TW202204403A - 犬抗體變異體 - Google Patents

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莉莎 柏格倫
亨利 坎普斯
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Abstract

本發明大體上係關於犬抗體變異體及其用途。特定言之，本發明係關於犬抗體恆定區中用於改良其半衰期及其他特徵之突變。

Description

犬抗體變異體
本發明大體上係關於犬抗體變異體及其用途。特定言之，本發明係關於犬抗體之Fc恆定區中用於改良半衰期的突變。
犬IgG單株抗體(mAb)將研發作為獸醫學中之有效治療劑。幾年前，鑑別且表徵四種犬IgG子類(Bergeron等人，2014，Vet Immunol Immunopathol .第157 (1-2)卷，第31至41頁)。然而，並未對延長犬IgG之半衰期的進行足夠研究。
經由再循環機制，新生兒Fc受體(FcRn)以與其片段可結晶(Fc)區之pH依賴性相互作用延長IgG之半衰期。特定言之，跨越CH2及CH3域之界面的Fc區與細胞表面上之FcRn相互作用以調節IgG內環境穩定。IgG胞飲作用之後的酸性相互作用有助於此相互作用且因此避免IgG降解。內吞IgG接著再循環回至細胞表面且以鹼性pH經釋放進入血流中，藉此保持足夠的血清IgG以發揮恰當功能。因此，IgG之藥物動力學概況視其Fc區之結構及功能特性而定。
三種犬IgG子類結合犬FcRn且已經與人類IgG類似物進行比較。犬IgG之半衰期仍需要進行充分研究，因為在無任何實驗支援的情況下，吾人不能預期或預測其是否將與人類IgG緊密對準。
延長IgG之半衰期可允許抗體藥物之不太頻繁給藥及/或較低劑量，其繼而減少獸醫問診，提高患者順應性，且降低濃度依賴性細胞毒性/不良事件。
因此，需要鑑別Fc恆定區中用以提高半衰期之突變。
本發明係關於突變犬IgG，相對於野生型犬IgG，該突變犬IgG提供更高的FcRn親和力及更高的半衰期。特定言之，本申請案之本發明人已發現用另一胺基酸取代位置434之胺基酸殘基天冬醯胺(Asn或N)出人意料地且未預期地增強針對FcRn之親和力，且藉此延長IgG之半衰期。
在一個態樣中，本發明提供一種經修飾之IgG，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。在一例示性實施例中，該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代。
在另一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
在又一態樣中，本發明提供一種抗體或分子，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
在另一態樣中，本發明提供一種用於產生或製造抗體或分子之方法，該方法包含：提供具有包含犬IgG恆定域之抗體的載體或宿主細胞，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代。其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
在另一態樣中，本發明提供一種用於延長犬之抗體血清半衰期之方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。在一例示性實施例中，該抗體使半衰期延長約30天。
在另一態樣中，本發明提供一種用於保持抗體於犬體內之治療性血清水準之方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。在一例示性實施例中，該抗體在範圍介於約1個月至約7個月之時間段內保持該抗體於該犬體內之治療性血清水準。
本發明之其他特徵及優勢將自以下詳細描述實例及圖式變得顯而易知。然而，應理解，詳細描述及特定實例雖然指示本發明之較佳實施例，但僅以說明方式給出，因為熟習此項技術者將由此詳細描述而對本發明之精神及範疇內的各種改變及修正變得顯而易知。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年4月17日申請的美國臨時專利申請案第63/011453號的優先權及權益，該美國臨時專利申請案特此以全文引用的方式併入本文中。
參考形成本發明之一部分的以下詳細描述，可更容易地理解本發明之主題。應理解，本發明不限於本文所描述及/或展示之具體產物、方法、條件或參數，且本文所用之術語僅借助於實例出於描述特定實施例的目的，且不意欲限制任何所主張之本發明。
除非本文中另外定義，否則結合本申請使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。
如在本發明中使用，除非另外指明，否則以下術語及縮寫應理解具有以下含義。定義
在本發明中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物，且特定數值之引用包括至少該特定值。因此，舉例而言，提及「分子(a molecule)」或「化合物(a compound)」係提及一或多種此類分子或化合物及熟習此項技術者已知之其等效物等。如本文所用，術語「複數個(種)」意謂多於一個(種)。當表示值範圍時，另一實施例包括自一個特定值及/或至另一個特定值。類似地，當藉由在前面使用「約」以近似值表示值時，應理解，該特定值形成另一實施例。所有範圍均為包括性及可組合的。
在說明書及申請專利範圍中，免疫球蛋白重鏈中之胺基酸殘基之編號係如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中之Eu索引的編號。「如Kabat中之Eu索引」係指IgG抗體之殘基編號且反映於本文中之圖2中。
術語「經分離」在結合核酸使用時為自其天然來源中通常與其相關之至少一種污染物核酸中鑑別且分離出之核酸。經分離之核酸可以與自然界中發現的形式或環境不同的形式或環境存在。因此，經分離之核酸分子區別於在天然細胞中存在的核酸分子。經分離之核酸分子包括細胞中含有之通常表現本文中所編碼之多肽的核酸分子，其中例如該核酸分子處於與天然細胞之質粒或染色體位置不同的質粒或染色體位置。經分離之核酸可以單股或雙股形式存在。當利用經分離之核酸分子表現蛋白質時，寡核苷酸或聚核苷酸將含有最小有義股或編碼股，但可含有有義股及反義股兩者(亦即，可為雙股)。
當核酸分子與另一核酸分子處於功能關係時，該核酸分子經「可操作地連接(operably linked/ operably attached)」。舉例而言，若啟動子或強化子影響序列之轉錄，則該啟動子或強化子係可操作地連接至核酸之編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以促進轉譯，則核糖體結合位點係可操作地連接至核酸之編碼序列。若編碼變異Fc區之核酸分子經定位而使得經表現之融合蛋白包含與變異Fc區多肽上游或下游鄰接之異源蛋白質或其功能片段，則其可操作地連接於編碼異源蛋白質(亦即，當其存在於自然界中時不包含Fc區的蛋白質或其功能片段)之核酸分子；異源蛋白質可緊鄰變異Fc區多肽或可藉由任何長度及組成之連接子序列與其間隔開。同樣地，當多肽(在本文中與「蛋白質」同義地使用)分子與另一多肽處於功能關係時，該多肽分子經「可操作地連接」。
如本文中所使用，術語「功能片段」參考多肽或蛋白質(例如，變異Fc區或單株抗體)時，係指保留全長多肽之至少一個功能的彼蛋白質片段。片段之大小可介於六個胺基酸至全長多肽之全部胺基酸序列減一個胺基酸的範圍內。本發明之變異Fc區多肽之功能片段保留至少一種如本文所定義之「胺基酸取代」。變異Fc區多肽之功能片段保留此項技術中已知的與Fc區相關之至少一個功能(例如，ADCC、CDC、Fc受體結合、Clq結合、細胞表面受體之下調或可例如增加與其可操作連接之多肽之活體內或活體外半衰期)。
術語「經純化」或「純化」係指自樣品實質性移除至少一種污染物。舉例而言，抗原特異性抗體可藉由完全或實質性移除(至少90%、91%、92%、93%、94%、95%，或更佳地至少96%、97%、98%或99%)至少一種污染性非免疫球蛋白蛋白質來純化；其亦可藉由移除並未結合於相同抗原之免疫球蛋白蛋白質來純化。移除非免疫球蛋白蛋白質及/或移除並未結合特定抗原之免疫球蛋白使得樣品中抗原特異性免疫球蛋白之百分比增加。在另一實施例中，細菌性宿主細胞中表現之多肽(例如，免疫球蛋白)藉由完全或實質性移除宿主細胞蛋白質來純化；藉此增加樣品中多肽之百分比。
術語「天然的」在指代多肽(例如，Fc區)時在本文中用以指示該多肽具有由自然界中通常存在之多肽或其天然存在之多晶型之胺基酸序列組成的胺基酸序列。天然多肽(例如，天然Fc區)可藉由重組方式製備或可自天然存在源分離。
如本文所使用，術語「表現載體」係指含有所需編碼序列及在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之適當核酸序列的重組DNA分子。
如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指位於活體外或原位或活體內的任何真核或原核細胞(例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌；CHO細胞、酵母菌細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、魚細胞及昆蟲細胞)。
如本文中所使用，術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為天然序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之一般可接受的邊界可不同，但犬IgG重鏈Fc區通常被限定以例如自位置231之胺基酸殘基延伸至其羧基端。在一些實施例中，變異體僅包含Fc區之部分且可包括或不包括羧基端。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域：CH2及CH3。在一些實施例中，涵蓋具有一或多個恆定域之變異體。在其他實施例中，涵蓋不含此類恆定域(或僅含此類恆定域之部分)之變異體。
犬IgG Fc區之「CH2域」通常自例如約胺基酸231延伸至約胺基酸340(參見圖2B)。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。兩個N連接之分支鏈碳水化合物鏈插入於完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。
犬IgG Fc區之「CH3域」通常為Fc區延伸中之CH2域之C端殘基延伸段，例如自約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447(參見圖2B)。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。相對於包含天然Fc區或變異體之親本Fc區的多肽，包含本發明之變異Fc區的多肽之至少一種效應功能可增強或減弱。效應功能之實例包括(但不限於)：Clq結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。此類效應功能可能需要可操作地連接於結合域(例如抗體可變域)之Fc區且可使用各種分析(例如，Fc結合分析、ADCC分析、CDC分析、全血樣品或分級分離之血液樣品的目標細胞消耗等)來評估。
「天然序列Fc區」或「野生型Fc區」係指與在自然界中通常發現之Fc區之胺基酸序列具有一致性之胺基酸序列。例示性天然序列犬Fc區展示於圖2中且包括犬IgGB_65 Fc區之天然序列。
「變異Fc區」包含與天然序列Fc區(或其片段)之胺基酸序列相差至少一個如本文所定義之「胺基酸取代」的胺基酸序列。在較佳實施例中，變異Fc區相比於天然序列Fc區或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，較佳地在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有1、2、3、4或5個胺基酸取代。在一替代實施例中，變異Fc區可根據本文中所揭示之方法產生且此變異Fc區可與所選異源多肽(諸如抗體可變域或非抗體多肽(例如，受體或配位體之結合域))融合。
如本文中所使用，在多肽之上下文中的術語「衍生物」係指包含已藉由引入胺基酸殘基取代而變異之胺基酸序列的多肽。如本文中所使用，術語「衍生物」亦指已藉由任何類型之分子與多肽之共價附接經修飾的多肽。舉例而言(但不以限制方式)，抗體可例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/阻斷基團進行之衍生化、蛋白水解裂解、與細胞配位體或其他蛋白連接等來修飾。A衍生物多肽可藉由使用熟習此項技術者已知之技術進行化學修飾來製備，該等技術包括(但不限於)特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素之代謝合成等。此外，衍生物多肽具有與衍生其之多肽類似或相同的功能。應瞭解包含本發明之變異Fc區的多肽可為如本文所定義之衍生物，較佳地，衍生化發生在Fc區內。
如本文中所使用，關於多肽(例如，Fc區或單株抗體)之「實質上之犬來源」指示該多肽具有與天然犬胺基多肽之胺基酸序列至少80%、至少85%、更佳地至少90%、91%、92%、93%、94%或甚至更佳地至少95%、95%、97%、98%或99%同源性的胺基酸序列。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合至Fc區(例如，抗體之Fc區)的受體。較佳FcR係天然序列FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的FcR。另一較佳FcR包括新生受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J. Immunol. 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249 (1994))。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來鑑別之FcR。
片語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」及「ADCC」係指細胞介導之反應，其中表現FcR之非特異性細胞毒性細胞(例如，非特異性)(例如，自然殺手(「NK」)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)識別目標細胞上之經結合抗體且隨後使得目標細胞裂解。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。
如本文中所使用，片語「效應細胞」係指表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球(較佳地犬)。較佳地，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之白血球之實例包括PBMC、NK細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性球。效應細胞可自天然來源(例如自血液或PBMC)分離。
具有「變化」FcRn結合親和力之變異多肽為在pH 6.0下量測時，與變異體之親本多肽或包含天然Fc區之多肽相比，具有增強(亦即，增加的、更大的或更高的)或減弱(亦即降低的、更小的或更低的)FcRn結合親和力之多肽。顯示與FcRn之結合增加或結合親和力增加的變異多肽以相比於親本多肽更大的親和力結合FcRn。顯示與FcRn之結合減小或結合親和力減小的變異多肽以相比於其親本多肽更低的親和力結合FcRn。顯示與FcRn之結合減小的此類變異體可具有與FcRn很少或沒有可觀的結合，例如與親本多肽相比，0%至20%與FcRn之結合。與其親本多肽相比，以「增強親和力」結合FcRn之變異多肽為當結合分析中變異多肽及親本多肽之量基本上相同，且所有其他條件一致時，以比親本多肽更高之結合親和力結合FcRn的多肽。舉例而言，具有增強FcRn結合親和力之變異多肽可顯示相比於親本多肽，FcRn結合親和力增加約1.10倍至約100倍(更通常約1.2倍至約50倍)，其中例如在ELISA分析或一般熟習此項技術者可用之其他方法中測定FcRn結合親和力。
如本文中所使用，「胺基酸取代」係指給定胺基酸序列中之至少一個現有胺基酸殘基經另一不同「置換」胺基酸殘基置換。該或該等置換殘基可為「天然存在之胺基酸殘基」(亦即，由遺傳密碼編碼)且選自由以下組成之群：丙胺酸(Ala)；精胺酸(Arg)；天冬醯胺(Asn)；天冬胺酸(Asp)；半胱胺酸(Cys)；麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)；甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)；異白胺酸(Ile)：白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)；甲硫胺酸(Met)；苯丙胺酸(Phe)；脯胺酸(Pro)；絲胺酸(Ser)；蘇胺酸(Thr)；色胺酸(Trp)；酪胺酸(Tyr)；及纈胺酸(Val)。本文中之胺基酸取代定義亦涵蓋一或多個非天然存在之胺基酸殘基取代。「非天然存在之胺基酸殘基」係指除上文所列之彼等天然存在之胺基酸殘基以外的能夠共價結合多肽鏈中之一或多個相鄰胺基酸殘基的殘基。非天然存在之胺基酸殘基之實例為正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人，Meth. Enzym. 202:301-336(1991)中所述者。
術語「分析信號」係指偵測蛋白質-蛋白質相互作用之任何方法的輸出，包括(但不限於)比色分析之吸光度量測、螢光強度或衰變數/分鐘。分析格式可包括ELISA、facs或其他方法。「分析信號」之變化可反映細胞存活率之變化及/或動力學解離速率、動力學締合速率或兩者之變化。「更高分析信號」係指所量測的大於另一數值之輸出數值(例如，在ELISA分析中，與親本多肽相比，變異體可以具有更高(更大)的量測數值)。A「更低」分析信號係指所量測的小於另一數值之輸出數值(例如，在ELISA分析中，與親本多肽相比，變異體可以具有更低的(較小)量測數值)。
術語「結合親和力」係指與各Fc受體-Fc結合相互作用相關之平衡解離常數(以濃度單位表述)。結合親和力直接與動力學解離速率(通常以倒數時間單位報導，例如秒- 1 )除以動力學締合速率(通常以每單位時間之濃度單位報導，例如莫耳/秒)之比率相關。一般而言，不可能明確地表明平衡解離常數之變化是否是由於締合速率、解離速率或兩者之差異而導致，除非此等參數中之每一者以實驗方式經測定(例如，藉由BIACORE或 SAPIDYNE量測)。
如本文中所使用，術語「鉸鏈區」係指犬IgG延伸中之胺基酸延伸，例如犬IgG之位置216至位置230。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間二硫(S-S)鍵之半胱胺酸殘基置放在相同位置而與IgG序列對齊。
「Clq」為包括針對免疫球蛋白之Fc區之結合位點的多肽。Clq連同兩種絲胺酸蛋白酶Clr及Cls形成複合體Cl(CDC路徑之第一組分)。
如本文中所使用，術語「抗體」可與「免疫球蛋白」互換使用或「Ig」以最廣泛的意義使用且特定地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需生物活性或功能活性。本發明及術語「抗體」亦涵蓋包含來源於不同物種之部分的單鏈抗體及嵌合、犬或犬類化抗體，以及嵌合或CDR移植之單鏈抗體等。此等抗體之各種部分可藉由習知技術化學地、合成地連接在一起或可使用基因工程改造技術製備為連續蛋白。舉例而言，編碼嵌合或犬類化鏈之核酸可表現以產生連續蛋白質。參見例如，美國專利第4,816,567號；美國專利第4,816,397號； WO 86/01533；美國專利第5,225,539號；及美國專利第5,585,089號及第5,698,762號。關於靈長類化抗體亦參見Newman,R.等人，BioTechnology, 10:1455-1460, 1993，且關於單鏈抗體，參見Ladner等人，美國專利第4,946,778號及Bird,R.E.等人，Science, 242:423-426, 1988。應瞭解，包含Fc區(或其部分)之抗體之所有形式涵蓋於本文中之術語「抗體」中。此外，抗體可用可偵測標記來標記，固定於固相上及/或根據此項技術中已知之方法與異源化合物(例如，酶或毒素)共軛。
如本文中所使用，術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)直鏈抗體；單鏈抗體分子；Fc或Fc之肽、Fab及Fab片段，及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體片段較佳地保留鉸鏈之至少一部分且視情況IgG重鏈之CH1區。在其他較佳實施例中，抗體片段包含CH2區之至少一部分或整個CH2區。
如本文中所使用，當術語「功能片段」關於單株抗體使用時意欲指代單株抗體仍保留功能活性之部分。功能活性可為例如抗原結合活性或特異性、受體結合活性或特異性、效應功能活性等。單株抗體功能片段包括例如單獨的重鏈或輕鏈及其片段，諸如VL、VH及Fd；單價片段，諸如Fv、Fab及Fab'；二價片段，諸如F(ab')2；單鏈Fv(scFv)；及Fc片段。此類術語描述於例如Harlowe及Lane，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (編), New York: VCH Publisher, Inc.)；Huston等人, Cell Biophysics, 22:189-224 (1993)；Pluckthun及Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515(1989)及Day, E. D., Advanced Immunochemistry, 第二版, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y.(1990)中。術語功能片段意欲包括例如藉由蛋白酶消化或人類單株抗體之還原及藉由熟習此項技術者已知之重組DNA方法產生之片段。
如本文中所使用，術語「片段」係指包含另一多肽之胺基酸序列之至少5、15、20、25、40、50、70、90、100或更多個相鄰胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽。在一較佳實施例中，多肽之片段保留全長多肽之至少一個功能。
如本文中所使用，術語「嵌合抗體」包括單價、二價或多價免疫球蛋白。單價嵌合抗體為由嵌合重鏈經由與嵌合輕鏈之二硫橋鍵締合形成的二聚體。二價嵌合抗體為由兩個重鏈-輕鏈二聚體經由至少一個二硫橋鍵締合形成的四聚體。用於犬之抗體之嵌合重鏈包含來源於非犬抗體之重鏈的與犬重鏈恆定區之至少一部分，諸如CH1或CH2連接的抗原結合區。用於犬之抗體之嵌合輕鏈包含來源於非犬抗體之輕鏈的與犬輕鏈恆定區(CL)之至少一部分連接的抗原結合區。具有相同或不同可變區結合特異性之嵌合重鏈及輕鏈的抗體、片段或衍生物亦可藉由個別多肽鏈根據已知方法步驟之適當締合來製備。藉由此途徑，將表現嵌合重鏈之宿主與表現嵌合輕鏈之宿主單獨培養，且免疫球蛋白鏈經單獨地回收且接著進行締合。替代地，宿主可進行共培養且使各鏈在培養基中自發地締合，接著回收經組裝之免疫球蛋白或片段，或重鏈及輕鏈均可在相同宿主細胞中表現。用於產生嵌合抗體之方法為此項技術中熟知的(參見例如美國專利第6,284,471號；第5,807,715號；第4,816,567號；及第4,816,397號)。
如本文中所使用，非犬(例如鼠類)抗體之「犬類化」形式(亦即，犬類化抗體)為含有來源於非犬免疫球蛋白之最少序列或沒有來源於非犬免疫球蛋白之序列的抗體。在極大程度上，犬類化抗體係犬免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的高變區之殘基經來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔、人類或非人類靈長類動物之非犬物種(供者抗體)的高變區之殘基置換。在一些情況下，犬免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應的非犬殘基置換。此外，犬類化抗體可包含在接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。通常進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，犬類化抗體將包含基本上全部至少一個，且通常兩個可變域，其中全部或基本上全部高變環(CDR)對應於非犬免疫球蛋白之彼等高變環且全部或基本上全部FR殘基為犬免疫球蛋白序列之彼等FR殘基。犬類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分(Fc)，通常犬免疫球蛋白之至少一部分。
如本文中所使用，術語「免疫黏附素」表示將異源「黏附素」蛋白質(例如，受體、配位體或酶)之結合域與免疫球蛋白恆定域組合之抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含除抗體(亦即，為「異源」)之抗原識別及結合位點(抗原組合位點)以外的黏附素胺基酸序列以所需結合特異性與免疫球蛋白恆定域序列之融合。
如本文中所使用，術語「配位體結合域」係指任何天然受體或保持對應天然受體之至少一種定性配位體結合能力的其任何區或衍生物。在某些實施例中，受體來自具有與免疫球蛋白超基因家族成員同源之胞外域的細胞表面多肽。不為免疫球蛋白超基因家族成員，但此定義仍然特定涵蓋之其他受體為細胞因子之受體，且特定言之具有酪胺酸激酶活性之受體(受體酪胺酸激酶)(造血素及神經生長因子受體超家族之成員)，及細胞黏附分子(例如，E-選擇素、L-選擇素及P-選擇素)。
如本文中所使用，術語「受體結合域」係指受體之任何天然配位體，包括例如細胞黏附分子，或此類天然配位體之保持對應天然配位體之至少一種定性受體結合能力的任何區或衍生物。
如本文中所使用，「經分離」多肽為自其天然環境之組分鑑別及分離及/或回收之多肽。其天然環境之污染組分為將干擾多肽之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在某些實施例中，經分離多肽經純化(1)至大於95重量%之多肽，如藉由洛瑞法(Lowry method)所測定，且更佳大於99重量%，(2)在一定程度上藉由使用旋轉杯式定序儀(spinning cup sequenator)足以獲得至少15個N端殘基或內部胺基酸序列，或(3)藉由SDS-page在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍或銀染色(Coomassie blue or silver stain)達至均質性。經分離之多肽包括原位存在於重組細胞內之多肽，因為多肽之天然環境中的至少一種組分將不存在。然而，通常經分離之多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文中所使用，術語「病症」及「疾病」可互換地使用以指代將得益於用變異多肽(包含本發明之變異Fc區的多肽)治療之任何病狀，包括慢性及急性病症或疾病(例如，使患者易患特定病症之病理學病狀)。
如本文中所使用，術語「受體」係指能夠結合至少一種配位體之多肽。較佳受體為具有胞外配位體結合域及視情況其他域(例如，跨膜域、胞內域及/或膜錨)之細胞表面或可溶性受體。在本文中所描述之分析中評估之受體可為完整受體或其片段或衍生物(例如，包含與一或多種異源多肽融合之受體之結合域的融合蛋白)。此外，用於評估受體之結合性質的受體可存在於細胞中或經分離且視情況塗佈於分析培養盤或某一其他固相上或經直接標記且用作探針。犬野生型 IgG
犬IgG為此項技術中熟知的且充分描述於例如Bergeron等人, 2014,Vet Immunol Immunopathol ., 第157 (1-2)卷, 第31-41頁中。在一個實施例中，犬IgG為IgGA 。在另一實施例中，犬IgG為IgGB 。在又一實施例中，犬IgG為IgGC 。在另一實施例中，犬IgG為IgGD 。在一特定實施例中，犬IgG為IgGB _65。
IgGA 、IgGB 、IgGC 及IgGD 之胺基酸及核酸序列在此項技術中亦為熟知的。
在一個實例中，本發明之IgG包含恆定域，例如CH1、CH2或CH3域，或其組合。在另一實施例中，本發明之恆定域包含Fc區，包括例如CH2或CH3域，或其組合。
在一特定實例中，野生型恆定域包含SEQ ID NO.:2中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，野生型IgG恆定域係SEQ ID NO.:2之同系物、變異體、異構體或功能片段，但不含位置434之任何突變。各可能性代表本發明之各別實施例。
IgG恆定域亦包括具有與重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列實質上類似之胺基酸序列的多肽。實質上相同的胺基酸序列在本文所定義為與比較胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列，如藉由根據Pearson及Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)之FASTA搜索法所測定。
本發明亦包括本文中所描述之編碼IgG或其部分之核酸分子。在一個實施例中，核酸可編碼包含例如CH1、CH2、CH3區或其組合之抗體重鏈。在另一實施例中，核酸可編碼包含例如VH區中之任一者或其部分，或VH CDR中之任一者，包括其任何變異體之抗體重鏈。本發明亦包括編碼抗體輕鏈之核酸分子，該抗體輕鏈包含例如CL區中之任一者或其部分、VL區中之任一者或其部分，或VL CDR中之任一者，包括其任何變異體。在某些實施例中，核酸編碼重鏈及輕鏈兩者或其部分。
SEQ ID NO.:2中闡述之野生型恆定域之胺基酸序列係由SEQ ID NO.:4中闡述之核酸序列編碼。經修飾之犬 IgG
本申請案之本發明人已發現用另一胺基酸取代位置434之胺基酸殘基天冬醯胺(Asn或N)出人意料地且未預期地增強針對FcRn之親和力，且延長IgG之半衰期。如本文中所使用，術語位置434係指根據如Kabat中之EU索引編號的位置(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種經修飾之IgG，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。位置434之天冬醯胺可經任何其他胺基酸取代。舉例而言，位置434之天冬醯胺可經以下取代：組胺酸(亦即，N434H)、絲胺酸(亦即，N434S)、丙胺酸(亦即，N434A)、苯丙胺酸(亦即，N434F)、甘胺酸(亦即，N434G)、異白胺酸(亦即，N434I)、離胺酸(亦即，N434K)、白胺酸(亦即，N434L)、甲硫胺酸(亦即，N434M)、麩醯胺酸(亦即，N434Q)、精胺酸(亦即，N434R)、蘇胺酸(亦即，N434T)、纈胺酸(亦即，N434V)、色胺酸(亦即，N434W)、酪胺酸(亦即，N434Y)、半胱胺酸(亦即，N434C)、天冬胺酸(亦即，N434D)、麩胺酸(亦即，N434E)或脯胺酸(亦即，N434P)。在一特定實施例中，取代係經組胺酸取代(亦即，N434H)。
在一特定實例中，本發明之突變恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，突變IgG恆定域係SEQ ID NO.:1之同系物、變異體、異構體或功能片段，但具有位置434之突變。各可能性代表本發明之各別實施例。
SEQ ID NO.:1中闡述之突變恆定域之胺基酸序列係由其對應突變核酸序列，例如SEQ ID NO.:4中闡述之核酸序列之突變形式編碼。
在一些實施例中，本發明之突變恆定域包含SEQ ID NO.:65或66中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，突變IgG恆定域係SEQ ID NO.:65或66之同系物、變異體、異構體或功能片段，但具有位置434之突變。各可能性代表本發明之各別實施例。
SEQ ID NO.:65或66中所闡述之突變恆定域之胺基酸序列係由其對應突變核酸序列編碼。
在一個態樣中，本發明之經修飾之IgG提供範圍介於約10天至約35天時間段的半衰期。在一個實施例中，本發明之經修飾之IgG提供約10、12、15、17、19、20、23、26、28、30、33或35天的半衰期。在一特定實施例中，本發明之經修飾之IgG提供大於30天的半衰期。
在一個態樣中，本發明之經修飾之IgG保持範圍介於約1個月至約7個月時間段的治療性血清水準。在一個實施例中，本發明之經修飾之IgG保持約7、14、28、56、84、112、140、168或210天的治療性血清水準。在一特定實施例中，本發明之經修飾之IgG保持大於3個月的治療性血清水準。用於製備本發明之抗體分子的方法
用於製備抗體分子的方法為此項技術中熟知的且充分描述於美國專利8,394,925；8,088,376； 8,546,543；10,336,818；及9,803,023及美國專利申請案公開案20060067930中，該等專利以全文引用之方式併入本文中。可使用熟習此項技術者已知的任何適合之方法、製程或技術。具有本發明之變異Fc區的抗體分子可根據此項技術中熟知的方法來產生。在一些實施例中，變異Fc區可與所選異源多肽，諸如抗體可變域或受體或配位體之結合域融合。
隨著分子生物學及重組技術方法之出現，熟習此項技術之人員可藉由重組方式產生抗體及抗體樣分子且藉此產生編碼在抗體之多肽結構中發現之特異性胺基酸序列的基因序列。此類抗體可藉由選殖編碼該等抗體之多肽鏈的基因序列或藉由直接合成該等多肽鏈及組裝合成鏈以形成針對特定抗原決定基及抗原決定子具有親和力之活性四聚(H2L2)結構來製備。此允許準備產生具有來自不同物種及來源之中和抗體之序列特徵的抗體。
無論抗體之來源如何，或其如何以重組方式構築，或其如何在活體外或活體內使用轉殖基因動物(實驗室或商業規模之大細胞培養物)、使用轉殖基因植物，或藉由在製程之任何階段不採用活生物體而直接進行化學合成來合成，所有抗體均具有整體類似的3維結構。此結構通常以H2L2形式提供且指代抗體通常包含兩條輕(L)胺基酸鏈及2條重(H)胺基酸鏈的事實。兩條鏈具有能夠與結構上互補之抗原目標交互的區。與該目標交互之區稱為「可變」或「V」區且其特徵在於具有不同抗原特異性之抗體的胺基酸序列不同。H或L鏈之可變區含有能夠特異性結合於抗原目標之胺基酸序列。
如本文中所使用，術語「抗原結合區」係指抗體分子之含有與抗原相互作用且向抗體賦予其針對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分。抗體結合區包括保持抗原結合殘基之恰當構形所必需的「構架」胺基酸殘基。在提供抗原結合區之H或L鏈之可變區內為稱為「高變」之小序列，因為其在不同特異性抗體之間具有極高變異性。此類高變區亦稱為「互補決定區」或「CDR」區。此等CDR區造成抗體針對特定抗原決定子結構之基本特異性。
CDR表示可變區內之非相鄰胺基酸延伸，但與物種無關，已發現此等重要胺基酸序列在可變重鏈及輕鏈區內之位置在可變鏈之胺基酸序列內具有類似位置。所有抗體之可變重鏈及輕鏈各自具有三個彼此不相鄰的CDR區。在所有哺乳動物物種中，抗體肽含有恆定(亦即，高度保守性)及可變區，且在後者中存在CDR，且所謂的「構架區」由在重鏈或輕鏈之可變區內但在CDR之外的胺基酸序列構成。
本發明進一步提供包括上文所描述之核酸中之至少一者的載體。因為遺傳密碼係簡併的，所以可使用超過一個密碼子編碼特定胺基酸。使用遺傳密碼，可鑑別出一或多種不同核苷酸序列，其中之每一者將能夠編碼胺基酸。特定寡核苷酸實際上將構成實際編碼序列之機率可藉由考慮異常鹼基配對關係及在表現抗體或部分之真核或原核細胞中實際上使用(編碼特定胺基酸的)特定密碼子的頻率來估算。Lathe等人，183 J. Molec. Biol. 1-12(1985)揭示了此類「密碼子使用規則」。使用Lathe之「密碼子使用規則」，可鑑別出含有理論上能夠編碼犬IgG序列之「最可能」核苷酸序列的單核苷酸序列或核苷酸序列之集合。亦預期編碼用於本發明之區的抗體亦可藉由使用產生本文中所描述之抗體及肽之變異體的標準分子生物技術改變現有抗體基因來提供。此類變異體包括(但不限於)抗體或肽之胺基酸序列的缺失、添加及取代。
舉例而言，一類取代為保守性胺基酸取代。此類取代為犬抗體肽中之既定胺基酸經另一具有類似特徵之胺基酸取代的彼等取代。通常視為保守性取代的是脂族胺基酸Ala、Val、Leu及lie中之一個置換成另一個；羥基殘基Ser及Thr之互換；酸性殘基Asp及Glu之交換；醯胺殘基Asn與Gin之間的取代；鹼性殘基Lys及Arg之交換；芳族殘基Phe、Tyr等中之置換。關於那些胺基酸變化有可能在表現型上沉默之指南發現於Bowie等人，247Science 1306-10 (1990)。
變異犬抗體或肽可能為全功能或可能在一或多個活動中缺乏功能。全功能變異體通常僅含有保守性變型或非關鍵殘基或非關鍵區中之變型。功能變異體亦可含有使得功能無變化或不明顯變化的類似胺基酸取代。替代地，此類取代可能在一定程度上對功能產生正面或負面影響。非功能性變異體通常含有一或多種非保守性胺基酸取代、缺失、插入、反轉或截短，或關鍵殘基或關鍵區中之取代、插入、反轉或缺失。
可藉由此項技術中已知之方法(諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發)鑑別出功能必需的胺基酸。Cunningham等人，244Science 1081-85 (1989)。後一程序在分子中之每個殘基處引入單丙胺酸突變。隨後測試所得突變分子之生物活性，諸如抗原決定基結合或活體外ADCC活性。對於配位體-受體結合關鍵之位點亦可藉由結構分析(諸如結晶學)、核磁共振或光親和性標記來測定。Smith等人，224J . Mol . Biol . 899-904 (1992)；de Vos等人, 255Science 306-12 (1992)。
此外，多肽通常含有除二十種「天然存在」胺基酸以外之胺基酸。此外，包括末端胺基酸之許多胺基酸可藉由天然過程(諸如加工及其他轉譯後修飾)或藉由此項技術中熟知的化學修飾技術來修飾。已知修飾包括(但不限於)乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價附接、血紅素部分之共價附接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價附接、脂質或脂質衍生物之共價附接、磷脂醯肌醇之共價附接、交聯、環化、雙硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、胱胺酸之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、伽瑪羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉移RNA介導之胺基酸添加至蛋白質(諸如精氨醯化)及泛蛋白化。此類修飾已為熟習此項技術者所熟知且非常詳細地描述於科學文獻中。舉例而言，幾種特定地常見修飾糖基化、脂質附接、硫酸化、麩胺酸殘基之伽瑪羧化、羥基化及ADP核糖基化描述於大多數基礎本文中，諸如Proteins-Structure and Molecular Properties (第2版，T. E. Creighton, W. H. Freeman & Co., N.Y., 1993)。可獲得關於此主題之許多詳細的綜述，諸如根據Wold，Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson編., Academic Press, N.Y., 1983)；Seifter等人. 182Meth . Enzymol . 626-46 (1990)；及Rattan等人，663Ann . NY Acad . Sci . 48-62 (1992)。
在另一態樣中，本發明提供抗體衍生物。抗體之「衍生物」含有通常並非蛋白質之一部分的其他化學部分。蛋白質之共價修飾包括於本發明之範疇內。可藉由使抗體之目標胺基酸殘基與有機衍生劑反應將此類修飾引入分子中，該有機衍生劑能夠與所選側鏈或末端殘基反應。舉例而言，用此項技術中熟知的雙官能性試劑進行衍生化適用於將抗體或片段與水不可溶載體基質或與其他巨分子載劑交聯。
衍生物亦包括經標記的放射性標記之單株抗體。舉例而言，放射性碘(251、1311)、碳(4C)、硫(35S)、銦、氚(H3 )或類似者；單株抗體與生物素或抗生素蛋白、與酶(諸如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、澱粉酶、羧酸脫水酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶或葡萄糖6-磷酸酯脫氫酶)之結合物；以及單株抗體與生物發光劑(諸如螢光素酶)、靜默變化劑(諸如吖啶酯)或螢光劑(諸如藻膽蛋白)之結合物。
本發明之另一衍生物雙官能性抗體為藉由組合兩種單獨抗體之識別兩種不同抗原基團的部分而產生的雙特異性抗體。此可藉由交聯或重組技術來實現。另外，各部分可添加至抗體或其部分中以增加活體內半衰期(例如，藉由延長達至血流清除之時間)。此類技術包括例如添加PEG部分(亦稱為聚乙二醇化)，且為此項技術中熟知的。參見美國專利申請公開案第20030031671號。
在一些實施例中，將編碼本發明抗體之核酸直接引入至宿主細胞中，且在足以誘導編碼之抗體表現之條件下培育細胞。在本發明核酸已引入至細胞中之後，典型地通常在37℃下(有時在選擇下)培育細胞約1至24小時的時間段以便允許抗體表現。在一個實施例中，抗體經分泌於細胞生長之培養基之上清液中。傳統上，在鼠類雜交瘤株中產生呈天然分子形式之單株抗體。除了彼技術之外，本發明提供抗體之重組DNA表現。此允許在所選宿主物種中產生抗體，以及一系列抗體衍生物及融合蛋白質。
編碼本發明之至少一種抗體、部分或多肽之核酸序列可根據習知技術與載體DNA重組，該等技術包括用於連接之平端式或交錯端式末端、提供適當末端之限制酶消化、黏合末端視需要之填充、避免不當連接之鹼性磷酸酶處理及利用適當連接酶之連接。此類操縱之技術係藉由例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 及1989)及上述之Ausubel等人，1993揭示，可用於構築編碼抗體分子或其抗原結合區之核酸序列。
若諸如DNA之核酸分子含有含轉錄及轉譯調節資訊之核苷酸序列且此類序列「可操作地連接」至編碼多肽之核苷酸序列，則該核酸分子稱為「能夠表現」該多肽。可操作鍵聯為其中視圖表現之調節DNA序列及DNA序列以允許基因表現為可回收量的肽或抗體部分之方式連接的鍵聯。基因表現所需之調節區之精確性質可能因不同生物體而不同，如類似技術中所熟知。參見例如上述之Sambrook等人，2001；上述之Ausubel等人，1993。
因此，本發明涵蓋原核或真核細胞中之抗體或肽之表現。適合之宿主包括細菌或真核宿主，包括活體內或原位的細菌、酵母菌、昆蟲、真菌、鳥類及哺乳動物細胞，或哺乳動物、昆蟲、鳥類或酵母菌來源之宿主細胞。哺乳動物細胞或組織可屬於人類靈長類、倉鼠、兔、嚙齒類動物、乳牛、豬綿羊、馬、山羊、犬或貓來源。亦可使用此項技術中已知的任何其他適合之哺乳動物細胞。
在一個實施例中，本發明之核苷酸序列將併入至能夠在接受者宿主中自發複製的質體或病毒載體中。廣泛多種載體中之任一者可用於此目的。參見例如上述之Ausubel等人，1993。選擇特定質體或病毒載體之重要因素包括：可自不含有載體之彼等接受者細胞中識別且選擇出含有載體之接受者細胞的容易性；特定宿主中所需要的載體複本數目；及是否期望能夠在不同物種之宿主細胞之間「穿梭」載體。
此項技術中已知之實例原核載體包括質體，諸如能夠在大腸桿菌中複製之彼等質體(諸如(例如)pBR322、CoIE1、pSC101、pACYC 184、.pi.vX)。舉例而言，此類質體係藉由上述之Maniatis等人，1989；上述之Ausubel等人，1993揭示。芽孢桿菌屬質體包括pC194、pC221、pT127等。此類質體係藉由Gryczan揭示於THE MOLEC BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982)中。適合的鏈黴菌屬質體包括p1J101 (Kendall等人, 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987))及鏈黴菌屬噬菌體，諸如phLC31(Chater等人於SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 ( Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986)中)。假單胞菌屬質體經綜述於John等人, 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986)；lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978)；及上述之Ausubel等人, 1993中。
替代地，適用於表現編碼抗體或肽之cDNA的基因表現元件包括(但不限於)(a)病毒轉錄啟動子及其強化子元件，諸如SV40早期啟動子(Okayama等人, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983))、勞氏肉瘤病毒LTR (Gorman等人，79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982))及莫洛尼鼠類白血病病毒LTR (Grosschedl等人, 41 Cell 885 (1985))；(b)剪接區及聚腺苷酸化位點，諸如衍生自SV40晚期區之彼等(Okayarea等人，1983)；及(c)諸如SV40中之聚腺苷酸化位點(Okayama等人，1983)。
可如Weidle等人,51 Gene 21 (1987)所描述，使用SV40早期啟動子及其強化子、小鼠免疫球蛋白H鏈啟動子強化子、SV40晚期區mRNA剪接、兔S-血球蛋白插入、免疫球蛋白及兔S-血球蛋白聚腺苷酸化位點及SV40聚腺苷酸化元件作為表現元件來表現免疫球蛋白cDNA基因。對於由部件cDNA、部件基因體DNA構成之免疫球蛋白基因(Whittle等人, 1 Protein Engin. 499 (1987))，轉錄啟動子可為人類細胞巨大病毒，啟動子強化子可為細胞巨大病毒及小鼠/人類免疫球蛋白，且mRNA剪接及聚腺苷酸化區可為天然染色體免疫球蛋白序列。
在一個實施例中，針對嚙齒類動物細胞中之cDNA基因表現，轉錄啟動子為病毒LTR序列，轉錄啟動子強化子為小鼠免疫球蛋白重鏈強化子及病毒LTR強化子中之任一者或兩者，剪接區含有大於31 bp之內含子，且聚腺苷酸化及轉譯終止區衍生自與將合成之免疫球蛋白鏈相對應的天然染色體序列。在其他實施例中，編碼其他蛋白質之cDNA序列與上文列舉之表現元件組合以實現哺乳動物細胞中之蛋白質表現。
各融合基因可組裝於表現載體中或插入至表現載體中。能夠表現免疫球蛋白鏈基因產物之接受者細胞隨後僅傳染有肽或H或L鏈編碼基因，或共轉染有H及L鏈基因。經轉染之受體細胞在准許合併基因之表現的條件下培養且自培養物回收表現的免疫球蛋白鏈或完整抗體或片段。
在一個實施例中，編碼肽或H及L鏈之融合基因或其部分經組裝於個別表現載體中，該等表現載體隨後用以共轉染接受者細胞。替代地，編碼H及L鏈之融合基因可組裝於相同表現載體上。對於表現載體之轉染及抗體之產生，接受者細胞株可為骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞可合成、組裝及分泌由經傳染之免疫球蛋白基因編碼之免疫球蛋白且具有使免疫球蛋白糖基化之機制。骨髓瘤細胞可在培養物中或在小鼠之腹腔中生長，其中分泌之免疫球蛋白可自腹水流體中獲得。其他適合之接受者細胞包括淋巴細胞，諸如犬或非犬來源之B淋巴球；犬或非犬來源之融合瘤細胞；或物種間的異種融合瘤細胞。
攜載本發明之抗體構築體或多肽的表現載體可藉由多種適合之方式中之任一者引入至適當宿主細胞中，該等方式包括生物化學方式，諸如轉化、轉染、共軛、原生質體融合、磷酸鈣-沈澱及施用諸如二乙胺基乙基(DEAE)聚葡糖的聚陽離子；及機械方式，諸如電穿孔、直接顯微注射及微彈轟擊。Johnston等人，240Science 1538 (1988)。
對於免疫球蛋白H及L鏈之產生，酵母菌可提供優於細菌之明顯優勢。酵母菌會進行包括糖基化之轉譯後肽修飾。目前存在多種利用強啟動子序列及高質體複本數之重組DNA策略。該等強啟動子序列及高質體複本數可用於在酵母菌中產生所需蛋白質。酵母菌識別經選殖哺乳動物基因產物之前導序列且分泌攜帶前導序列之肽(亦即前肽)。Hitzman等人, 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)。
可常規地評估酵母菌基因表現系統之肽、抗體、其片段及區的產生量、分泌量及穩定性。當酵母菌在富含葡萄糖之培養基中生長時，可利用一系列酵母菌基因表現系統中之任一者，該等系統併入了來自編碼大量產生之糖分解酶之有效表現基因的啟動子及終止元件。已知糖分解基因亦可提供極有效的轉錄控制信號。舉例而言，可利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因之啟動子及終止子信號。可採取多種途徑來評估用於在酵母菌中表現經選殖免疫球蛋白cDNA之最優表現質體。參見第II卷DNA Cloning, 45-66, (Glover編) IRL Press, Oxford, UK 1985)。
細菌菌株亦可用作用以產生本發明所述之抗體分子或肽的宿主。將含有衍生自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體結合此等細菌宿主使用。載體通常攜帶複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之特定基因。可採用多種途徑來評估用於在細菌中產生由經選殖免疫球蛋白cDNA編碼之抗體、片段及區或抗體鏈之表現質體(參見上述之Glover, 1985；上述之Ausubel, 1993；上述之Sambrook, 2001；Colligan等人編. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1994-2001)；Colligan等人編. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1997-2001))。
宿主哺乳動物細胞可活體外或活體內生長。哺乳動物細胞提供針對免疫球蛋白蛋白分子之轉譯後修飾，包括前導肽移除、H及L鏈之摺疊及組裝、抗體分子之糖基化及功能性抗體蛋白質之分泌。除了上文所描述之淋巴來源之細胞之外，可用作產生抗體蛋白之宿主的哺乳動物細胞包括纖維母細胞來源之細胞，諸如Vero (ATCC CRL 81)或CHO-K1 (ATCC CRL 61)細胞。許多載體系統可用於在哺乳動物細胞中表現選殖肽H及L鏈基因(參見上述之Glover，1985)。可遵循不同途徑以獲得完全H2L2抗體。可能在相同細胞中共表現H及L鏈以實現H及L鏈胞內締合及鍵聯成完全四聚體H2L2抗體及/或肽。可藉由在相同宿主中使用相同或不同的質體來進行共表現。H及L鏈及/或肽之基因可置放於相同質體中，隨後將該質體轉染至細胞中，藉此直接選擇表現該兩條鏈之細胞。替代地，細胞可首先轉染有編碼一條鏈(例如L鏈)之質體，接著使所得細胞株轉染有含第二可選標記之H鏈質體。經由任一途徑產生肽及/或H2L2分子之細胞株可轉染有編碼其他肽複本、H、L或H加L鏈以及前他可選標記之質體以產生具有增強特性之細胞株，諸如更高的產生經組裝H2L2抗體分子或經轉染細胞株之穩定性增強。
為長期、高產率產生重組型抗體，可使用穩定表現。舉例而言，可對穩定表現抗體分子之細胞株進行工程改造。勝於使用含有病毒複製起點之表現載體，宿主細胞可用免疫球蛋白表現卡匣及可選標記轉化。在引入外源DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1至2天，且接著轉換成選擇性培養基。重組型質體中之可選標記賦予對選擇之抵抗性且允許細胞將質體穩定整合至染色體中並生長以形成又可選殖且擴展至細胞株中的焦點。此類經工程改造之細胞株可特別適用於篩選及評估直接地或間接地與抗體分子相互作用的化合物/組分。
一旦產生本發明抗體，則可藉由此項技術中已知的用於純化免疫球蛋白分子之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力、針對蛋白質A之後的特定抗原之特定親和力及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解性或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術來將其純化。在許多實施例中，抗體由細胞分泌至培養基中且自培養基中收集。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於胺基酸殘基434。在一個實施例中，取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
具有取代之抗體可為熟習此項技術者已知的任何適合之抗體。在一個實例中，抗體為抗IL31抗體。在另一實例中，抗體為抗NGF抗體。
本文中所描述之不含取代之抗IL31抗體為此項技術中所熟知的且充分描述於例如美國專利10,526,405；10,421,807；9,206,253；及8,790,651中。另外，本文中所描述之不含取代之抗NGF抗體亦為此項技術中所熟知的且充分描述於例如美國專利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；及9,505,829中。
在一個實施例中，本發明之抗IL31抗體(亦即，具有取代之抗體)減少、抑制或中和IL-31介導之搔癢或過敏性病狀。在另一實施例中，本發明之抗IL31抗體減少、抑制或中和犬之IL-31活性。
在一個實例中，本發明之抗IL31抗體結合於處於SEQ ID NO: 44之犬IL-31胺基酸序列之約胺基酸殘基95與125之間的區，較佳地處於SEQ ID NO: 44之犬IL-31序列之約胺基酸殘基102與122之間的區的IL-31。
抗IL31抗體之VL、VH及CDR序列為此項技術中所熟知的且充分描述於例如美國專利10,526,405；10,421,807；9,206,253；及8,790,651中。在一個實例中，本發明之抗IL31抗體可包括互補決定區(CDR)序列之以下組合中之至少一者：(1) 11E12:SEQ ID NO: 13之可變重鏈(VH)-CDR1、SEQ ID NO: 15之VH-CDR2、SEQ ID NO: 17之VH-CDR3、SEQ ID NO: 19之可變輕鏈(VL)-CDR1、SEQ ID NO: 21之VL-CDR2及SEQ ID NO: 23之VL-CDR3；或(2) 34D03:SEQ ID NO: 14之VH-CDR1、SEQ ID NO: 16之VH-CDR2、SEQ ID NO: 18之VH-CDR3、SEQ ID NO: 20之VL-CDR1、SEQ ID NO: 22之VL-CDR2及SEQ ID NO: 24之VL-CDR3。在一些實施例中，本發明之抗IL31抗體可包括本文中所描述之至少一種CDR。
在一個實施例中，本發明之抗IL31抗體可包括可變輕鏈，該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 25 (MU-11E12-VL)、SEQ ID NO: 26 (CAN-11E12-VL-cUn-FW2)、SEQ ID NO: 27 (CAN-11E12-VL-cUn-13)、SEQ ID NO: 28 (MU-34D03-VL)或SEQ ID NO: 29 (CAN-34D03-VL-998-1)中所闡述之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明之抗IL31抗體可包括可變重鏈，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 30 (MU-11E12-VH)、SEQ ID NO: 31 (CAN-11E12-VH-415-1)、SEQ ID NO: 32 (MU-34D03-VH)或SEQ ID NO: 33 (CAN-34D03-VH-568-1)中所闡述之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明之突變抗NGF抗體(亦即具有取代之抗體)減少、抑制或中和動物中之NGF活性，及/或增強抑制NGF結合於Trk A及p75之能力，以便治療NGF介導之疼痛或病狀。
抗NGF抗體之VL、VH及CDR序列亦為此項技術中所熟知的且充分描述於例如美國專利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；及9,505,829中。在一個實例中，本發明之抗NGF抗體可包括以下互補決定區(CDR)序列中之至少一者：ZTS-841:SEQ ID NO: 57之可變重鏈(VH)-CDR1、SEQ ID NO: 58之VH-CDR2、SEQ ID NO: 59之VH-CDR3、SEQ ID NO: 62之可變輕鏈(VL)-CDR1、SEQ ID NO: 63之VL-CDR2及SEQ ID NO:64之VL-CDR3。在一些實施例中，VL-CDR2具有SEQ ID NO: 63之GNG殘基。
在一個實施例中，本發明之抗NGF抗體可包括可變輕鏈，該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 61(CAN-ZTS-841-VL)中所闡述之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體可包括可變重鏈，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 56(CAN-ZTS-841-VH)中所闡述之胺基酸序列。醫藥學及獸醫學應用
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之分子及一或多種醫藥學上可接受之載劑。更特定言之，本發明提供一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑及作為活性成分的本發明之抗體或肽。
「醫藥學上可接受之載劑」包括對於以所採用劑量及濃度暴露於其中之細胞或動物為無毒的任何賦形劑。醫藥組合物可包括一種或額外治療劑。
「醫藥學上可接受」係指彼等化合物、材料、組合物及/或劑型在合理醫學判斷之範疇內，適於與動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題併發症，與合理的效益/風險比相稱。
醫藥學上可接受之載劑包括溶劑、分散介質、緩衝液、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、潤濕劑、防腐劑、傢伙(buggers)、螯合劑、抗氧化劑、等張劑及吸收延遲劑。
醫藥學上可接受之載劑包括水；生理食鹽水；磷酸鹽緩衝鹽水；右旋糖；甘油；諸如乙醇及異丙醇之醇；磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白之蛋白質；諸如聚乙烯吡咯啶酮之親水性聚合物；諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸之胺基酸；單醣、雙醣及其他包括葡萄糖、甘露糖或糊精之碳水化合物；EDTA；諸如鈉之成鹽相對離子；及/或諸如TWEEN、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS之非離子界面活性劑；諸如糖、多元醇(諸如甘露醇及山梨醇)及氯化鈉之等張劑；以及其組合。
本發明之醫藥組合物可以多種方式調配，包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、脂質體、栓劑、錠劑、丸劑或散劑。在一些實施例中，組合物係呈可注射或可輸注溶液形式。組合物可呈適於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、非經腸、經黏膜、經口、局部或經皮投與之形式。組合物可調配為立即、控制、延長或延遲釋放組合物。
本發明之組合物可以單獨的治療劑形式或與其他治療劑組合之形式投與。其可單獨投與，但通常與基於所選投藥途徑及標準醫藥實踐選擇的醫藥學載劑一起投與。本文所揭示之抗體之投藥可藉由任何適合之手段進行，包括非經腸注射(諸如腹膜內、皮下或肌肉內注射)、經口，或藉由將抗體(典型地攜載於醫藥調配物中)局部投與至呼吸道表面。局部投與至呼吸道表面可藉由鼻內投與(例如藉由使用滴管、拭子或吸入器)來進行。抗體局部投與至呼吸道表面亦可藉由吸入投與，諸如藉由形成呈氣霧懸浮液形式的含有抗體之醫藥調配物之可吸入粒子，且接著使個體吸入該等可吸入粒子來進行。用於投與醫藥調配物之可吸入粒子的方法及裝置為吾人所熟知的，且可採用任何習知技術。
在一些所需實施例中，抗體藉由非經腸注射來投與。對於非經腸投與，抗體或分子可結合醫藥學上可接受之非經腸媒劑調配為溶液、懸浮液、乳液或凍乾粉形式。舉例而言，媒劑可為抗體溶液或其溶解於可接受之載劑(諸如水性載劑)中的混合物，此類媒劑為水、生理鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液或5%血清白蛋白、0.4%生理鹽水、0.3%甘胺酸及類似者。亦可使用脂質體及非水性媒劑，諸如非揮發性油。此等溶液為無菌的且通常不含顆粒物質。此等組合物可藉由習知熟知滅菌技術來滅菌。組合物可含有醫藥學上可接受之輔助物質，如大致生理條件所需要，諸如pH調節劑及緩衝劑、毒性調節劑及其類似者，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。此等調配物中之抗體濃度可廣泛變化，例如自小於約0.5重量%，通常為或至少約為1重量%至高達15重量%或20重量%，且將根據所選擇之特定投藥模式主要基於液體體積、黏度等來選擇。媒劑或凍乾粉可含有維持等張性之添加劑(例如氯化鈉、甘露醇)及維持化學穩定性之添加劑(例如緩衝液及防腐劑)。調配物藉由常用技術來滅菌。用於製備非經腸可投與組合物之實際方法將為熟習此項技術者已知或顯而易見，且其更詳細地描述於例如REMINGTON'S PHARMA. SCI. (第15版, Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)中。
本發明之抗體或分子可凍乾以便儲存且在使用之前在適合之載劑中復原。此技術已顯示對習知免疫球蛋白有效。可採用任何適合之凍乾及復原技術。熟習此項技術者應瞭解，凍乾及復原可引起不同程度的抗體活性損失且可必須調整使用水準以補償。可投與含有本發明抗體或其混合物之組合物以預防現有疾病之復發及/或治療性治療現有疾病。適合之醫藥學載劑描述於最近版本之雷明頓氏醫藥科學(此技術領域中之標準參考本文)中。在治療性應用中，向已經患有疾病之個體投與足以治癒或至少部分地遏制或減輕疾病及其併發症之量的組合物。
用於治療如本文所描述之病狀或疾病的本發明之組合物的有效劑量視許多不同因素而變化，該等因素包括例如但不限於特定藥劑之藥效學特徵及其投藥模式及途徑；目標位點；動物之生理狀態；所投與之其他藥物；治療為預防性的抑或治療性的；接受者之年齡、健康狀況及體重；症狀之性質及程度、並行治療之類別、治療頻率及所需效果。
單次或多次投與組合物可以在治療獸醫所選之劑量及模式下進行。在任何情況下，醫藥調配物應提供足以有效治療個體之量的一或多種本發明抗體。在一例示性實施例中，本發明之組合物係兩個月一次、三個月一次、四個月一次、五個月一次、六個月一次或七個月一次地進行投與。
治療劑量可使用熟習此項技術者已知之常規方法來滴定以使安全性及功效最佳化。
本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」。「治療有效量」係指在所需劑量及時間段下，有效達成所需治療結果之量。治療有效量之分子可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重，及分子在個體中引起所需反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為分子之治療有益效應超過其任何毒性或有害效應的量。
在另一態樣中，本發明之組合物可用於例如治療犬之各種疾病及病症。如本文中所使用，術語「治療(treat/treatment)」係指治療性治療，包括防治性或預防性措施，其中目標係預防或減緩(減輕)非所要的與疾病或病狀相關之生理變化。不論可偵測或不可偵測，有益的或所需的臨床結果包括(但不限於)症狀緩解、疾病或病狀之程度減弱、疾病或病狀穩定(亦即，其中疾病或病狀不再惡化)、疾病或病狀之進程延遲或減緩、疾病或病狀改善或緩和及疾病或病狀緩解(不論部分或總體)。需要治療之彼等者包括已患有該疾病或病狀以及易於患有該疾病或病狀之彼等者或應預防該疾病或病狀之彼等者。
本發明之突變分子可用於治療任何適合之疾病或病症。舉例而言，本發明之突變抗IL31抗體可用於治療IL-31介導之搔癢或過敏性病狀。IL-31介導之搔癢病狀之實例包括例如但不限於異位性皮膚炎、濕疹、牛皮癬、硬皮病及搔癢性皮炎。IL-31介導之過敏性病狀之實例包括例如但不限於過敏性皮炎、夏季濕疹、蕁麻疹、馬氣喘病、發炎性呼吸道疾病、復發性呼吸道阻塞、氣管過度反應、慢性阻塞性肺部疾病及由自體免疫引起之發炎過程。
本發明之突變抗NGF抗體可用於治療NGF介導之疼痛或病狀。疼痛之實例包括例如但不限於慢性疼痛、發炎性疼痛、術後切口疼痛、神經痛、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、疱疹後神經痛、癌症痛、由燒傷引起之疼痛、與傷口相關之疼痛、與創傷相關之疼痛、神經痛、與肌肉骨骼病症相關之疼痛、類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊椎炎、血清陰性(非類風濕性)關節病、非關節風濕病、關節周圍病症或周邊神經病變。在一特定實施例中，疼痛為骨關節炎疼痛。
本說明書中引用之所有專利及文獻參考以全文引用之方式併入本文中。
提供以下實例以補充先前揭示內容且提供對本文所描述之主題的較佳理解。此等實例不應視為限制所描述之主題。應理解，本文所描述之實例及實施例僅用於說明之目的，且鑒於其各種修改或改變對於熟習此項技術者將為顯而易見的且欲包括於本發明之真正範疇內且可在不脫離本發明之真正範疇的情況下進行。實例 實例 1 構築犬 IgG Fc 突變體
如Bergeron等人(Bergeron等人, 2014,Vet Immunol Immunopathol ., 第157(1-2)卷, 第31-41頁)所描述，實施所有犬IgG之構築(圖1)，其中利用含有編碼IgGB (65)子類之犬恆定區之序列的質體且本文所研究之各mAb之VH/VL序列經插入上游且與編碼恆定域之核苷酸同框。使用Agilent之QuikChange II突變誘發及用於單點定向突變誘發的相關Agilent引子設計工具將突變併入至各質體之CH3域(圖2)之位置N434中 (https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp)。
抗體構築體使用標準脂染胺轉染方案( Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)在HEK 293細胞中暫時表現或使用ExpiCHO瞬時系統( ThermoFisher Scientific)套組方案在CHO細胞中暫時表現。ExpiCHO表現遵循由ThermoFisher概述之方案，以共轉染含有編碼IgG輕鏈及IgG重鏈之基因序列的質體。針對HEK293表現，共轉染按重量計之等量重鏈質體及輕鏈質體。使細胞生長7天，之後採集上清液用於抗體純化。經由Octet QKe定量(Pall ForteBio Corp, Menlo Park, CA, USA)篩檢結合於蛋白質A或蛋白質G感測器之抗體。針對蛋白質品質，如Bergeron等人中所描述來純化且定量結合於蛋白質A之構築體。實例 2 目標結合親和力及效能分析
藉由Biacore評估各mAb之親和力且經由適合的基於細胞之效能分析來測定IC50。在Biacore T200(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)上進行表面電漿子共振以量測各抗體針對其目標之結合親和力，2.5 μg/ml之各目標蛋白質藉由使用最終密度約250個RU(共振單位)之EDC/NHS分別在CM5感測器流通池2至4上進行胺偶合來固定。
流通池1用作內部參考以校正操作緩衝液效應。在15℃下以250 s之接觸時間及30 μl/min之流速量測抗體結合。解離時段為300 s。每一者用再生緩衝液(10 mM甘胺酸pH1.5及10 mM NaOH)及20 μl/min之流速進行再生60 s。在相同的分析形式下，操作/稀釋緩衝液(1×HBS-EP、GE Healthcare，BR-1006-69，10×包括100 mM HEPES、150 mM NaCl、30 mM EDTA及0.5% v/v界面活性劑P20、pH7.4，1:10於過濾MQ H2O中)用作陰性對照。
藉由使用雙重參照之方法用Biacore T200評估軟體來分析資料。所得曲線與1:1結合模型擬合。在野生型及N434H突變IgG之間未觀測到結合親和力或IC50之差異(表 1 )。
Figure 02_image001
mAb1及mAb2分別係指犬類化抗IL31及抗NGF抗體。抗IL31抗體為此項技術中所熟知的。參見例如，美國專利10,526,405；10,421,807；9,206,253；8,790,651。抗NGF抗體亦為此項技術中所熟知的。參見例如，美國專利10,125,192；10,093,725；9,951,128；9,617,334；及 9,505,829。實例 3 活體外 FcRn 結合分析
分離、製備犬FcRn，且根據上文所論述之Bergeron等人分析針對犬FcRn之突變Fc IgG。使用標準PCR以使用由食蟹獼猴、人類、小鼠及大鼠之序列比對設計的簡併引子來擴增犬FcRn-α次單元及β-微球蛋白。引子在5'(3 prime)末端含有HindIII及在5'(5 prime)末端含有BamH1以便於次選殖至pcDNA3.1(+)載體中，經工程改造具有c端6×His+BAP標籤(AGLNDIFEAQKIEWHE)。FcRn-α次單元及β-微球蛋白經共轉染至HEK 293細胞中且FcRn複合體係藉由經由c端His標籤進行IMAC親和純化來純化。藉由Biacore 3000或Biacore T200(GE Healthcare， Pittsburgh, PA, USA)使用CM5感測器晶片量測KD。
使用標準胺固定方法將FcRn固定在感測器表面上以達至所需表面密度。HBS-EP用作固定操作緩衝液，且將10mM MES；150mM NaCl；0.005% Tween20；0.5 mg/mL BSA；pH6及pH7.2及PBS；0.005% Tween20；0.5 mg/mL BSA；pH7.4用於方法操作緩衝液及滴定。Fc突變IgG在受體表面上流動且使用Scrubber2軟體分析(BioLogic Software Pty, Ltd., Campbell, Australia)或T200評估軟體測定親和力(表 2 )。自所有操作中減去僅含有緩衝液之空白操作。流通池使用50 mM Tris pH8進行再生。在15℃下進行操作。
在mAb 1及2之位置434產生的突變對於pH6下IgG針對FcRn之親和力具有明顯影響。對於所有三種mAb，突變N434H使得pH6下之FcRn親和力顯著增加，同時保持pH 7.2下之微弱親和力。位置434之大量突變誘發顯示幾種其他突變使得pH6下之FcRn親和力增加。此研究顯示IgG之FcRn親和力增加並非取決於VHVL域，且對於任何犬IgGB(65)而言係通用的。
Figure 02_image003
mAb1及mAb2分別係指犬類化抗IL31及抗NGF抗體；NBO=未觀測到結合。實例 4 犬之 Fc 突變 IgG PK 研究
研究目標係判定針對兩種獨特且不同的Fc突變N434H已併入至各IgG中之目標，犬之2種IgG單株抗體(mAb1及mAb2)之藥物動力學提高。
對於mAb1 WT及N434H突變IgG，向4隻雄性米格魯犬之群組靜脈內投與單次2 mg/kg劑量。對於mAb2 WT及突變IgG，以28天間隔向4隻雄性及4隻雌性米格魯犬之群組投與三個2 mg/kg劑量的IgG中之一者。前兩個劑量經皮下投與且最後一個劑量經靜脈內投與。使用特定針對各IgG且在GyrolabxP™平台上自動化之經驗證配位體結合分析來分析犬血清中之『游離』IgG(圖 3 至圖 6 )。使用藉助於Watson™之非隔室途徑(用於AUC計算之直線梯形法則)來進行藥物動力學計算(表 3 )。對於mAb2 IgG，使用給藥之後的7至28天之時間點估算第一劑量及第二劑量之半衰期。使用給藥之後的7至42天之時間點估算最後一個劑量之半衰期。藉由Excel™進行其他計算，包括校正第2次及第3次注射藥物之後的濃度-時間特徵曲線之重疊的AUC。使用Excel™或Watson™計算濃度-時間資料及藥物動力學資料在簡單統計下之彙總(均值、標準差、變化係數)。未進行其他統計分析。
Figure 02_image005
mAb1及mAb2分別係指犬類化抗IL31及抗NGF抗體。
犬IgGB(65)點突變N434H已顯示米格魯犬中兩種不同犬IgG之半衰期延長。對於mAb1，半衰期自9.7+/-2.6天延長至17.1+/-5.1天，且對於Ma2b2，半衰期自9.2+/-1.7延長至19.3+/-3.1。作用機制係經由增強在pH6下針對犬FcRn之親和力，且已證實三種犬IgG結合了極不同且獨特的可溶性目標。因此，證實IgGB(65)之N434突變之半衰期延長與VHVL域無關。實例 5 FcRn 結合分析
分離、製備犬FcRn，且根據上文所論述之Bergeron等人分析針對犬FcRn之突變Fc IgG。使用標準PCR來擴增犬FcRn-α次單元及β-微球蛋白。FcRn-α次單元及β-微球蛋白經共轉染至HEK 293細胞中且FcRn複合體係藉由經由c端His標籤進行IMAC親和純化來純化。FcRn複合體經由BirA酶促生物素醯化反應來進行生物素標記。藉由Biacore T200(GE Healthcare，Pittsburgh, PA, USA)或Biacore 8K(Cytiva, Marlborough, MA, USA)使用SA感測器晶片量測KD。
使用修改之SA捕獲方法將FcRn捕獲於感測器表面上。10mM MES；150mM NaCl；0.005% Tween20；0.5 mg/mL BSA；pH6用作捕獲方法操作緩衝液及滴定。1×HB-P、0.5 mg/mL BSA；pH7.4亦用於方法操作緩衝液及滴定。Fc突變IgG在受體表面上流動，且使用T200評估軟體或Biacore Insight評估軟體測定親和力。自所有操作中減去僅含有緩衝液之空白操作。流通池使用50 mM Tris pH8或pH9進行再生。在15℃下進行操作。
在各別位置產生的突變對於pH6下IgG針對FcRn之親和力具有明顯影響。藉由表面電漿子共振(Biacore)量測野生型(WT)及突變IgG與犬FcRn之結合。
在結合不同目標之完全不同且結構上不同的抗體(亦即，抗IL31及抗NGF抗體)以及結合相同目標之不同版本抗體(亦即，不同版本之抗IL31及抗NGF抗體)中觀測到對於親和力之明顯影響(表1至表4)。因此，針對IgG之FcRn親和力增加並不取決於VHVL域或CDR區。另外，在多種IgG子類中觀測到對於親和力之明顯影響，但存在略微差異。大體而言，結果顯示針對IgG之FcRn親和力增加與犬IgG子類無關。
Figure 02_image007
mAb1及mAb2分別係指犬類化抗IL31 (34D03)及抗NGF (ZTS-841)抗體。此表及以上表1至表3中之mAb1係相同的(亦即，34D03)。然而，此表中之mAb2為ZTS-841抗NGF抗體，相對於表1至表3中列舉之mAb2抗體，其具有不同的VL、VH及CDR區；NBO=未觀測到結合。
Figure 02_image009
mAb1係指犬類化抗IL31抗體。ID編號15至21及31對應於34D03抗IL31抗體。ID編號33及34對應於11E12抗IL31抗體。實例 6 犬之 Fc 突變 IgG PK 研究 研究目標係基於犬誘發之搔癢模型中之療效，測定4.0 mg/kg劑量之ZTS-00008183的有效性，在該犬誘發之搔癢模型中，藉由評估在第0天投與測試物後的至多210天的搔癢減少狀況來量測療效。如本文中所使用，術語「ZTS-00008183」係指其恆定區中具有N434H突變之抗IL31抗體。ZTS-00008183具有本文中所描述之34D03之可變區(亦即，包括CDR之VL及VH)。
藉由單次SC注射向米格魯犬(年齡約4歲)投與ZTS-00008183或安慰劑。處理彙總於以下中。
Figure 02_image011
在給藥前(第-7天)及藥物投與後第7天、第14天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天及第210天收集血清樣品。
特定言之，在IL-31誘導之搔癢刺激研究中，用單次皮下投與4 mg/kg ZTS-00008183處理米格魯犬(n=8，給藥時年齡約4歲)。在給藥前(第-7天)及藥物投與後第7天、第14天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天及第210天收集血清樣品。
使用配位體結合分析定量測試mAb。藉由適合的ADA分析方法評估抗藥物抗體(ADA)。
自BioAgilytix Labs接收呈Excel™電子試算表形式之生物分析資料。將資料導入至Watson™ v.7.4.1中。使用非隔室途徑藉助於Watson™ v.7.4.1計算毒理動力學及藥物動力學參數(Cmax 、tmax 、AUC、AUCextrap及t1 / 2 )。使用給藥後56至210天之時間點估算群組T02之ZTS-00008183半衰期。評估免疫原性。
ZTS-00008183之血清濃度列舉於表6中。
Figure 02_image013
ZTS-00008183之藥物動力學參數均值顯示於下表7中。
Figure 02_image015
未偵測到處理誘導之免疫原性。
ZTS-00008183之血清概況展示於圖7中。ZTS-00008183之血清概況均值展示於圖8中。
總之，結果具有N434H突變之犬IgG恆定域提供約30天之半衰期。相對於野生型之9.2至9.7天之半衰期，其半衰期延長大於2倍(亦即，200%延長)(參見表2)。實例 7 Fc 突變 IgG 之長期治療效果
在犬IL-31誘導之搔癢模型中，對4 mg/kg單次皮下劑量之ZTS-00008183進行評估。
在並行設計的療效研究中，使用隨機化完全集區設計將二十四隻健康米格魯犬隨機分至處理組，且接受4 mg/kg體重之ZTS-00008183或安慰劑。藉由歷史搔癢評分對動物進行集區，以形成八個(8)大小為3的完全集區。
Figure 02_image017
SC係指皮下；N係指動物數量。
在研究第-7天向各動物體育IL-31刺激(2.5 µg/kg)以誘導搔癢，進而建立基線搔癢評分。在研究第7天、第28天、第56天、第84天、第112天、第140天、第168天及第210天再次投與IL-31刺激。
觀測動物在各次刺激之後的120分鐘時段內的搔癢行為。在1-分鐘窗口內進行觀測且彼窗口中之任何搔癢活動會得到「是」的回應。是的累積回應數目確定了搔癢評分。
注意到在此研究期間沒有不良事件，且所有測試及對照物以及刺激材料係根據方案進行投與。
結果表明，在吾人之犬IL-31誘導之搔癢模型中，與在3、4及5個月的對照組(P＜0.0001)相比，4.0 mg/kg單次SC劑量之ZTS-00008183顯示顯著更低的最小平方均值搔癢評分(表9、11及13)。
如圖9至13中所示，在吾人之犬IL-31誘導之搔癢模型中，與研究第84天、第112天、第140天、第168天及第210天之對照組相比，ZTS-0008183 (T02)以4 mg/kg給藥時顯示顯著更低的總搔癢評分。
基於搔癢得分，結果亦表明ZTS-00008183在84、112、140、168及210天(亦即，約7個月)內係治療有效的。
結果進一步表明ZTS-00008183具有長期治療效果且可每3個月、每4個月、每5個月、每6個月或每7個月投與一次。
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Figure 02_image029
總之，結果表明具有N434H突變之犬IgG恆定域保持約210天(亦即，7個月)之治療性血清水準。相對於先前研究中報導之野生型抗IL31抗體之治療性水準天數，其高幾倍。
已描述本發明之較佳實施例，應理解，本發明不限於確切實施例，且各種變化及修改可由熟習此項技術者在不偏離本發明之如所附申請專利範圍中定義的範疇或精神之情況下於其中實現。序列表的簡要說明
SEQ ID NO.:1為具有N434H突變之突變犬IgGB恆定域之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:2為野生型犬IgGB恆定域之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:3為經密碼子最佳化之野生型犬IgG恆定域(IgGB_65_WT)之核酸序列；
SEQ ID NO.:4為野生型犬IgGB恆定域之核酸序列；
SEQ ID NO.:5為IgGB CH1域位置118-215之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:6為IgGB鉸鏈域位置217-230之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:7為野生型IgGB CH2域位置231-340之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:8為野生型IgGBCH3域位置341-447之胺基酸序列；
SEQ ID NO.:9為IgGB CH1域之核酸序列；
SEQ ID NO.:10為IgGB鉸鏈域之核酸序列；
SEQ ID NO.:11為野生型IgGB CH2域之核酸序列；
SEQ ID NO.:12為野生型IgGBCH3域之核酸序列；
SEQ ID NO:13為抗IL31抗體之可變重鏈CDR1，在本文中稱作11E12-VH-CDR1；
SEQ ID NO:14為抗IL31抗體之可變重鏈CDR1，在本文中稱作34D03-VH-CDR1；
SEQ ID NO:15為抗IL31抗體之可變重鏈CDR2，在本文中稱為11E12-VH-CDR2；
SEQ ID NO:16為抗IL31抗體之可變重鏈CDR2，在本文中稱為34D03-VH-CDR2；
SEQ ID NO:17為抗IL31抗體之可變重鏈CDR3，在本文中稱為11E12-VH-CDR3；
SEQ ID NO:18為抗IL31抗體之可變重鏈CDR3；在本文中稱作34D03-VH-CDR3；
SEQ ID NO:19為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR1，在本文中稱為11E12-VL-CDR1；
SEQ ID NO:20為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR1，在本文中稱為34D03-VL-CDR1；
SEQ ID NO:21為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR2，在本文中稱為11E12-VL-CDR2；
SEQ ID NO:22為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR2，在本文中稱為34D03-VL-CDR2；
SEQ ID NO:23為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR3，在本文中稱為11E12-VL-CDR3；
SEQ ID NO:24為抗IL31抗體之可變輕鏈CDR3，在本文中稱為34D03-VL-CDR3；
SEQ ID NO:25為抗IL31抗體之可變輕鏈序列，在本文中稱為MU-11E12-VL；
SEQ ID NO:26為抗IL31抗體之可變輕鏈序列，在本文中稱為CAN-11E12-VL-cUn-FW2；
SEQ ID NO:27為抗IL31抗體之可變輕鏈序列，在本文中稱為CAN-11E12-VL-cUn-13；
SEQ ID NO:28為抗IL31抗體之可變輕鏈序列，在本文中稱為MU-34D03-VL；
SEQ ID NO:29為抗IL31抗體之可變輕鏈序列，在本文中稱為CAN-34D03-VL-998-1；
SEQ ID NO:30為抗IL31抗體之可變重鏈序列，在本文中稱為MU-11E12-VH；
SEQ ID NO:31為抗IL31抗體之可變重鏈序列，在本文中稱為CAN-11E12-VH-415-1；
SEQ ID NO:32為抗IL31抗體之可變重鏈序列，在本文中稱為MU-34D03-VH；
SEQ ID NO:33為抗IL31抗體之可變重鏈序列，在本文中稱為CAN-34D03-VH-568-1；
SEQ ID NO:34為與Genbank寄存編號C7G0W1相對應之胺基酸序列且對應於犬IL-31全長蛋白質；
SEQ ID NO:35為與Genbank寄存編號 C7G0W1相對應之核苷酸序列且對應於編碼犬IL-31全長蛋白質之核苷酸序列；
SEQ ID NO:36為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為MU-11E12-VL)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:37為編碼抗IL31抗體之可變重鏈序列(本文中稱為MU-11E12-VH)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:38為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為MU-34D03-VL)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:39為編碼抗IL31抗體之可變重鏈序列(本文中稱為MU-34D03-VH)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:40為本文中稱為HC-64之犬野生型重鏈恆定區的胺基酸序列(Genbank寄存編號AF354264)；
SEQ ID NO:41為編碼本文中稱為HC-64之犬野生型重鏈恆定區的核苷酸序列(Genbank寄存編號AF354264)；
SEQ ID NO:42為本文中稱為HC-65之犬野生型重鏈恆定區的胺基酸序列(Genbank寄存編號AF354265)；
SEQ ID NO:43為編碼本文中稱為HC-65之犬野生型重鏈恆定區的核苷酸序列(Genbank寄存編號AF354265)；
SEQ ID NO:44為本文中稱為κ之犬輕鏈恆定區的胺基酸序列(Genbank寄存編號XP_532962)；
SEQ ID NO:45為編碼稱為κ之犬輕鏈恆定區的核苷酸序列(Genbank寄存編號XP_532962)；
SEQ ID NO:46為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為CAN-34D03-VL-998-1)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:47為編碼抗IL31抗體之可變重鏈序列(本文中稱為CAN-34D03-VH-568-1)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:48為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為CAN-11E12-VL-cUn-FW2)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:49為編碼抗IL31抗體之可變重鏈序列(本文中稱為CAN-11E12-VH-415-1)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:50為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為CAN-11E12-VL-cUn-13)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:51為抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為CAN-11E12_VL_cUn_1)；
SEQ ID NO:52為編碼抗IL31抗體之可變輕鏈序列(本文中稱為CAN-11E12-VL-cUn-1)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:53對應於用於大腸桿菌(E. coli)表現之犬IL-31全長構築體的胺基酸序列；
SEQ ID NO:54為與用於大腸桿菌表現之犬IL-31全長構築體相對應的核苷酸序列；
SEQ ID NO:55為編碼本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變重鏈序列的核苷酸序列；
SEQ ID NO:56為編碼本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變重鏈序列的胺基酸序列；
SEQ ID NO:57為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變重鏈CDR1；
SEQ ID NO:58為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變重鏈CDR2；
SEQ ID NO:59為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變重鏈CDR3；
SEQ ID NO:60為編碼本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變輕鏈序列的核苷酸序列；
SEQ ID NO:61為編碼本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變輕鏈序列的胺基酸序列；
SEQ ID NO:62為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變輕鏈CDR1；
SEQ ID NO:63為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體之可變輕鏈CDR2；
SEQ ID NO:64為本文中稱為ZTS-841之抗NGF抗體的可變輕鏈CDR3；
SEQ ID NO:65為IgGB位置341-447之突變CH3域之胺基酸序列；
SEQ ID NO:66為IgGB之CH3域內的突變區之胺基酸序列；
SEQ ID NO:67為本文中稱為ZTS-00008183之抗NGF抗體之輕鏈的核酸序列；
SEQ ID NO:68為本文中稱為ZTS-00008183之抗NGF抗體之輕鏈的胺基酸序列；
SEQ ID NO:69為本文中稱為ZTS-00008183之抗NGF抗體之重鏈的核酸序列；
SEQ ID NO:70為本文中稱為ZTS-00008183之抗NGF抗體之重鏈的胺基酸序列。
專利或申請案檔案含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。
[圖1]展示IgG之域結構。在CH3域中進行Fc突變N434H以藉由在pH6下增加針對FcRn之親和力來延長IgG半衰期。
[圖2A]展示具有N434H之犬IgGB及野生型(WT)犬IgGB之胺基酸序列。
[圖2B]展示野生型(WT)人類IgG1 WT犬1gGA、WT犬IgGB、WT犬IgGC及WT犬IgGD之胺基酸序列之比對。胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引進行編號。CH1、鉸鏈、CH2及CH3胺基酸殘基分別呈紅色、紫色、藍色及綠色。
[圖2C]展示WT IgGB 65之Fc核苷酸序列。
[圖3]展示在56天時間段內量測的4隻犬(2隻雄性(01M、02M)及2隻雌性(03F、04F))在單次注射2 mg/kg之後，其體內之WT mAb1 IgG的各別血清濃度。
[圖4]展示在56天時間段內量測的4隻犬(2隻雄性(17M、18M)及2隻雌性(19F、20F))在單次注射2 mg/kg之後，其體內之N434H mAb1 IgG的各別血清濃度。
[圖5]展示在98天時間段內量測的8隻犬(4隻雄性(H03433、H03434、H03435、H03436)及4隻雌性(H03453、H03454、H03455、H03456)在三次注射2 mg/kg (SC/SC/IV)之後，其體內之WT mAb2 IgG的各別血清濃度。
[圖6]展示在98天時間段內量測的8隻犬(4隻雄性(H03433、H03434、H03435、H03436)及4隻雌性(H03453、H03454、H03455及H03456)在三次注射2 mg/kg (SC/SC/IV)之後，其體內之N434H mAb2 IgG的各別血清濃度。
[圖7]展示在單次4 mg/kg皮下投藥之後，犬體內之ZTS-00008183之血清概況。各顏色表示不同的動物識別號。
[圖8]展示在單次4 mg/kg皮下投藥之後，犬體內之ZTS-00008183之平均血清概況。
[圖9].處理組隨時間點(3至5個月)之最小平方均值曲線圖。α水準：第84天=0.07085，第112天=0.04575，第140天=0.04352。
[圖10].處理組隨時間點(3至5個月)之最小平方均值及百分比變化曲線圖。均值變化%=100×[均值(T01)-均值(T02)/均值(T01)]。
[圖11].所有時間點之搔癢評分盒狀圖。T01 =安慰劑0 mg/kg，T02 = ZTS-00008183 4 mg/kg。
[圖12].處理組在所有時間點之算術均值搔癢評分圖。誤差杠表示標準誤差。
[圖13].處理組在所有時間點之算術均值搔癢評分圖及百分比變化。均值變化%=100×[均值(T01)-均值(T0X)/均值(T01)]，X=2、3。
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Claims (96)

  1. 一種經修飾之IgG，其包含：犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含相對於野生型犬IgG恆定域的至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
  2. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  3. 如請求項1之經修飾之IgG，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之IgG之半衰期相比，該經修飾之IgG具有延長的半衰期。
  4. 如請求項1之經修飾之IgG，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之IgG相比，該經修飾之IgG具有針對FcRn之更高親和力。
  5. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該經修飾之IgG為犬或犬類化IgG。
  6. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該IgG為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 。
  7. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該IgG恆定域為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 之恆定域。
  8. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該IgG恆定域包含具有CH3域之Fc恆定區。
  9. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該IgG恆定域包含具有CH2及CH3域之Fc恆定區。
  10. 如請求項1之經修飾之IgG，其中該IgG恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之經修飾之IgG及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 一種套組，其包含於容器中之如請求項1之經修飾之IgG，及使用說明書。
  13. 一種多肽，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
  14. 如請求項13之多肽，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  15. 如請求項13之多肽，其中與該野生型犬IgG恆定域之多肽之半衰期相比，該多肽具有延長的半衰期。
  16. 如請求項13之多肽，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之IgG之多肽相比，該多肽具有針對FcRn之更高親和力。
  17. 如請求項13之多肽，其中該多肽為犬或犬類化IgG之多肽。
  18. 如請求項17之多肽，其中該IgG為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 。
  19. 如請求項13之多肽，其中該IgG恆定域為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 之恆定域。
  20. 如請求項13之多肽，其中該IgG恆定域包含具有CH3域之Fc恆定區。
  21. 如請求項13之多肽，其中該IgG恆定域包含具有CH2及CH3域之Fc恆定區。
  22. 如請求項13之多肽，其中該IgG恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項13之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  24. 一種套組，其包含於容器中之如請求項13之多肽，及使用說明書。
  25. 一種抗體，其包含：相對於野生型犬IgG恆定域，包含至少一個胺基酸取代之犬IgG恆定域，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
  26. 如請求項25之抗體，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  27. 如請求項25之抗體，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之抗體之半衰期相比，該抗體具有延長的半衰期。
  28. 如請求項25之抗體，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之抗體相比，該抗體具有針對FcRn之更高親和力。
  29. 如請求項25之抗體，其中該抗體為犬或犬類化抗體。
  30. 如請求項25之抗體，其中該抗體為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 。
  31. 如請求項25之抗體，其中該IgG恆定域為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 之恆定域。
  32. 如請求項25之抗體，其中該IgG恆定域包含具有CH3域之Fc恆定區。
  33. 如請求項25之抗體，其中該IgG恆定域包含具有CH2及CH3域之Fc恆定區。
  34. 如請求項25之抗體，其中該IgG恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如請求項25之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 一種套組，其包含於容器中之如請求項25之抗體，及使用說明書。
  37. 一種載體，其包含編碼SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列的核酸序列。
  38. 一種經分離之細胞，其包含如請求項37之載體。
  39. 一種製造抗體或分子之方法，該方法包含：提供如請求項38之細胞；及培養該細胞。
  40. 一種製造抗體之方法，該方法包含：提供如請求項25至34中任一項之抗體。
  41. 一種用於延長犬之抗體血清半衰期的方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
  42. 如請求項41之方法，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  43. 如請求項41之方法，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之抗體之半衰期相比，該抗體具有延長的半衰期。
  44. 如請求項41之方法，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之抗體相比，該抗體具有針對FcRn之更高親和力。
  45. 如請求項41之方法，其中該抗體為犬或犬類化抗體。
  46. 如請求項41之方法，其中該抗體為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 。
  47. 如請求項41之方法，其中該IgG恆定域為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 之恆定域。
  48. 如請求項41之方法，其中該IgG恆定域包含具有CH3域之Fc恆定區。
  49. 如請求項41之方法，其中該IgG恆定域包含具有CH2及CH3域之Fc恆定區。
  50. 如請求項41之方法，其中該IgG恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。
  51. 一種融合分子，其包含：與藥劑融合之犬IgG恆定域，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434。
  52. 如請求項51之分子，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  53. 如請求項51之分子，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之分子之半衰期相比，該分子具有延長的半衰期。
  54. 如請求項51之分子，其中與具有該野生型犬IgG恆定域之分子相比，該分子具有針對FcRn之更高親和力。
  55. 如請求項51之分子，其中該分子為犬或犬類化抗體。
  56. 如請求項51之分子，其中該分子包含IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 。
  57. 如請求項51之分子，其中該IgG恆定域為IgGA 、IgGB 、IgGC 或IgGD 之恆定域。
  58. 如請求項51之分子，其中該IgG恆定域包含具有CH3域之Fc恆定區。
  59. 如請求項51之分子，其中該IgG恆定域包含具有CH2及CH3域之Fc恆定區。
  60. 如請求項51之分子，其中該IgG恆定域包含SEQ ID NO.:1中所闡述之胺基酸序列。
  61. 一種醫藥組合物，其包含如請求項51之分子及醫藥學上可接受之載劑。
  62. 一種套組，其包含於容器中之如請求項51之分子，及使用說明書。
  63. 一種經修飾之IgG，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所闡述之胺基酸序列的犬IgG恆定域，其中與具有野生型犬IgG恆定域之IgG的半衰期相比，該經修飾之IgG具有延長的半衰期。
  64. 如請求項63之經修飾之IgG，其中該延長的半衰期為範圍介於約25天至約35天之時間段。
  65. 如請求項63之經修飾之IgG，其中該延長的半衰期為約30天。
  66. 一種經修飾之IgG，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所闡述之胺基酸序列的犬IgG恆定域，其中該經修飾之IgG長期保持其治療水準。
  67. 如請求項66之經修飾之IgG，其中該經修飾之IgG在範圍介於約1個月至約7個月之時間段內保持其治療水準。
  68. 如請求項66之經修飾之IgG，其中該經修飾之IgG在向犬個體皮下遞送該IgG後之該時間段內保持其治療水準。
  69. 一種抗體，其包含：SEQ ID NO.:1、65或66中所闡述之包含胺基酸序列的犬IgG恆定域，其中與具有野生型犬IgG恆定域之抗體之半衰期相比，該抗體具有延長的半衰期。
  70. 如請求項69之抗體，其中該延長的半衰期為範圍介於約25天至約35天之時間段。
  71. 如請求項69之抗體，其中該延長的半衰期為約30天。
  72. 一種抗體，其包含：包含SEQ ID NO.:1、65或66中所闡述之胺基酸序列的犬IgG恆定域，其中該抗體長期保持其治療水準。
  73. 如請求項66之抗體，其中該抗體在範圍介於約1個月至約7個月之時間段內保持其治療水準。
  74. 如請求項66之抗體，其中該抗體在向犬個體皮下遞送該抗體後之該時間段內保持其治療水準。
  75. 如請求項25至34及69至74中任一項之抗體，其中該抗體為抗IL31或抗NGF抗體。
  76. 一種用於延長犬之抗體血清半衰期之方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434，且其中該抗體為抗IL31抗體。
  77. 如請求項76之方法，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  78. 如請求項76之方法，其中該方法使半衰期延長範圍介於約25天至約35天之時間段。
  79. 如請求項76之抗體，其中該方法使半衰期延長約30天。
  80. 一種用於保持抗體於犬體內之治療性血清水準的方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434，且其中該抗體為抗IL31抗體。
  81. 如請求項80之方法，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  82. 如請求項80之方法，其中該方法在範圍介於約1個月至約7個月之時間段內保持該抗體於該犬體內之治療性血清水準。
  83. 如請求項80之方法，其中該方法在向該犬皮下遞送該抗體後之該時間段內保持治療性血清水準。
  84. 一種用於延長犬之抗體血清半衰期之方法，該方法包含：向該犬投與治療有效量之包含犬IgG恆定域之抗體，相對於野生型犬IgG恆定域，該犬IgG恆定域包含至少一個胺基酸取代，其中該取代處於根據如Kabat中之EU索引編號的胺基酸殘基434，且其中該抗體為抗NGF抗體。
  85. 如請求項84之方法，其中該取代為位置434之天冬醯胺經組胺酸取代(N434H)。
  86. 如請求項84之方法，其中該方法使半衰期延長範圍介於約10天至約35天之時間段。
  87. 如請求項84之抗體，其中該方法使半衰期延長約30天。
  88. 一種治療犬個體之IL-31介導之搔癢或過敏性病況的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之如請求項75之抗IL31抗體，藉此治療該犬個體之該IL-31介導之搔癢或過敏性病況。
  89. 如請求項88之方法，其中該IL-31介導之搔癢或過敏性病況為選自由以下組成之群的搔癢病況：異位性皮膚炎、濕疹、牛皮癬、硬皮病及搔癢性皮炎。
  90. 如請求項88之方法，其中該IL-31介導之搔癢或過敏性病況係選自由以下組成之群的過敏性病況：過敏性皮炎、夏季濕疹、蕁麻疹、馬氣喘病(heaves)、發炎性呼吸道疾病、復發性呼吸道阻塞、氣管過度反應、慢性阻塞性肺部疾病及由自體免疫引起之發炎過程。
  91. 如請求項88之方法，其中該抗體係兩個月一次、三個月一次、四個月一次、五個月一次、六個月一次或七個月一次地進行投與。
  92. 如請求項88之方法，其中該抗體係以小於4.0mg/kg體重之劑量皮下投與。
  93. 一種治療犬個體之疼痛的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之如請求項75之抗NGF抗體，藉此治療該犬個體之該疼痛。
  94. 如請求項93之方法，其中該疼痛為慢性疼痛、發炎性疼痛、術後切口疼痛、神經痛、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、疱疹後神經痛、癌症痛、由燒傷引起之疼痛、與傷口相關之疼痛、與創傷相關之疼痛、神經痛、與肌肉骨骼病症相關之疼痛、類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊椎炎、血清陰性(非類風濕性)關節病、非關節風濕病、關節周圍病症或周邊神經病變。
  95. 如請求項93之方法，其中該疼痛為骨關節炎疼痛。
  96. 如請求項93之方法，其中該抗體係兩個月一次、三個月一次、四個月一次、五個月一次、六個月一次或七個月一次地進行投與。
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