的二聚体。二价嵌合抗体为由两个重链-轻链二聚体经由至少一个二硫桥键缔合形成的四聚体。用于犬的抗体的嵌合重链包含来源于非犬抗体的重链的与犬重链恒定区的至少一部分，例如CH1或CH2连接的抗原结合区。用于犬的抗体的嵌合轻链包含来源于非犬抗体的轻链的与犬轻链恒定区(CL)的至少一部分连接的抗原结合区。具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合重链和轻链的抗体、片段或衍生物还可通过个别多肽链根据已知方法步骤的适当缔合来制备。通过此途径，将表达嵌合重链的宿主与表达嵌合轻链的宿主单独培养，且免疫球蛋白链经单独地回收且接着进行缔合。替代地，宿主可进行共培养且使各链在培养基中自发地缔合，接着回收经组装的免疫球蛋白或片段，或重链和轻链均可在相同宿主细胞中表达。用于产生嵌合抗体的方法为本领域中熟知的(参见例如美国专利第6,284,471号；第5,807,715号；第4,816,567号；和第4,816,397号)。

如本文中所使用，非犬(例如鼠类)抗体的“犬类化”形式(即，犬类化抗体)为含有来源于非犬免疫球蛋白的最少序列或没有来源于非犬免疫球蛋白的序列的抗体。在极大程度上，犬类化抗体是犬免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基经来自例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔、人类或非人类灵长类动物的非犬物种(供者抗体)的高变区的残基置换。在一些情况下，犬免疫球蛋白的构架区(FR)残基经相应的非犬残基置换。此外，犬类化抗体可包含在接受者抗体或供者抗体中未发现的残基。通常进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，犬类化抗体将包含基本上全部至少一个，且通常两个可变域，其中全部或基本上全部高变环(CDR)对应于非犬免疫球蛋白的那些高变环且全部或基本上全部FR残基为犬免疫球蛋白序列的那些FR残基。犬类化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，通常犬免疫球蛋白的至少一部分。

如本文中所使用，术语“免疫粘附素”表示将异源“粘附素”蛋白质(例如，受体、配体或酶)的结合域与免疫球蛋白恒定域组合的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包含除抗体(即，为“异源”)的抗原识别和结合位点(抗原组合位点)以外的粘附素氨基酸序列以所需结合特异性与免疫球蛋白恒定域序列的融合。

如本文中所使用，术语“配体结合域”是指任何天然受体或保持对应天然受体的至少一种定性配体结合能力的其任何区或衍生物。在某些实施例中，受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族成员同源的胞外域的细胞表面多肽。不为免疫球蛋白超基因家族成员，但此定义仍然特定涵盖的其它受体为细胞因子的受体，并且确切地说具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)(造血素和神经生长因子受体超家族的成员)，和细胞粘附分子(例如，E-选择素、L-选择素和P-选择素)。

如本文中所使用，术语“受体结合域”是指受体的任何天然配体，包括例如细胞粘附分子，或此类天然配体的保持对应天然配体的至少一种定性受体结合能力的任何区或衍生物。

如本文中所使用，“经分离”多肽为自其天然环境的组分鉴别和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分为将干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施例中，经分离多肽经纯化(1)至大于95重量％的多肽，如通过洛瑞法(Lowry method)所测定，且更优选大于99重量％，(2)在一定程度上通过使用旋转杯式测序仪(spinning cup sequenator)足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列，或(3)通过SDS-page在还原或非还原条件下使用库马斯蓝或银染色(Coomassieblue or silver stain)达至均质性。经分离的多肽包括原位存在于重组细胞内的多肽，因为多肽的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常经分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文中所使用，术语“病症”和“疾病”可互换地使用以指代将得益于用变异多肽(包含本发明的变异Fc区的多肽)治疗的任何病状，包括慢性和急性病症或疾病(例如，使患者易患特定病症的病理学病状)。

如本文中所使用，术语“受体”是指能够结合至少一种配体的多肽。优选受体为具有胞外配体结合域和任选的其它域(例如，跨膜域、胞内域和/或膜锚)的细胞表面或可溶性受体。在本文中所描述的分析中评估的受体可为完整受体或其片段或衍生物(例如，包含与一种或多种异源多肽融合的受体的结合域的融合蛋白)。此外，用于评估受体的结合性质的受体可存在于细胞中或经分离且任选地涂布于分析培养板或某一其它固相上或经直接标记且用作探针。

犬野生型IgG

犬IgG为本领域中熟知的且充分描述于例如Bergeron等人,2014,Vet ImmunolImmunopathol.,第157(1-2)卷,第31-41页中。在一个实施例中，犬IgG为IgG_A。在另一实施例中，犬IgG为IgG_B。在又一实施例中，犬IgG为IgG_C。在另一实施例中，犬IgG为IgG_D。在一个特定实施例中，犬IgG为IgG_B_65。

IgG_A、IgG_B、IgG_C和IgG_D的氨基酸和核酸序列在本领域中也是熟知的。

在一个实例中，本发明的IgG包含恒定域，例如CH1、CH2或CH3域，或其组合。在另一实施例中，本发明的恒定域包含Fc区，包括例如CH2或CH3域，或其组合。

在一个特定实例中，野生型恒定域包含SEQ ID NO.:2中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型IgG恒定域是SEQ ID NO.:2的同系物、变体、异构体或功能片段，但不含位置434的任何突变。每种可能性代表本发明的对应实施例。

IgG恒定域还包括具有与重链和/或轻链的氨基酸序列大体上类似的氨基酸序列的多肽。大体上相同的氨基酸序列在本文所定义为与比较氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的序列，如通过根据Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988)的FASTA搜索法所测定。

本发明还包括本文中所描述的编码IgG或其部分的核酸分子。在一个实施例中，核酸可编码包含例如CH1、CH2、CH3区或其组合的抗体重链。在另一实施例中，核酸可编码包含例如VH区中的任一者或其部分，或VH CDR中的任一者，包括其任何变体的抗体重链。本发明还包括编码抗体轻链的核酸分子，所述抗体轻链包含例如CL区中的任一者或其部分、VL区中的任一者或其部分，或VL CDR中的任一者，包括其任何变体。在某些实施例中，核酸编码重链和轻链两者或其部分。

SEQ ID NO.:2中阐述的野生型恒定域的氨基酸序列由SEQ ID NO.:4中阐述的核酸序列编码。

经修饰的犬IgG

本申请的本发明人已发现用另一氨基酸取代位置434的氨基酸残基天冬酰胺(Asn或N)出人意料地且未预期地增强针对FcRn的亲和力，且延长IgG的半衰期。如本文中所使用，术语位置434是指根据如Kabat中的EU索引编号的位置(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。

因此，在一个实施例中，本发明提供一种经修饰的IgG，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。位置434的天冬酰胺可经任何其它氨基酸取代。举例来说，位置434的天冬酰胺可经以下取代：组氨酸(即，N434H)、丝氨酸(即，N434S)、丙氨酸(即，N434A)、苯丙氨酸(即，N434F)、甘氨酸(即，N434G)、异亮氨酸(即，N434I)、赖氨酸(即，N434K)、亮氨酸(即，N434L)、甲硫氨酸(即，N434M)、谷氨酰胺(即，N434Q)、精氨酸(即，N434R)、苏氨酸(即，N434T)、缬氨酸(即，N434V)、色氨酸(即，N434W)、酪氨酸(即，N434Y)、半胱氨酸(即，N434C)、天冬氨酸(即，N434D)、谷氨酸(即，N434E)或脯氨酸(即，N434P)。在一个特定实施例中，取代是经组氨酸取代(即，N434H)。

在一个特定实例中，本发明的突变恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变IgG恒定域是SEQ ID NO.:1的同系物、变体、异构体或功能片段，但在位置434处具有突变。各可能性代表本发明的对应实施例。

SEQ ID NO.:1中阐述的突变恒定域的氨基酸序列由其对应突变核酸序列，例如SEQ ID NO.:4中阐述的核酸序列的突变形式编码。在一些实施例中，对应于突变形式的位置434的核酸密码子包含CAC或CAT。

在一些实施例中，本发明的突变恒定域包含SEQ ID NO.:65或66中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变IgG恒定域是SEQ ID NO.:65或66的同系物、变体、异构体或功能片段，但在位置434处具有突变。各可能性代表本发明的对应实施例。

SEQ ID NO.:65或66中所阐述的突变恒定域的氨基酸序列由其对应突变核酸序列编码。

在一个方面中，本发明的经修饰的IgG提供范围介于约10天至约35天时间段的半衰期。在一个实施例中，本发明的经修饰的IgG提供约10、12、15、17、19、20、23、26、28、30、33或35天的半衰期。在一个特定实施例中，本发明的经修饰的IgG提供大于30天的半衰期。

在一个方面中，本发明的经修饰的IgG保持范围介于约1个月至约7个月时间段的治疗性血清水平。在一个实施例中，本发明的经修饰的IgG保持约7、14、28、56、84、112、140、168或210天的治疗性血清水平。在一个特定实施例中，本发明的经修饰的IgG保持大于3个月的治疗性血清水平。

用于制备本发明的抗体分子的方法

用于制备抗体分子的方法是本领域中熟知的且充分描述于美国专利8,394,925；8,088,376；8,546,543；10,336,818；和9,803,023和美国专利申请公开案20060067930中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。可使用本领域技术人员已知的任何适合的方法、工艺或技术。具有本发明的变异Fc区的抗体分子可根据本领域中熟知的方法来产生。在一些实施例中，变异Fc区可与所选异源多肽，例如抗体可变域或受体或配体的结合域融合。

随着分子生物学和重组技术方法的出现，本领域技术人员可通过重组方式产生抗体和抗体样分子且从而产生编码在抗体的多肽结构中发现的特异性氨基酸序列的基因序列。此类抗体可通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或通过直接合成所述多肽链和组装合成链以形成针对特定抗原决定基和抗原决定子具有亲和力的活性四聚(H2L2)结构来制备。这允许准备产生具有来自不同物种和来源的中和抗体的序列特征的抗体。

无论抗体的来源如何，或其如何以重组方式构建，或其如何在活体外或活体内使用转殖基因动物(实验室或商业规模的大细胞培养物)、使用转殖基因植物，或通过在工艺的任何阶段不采用活生物体而直接进行化学合成来合成，所有抗体均具有整体类似的3维结构。此结构通常以H2L2形式提供且指代抗体通常包含两条轻(L)氨基酸链和2条重(H)氨基酸链的事实。两条链具有能够与结构上互补的抗原目标相互作用的区。与所述目标相互作用的区称为“可变”或“V”区且其特征在于具有不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列不同。H或L链的可变区含有能够特异性结合于抗原目标的氨基酸序列。

如本文中所使用，术语“抗原结合区”是指抗体分子的含有与抗原相互作用且向抗体赋予其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包括保持抗原结合残基的恰当构形所必需的“构架”氨基酸残基。在提供抗原结合区的H或L链的可变区内为称为“高变”的小序列，因为其在不同特异性抗体之间具有极高变异性。此类高变区也称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区造成抗体针对特定抗原决定子结构的基本特异性。

CDR表示可变区内的非相邻氨基酸延伸，但与物种无关，已发现这些重要氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置在可变链的氨基酸序列内具有类似位置。所有抗体的可变重链和轻链各自具有三个彼此不相邻的CDR区。在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即，高度保守性)和可变区，且在后者中存在CDR，且所谓的“构架区”由在重链或轻链的可变区内但在CDR的外的氨基酸序列构成。

本发明进一步提供包括上文所描述的核酸中的至少一者的载体。因为遗传密码是简并的，所以可使用超过一个密码子编码特定氨基酸。使用遗传密码，可鉴别出一种或多种不同核苷酸序列，其中的每一者将能够编码氨基酸。特定寡核苷酸实际上将构成实际编码序列的机率可通过考虑异常碱基配对关系和在表达抗体或部分的真核或原核细胞中实际上使用(编码特定氨基酸的)特定密码子的频率来估算。Lathe等人，183J.Molec.Biol.1-12(1985)公开了此类“密码子使用规则”。使用Lathe的“密码子使用规则”，可鉴别出含有理论上能够编码犬IgG序列的“最可能”核苷酸序列的单核苷酸序列或核苷酸序列的集合。还预期编码用于本发明的区的抗体还可通过使用产生本文中所描述的抗体和肽的变体的标准分子生物技术改变现有抗体基因来提供。此类变体包括(但不限于)抗体或肽的氨基酸序列的缺失、添加和取代。

举例来说，一类取代为保守性氨基酸取代。此类取代为犬抗体肽中的既定氨基酸经另一具有类似特征的氨基酸取代的那些取代。通常视为保守性取代的是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和lie中的一个置换成另一个；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn与Gin之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；芳族残基Phe、Tyr等中的置换。关于那些氨基酸变化有可能在表型上沉默的指南发现于Bowie等人，247Science 1306-10(1990)。

变异犬抗体或肽可能为全功能或可能在一个或多个活动中缺乏功能。全功能变体通常仅含有保守性变型或非关键残基或非关键区中的变型。功能变体还可含有使得功能无变化或不明显变化的类似氨基酸取代。替代地，此类取代可能在一定程度上对功能产生正面或负面影响。非功能性变体通常含有一种或多种非保守性氨基酸取代、缺失、插入、反转或截短，或关键残基或关键区中的取代、插入、反转或缺失。

可通过本领域中已知的方法(例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变)鉴别出功能必需的氨基酸。Cunningham等人，244Science 1081-85(1989)。后一程序在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变。随后测试所得突变分子的生物活性，例如抗原决定基结合或活体外ADCC活性。对于配体-受体结合关键的位点还可通过结构分析(例如结晶学)、核磁共振或光亲和性标记来测定。Smith等人，224J.Mol.Biol.899-904(1992)；de Vos等人,255Science306-12(1992)。

此外，多肽通常含有除二十种“天然存在”氨基酸以外的氨基酸。此外，包括末端氨基酸的许多氨基酸可通过天然过程(例如加工和其它翻译后修饰)或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。已知修饰包括(但不限于)乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、双硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、伽玛羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白质(例如精氨酰化)和泛蛋白化。此类修饰已为本领域技术人员所熟知且非常详细地描述于科学文献中。举例来说，几种特定地常见修饰糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的伽玛羧化、羟基化和ADP核糖基化描述于大多数基础本文中，例如Proteins-Structure and Molecular Properties(第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman&Co.,N.Y.,1993)。可获得关于此主题的许多详细的综述，例如根据Wold，Posttranslational Covalent Modification of proteins,1-12(Johnson编.,AcademicPress,N.Y.,1983)；Seifter等人.182Meth.Enzymol.626-46(1990)；和Rattan等人，663Ann.NY Acad.Sci.48-62(1992)。

在另一方面中，本发明提供抗体衍生物。抗体的“衍生物”含有通常并非蛋白质的一部分的其它化学部分。蛋白质的共价修饰包括于本发明的范围内。可通过使抗体的目标氨基酸残基与有机衍生剂反应将此类修饰引入分子中，所述有机衍生剂能够与所选侧链或末端残基反应。举例来说，用本领域中熟知的双官能性试剂进行衍生化适用于将抗体或片段与水不可溶载体基质或与其它巨分子载体交联。

衍生物还包括经标记的放射性标记的单克隆抗体。举例来说，放射性碘(251、1311)、碳(4C)、硫(35S)、铟、氚(H³)或类似者；单克隆抗体与生物素或抗生素蛋白、与酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、羧酸脱水酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸酯脱氢酶)的结合物；以及单克隆抗体与生物发光剂(例如荧光素酶)、静默变化剂(例如吖啶酯)或荧光剂(例如藻胆蛋白)的结合物。

本发明的另一衍生物双官能性抗体为通过组合两种单独抗体的识别两种不同抗原基团的部分而产生的双特异性抗体。此可通过交联或重组技术来实现。另外，各部分可添加至抗体或其部分中以增加活体内半衰期(例如，通过延长达至血流清除的时间)。此类技术包括例如添加PEG部分(也称为聚乙二醇化)，并且是本领域中熟知的。参见美国专利申请公开案第20030031671号。

在一些实施例中，将编码本发明抗体的核酸直接引入至宿主细胞中，且在足以诱导编码的抗体表达的条件下培育细胞。在本发明核酸已引入至细胞中之后，典型地通常在37℃下(有时在选择下)培育细胞约1至24小时的时间段以便允许抗体表达。在一个实施例中，抗体经分泌于细胞生长的培养基的上清液中。传统上，在鼠类杂交瘤株中产生呈天然分子形式的单克隆抗体。除了所述技术的外，本发明提供抗体的重组DNA表达。此允许在所选宿主物种中产生抗体，以及一系列抗体衍生物和融合蛋白质。

编码本发明的至少一种抗体、部分或多肽的核酸序列可根据常规技术与载体DNA重组，所述技术包括用于连接的平端式或交错端式末端、提供适当末端的限制酶消化、粘合末端视需要的填充、避免不当连接的碱性磷酸酶处理和利用适当连接酶的连接。此类操纵的技术通过例如Maniatis等人,MOLECULAR CLONING,LAB.MANUAL,(Cold Spring HarborLab.Press,NY,1982和1989)和上述的Ausubel等人，1993公开，可用于构建编码抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。

如果例如DNA的核酸分子含有含转录和翻译调节信息的核苷酸序列且此类序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列，则所述核酸分子称为“能够表达”所述多肽。可操作键联为其中试图表达的调节DNA序列和DNA序列以允许基因表达为可回收量的肽或抗体部分的方式连接的键联。基因表达所需的调节区的精确性质可能因不同生物体而不同，如类似技术中所熟知。参见例如上述的Sambrook等人，2001；上述的Ausubel等人，1993。

因此，本发明涵盖原核或真核细胞中的抗体或肽的表达。适合的宿主包括细菌或真核宿主，包括活体内或原位的细菌、酵母菌、昆虫、真菌、鸟类和哺乳动物细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟类或酵母菌来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可属于人类灵长类、仓鼠、兔、啮齿类动物、乳牛、猪绵羊、马、山羊、犬或猫来源。还可使用本领域中已知的任何其它适合的哺乳动物细胞。

在一个实施例中，本发明的核苷酸序列将并入至能够在接受者宿主中自发复制的质粒或病毒载体中。广泛多种载体中的任一者可用于此目的。参见例如上述的Ausubel等人，1993。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：可从不含有载体的那些接受者细胞中识别且选择出含有载体的接受者细胞的容易性；特定宿主中所需要的载体拷贝数目；和是否期望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。

本领域中已知的实例原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的那些质粒(例如pBR322、CoIE1、pSC101、pACYC 184、.pi.vX)。举例来说，此类质粒通过上述的Maniatis等人，1989；上述的Ausubel等人，1993公开。芽孢杆菌属质粒包括pC194、pC221、pT127等。此类质粒通过Gryczan公开于THE MOLEC BIO.OF THE BACILLI 307-329(Academic Press,NY,1982)中。适合的链霉菌属质粒包括p1J101(Kendall等人,169J.Bacteriol.4177-83(1987))和链霉菌属噬菌体，例如phLC31(Chater等人于SIXTHINT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO.45-54(Akademiai Kaido,Budapest,Hungary1986)中)。假单胞菌属质粒经综述于John等人,8Rev.Infect.Dis.693-704(1986)；lzaki,33Jpn.J.Bacteriol.729-42(1978)；和上述的Ausubel等人,1993中。

替代地，适用于表达编码抗体或肽的cDNA的基因表达元件包括(但不限于)(a)病毒转录启动子和其强化子元件，例如SV40早期启动子(Okayama等人,3Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳氏肉瘤病毒LTR(Gorman等人，79Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 6777(1982))和莫洛尼鼠类白血病病毒LTR(Grosschedl等人,41Cell 885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，例如衍生自SV40晚期区的那些(Okayarea等人，1983)；和(c)例如SV40中的聚腺苷酸化位点(Okayama等人，1983)。

可如Weidle等人,51Gene 21(1987)所描述，使用SV40早期启动子和其强化子、小鼠免疫球蛋白H链启动子强化子、SV40晚期区mRNA剪接、兔S-血球蛋白插入序列、免疫球蛋白和兔S-血球蛋白聚腺苷酸化位点和SV40聚腺苷酸化元件作为表达元件来表达免疫球蛋白cDNA基因。对于由部件cDNA、部件基因组DNA构成的免疫球蛋白基因(Whittle等人,1Protein Engin.499(1987))，转录启动子可为人类细胞巨大病毒，启动子强化子可为细胞巨大病毒和小鼠/人类免疫球蛋白，且mRNA剪接和聚腺苷酸化区可为天然染色体免疫球蛋白序列。

在一个实施例中，针对啮齿类动物细胞中的cDNA基因表达，转录启动子为病毒LTR序列，转录启动子强化子为小鼠免疫球蛋白重链强化子和病毒LTR强化子中的任一者或两者，剪接区含有大于31bp的内含子，且聚腺苷酸化和翻译终止区衍生自与将合成的免疫球蛋白链相对应的天然染色体序列。在其它实施例中，编码其它蛋白质的cDNA序列与上文列举的表达元件组合以实现哺乳动物细胞中的蛋白质表达。

各融合基因可组装于表达载体中或插入至表达载体中。能够表达免疫球蛋白链基因产物的接受者细胞随后仅传染有肽或H或L链编码基因，或共转染有H和L链基因。经转染的受体细胞在准许合并基因的表达的条件下培养且自培养物回收表达的免疫球蛋白链或完整抗体或片段。

在一个实施例中，编码肽或H和L链的融合基因或其部分经组装于个别表达载体中，所述表达载体随后用以共转染接受者细胞。替代地，编码H和L链的融合基因可组装于相同表达载体上。对于表达载体的转染和抗体的产生，接受者细胞系可为骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可合成、组装和分泌由经传染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白且具有使免疫球蛋白糖基化的机制。骨髓瘤细胞可在培养物中或在小鼠的腹腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可自腹水流体中获得。其它适合的接受者细胞包括淋巴细胞，例如犬或非犬来源的B淋巴球；犬或非犬来源的融合瘤细胞；或物种间的异种融合瘤细胞。

携载本发明的抗体构建体或多肽的表达载体可通过多种适合的方式中的任一者引入至适当宿主细胞中，所述方式包括生物化学方式，例如转化、转染、共轭、原生质粒融合、磷酸钙-沉淀和施用例如二乙氨基乙基(DEAE)聚葡糖的聚阳离子；和机械方式，例如电穿孔、直接显微注射和微弹轰击。Johnston等人，240Science 1538(1988)。

对于免疫球蛋白H和L链的产生，酵母菌可提供优于细菌的明显优势。酵母菌会进行包括糖基化的翻译后肽修饰。目前存在多种利用强启动子序列和高质粒拷贝数的重组DNA策略。所述强启动子序列和高质粒拷贝数可用于在酵母菌中产生所需蛋白质。酵母菌识别经克隆哺乳动物基因产物的前导序列且分泌携带前导序列的肽(即前肽)。Hitzman等人,11th Int'l Conference on Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。

可常规地评估酵母菌基因表达系统的肽、抗体、其片段和区的产生量、分泌量和稳定性。当酵母菌在富含葡萄糖的培养基中生长时，可利用一系列酵母菌基因表达系统中的任一者，所述系统并入了来自编码大量产生的糖分解酶的有效表达基因的启动子和终止元件。已知糖分解基因还可提供极有效的转录控制信号。举例来说，可利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可采取多种途径来评估用于在酵母菌中表达经克隆免疫球蛋白cDNA的最优表达质粒。参见第II卷DNA Cloning,45-66,(Glover编)IRL Press,Oxford,UK 1985)。

细菌菌株还可用作用以产生本发明所述的抗体分子或肽的宿主。将含有衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体结合这些细菌宿主使用。载体通常携带复制位点以及能够在转型细胞中提供表型选择的特定基因。可采用多种途径来评估用于在细菌中产生由经克隆免疫球蛋白cDNA编码的抗体、片段和区或抗体链的表达质粒(参见上述的Glover,1985；上述的Ausubel,1993；上述的Sambrook,2001；Colligan等人编.Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,NY,N.Y.(1994-2001)；Colligan等人编.Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.(1997-2001))。

宿主哺乳动物细胞可活体外或活体内生长。哺乳动物细胞提供针对免疫球蛋白蛋白分子的翻译后修饰，包括前导肽移除、H和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化和功能性抗体蛋白质的分泌。除了上文所描述的淋巴来源的细胞的外，可用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括纤维母细胞来源的细胞，例如Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCC CRL61)细胞。许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆肽H和L链基因(参见上述的Glover，1985)。可遵循不同途径以获得完全H2L2抗体。可能在相同细胞中共表达H和L链以实现H和L链胞内缔合和键联成完全四聚体H2L2抗体和/或肽。可通过在相同宿主中使用相同或不同的质粒来进行共表达。H和L链和/或肽的基因可置于相同质粒中，随后将所述质粒转染至细胞中，从而直接选择表达所述两条链的细胞。替代地，细胞可首先转染有编码一条链(例如L链)的质粒，接着使所得细胞系转染有含第二可选标记的H链质粒。经由任一途径产生肽和/或H2L2分子的细胞系可转染有编码其它肽拷贝、H、L或H加L链以及其它可选标记的质粒以产生具有增强特性的细胞系，例如更高的产生经组装H2L2抗体分子或经转染细胞系的稳定性增强。

为长期、高产率产生重组型抗体，可使用稳定表达。举例来说，可对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程改造。胜于使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可用免疫球蛋白表达盒和可选标记转化。在引入外源DNA之后，可使经工程改造的细胞在富集培养基中生长1至2天，且接着转换成选择性培养基。重组型质粒中的可选标记赋予对选择的抵抗性且允许细胞将质粒稳定整合至染色体中并生长以形成又可克隆且扩展至细胞系中的焦点。此类经工程改造的细胞系可特别适用于筛选和评估直接地或间接地与抗体分子相互作用的化合物/组分。

一旦产生本发明抗体，则可通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和力、针对蛋白质A之后的特定抗原的特定亲和力和筛分柱色谱法)、离心、差异溶解性或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术来将其纯化。在许多实施例中，抗体由细胞分泌至培养基中且自培养基中收集。

在另一方面中，本发明提供一种抗体，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于氨基酸残基434。在一个实施例中，取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

具有取代的抗体可为本领域技术人员已知的任何适合的抗体。在一个实例中，抗体为抗IL31抗体。在另一实例中，抗体为抗NGF抗体。在另一实例中，抗体为抗TGFβ抗体。

本文中所描述的不含取代的抗IL31抗体为本领域中所熟知的且充分描述于例如美国专利10,526,405；10,421,807；9,206,253；和8,790,651中。另外，本文中所描述的不含取代的抗NGF抗体也是本领域中所熟知的且充分描述于例如美国专利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；和9,505,829中。此外，不具有本文所描述的取代的抗TGFβ抗体也是本领域中众所周知的且充分描述于例如美国专利申请63/036,092和63/248,679以及PCT国际专利申请PCT/US2021/036347中。

在一个实施例中，本发明的抗IL31抗体(即，具有取代的抗体)减少、抑制或中和IL-31介导的瘙痒或过敏性病状。在另一实施例中，本发明的抗IL31抗体减少、抑制或中和犬的IL-31活性。

在一个实例中，本发明的抗IL31抗体结合于处于SEQ ID NO:44的犬IL-31氨基酸序列的约氨基酸残基95与125之间的区，优选地处于SEQ ID NO:44的犬IL-31序列的约氨基酸残基102与122之间的区的IL-31。

抗IL31抗体的VL、VH和CDR序列是本领域中所熟知的且充分描述于例如美国专利10,526,405；10,421,807；9,206,253；和8,790,651中。在一个实例中，本发明的抗IL31抗体可包括以下互补决定区(CDR)序列组合中的至少一者：(1)11E12:SEQ ID NO:13的可变重链(VH)-CDR1、SEQ ID NO:15的VH-CDR2、SEQ ID NO:17的VH-CDR3、SEQ ID NO:19的可变轻链(VL)-CDR1、SEQ ID NO:21的VL-CDR2和SEQ ID NO:23的VL-CDR3；或(2)34D03:SEQ ID NO:14的VH-CDR1、SEQ ID NO:16的VH-CDR2、SEQ ID NO:18的VH-CDR3、SEQ ID NO:20的VL-CDR1、SEQ ID NO:22的VL-CDR2和SEQ ID NO:24的VL-CDR3。在一些实施例中，本发明的抗IL31抗体可包括本文中所描述的至少一种CDR。

在一个实施例中，本发明的抗IL31抗体可包括可变轻链，所述可变轻链包含SEQID NO:25(MU-11E12-VL)、SEQ ID NO:26(CAN-11E12-VL-cUn-FW2)、SEQ ID NO:27(CAN-11E12-VL-cUn-13)、SEQ ID NO:28(MU-34D03-VL)或SEQ ID NO:29(CAN-34D03-VL-998-1)中所阐述的氨基酸序列。

在另一实施例中，本发明的抗IL31抗体可包括可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:30(MU-11E12-VH)、SEQ ID NO:31(CAN-11E12-VH-415-1)、SEQ ID NO:32(MU-34D03-VH)或SEQ ID NO:33(CAN-34D03-VH-568-1)中所阐述的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的突变抗NGF抗体(即具有取代的抗体)减少、抑制或中和动物中的NGF活性，和/或增强抑制NGF结合于Trk A和p75的能力，以便治疗NGF介导的疼痛或病状。

抗NGF抗体的VL、VH和CDR序列也是本领域中所熟知的且充分描述于例如美国专利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；和9,505,829中。在一个实例中，本发明的抗NGF抗体可包括以下互补决定区(CDR)序列中的至少一者：ZTS-841：SEQ ID NO:57的可变重链(VH)-CDR1、SEQ ID NO:58的VH-CDR2、SEQ ID NO:59的VH-CDR3、SEQ ID NO:62的可变轻链(VL)-CDR1、SEQ ID NO:63的VL-CDR2和SEQ ID NO:64的VL-CDR3。在一些实施例中，VL-CDR2具有SEQ ID NO:63的GNG残基。

在一个实施例中，本发明的抗NGF抗体可包括可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:61(CAN-ZTS-841-VL)中所阐述的氨基酸序列。

在另一实施例中，本发明的抗NGF抗体可包括可变重链，所述可变重链包含SEQ IDNO:56(CAN-ZTS-841-VH)中所阐述的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗TGFβ抗体(即，具有取代的抗体)减少、抑制或中和TGFβ介导的疾病或病况，例如慢性肾病。在另一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体减少、抑制或中和狗的TGFβ活性。本发明的抗TGFβ抗体可结合至TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或其组合。举例来说，在一个实施例中，本发明的抗TGFβ抗体结合至TGFβ1。在另一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体结合至TGFβ2。在另一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体结合至TGFβ3。在又一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体结合至TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或其组合。

抗TGFβ抗体的VL、VH和CDR序列也是本领域中众所周知的且充分描述于例如美国专利申请63/036,092和63/248,679以及PCT国际专利申请PCT/US2021/036347中。在一个实例中，本发明的抗TGFβ抗体可包括以下互补决定区(CDR)序列组合中的至少一者：(1)ZTS-426：SEQ ID NO:71的可变重链(VH)-CDR1、SEQ ID NO:72的VH-CDR2、SEQ ID NO:73的VH-CDR3、SEQ ID NO:74的可变轻链(VL)-CDR1、SEQ ID NO:75的VL-CDR2和SEQ ID NO:76的VL-CDR3；或(2)ZTS-501：SEQ ID NO:81的VH-CDR1、SEQ ID NO:82的VH-CDR2、SEQ ID NO:83的VH-CDR3、SEQ ID NO:84的VL-CDR1、SEQ ID NO:85的VL-CDR2和SEQ ID NO:86的VL-CDR3；或(3)ZTS-4155：SEQ ID NO:91的VH-CDR1、SEQ ID NO:92的VH-CDR2、SEQ ID NO:93的VH-CDR3、SEQ ID NO:94的VL-CDR1、SEQ ID NO:95的VL-CDR2和SEQ ID NO:96的VL-CDR3；或(4)ZTS-122：SEQ ID NO:101的VH-CDR1、SEQ ID NO:102的VH-CDR2、SEQ ID NO:103的VH-CDR3、SEQ ID NO:104的VL-CDR1、SEQ ID NO:105的VL-CDR2和SEQ ID NO:106的VL-CDR3；或(5)ZTS-207：SEQ ID NO:111的VH-CDR1、SEQ ID NO:112的VH-CDR2、SEQ ID NO:113的VH-CDR3、SEQ ID NO:114的VL-CDR1、SEQ ID NO:115的VL-CDR2和SEQ ID NO:116的VL-CDR3。

在一些实施例中，本发明的抗TGFβ抗体可包括本文所描述的至少一个CDR。

在另一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体可包括可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:77(ZTS-426)、SEQ ID NO:87(ZTS-501)、SEQ ID NO:97(ZTS-4155)、SEQ ID NO:107(ZTS-122)或SEQ ID NO:117(ZTS-207)中所阐述的氨基酸序列。

在另一实施例中，本发明的抗TGFβ抗体可包括可变轻链，所述可变轻链包含SEQID NO:79(ZTS-426)、SEQ ID NO:89(ZTS-501)、SEQ ID NO:99(ZTS-4155)、SEQ ID NO:109(ZTS-122)或SEQ ID NO:119(ZTS-207)中所阐述的氨基酸序列。

药学和兽医学应用

本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的分子和一种或多种药学上可接受的载体。更确切地说，本发明提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体或稀释剂和作为活性成分的本发明的抗体或肽。

“药学上可接受的载体”包括对于以所采用剂量和浓度暴露于其中的细胞或动物为无毒的任何赋形剂。药物组合物可包括一种或额外治疗剂。

“药学上可接受”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理医学判断的范围内，适于与动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题并发症，与合理的效益/风险比相称。

药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、缓冲液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、润湿剂、防腐剂、家伙(buggers)、螯合剂、抗氧化剂、等张剂和吸收延迟剂。

药学上可接受的载体包括水；生理食盐水；磷酸盐缓冲盐水；右旋糖；甘油；例如乙醇和异丙醇的醇；磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；例如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、双糖和其它包括葡萄糖、甘露糖或糊精的碳水化合物；EDTA；例如钠的成盐相对离子；和/或例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS的非离子表面活性剂；例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)和氯化钠的等张剂；以及其组合。

本发明的药物组合物可以多种方式配制，包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、片剂、丸剂或散剂。在一些实施例中，组合物呈可注射或可输注溶液形式。组合物可呈适于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、非经肠、经粘膜、经口、局部或经皮施用的形式。组合物可配制为立即、控制、延长或延迟释放组合物。

本发明的组合物可以单独的治疗剂形式或与其它治疗剂组合的形式施用。其可单独施用，但通常与基于所选施用途径和标准医药实践选择的医药学载体一起施用。本文所公开的抗体的施用可通过任何适合的手段进行，包括非经肠注射(例如腹膜内、皮下或肌肉内注射)、经口，或通过将抗体(典型地携载于医药配制物中)局部施用至呼吸道表面。局部施用至呼吸道表面可通过鼻内施用(例如通过使用滴管、拭子或吸入器)来进行。抗体局部施用至呼吸道表面还可通过吸入施用，例如通过形成呈气雾悬浮液形式的含有抗体的医药配制物的可吸入粒子，且接着使个体吸入所述可吸入粒子来进行。用于施用医药配制物的可吸入粒子的方法和装置是我们所熟知的，且可采用任何常规技术。

在一些所需实施例中，抗体通过非经肠注射来施用。对于非经肠施用，抗体或分子可结合药学上可接受的非经肠媒剂配制为溶液、悬浮液、乳液或冻干粉形式。举例来说，媒剂可为抗体溶液或其溶解于可接受的载体(例如水性载体)中的混合物，此类媒剂为水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液或5％血清白蛋白、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸和类似者。还可使用脂质体和非水性媒剂，例如非挥发性油。这些溶液为无菌的且通常不含颗粒物质。这些组合物可通过常规熟知灭菌技术来灭菌。组合物可含有药学上可接受的辅助物质，如大致生理条件所需要，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂和其类似者，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制物中的抗体浓度可广泛变化，例如自小于约0.5重量％，通常为或至少约为1重量％至高达15重量％或20重量％，且将根据所选择的特定施用模式主要基于液体体积、粘度等来选择。媒剂或冻干粉可含有维持等张性的添加剂(例如氯化钠、甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲液和防腐剂)。配制物通过常用技术来灭菌。用于制备非经肠可施用组合物的实际方法将为本领域技术人员已知或显而易见，且其更详细地描述于例如REMINGTON'S PHARMA.SCI.(第15版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.,1980)中。

本发明的抗体或分子可冻干以便储存且在使用之前在适合的载体中复原。此技术已显示对常规免疫球蛋白有效。可采用任何适合的冻干和复原技术。本领域技术人员应了解，冻干和复原可引起不同程度的抗体活性损失且可必须调整使用水平以补偿。可施用含有本发明抗体或其混合物的组合物以预防现有疾病的复发和/或治疗性治疗现有疾病。适合的医药学载体描述于最近版本的雷明顿氏医药科学(此技术领域中的标准参考本文)中。在治疗性应用中，向已经患有疾病的个体施用足以治愈或至少部分地遏制或减轻疾病和其并发症的量的组合物。

用于治疗如本文所描述的病状或疾病的本发明的组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，所述因素包括例如但不限于特定药剂的药效学特征和其施用模式和途径；目标位点；动物的生理状态；所施用的其它药物；治疗为预防性的抑或治疗性的；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度、并行治疗的类别、治疗频率和所需效果。

单次或多次施用组合物可以在治疗兽医所选的剂量和模式下进行。在任何情况下，医药配制物应提供足以有效治疗个体的量的一种或多种本发明抗体。在一个示例性实施例中，本发明的组合物两个月一次、三个月一次、四个月一次、五个月一次、六个月一次或七个月一次地进行施用。

治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定以使安全性和功效最佳化。

本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段下，有效达成所需治疗结果的量。治疗有效量的分子可根据例如个体的疾病病况、年龄、性别和体重，和分子在个体中引起所需反应的能力的因素而变化。治疗有效量也是分子的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的量。

在另一方面中，本发明的组合物可用于例如治疗犬的各种疾病和病症。如本文中所使用，术语“治疗(treat/treatment)”是指治疗性治疗，包括防治性或预防性措施，其中目标为预防或减缓(减轻)非所要的与疾病或病状相关的生理变化。不论可检测或不可检测，有益的或所需的临床结果包括(但不限于)症状缓解、疾病或病状的程度减弱、疾病或病状稳定(即，其中疾病或病状不再恶化)、疾病或病状的进程延迟或减缓、疾病或病状改善或缓和和疾病或病状缓解(不论部分或总体)。需要治疗的人包括已患有所述疾病或病状以及易于患有所述疾病或病状的人或应预防所述疾病或病状的人。

本发明的突变分子可用于治疗任何适合的疾病或病症。举例来说，本发明的突变抗IL31抗体可用于治疗IL-31介导的瘙痒或过敏性病状。IL-31介导的瘙痒病状的实例包括例如但不限于异位性皮肤炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒性皮炎。IL-31介导的过敏性病状的实例包括例如但不限于过敏性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马气喘病、发炎性呼吸道疾病、复发性呼吸道阻塞、气管过度反应、慢性阻塞性肺部疾病和由自体免疫引起的发炎过程。

本发明的突变抗NGF抗体可用于治疗NGF介导的疼痛或病状。疼痛的实例包括例如但不限于慢性疼痛、发炎性疼痛、术后切口疼痛、神经痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、疱疹后神经痛、癌症痛、由烧伤引起的疼痛、与伤口相关的疼痛、与创伤相关的疼痛、神经痛、与肌肉骨胳病症相关的疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、僵直性脊椎炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病、关节周围病症或周边神经病变。在一个特定实施例中，疼痛为骨关节炎疼痛。

本发明的突变抗TGFβ抗体可用于治疗TGFβ介导的疾病或病况。TGFβ介导的疾病或病况的实例包括例如但不限于慢性肾病。

本说明书中引用的所有专利和文献参考以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以补充先前公开内容且提供对本文所描述的主题的较佳理解。这些实例不应视为限制所描述的主题。应理解，本文所描述的实例和实施例仅用于说明的目的，且鉴于其各种修改或改变对于本领域技术人员将为显而易见的且欲包括于本发明的真正范围内且可在不脱离本发明的真正范围的情况下进行。

实例

实例1

构建犬IgG Fc突变体

如Bergeron等人(Bergeron等人,2014,Vet Immunol Immunopathol.,第157(1-2)卷,第31-41页)所描述，实施所有犬IgG的构建(图1)，其中利用含有编码IgGB(65)子类的犬恒定区的序列的质粒且本文所研究的各mAb的VH/VL序列经插入上游且与编码恒定域的核苷酸同框。使用Agilent的QuikChange II诱变和用于单点定向诱变的相关Agilent引物设计工具将突变并入至各质粒的CH3域(图2)的位置N434中(https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp)。

抗体构建体使用标准脂染胺转染方案(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)在HEK 293细胞中暂时表达或使用ExpiCHO瞬时系统(ThermoFisherScientific)试剂盒方案在CHO细胞中暂时表达。ExpiCHO表达遵循由ThermoFisher概述的方案，以共转染含有编码IgG轻链和IgG重链的基因序列的质粒。针对HEK293表达，共转染按重量计的等量重链质粒和轻链质粒。使细胞生长7天，之后采集上清液用于抗体纯化。经由Octet QKe定量(Pall ForteBio Corp,Menlo Park,CA,USA)筛检结合于蛋白质A或蛋白质G传感器的抗体。针对蛋白质质量，如Bergeron等人中所描述来纯化且定量结合于蛋白质A的构建体。

实例2

目标结合亲和力和性能分析

通过Biacore评估各mAb的亲和力且经由适合的基于细胞的性能分析来测定IC50。在Biacore T200(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上进行表面等离子共振以测量各抗体针对其目标的结合亲和力，2.5μg/ml的各目标蛋白质通过使用最终密度约250个RU(共振单位)的EDC/NHS分别在CM5传感器流通池2至4上进行胺偶合来固定。

流通池1用作内部参考以校正操作缓冲液效应。在15℃下以250s的接触时间和30μl/min的流速测量抗体结合。解离时段为300s。每一者用再生缓冲液(10mM甘氨酸pH1.5和10mM NaOH)和20μl/min的流速进行再生60s。在相同的分析形式下，操作/稀释缓冲液(1×HBS-EP、GE Healthcare，BR-1006-69，10×包括100mM HEPES、150mM NaCl、30mM EDTA和0.5％v/v表面活性剂P20、pH7.4，1:10于过滤MQ H2O中)用作阴性对照。

通过使用双重参照的方法用Biacore T200评估软件来分析数据。所得曲线与1:1结合模型拟合。在野生型和N434H突变IgG之间未观测到结合亲和力或IC50的差异(表1)。

表1.WT和N434H突变IgG的亲和力和效力。在WT与突变IgG之间未测量到差异：

mAb1、mAb2和mAB3分别是指犬类化抗IL31、抗NGF和抗TGFβ抗体。抗IL31抗体是本领域中所熟知的。参见例如美国专利10,526,405；10,421,807；9,206,253；8,790,651。抗NGF抗体也是本领域中所熟知的。参见例如美国专利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；和9,505,829。抗TGFβ抗体也是本领域中众所周知的。参见例如美国专利申请63/036,092和63/248,679以及PCT专利申请PCT/US2021/036347。使用抗TGFβ抗体ZTS-4155。

实例3

活体外FcRn结合分析

分离、制备犬FcRn，且根据上文所论述的Bergeron等人分析针对犬FcRn的突变FcIgG。使用标准PCR以使用由食蟹猕猴、人类、小鼠和大鼠的序列比对设计的简并引物来扩增犬FcRn-α亚基和β-微球蛋白。引物在3'(3prime)末端含有HindIII和在5'(5prime)末端含有BamH1以便于亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中，经工程改造具有c端6×His+BAP标签(AGLNDIFEAQKIEWHE)。FcRn-α亚基和β-微球蛋白经共转染至HEK 293细胞中且FcRn复合体通过经由c端His标签进行IMAC亲和纯化来纯化。通过Biacore 3000或Biacore T200(GEHealthcare，Pittsburgh,PA,USA)使用CM5传感器芯片测量KD。

使用标准胺固定方法将FcRn固定在传感器表面上以达至所需表面密度。HBS-EP用作固定操作缓冲液，且将10mM MES；150mM NaCl；0.005％ Tween20；0.5mg/mL BSA；pH6和pH7.2和PBS；0.005％ Tween20；0.5mg/mL BSA；pH7.4用于方法操作缓冲液和滴定。Fc突变IgG在受体表面上流动且使用Scrubber2软件分析(BioLogic Software Pty,Ltd.,Campbell,Australia)或T200评估软件测定亲和力(表2)。自所有操作中减去仅含有缓冲液的空白操作。流通池使用50mM Tris pH8进行再生。在15℃下进行操作。

在mAb 1、2和3的位置434产生的突变对于pH6下IgG针对FcRn的亲和力具有明显影响。对于所有三种mAb，突变N434H使得pH6下的FcRn亲和力显著增加，同时保持pH 7.2下的微弱亲和力。位置434的大量诱变显示几种其它突变使得pH6下的FcRn亲和力增加。此研究显示IgG的FcRn亲和力增加并非取决于VHVL域，且对于任何犬IgGB(65)而言是普遍的。

表2.通过表面等离子共振(Biacore)测量的野生型(WT)和N434突变IgG与犬FcRn的结合：

mAb1、mAb2和mAB3分别是指犬类化抗IL31、抗NGF和抗TGFβ抗体，如上表1中所示。

NBO＝未观测到结合。

WB＝弱结合；KD可能无法精确地计算。

实例4

犬的Fc突变IgG PK研究

研究目标为判定针对两种独特且不同的Fc突变N434H已并入至各IgG中的目标，犬的2种IgG单克隆抗体(mAb1和mAb2)的药物动力学提高。

对于mAb1 WT和N434H突变IgG，向4只雄性米格鲁犬的群组静脉内施用单次2mg/kg剂量。对于mAb2 WT和突变IgG，以28天间隔向4只雄性和4只雌性米格鲁犬的群组施用三个2mg/kg剂量的IgG中的一者。前两个剂量经皮下施用且最后一个剂量经静脉内施用。使用特定针对各IgG且在GyrolabxP^TM平台上自动化的经验证配体结合分析来分析犬血清中的‘游离’IgG(图3至图6)。使用通过Watson^TM的非隔室途径(用于AUC计算的直线梯形法则)来进行药物动力学计算(表3)。对于mAb2 IgG，使用给药之后的7至28天的时间点估算第一剂量和第二剂量的半衰期。使用给药之后的7至42天的时间点估算最后一个剂量的半衰期。通过Excel^TM进行其它计算，包括校正第2次和第3次注射药物之后的浓度-时间特征曲线的重叠的AUC。使用Excel^TM或Watson^TM计算浓度-时间数据和药物动力学数据在简单统计下的汇总(均值、标准差、变化系数)。未进行其它统计分析。

表3.野生型和N434H突变犬IgG的经计算半衰期：

IgG	半衰期(天)
		mAb1 WT	9.7+/-2.6
mAb1 N434H	17.1+/-5.1
		mAb2 WT	9.2+/-1.7
mAb2 N434H	19.3+/-3.1

mAb1和mAb2分别是指犬类化抗IL31和抗NGF抗体。

犬IgGB(65)点突变N434H已显示米格鲁犬中两种不同犬IgG的半衰期延长。对于mAb1，半衰期从9.7+/-2.6天延长至17.1+/-5.1天，且对于Ma2b2，半衰期自9.2+/-1.7延长至19.3+/-3.1。作用机制是经由增强在pH6下针对犬FcRn的亲和力，且已证实三种犬IgG结合了极不同且独特的可溶性目标。因此，证实IgGB(65)的N434突变的半衰期延长与VHVL域无关。

实例5

FcRn结合分析

分离、制备犬FcRn，且根据上文所论述的Bergeron等人分析针对犬FcRn的突变FcIgG。使用标准PCR来扩增犬FcRn-α亚基和β-微球蛋白。FcRn-α亚基和β-微球蛋白经共转染至HEK 293细胞中且FcRn复合体通过经由c端His标签进行IMAC亲和纯化来纯化。FcRn复合体经由BirA酶促生物素酰化反应来进行生物素标记。通过Biacore T200(GE Healthcare，Pittsburgh,PA,USA)或Biacore 8K(Cytiva,Marlborough,MA,USA)使用SA传感器芯片测量KD。

使用修改的SA捕获方法将FcRn捕获于传感器表面上。10mM MES；150mM NaCl；0.005％ Tween20；0.5mg/mL BSA；pH6用作捕获方法操作缓冲液和滴定。1×HB-P、0.5mg/mLBSA；pH7.4也用于方法操作缓冲液和滴定。Fc突变IgG在受体表面上流动，且使用T200评估软件或Biacore Insight评估软件测定亲和力。自所有操作中减去仅含有缓冲液的空白操作。流通池使用50mM Tris pH8或pH9进行再生。在15℃下进行操作。

在对应位置产生的突变对于pH6下IgG针对FcRn的亲和力具有明显影响。通过表面等离子共振(Biacore)测量野生型(WT)和突变IgG与犬FcRn的结合。

在结合不同目标的完全不同且结构上不同的抗体(即，抗IL31和抗NGF抗体)以及结合相同目标的不同版本抗体(即，不同版本的抗IL31和抗NGF抗体)中观测到对于亲和力的明显影响(表1至表4)。因此，针对IgG的FcRn亲和力增加并不取决于VHVL域或CDR区。另外，在多种IgG子类中观测到对于亲和力的明显影响，但存在略微差异。大体而言，结果显示针对IgG的FcRn亲和力增加与犬IgG子类无关。

表4A.野生型(WT)和N434突变IgG与犬FcRn的结合

mAb1和mAb2分别是指犬类化抗IL31(34D03)和抗NGF(ZTS-841)抗体。此表和以上表1至表3中的mAb1是相同的(即，34D03)。然而，此表中的mAb2为ZTS-841抗NGF抗体，相对于表1至表3中列举的mAb2抗体，其具有不同的VL、VH和CDR区；NBO＝未观测到结合。

表4B.野生型(WT)和N434突变IgG与犬FcRn的结合

mAb1是指犬类化抗IL31抗体。ID编号15至21和31对应于34D03

抗IL31抗体。ID编号33和34对应于11E12抗IL31抗体。

实例6

犬的Fc突变IgG PK研究

研究目标是基于犬诱发的搔痒模型中的疗效，测定4.0mg/kg剂量的ZTS-00008183的有效性，在所述犬诱发的搔痒模型中，通过评估在第0天施用测试物后的至多210天的搔痒减少状况来测量疗效。如本文中所使用，术语“ZTS-00008183”是指其恒定区中具有N434H突变的抗IL31抗体。ZTS-00008183具有本文中所描述的34D03的可变区(即，包括CDR的VL和VH)。

通过单次SC注射向米格鲁犬(年龄约4岁)施用ZTS-00008183或安慰剂。处理汇总于以下中。

表5.处理汇总

处理组	途径	剂量mg/kg)	化合物	配制物浓度(mg/mL)	N
						T01	SC	0	安慰剂	0	8
T02	SC	4.0	ZTS-00008183	40	8

在给药前(第-7天)和药物施用后第7天、第14天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天和第210天收集血清样品。

确切地说，在IL-31诱导的搔痒刺激研究中，用单次皮下施用4mg/kg ZTS-00008183治疗米格鲁犬(n＝8，给药时年龄约4岁)。在给药前(第-7天)和药物施用后第7天、第14天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天和第210天收集血清样品。

使用配体结合分析定量测试mAb。通过适合的ADA分析方法评估抗药物抗体(ADA)。

从BioAgilytix Labs接收呈Excel^TM电子试算表形式的生物分析数据。将数据导入至Watson^TMv.7.4.1中。使用非隔室途径通过Watson^TMv.7.4.1计算毒理动力学和药物动力学参数(C_max、t_max、AUC、AUCextrap和t_1/2)。使用给药后56至210天的时间点估算群组T02的ZTS-00008183半衰期。评估免疫原性。

ZTS-00008183的血清浓度列举于表6中。

表6.单次4mg/kg皮下施用后的犬体内的ZTS-00008183的药物动力学参数(T02)

ZTS-00008183的药物动力学参数均值显示于下表7中。

表7.ZTS-00008183的药物动力学参数均值。

参数	单位	ZTS-00008183
			AUC	微克*天/毫升	1940±285
AUC外推值	微克*天/毫升	1960±295
			Cmax	μg/mL	31.8±5.3
tmax	天	11.4±7.4
			t1/2	天	30.2±3.3

未检测到处理诱导的免疫原性。

ZTS-00008183的血清概况展示于图7中。ZTS-00008183的血清概况均值展示于图8中。

总之，结果具有N434H突变的犬IgG恒定域提供约30天的半衰期。相对于野生型的9.2至9.7天的半衰期，其半衰期延长大于2倍(即，200％延长)(参见表2)。

实例7

Fc突变IgG的长期治疗效果

在犬IL-31诱导的瘙痒模型中，对4mg/kg单次皮下剂量的ZTS-00008183进行评估。

在并行设计的疗效研究中，使用随机化完全集区设计将二十四只健康米格鲁犬随机分至处理组，且接受4mg/kg体重的ZTS-00008183或安慰剂。通过历史瘙痒评分对动物进行集区，以形成八个(8)大小为3的完全集区。

表8.处理汇总

处理组	途径	剂量(mg/kg)	化合物	配制物浓度(mg/mL)	N
						T01	SC	0	安慰剂	0	8
T02	SC	4.0	ZTS-00008183	40	8

SC是指皮下；N是指动物数量。

在研究第-7天向各动物施用IL-31刺激(2.5μg/kg)以诱导瘙痒，进而建立基线瘙痒评分。在研究第7天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天和第210天再次施用IL-31刺激。

观测动物在各次刺激之后的120分钟时段内的瘙痒行为。在1-分钟窗口内进行观测且所述窗口中的任何瘙痒活动会得到“是”的响应。是的累积响应数目确定了瘙痒评分。

注意到在此研究期间没有不良事件，且所有测试和对照物以及刺激材料是根据方案进行施用。

结果表明，在我们的犬IL-31诱导的瘙痒模型中，与在3、4和5个月的对照组(P<0.0001)相比，4.0mg/kg单次SC剂量的ZTS-00008183显示显著更低的最小平方均值搔痒评分(表9、11和13)。

如图9至13中所示，在我们的犬IL-31诱导的瘙痒模型中，与研究第84天、第112天、第140天、第168天和第210天的对照组相比，ZTS-0008183(T02)以4mg/kg给药时显示显著更低的总瘙痒评分。

基于瘙痒得分，结果还表明ZTS-00008183在84、112、140、168和210天(即，约7个月)内是治疗有效的。

结果进一步表明ZTS-00008183具有长期治疗效果且可每3个月、每4个月、每5个月、每6个月或每7个月施用一次。

表9.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第84天的最小平方均值瘙痒评分和92.9％的上信赖限和下信赖限。

表10.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第84天的处理评分之间的均值差和92.9％的上信赖限和下信赖限。

表11.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第112天的最小平方均值瘙痒评分和95.4％的上信赖限和下信赖限。

表12.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第112天的处理评分之间的均值差和95.4％的上信赖限和下信赖限。

表13.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第140天的最小平方均值瘙痒评分和95.4％的上信赖限和下信赖限。

表14.用安慰剂(T01)或ZTS-00008183(T02)处理后，第140天的处理评分之间的均值差和95.4％的上信赖限和下信赖限。

总之，结果表明具有N434H突变的犬IgG恒定域保持约210天(即，7个月)的治疗性血清水平。相对于先前研究中报告的野生型抗IL31抗体的治疗性水平天数，其高几倍。

实例8

FcRn结合分析

如实例3中所论述，分离、制备犬FcRn，且根据上文所论述的Bergeron等人分析针对犬FcRn的突变Fc IgG。使用标准PCR以使用由食蟹猕猴、人类、小鼠和大鼠的序列比对设计的简并引物来扩增犬FcRn-α亚基和β-微球蛋白。引物在3'末端含有HindIII和在5'末端含有BamH1以便于亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中，经工程改造具有c端6×His+BAP标签(AGLNDIFEAQKIEWHE)。FcRn-α亚基和β-微球蛋白经共转染至HEK 293细胞中且FcRn复合体通过经由c端His标签进行IMAC亲和纯化来纯化。通过Biacore T200(GE Healthcare，Pittsburgh,PA,USA)使用CM5或SA传感器芯片测量KD。

使用修改的SA捕获方法将FcRn捕获于传感器表面上。10mM MES；150mM NaCl；0.005％ Tween20；0.5mg/mL BSA；pH6用作捕获方法操作操作缓冲液和滴定。1×HB-P、0.5mg/mL BSA；pH7.4也用于方法操作缓冲液和滴定。Fc突变IgG在受体表面上流动，且使用T200评估软件或Biacore Insight评估软件测定亲和力。自所有操作中减去仅含有缓冲液的空白操作。流通池使用50mM Tris pH8或pH9进行再生。在15℃下进行操作。

在mAb3抗TGFβ抗体的位置434产生的突变对于pH6下IgG针对FcRn的亲和力具有明显影响。突变N434H使得pH6下的FcRn亲和力显著增加，同时保持pH 7.4下的微弱亲和力。此研究显示IgG的FcRn亲和力增加并非取决于VHVL域，且对于任何犬抗TGFβ抗体而言是普遍的。

表15.通过表面等离子共振(Biacore)测量的野生型(WT)和N434突变IgG与犬FcRn的结合：

使用犬IgG子类B。

NBO＝未观测到结合。

ID编号1、3、5和7表示野生型mAb3抗TGFβ抗体ZTS-501、ZTS-426、ZTS-122和ZTS-207。ID编号2、4、6和8分别表示突变型mAb3抗TGFβ抗体ZTS-501、ZTS-426、ZTS-122和ZTS-207。

已描述本发明的优选实施例，应理解，本发明不限于确切实施例，且各种变化和修改可由本领域技术人员在不偏离本发明的如所附权利要求书中定义的范围或精神的情况下于其中实现。

Claims (82)

1.一种经修饰的IgG，其包含：犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含相对于野生型犬IgG恒定域的至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

2.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

3.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的IgG的半衰期相比，所述经修饰的IgG具有延长的半衰期。

4.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的IgG相比，所述经修饰的IgG具有针对FcRn的更高亲和力。

5.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG为犬或犬类化IgG。

6.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D。

7.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定域为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D的恒定域。

8.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定域包含具有CH3域的Fc恒定区。

9.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定域包含具有CH2和CH3域的Fc恒定区。

10.根据权利要求1所述的经修饰的IgG，其中所述IgG恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。

11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的经修饰的IgG和药学上可接受的载体。

12.一种试剂盒，其包含容器中的根据权利要求1所述的经修饰的IgG，和使用说明书。

13.一种多肽，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

15.根据权利要求13所述的多肽，其中与所述野生型犬IgG恒定域的多肽的半衰期相比，所述多肽具有延长的半衰期。

16.根据权利要求13所述的多肽，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的IgG的多肽相比，所述多肽具有针对FcRn的更高亲和力。

17.根据权利要求13所述的多肽，其中所述多肽为犬或犬类化IgG的多肽。

18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述IgG为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D。

19.根据权利要求13所述的多肽，其中所述IgG恒定域为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D的恒定域。

20.根据权利要求13所述的多肽，其中所述IgG恒定域包含具有CH3域的Fc恒定区。

21.根据权利要求13所述的多肽，其中所述IgG恒定域包含具有CH2和CH3域的Fc恒定区。

22.根据权利要求13所述的多肽，其中所述IgG恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。

23.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的多肽和药学上可接受的载体。

24.一种试剂盒，其包含于容器中的根据权利要求13所述的多肽，和使用说明书。

25.一种抗体，其包含：相对于野生型犬IgG恒定域，包含至少一个氨基酸取代的犬IgG恒定域，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

26.根据权利要求25所述的抗体，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

27.根据权利要求25所述的抗体，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的抗体的半衰期相比，所述抗体具有延长的半衰期。

28.根据权利要求25所述的抗体，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的抗体相比，所述抗体具有针对FcRn的更高亲和力。

29.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体为犬或犬类化抗体。

30.根据权利要求25所述的抗体，其中所述抗体为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D。

31.根据权利要求25所述的抗体，其中所述IgG恒定域为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D的恒定域。

32.根据权利要求25所述的抗体，其中所述IgG恒定域包含具有CH3域的Fc恒定区。

33.根据权利要求25所述的抗体，其中所述IgG恒定域包含具有CH2和CH3域的Fc恒定区。

34.根据权利要求25所述的抗体，其中所述IgG恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。

35.一种药物组合物，其包含根据权利要求25所述的抗体和药学上可接受的载体。

36.一种试剂盒，其包含于容器中的根据权利要求25所述的抗体，和使用说明书。

37.一种载体，其包含编码SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列的核酸序列。

38.一种经分离的细胞，其包含根据权利要求37所述的载体。

39.一种制造抗体或分子的方法，所述方法包含：提供根据权利要求38的细胞；和培养所述细胞。

40.一种制造抗体的方法，所述方法包含：提供根据权利要求25至34中任一项的抗体。

41.一种用于延长犬的抗体血清半衰期的方法，所述方法包含：向所述犬施用治疗有效量的包含犬IgG恒定域的抗体，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

43.根据权利要求41所述的方法，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的抗体的半衰期相比，所述抗体具有延长的半衰期。

44.根据权利要求41所述的方法，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的抗体相比，所述抗体具有针对FcRn的更高亲和力。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗体为犬或犬类化抗体。

46.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗体为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D。

47.根据权利要求41所述的方法，其中所述IgG恒定域为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D的恒定域。

48.根据权利要求41所述的方法，其中所述IgG恒定域包含具有CH3域的Fc恒定区。

49.根据权利要求41所述的方法，其中所述IgG恒定域包含具有CH2和CH3域的Fc恒定区。

50.根据权利要求41所述的方法，其中所述IgG恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。

51.一种融合分子，其包含：与药剂融合的犬IgG恒定域，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434。

52.根据权利要求51所述的分子，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

53.根据权利要求51所述的分子，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的分子的半衰期相比，所述分子具有延长的半衰期。

54.根据权利要求51所述的分子，其中与具有所述野生型犬IgG恒定域的分子相比，所述分子具有针对FcRn的更高亲和力。

55.根据权利要求51所述的分子，其中所述分子为犬或犬类化抗体。

56.根据权利要求51所述的分子，其中所述分子包含IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D。

57.根据权利要求51所述的分子，其中所述IgG恒定域为IgG_A、IgG_B、IgG_C或IgG_D的恒定域。

58.根据权利要求51所述的分子，其中所述IgG恒定域包含具有CH3域的Fc恒定区。

59.根据权利要求51所述的分子，其中所述IgG恒定域包含具有CH2和CH3域的Fc恒定区。

60.根据权利要求51所述的分子，其中所述IgG恒定域包含SEQ ID NO.:1中所阐述的氨基酸序列。

61.一种药物组合物，其包含根据权利要求51所述的分子和药学上可接受的载体。

62.一种试剂盒，其包含于容器中的根据权利要求51所述的分子，和使用说明书。

63.一种经修饰的IgG，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所阐述的氨基酸序列的犬IgG恒定域，其中与具有野生型犬IgG恒定域的IgG的半衰期相比，所述经修饰的IgG具有延长的半衰期。

64.根据权利要求63所述的经修饰的IgG，其中所述延长的半衰期为范围介于约25天至约35天的时间段。

65.根据权利要求63所述的经修饰的IgG，其中所述延长的半衰期为约30天。

66.一种经修饰的IgG，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所阐述的氨基酸序列的犬IgG恒定域，其中所述经修饰的IgG长期保持其治疗水平。

67.根据权利要求66所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG在范围介于约1个月至约7个月的时间段内保持其治疗水平。

68.根据权利要求66所述的经修饰的IgG，其中所述经修饰的IgG在向犬个体皮下递送所述IgG后的所述时间段内保持其治疗水平。

69.一种抗体，其包含：SEQ ID NO.:1、65或66中所阐述的包含氨基酸序列的犬IgG恒定域，其中与具有野生型犬IgG恒定域的抗体的半衰期相比，所述抗体具有延长的半衰期。

70.根据权利要求69所述的抗体，其中所述延长的半衰期为范围介于约25天至约35天的时间段。

71.根据权利要求69所述的抗体，其中所述延长的半衰期为约30天。

72.一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所阐述的氨基酸序列的犬IgG恒定域，其中所述抗体长期保持其治疗水平。

73.根据权利要求66所述的抗体，其中所述抗体在范围介于约1个月至约7个月的时间段内保持其治疗水平。

74.根据权利要求66所述的抗体，其中所述抗体在向犬个体皮下递送所述抗体后的所述时间段内保持其治疗水平。

75.根据权利要求25至34和69至74中任一项所述的抗体，其中所述抗体为抗IL31、抗NGF或抗TGFβ抗体。

76.一种用于延长犬的抗体血清半衰期的方法，所述方法包含：向所述犬施用治疗有效量的包含犬IgG恒定域的抗体，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434，且其中所述抗体为抗TGFβ抗体。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

78.一种用于保持抗体于犬体内的治疗性血清水平的方法，所述方法包含：向所述犬施用治疗有效量的包含犬IgG恒定域的抗体，相对于野生型犬IgG恒定域，所述犬IgG恒定域包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代处于根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434，且其中所述抗体为抗TGFβ抗体。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述取代为位置434的天冬酰胺经组氨酸取代(N434H)。

80.一种治疗犬个体的TGFβ介导的疾病或病况的方法，所述方法包含：向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求75的抗TGFβ抗体，从而治疗所述犬个体的所述TGFβ介导的疾病或病况。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述TGFβ介导的疾病为慢性肾病。

82.根据权利要求80所述的方法，其中所述抗体两个月一次、三个月一次、四个月一次、五个月一次、六个月一次或七个月一次地进行施用。

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