BR112020000098A2 - mutantes de receptor fc-gama - Google Patents

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Abstract

A presente revelação refere-se a um polipeptídeo incluindo um mutante de receptor Fc-gama. O mutante de receptor Fc-gama da presente revelação é otimizado substituindo-se uma parte de uma sequência de aminoácidos de um receptor Fc-gama por uma sequência de aminoácidos diferente, de modo a fornecer uma excelente capacidade de ligação seletiva às imunoglobulinas. Portanto, o mesmo pode ser utilmente usado para aumentar a meia-vida in vivo dos fármacos, detectar e purificar imunoglobulinas, inibir rejeições de transplantes de órgãos ou prevenir ou tratar doenças autoimunes.

Description

“MUTANTES DE RECEPTOR Fc-GAMA”
CAMPO DA TÉCNICA
[0001] A presente revelação refere-se a mutantes de receptor Fc-gama com capacidade aprimorada de ligação a anticorpos IgG.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0002] Os receptores Fc-gama (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa) expressos nas células imunes humanas se ligam às regiões Fc (região de charneira inferior e região CH2 superior) de anticorpos IgG. Dentre esses receptores Fc-gama, FcγRI tem a maior afinidade para IgG no sangue. Porém, devido à baixa termoestabilidade e ao baixo nível de expressão, existem dificuldades nas aplicações médicas ou industriais.
[0003] Enquanto isso, o FcγRIIa é uma proteína transmembranar expressa na superfície de várias células do sistema imune, como os macrófagos, monócitos, neutrófilos, etc. O mesmo é um receptor com uma afinidade relativamente baixa (KD = ~ 10-6) para IgG. FcγRIIa liga-se às regiões Fc (região de charneira inferior e região CH2 superior) dos anticorpos IgG e ativa as células imunes através de mecanismos de sinalização intracelular.
[0004] Se é possível produzir e administrar um receptor Fc-gama solúvel existente na região extracelular e com afinidade notavelmente maior por IgG do que o receptor Fc-gama do tipo selvagem, a ligação de autoanticorpos que reconhecem células autólogas como antígenos ao receptor de Fc-gama na superfície das células imunes pode ser inibida de forma eficaz. Isso pode ser definitivamente útil no tratamento de doenças autoimunes, uma condição em que os autoanticorpos se acumulam nos órgãos e as células autólogas são reconhecidas como antígenos exógenos, levando a inflamações.
[0005] Em geral, a maioria dos fármacos proteicos, exceto os anticorpos, tem um curto tempo de retenção in vivo e a meia-vida sérica não excede 24 horas. O anticorpo IgG é colocado aleatoriamente em uma célula por pinocitose e, depois, liberado na corrente sanguínea de pH neutro sem ser degradado em endossomas de pH fracamente ácido por ligação a FcRn. Portanto, é retido in vivo por cerca de 3 semanas. O processo de ligação do receptor Fc-gama ao anticorpo IgG pode ser utilizado para o desenvolvimento de um parceiro de fusão que aumenta a meia-vida sérica dos fármacos proteicos.
[0006] As demandas por fármacos proteicos que exibem alta especificidade para doenças-alvo e poucos efeitos colaterais estão aumentando constantemente e, de acordo com isso, pesquisas para aprimorar a eficácia e a estabilidade dos fármacos proteicos estão sendo realizadas ativamente em todo o mundo. Em particular, como a meia-vida sérica de um fármaco proteico desempenha um papel crítico no mecanismo de ação, grau de efeitos colaterais, eficácia terapêutica, custo de produção, número de administrações, etc. da proteína, pesquisas para aumentar a meia-vida dos fármacos proteicos está sendo realizada ativamente pelas principais empresas farmacêuticas do mundo e pelos grupos de pesquisa em manipulação de proteínas.
[0007] Como exemplos representativos, a proteína-alvo é modificada com um polímero de PEG (polietileno glicol) ou a proteína-alvo é fundida com o anticorpo Fc ou albumina para aumentar a meia-vida sérica.
[0008] Se um polímero biocompatível como o PEG for conjugado em um sítio específico da proteína-alvo ou for inespecificamente ligado a vários sítios, a degradação por proteases pode ser reduzida. Além disso, a excreção nos rins pode diminuir e o tempo de retenção de sangue pode aumentar devido ao aumento do peso molecular. Como a adenosina desaminase modificada por PEG, desenvolvida em 1990 pela Enzon, foi aprovada pelo USFDA e lançada no mercado, mais de 10 produtos estão disponíveis comercialmente e são usados para aplicações clínicas. A Roche modificou o interferon-α com o polímero PEG (PEGuilação) para uso como agente terapêutico da hepatite C e comercializou o mesmo sob a marca Pegasys. A Amgen modificou o terminal N do filgrastim (Neupogen), que foi desenvolvido para tratar leucopenia, com PEG de 20 kDa para comercialização de uma forma de duração sustentada, Neulasta. No entanto, quando a proteína é injetada em grandes quantidades, a porção PEG é removida lentamente do corpo. Além disso, é relatado que a injeção a longo prazo do PEG de alto peso molecular pode causar efeitos colaterais. A estabilidade do soro está intimamente relacionada com o peso molecular do PEG. Um PEG com um peso molecular de 40.000 Da ou superior não é fácil de preparar e sabe-se que, à medida que o peso molecular é aumentado, o rendimento diminui devido à baixa reatividade com a proteína e o título da própria proteína também diminui rapidamente. Além disso, como o polímero PEG é uma mistura de polímeros com várias distribuições de peso molecular, um agente terapêutico proteico conjugado com o PEG é heterogêneo e causa dificuldades na produção e no controle de qualidade. Por conseguinte, é urgentemente necessário o desenvolvimento de uma nova tecnologia distinta de modificação da tecnologia de manipulação de proteínas com um polímero como o PEG para aumentar a meia-vida sérica dos fármacos proteicos.
[0009] Vários fármacos proteicos de fusão Fc fundidos com o anticorpo Fc estão sendo estudados e desenvolvidos para aprimorar a meia-vida sérica dos fármacos proteicos com efeitos farmacológicos. A fusão de uma proteína terapêutica com a região Fc de um anticorpo humano tornará possível usar o mecanismo de reciclagem de células através da ligação ao receptor FcRn. Uma tecnologia de conexão do interferon-α e um fragmento Fc com um ligante peptídico foi desenvolvida em 1998 e uma proteína de fusão obtida pela conexão da eritropoietina humana e Fc com um ligante peptídico foi desenvolvida em 2003. Como exemplo representativo, o etanercept (Enbrel®) é um inibidor do TNF-α, que é uma das principais citocinas causadoras de artrite. É um fármaco proteico obtido pela fusão de uma parte do receptor TNF-α existente fora de uma célula com o fragmento Fc de uma imunoglobulina. Atualmente, dez proteínas de fusão Fc, incluindo o etanercept, são aprovadas pelo USFDA e usadas para aplicações clínicas. No entanto, os agentes terapêuticos proteicos fundidos com o fragmento Fc têm o problema de citotoxicidade devido à função de ativação da célula imune intrínseca de Fc e são desvantajosos devido ao fato de que a meia-vida não aumenta significativamente devido à depuração mediada pelo receptor. Além disso, devido ao fato de que os mesmos devem ser fundidos com o fragmento Fc existente como homodímero, existe um problema de que a atividade farmacológica da proteína-alvo é alterada.
[0010] Também está sendo estudado um método para aumentar a meia-vida sérica de agentes terapêuticos proteicos usando albumina, que existe em alto nível no soro humano, em vez do fragmento Fc, como parceiro de fusão. Fármacos proteicos, incluindo hormônio de crescimento humano, interferon, etc. fundidos com albumina estão em desenvolvimento clínico pela Human Genome Sciences, detentora da tecnologia de fusão de albumina. Como a albumina é uma macroproteína com um grande peso molecular (66,5 kDa), a proteína de fusão resultante pode inibir a atividade da proteína-alvo.
[0011] Espera-se que uma tecnologia que usa um mutante FcγR seja aplicada a vários agentes terapêuticos proteicos e proteínas candidatas para aprimorar significativamente a meia-vida sérica. Além disso, muitos medicamentos peptídicos que têm eficácia farmacológica, mas são limitados em aplicações clínicas devido à meia-vida in vivo e tempo de permanência curtos, podem ser fundidos com o mutante FcγR para aumentar bastante a meia-vida sérica. Consequentemente, espera-se que o fármaco exerça eficácia no tecido-alvo por um longo tempo, levando a uma redução significativa da dosagem e frequência da administração, custo reduzido do desenvolvimento de novos fármacos e maior viabilidade do desenvolvimento de novos fármacos.
[0012] Uma doença autoimune é uma condição em que os anticorpos produzidos no corpo reconhecem células autólogas e as células imunes atacam as células autólogas através da resposta imune. As células imunes têm FcγRs que podem se ligar aos anticorpos. A ligação aos anticorpos leva à resposta imune, como ADCC ou ADCP. Por conseguinte, FcγRIIa solúvel, que se liga ao anticorpo que reconhece células autólogas e bloqueia a ligação de células autólogas reconhecidas a células imunes, pode ser vantajosamente desenvolvido em um agente terapêutico para doenças autoimunes. Para este propósito, um fármaco que inibe a doença autoimune usando o FcγRIIb solúvel do tipo selvagem com afinidade não alta por IgG está em fase de ensaio clínico de fase II (Sondermann et al., Curr Opin Immunol, 2016).
[0013] A descrição acima dada na seção Antecedentes é meramente para aprimorar o entendimento dos antecedentes da presente revelação, e não deve ser interpretada como um reconhecimento de que corresponde à técnica anterior,
anteriormente conhecida pelos versados na técnica.
REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[0014] Os inventores da presente revelação têm feito esforços para encontrar um receptor Fc-gama mutante com a capacidade de prolongar a meia-vida no soro de muitos fármacos peptídicos que não pode ser aplicado para aplicações clínicas, devido à meia-vida in vivo curta e ao curto tempo de residência in vivo. Como resultado, os mesmos identificaram que a capacidade de ligação à IgG de um receptor Fc-gama pode ser notavelmente aprimorada em comparação com o tipo selvagem por meio da otimização, substituindo uma parte de uma sequência de aminoácidos por uma sequência de aminoácidos diferente e concluíram a presente revelação.
[0015] A presente revelação é direcionada ao fornecimento de um polipeptídeo incluindo um mutante de receptor Fc-gama.
[0016] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo.
[0017] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um vetor contendo a molécula de ácido nucleico.
[0018] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de uma célula hospedeira contendo o vetor.
[0019] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de uma composição contendo o polipeptídeo, a molécula de ácido nucleico ou o vetor.
[0020] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de uma composição contendo o polipeptídeo ou a molécula de ácido nucleico.
[0021] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um kit para detectar um anticorpo IgG contendo o polipeptídeo ou uma região Fc do anticorpo IgG.
[0022] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de uma proteína ou peptídeo de fusão, em que o polipeptídeo é fundido com uma proteína fisiologicamente ativa ou um peptídeo fisiologicamente ativo.
[0023] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um método para preparar um polipeptídeo incluindo um mutante de receptor Fc-gama.
[0024] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um método para identificar a presença de um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra.
[0025] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um método para purificar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra.
[0026] A presente revelação também é direcionada ao fornecimento de um método para rastrear um mutante de receptor Fc-gama humano com capacidade de ligação aprimorada a um anticorpo IgG ou a uma região Fc do anticorpo IgG.
[0027] Outros objetivos e vantagens da presente revelação serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, reivindicações e desenhos.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[0028] Em um aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um polipeptídeo incluindo um mutante de receptor Fc-gama.
[0029] Os inventores da presente revelação têm feito esforços para encontrar um receptor Fc-gama mutante capaz de prolongar a meia-vida no soro de muitos fármacos peptídicos que não pode ser aplicado para aplicações clínicas, devido à curta meia-vida in vivo e curto tempo de residência in vivo. Como resultado, os mesmos identificaram que a capacidade de ligação à IgG de um receptor Fc-gama pode ser notavelmente aprimorada em comparação com o tipo selvagem por meio da otimização, substituindo uma parte de uma sequência de aminoácidos por uma sequência de aminoácidos diferente.
[0030] No presente relatório descritivo, o termo “mutante de receptor Fc-gama” se refere a um polipeptídeo de um receptor Fc-gama que é diferente do receptor Fc-gama do tipo selvagem. A diferença pode incluir a diferença na capacidade de ligação a imunoglobulinas, potencial terapêutico, composição de aminoácidos, solubilidade, etc. Especificamente, isso se refere à alteração em uma ou mais sequências de aminoácidos de um receptor Fc-gama que consiste em aminoácidos naturais ou sintéticos, com a capacidade de se ligar a uma imunoglobulina ou a uma região Fc (região Fc), e a alteração inclui substituição, exclusão ou inserção de um aminoácido.
[0031] A imunoglobulina pode ser qualquer uma de IgG, IgE, IgA, IgM ou IgD. Especificamente, é IgG. A imunoglobulina pode ser derivada de qualquer animal, incluindo humano, rato, camundongo, vaca, ovelha, cabra, galinha, avestruz e camelo. Especificamente, é derivado do ser humano.
[0032] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante de receptor Fc-gama da presente revelação tem características aprimoradas quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem.
[0033] No presente relatório descritivo, o termo “características aprimoradas” se refere a características desejáveis quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem. As características podem incluir a capacidade de ligação aumentada ou aprimorada a uma imunoglobulina ou uma região Fc, regulação ou inibição da função imune pela ligação a uma região Fc de uma imunoglobulina, aumento na meia- vida de um polipeptídeo ou uma proteína usada como agente terapêutico no soro, ou permitindo a detecção de um polipeptídeo ou proteína-alvo (por exemplo, uma imunoglobulina) ou aprimoramento da precisão da detecção.
[0034] No presente relatório descritivo, o termo “alteração na capacidade de ligação a uma imunoglobulina” significa que o mutante de receptor Fc-gama da presente revelação tem uma atividade de ligação diferente para uma imunoglobulina daquela do receptor Fc-gama do tipo selvagem. Pode se referir à alteração na capacidade de ligação entre uma imunoglobulina e o receptor, ou seja, a alteração na capacidade de ligação do receptor a uma imunoglobulina do complexo imune, agregado, dímero ou monômero, quando comparada à da Fc de tipo selvagem receptor gama.
[0035] No presente relatório descritivo, o termo “alteração em um ou mais aminoácidos que afetam a capacidade de ligação a uma imunoglobulina” significa a alteração em uma região de aminoácidos ou em uma região de uma região de aminoácidos de um receptor Fc-gama, associado à ligação entre o receptor Fc-gama do tipo selvagem e uma imunoglobulina. A alteração pode resultar de substituição, exclusão ou inserção.
[0036] De acordo com uma modalidade exemplificadora da presente revelação, o mutante de receptor Fc-gama da presente revelação aprimorou a capacidade de ligação a um anticorpo IgG ou a uma região Fc de um anticorpo IgG quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem. O mutante de receptor Fc- gama pode ter uma capacidade de ligação aprimorada em 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais ou 90% ou mais, quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem, ou 2 vezes ou mais, 3 vezes ou mais, 4 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 6 vezes ou mais, 7 vezes ou mais, 8 vezes ou mais, 9 vezes ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais ou 30 vezes ou mais quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem (Exemplos 2, 8, 10, 11, 13, 15 a 17 e 19).
[0037] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante tem uma capacidade de ligação a uma região Fc de um anticorpo IgG ou um anticorpo IgG aprimorada em 3 vezes ou mais quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem.
[0038] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o receptor Fc da presente revelação está na forma de uma forma isolada, o que significa que outras proteínas e/ou moléculas não proteicas são removidas.
[0039] A forma isolada pode ter uma pureza de pelo menos 40% ou mais, especificamente 60% ou mais, mais especificamente 75% ou mais, ainda mais especificamente 85% ou mais em comparação com uma molécula receptora não-Fc, quando medida com base no peso, atividade, similaridade de aminoácidos, reatividade com anticorpos ou outros meios existentes.
[0040] O polipeptídeo incluindo o receptor Fc da presente revelação pode estar ligado a uma membrana celular ou a um meio de suporte, ou pode estar em uma forma solúvel. Para uso como uma composição farmacêutica, o polipeptídeo pode estar especificamente em uma forma solúvel.
[0041] O polipeptídeo pode ser marcado com uma molécula repórter que gera um sinal detectável sob uma condição apropriada. A molécula repórter pode ser um radionucleotídeo, uma molécula quimioluminescente, uma molécula bioluminescente, uma molécula fluorescente ou uma enzima. As enzimas comumente usadas podem incluir peroxidase de rábano silvestre, glicose oxidase, β-galactosidase, fosfatase alcalina, etc.
[0042] Especificamente, o receptor Fc do presente mutante de revelação inclui um mutante natural ou artificial, uma variante ou um derivado do aminoácido do receptor Fc do tipo selvagem. O receptor Fc do tipo selvagem no qual o mutante, a variante ou o derivado se baseia pode ser derivado de espécies humanas ou animais. Especificamente, a espécie animal pode ser um mamífero, como camundongo, rato, coelho, vaca, ovelha, camelo, cabra, etc.
[0043] A alteração de aminoácidos para preparar o receptor Fc do mutante da presente revelação, isto é, deleção, inserção ou substituição, é alcançada por um meio existente. Quando o mutante do receptor Fc é derivado de um recombinante, um ácido nucleico que codifica a molécula pode ser aquele em que um código associado à inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos é introduzido ou excluído adequadamente. A sequência de aminoácidos desejada pode ser introduzida ao sintetizar uma molécula receptora por síntese peptídica de novo.
[0044] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante pode ser aquele em que o 117o aminoácido e o 159o aminoácido da sequência do receptor Fc-gama do tipo selvagem da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 são alterados.
[0045] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante é aquele em que o 117o aminoácido, o 119o aminoácido e o 159o aminoácido da sequência do receptor Fc-gama do tipo selvagem da SEQ ID NO: 43 ou SEQ A ID NO 49 são alterados e, adicionalmente, um ou mais aminoácidos selecionados dentre o 86o aminoácido, o 127o aminoácido e o 171o aminoácido são alterados.
[0046] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante é um mutante de receptor Fc-gama contendo uma sequência em que o 117o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 é substituído por asparagina (N) e o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q).
[0047] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante é aquele em que, além da substituição do 117o aminoácido e do 159o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49, um ou mais aminoácidos selecionados de um grupo que consiste no 55o aminoácido, no 86o aminoácido, no 119o aminoácido, no 127o aminoácido e no 171o aminoácido é substituído.
[0048] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante é um mutante de receptor Fc-gama incluindo uma sequência em que o 86o aminoácido é substituído por ácido aspártico (D), o 117o aminoácido é substituído por asparagina (N), o 119o aminoácido é substituído por metionina (M) ou valina (V), o 127o aminoácido é substituído por leucina (L), o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q) e o 171o aminoácido é substituído por ácido glutâmico (E) da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49.
[0049] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui ainda, além da substituição do 117o aminoácido e do 159o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49, uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste na substituição do 55o aminoácido por histidina (H), substituição do 86o aminoácido por ácido aspártico (D), substituição do 119o aminoácido por metionina (M) ou valina (V), substituição do 127o aminoácido com leucina (L) e substituição do 171o aminoácido com ácido glutâmico (E).
[0050] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 44.
[0051] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 45.
[0052] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 46.
[0053] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 47.
[0054] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 48.
[0055] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, o mutante inclui uma sequência da SEQ ID NO: 50.
[0056] O mutante de receptor Fc-gama da presente revelação inclui vários mutantes de receptor Fc-gama (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, etc.). Especificamente, pode ser um mutante de receptor Fc-gama IIa ou um mutante de receptor Fc-gama IIb.
[0057] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, um vetor contendo a molécula de ácido nucleico ou uma célula hospedeira que contém o vetor.
[0058] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para preparar um polipeptídeo contendo um mutante de receptor Fc-gama, que inclui: a) uma etapa de cultivo de uma célula hospedeira contendo um vetor contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo; e b) uma etapa de recuperação de um polipeptídeo expresso pela célula hospedeira.
[0059] A molécula de ácido nucleico da presente revelação pode ser uma molécula isolada ou recombinante e pode incluir não apenas um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, uma sequência complementar à mesma. O “ácido nucleico isolado” pode ser um ácido nucleico isolado da sequência genética de um genoma isolado de um indivíduo quando é um ácido nucleico isolado de uma fonte natural. Um ácido nucleico sintetizado enzimática ou quimicamente a partir de um modelo, por exemplo, um produto de PCR, uma molécula de cDNA ou um oligonucleotídeo também pode ser entendido como uma molécula de ácido nucleico isolado. A molécula de ácido nucleico isolado é uma molécula de ácido nucleico que é um componente de um fragmento ou de um construto maior de ácido nucleico. O ácido nucleico é “operacionalmente ligado” quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um DNA para uma pré-sequência ou um líder secretor está operacionalmente ligado a um DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré-proteína antes da secreção do polipeptídeo, um promotor ou um intensificador é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência polipeptídica, ou um sítio de ligação ao ribossomo, é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação, se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e existentes no mesmo quadro de leitura. No entanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios convenientes de enzimas de restrição. Se esses sítios não existirem, um adaptador oligonucleotídico sintético ou um ligante é usado de acordo com a prática convencional.
[0060] No presente relatório descritivo, o termo “vetor” se refere a um carreador com a capacidade de inserir uma sequência de ácidos nucleicos para introdução da sequência de ácidos nucleicos em uma célula que pode replicar a mesma. A sequência de ácidos nucleicos pode ser exógena ou heteróloga. O vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo ou um vírus (por exemplo, bacteriófago), embora não esteja limitado a isso. Os versados na técnica podem construir o vetor de acordo com uma tecnologia de recombinação padrão (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Ausubel et al., In: Current Protocolos em Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, EUA, 1994; etc.).
[0061] No presente relatório descritivo, o termo “vetor de expressão” se refere a um vetor contendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos uma parte de um produto gênico transcrito. Em alguns casos, a molécula de RNA é traduzida posteriormente em uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo. O vetor de expressão pode conter várias sequências reguladoras. O vetor ou o vetor de expressão pode conter, juntamente com uma sequência reguladora que controla a transcrição e tradução, outras sequências de ácidos nucleicos que fornecem funções diferentes.
[0062] No presente relatório descritivo, o termo “célula hospedeira” inclui uma célula eucariótica e uma célula procariótica, e se refere a uma célula transformável de qualquer organismo que possa replicar o vetor ou expressar um gene codificado pelo vetor. A célula hospedeira pode ser transfectada ou transformada pelo vetor, o que significa um processo pelo qual uma molécula de ácido nucleico exógena é transferida ou introduzida na célula hospedeira.
[0063] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para identificar a presença de um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra, que inclui: a) uma etapa de preparação de uma amostra para identificar a presença de um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG; b) uma etapa de ligação do polipeptídeo descrito acima à amostra, misturando-os juntos; e c) uma etapa de identificação da presença do anticorpo IgG ou da região Fc do anticorpo IgG com o polipeptídeo ligado.
[0064] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para purificar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra, que inclui: a) uma etapa de ligação do polipeptídeo descrito acima a uma amostra contendo um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG, misturando-os juntos; e b) uma etapa de purificação do anticorpo IgG ou da região Fc do anticorpo IgG com o polipeptídeo ligado.
[0065] Como descrito acima, devido ao fato de que o mutante de receptor Fc-gama da presente revelação aprimorou a capacidade de ligação a um anticorpo IgG ou a uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem, o mesmo pode ser útil para identificar a presença de, detectar ou purificar o anticorpo IgG ou a região Fc do anticorpo IgG.
[0066] A separação e purificação do polipeptídeo podem ser realizadas por qualquer uma das várias tecnologias conhecidas. Os exemplos incluem cromatografia de troca iônica, cromatografia de permeação em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa e eletroforese em gel preparativa, mas não se limitam a isso. A tecnologia de separação e purificação de polipeptídeos pode exigir a modificação de um polipeptídeo de acordo com um método comum. Por exemplo, uma etiqueta de histidina pode ser adicionada a uma proteína durante a purificação da coluna de níquel. Outras modificações podem induzir maior ou menor atividade, permitir mais produção de proteínas ou simplesmente purificação de proteínas. Outras etiquetas podem incluir uma etiqueta FLAG. Especificamente, a etiqueta é usada em um hospedeiro eucariótico.
[0067] Os métodos para purificar polipeptídeos incluem o método de precipitação com sulfato de amônio para purificar proteínas com base na mudança na solubilidade. Esse método é mais específico do que técnicas gerais, como relargagem (salting out). O sulfato de amônio é geralmente usado devido ao fato de que tem alta solubilidade e permite uma solução salina com alta força iônica. A solubilidade de um polipeptídeo varia de acordo com a força iônica da solução, portanto, de acordo com a concentração de sal.
[0068] Como a solubilidade de um polipeptídeo é distintamente diferente com alta força iônica, a relargagem é um método muito útil na purificação de polipeptídeos específicos. Especificamente, pela adição de sulfato de amônio kosmotrópico, não apenas os subprodutos dobráveis, como espécies desdobradas e dobradas, mas também hospedam impurezas derivadas de células, como componentes da parede celular e polipeptídeos. Como a eficiência da precipitação aumenta com o aumento da concentração do precipitante, um produto mutante do receptor Fc altamente purificado pode ser obtido enquanto o mutante do receptor Fc é resistente à precipitação em concentrações tão altas de sulfato de amônio.
[0069] O polipeptídeo precipitado é removido por centrifugação e a concentração do polipeptídeo precipitado de interesse é aumentada enquanto os subprodutos do polipeptídeo permanecem na solução. Em seguida, o polipeptídeo precipitado de interesse é recuperado por centrifugação e dissolvido em um tampão novo para purificação.
[0070] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para rastrear um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG, que inclui:
a) uma etapa de estabelecer uma biblioteca mutante de receptor Fc-gama, incluindo uma sequência em que o 117o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 é substituído por asparagina (N) e o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q); e b) uma etapa de rastreamento de um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o mutante de receptor Fc- gama, incluindo apenas a substituição das duas sequências de aminoácidos da biblioteca.
[0071] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para rastrear um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG, que inclui: a) uma etapa de estabelecer uma biblioteca de mutantes de receptor Fc- gama, incluindo uma sequência em que o 117o aminoácido é substituído por asparagina (N) e o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q) da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 e incluindo ainda a substituição de um ou mais aminoácidos selecionados, formam um grupo que consiste no 86o aminoácido, no 127o aminoácido e no 171o aminoácido; e b) uma etapa de rastreamento de um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o mutante de receptor Fc- gama, incluindo apenas a substituição das duas sequências de aminoácidos do 117º e do 159o aminoácidos da biblioteca.
[0072] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para rastrear um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG, que inclui: a) uma etapa de estabelecer uma biblioteca mutante de receptor Fc-gama, incluindo uma sequência em que o 55o aminoácido é substituído por histidina (H), o 117o aminoácido é substituído por asparagina (N), o 119o aminoácido é substituído por valina (V), o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q) e o 171o aminoácido é substituído por ácido glutâmico (E) da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49; e b) uma etapa de rastreamento de um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o mutante de receptor Fc- gama, incluindo apenas a substituição das cinco sequências de aminoácidos do 55o 117o, 119o, 159o e 171o aminoácidos da biblioteca.
[0073] O método de rastreamento da presente revelação pode ser útil para rastrear um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o mutante de receptor Fc-gama.
[0074] O mutante rastreado de acordo com o método de rastreamento da presente revelação pode incluir ainda as seguintes alterações de aminoácidos: substituição de um ou mais aminoácidos selecionados de um grupo que consiste no 55o aminoácido, no 86o aminoácido, no 119o aminoácido, no 127o aminoácido e 171o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49.
[0075] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, pode ainda haver uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de um grupo que consiste na substituição do 55o aminoácido por histidina (H), substituição do 86o aminoácido por ácido aspártico (D), substituição do 119o aminoácido por metionina (M) ou valina (V), substituição do 127o aminoácido por leucina (L) e substituição do 171o aminoácido por ácido glutâmico (E).
[0076] De acordo com uma modalidade exemplificadora da presente revelação, um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada a um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG foi rastreado através do método de rastreamento descrito acima (Exemplos 7 e 8).
[0077] No método de rastreamento da presente revelação, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou outras técnicas de citometria de fluxo automatizada podem ser usadas. Os instrumentos para citometria de fluxo são conhecidos dos versados na técnica. Exemplos dos instrumentos incluem FACSAria, FACS Star Plus, FACScan e FACSort (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C (Divisão de Épicos Coulter, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colorado, EUA) e MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianápolis, IN, EUA). Em geral, a separação de células e outras partículas em uma amostra líquida é incluída na técnica de citometria de fluxo. Normalmente, o objetivo da citometria de fluxo é analisar uma ou mais características de partículas separadas (por exemplo, a presença de ligantes marcados ou outras moléculas). As partículas são classificadas com base no tamanho, refração, dispersão da luz, opacidade, rugosidade, forma, fluorescência etc., à medida que passam através de um sensor, uma por uma.
[0078] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece uma composição contendo o polipeptídeo, a molécula de ácido nucleico ou o vetor descrito acima.
[0079] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, a composição da presente revelação é para detectar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra.
[0080] No presente relatório descritivo, o termo “amostra” se refere a uma substância que provavelmente contém um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG. A amostra pode ser excrementos, células, sangue, plasma, soro, cabelo, urina etc. isolados natural ou artificialmente de um indivíduo.
[0081] O termo “indivíduo” usado no presente relatório descritivo inclui um mamífero, incluindo um primata como ser humano e chimpanzé, um animal de estimação como cachorro, gato, etc., um gado como vaca, cavalo, ovelha, cabra etc. roedor como camundongo, rato, etc.
[0082] Além disso, a composição pode estar contida em um kit que pode ser útil para detectar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG contido em uma amostra, quantificar a quantidade de anticorpo IgG em um indivíduo ou medir ou detectar a condição relacionada à imunidade de um paciente (por exemplo, alterações imunológicas causadas por hipersensibilidade imune, doença autoimune ou transplante de órgão).
[0083] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece uma proteína ou peptídeo de fusão em que o polipeptídeo está ligado a uma proteína fisiologicamente ativa ou a um peptídeo fisiologicamente ativo.
[0084] A proteína ou peptídeo de fusão de acordo com a presente revelação aumentou a meia-vida in vivo devido ao fato de que a proteína fisiologicamente ativa ou o peptídeo fisiologicamente ativo está ligado ao mutante de receptor Fc-gama e, portanto, pode ser retido por mais tempo in vivo.
[0085] No presente relatório descritivo, o termo “proteína de fusão (polipeptídeo de fusão)” pode se referir a uma proteína de fusão com uma nova estrutura molecular em que uma ou mais proteínas com atividade fisiológica estão ligadas ao terminal N ou terminal C do mutante de receptor Fc-gama. E, o “peptídeo de fusão” se refere a um peptídeo de fusão com uma nova estrutura molecular, em que um ou mais peptídeos de baixo peso molecular com atividade fisiológica estão ligados ao terminal N ou terminal C do mutante de receptor Fc-gama.
[0086] A proteína fisiologicamente ativa ou o peptídeo fisiologicamente ativo pode ser ligado ao mutante de receptor Fc-gama diretamente ou através de um ligante composto por aminoácidos.
[0087] Especificamente, a proteína fisiologicamente ativa ou o peptídeo fisiologicamente ativo podem ser ligados ao mutante de receptor Fc-gama usando uma tecnologia conhecida de recombinação genética. O mesmo pode estar ligado ao terminal N, ao terminal C ou a um radical livre do mutante de receptor Fc-gama com o uso de um reticulador conhecido.
[0088] A proteína fisiologicamente ativa pode incluir um hormônio e um receptor do mesmo, um modificador de resposta biológica e um receptor do mesmo, uma citocina e um receptor do mesmo, uma enzima, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, etc. Especificamente, a proteína fisiologicamente ativa pode incluir o ser humano hormônio do crescimento (hGH), insulina, hormônio folículo-estimulante (FSH), gonadotrofina coriônica humana, hormônio da paratireoide (PTH), eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônia granulócitos-macrófagos (GM-
CSF), interferon-alfa, interferon-beta, interferon-gama, interleucina, fator de ativação de macrófagos, fator de necrose tumoral, ativador de plasminogênio tecidual, fator de coagulação sanguínea VII, VII a, V III, IX, hBMP2 (proteína morfogênica óssea humana 2), KGF (fator de crescimento de queratinócitos), PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), glucocerebrosidase, α-galactosidase A, α-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, lactase, adenosina desaminase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, fator ativador de plaquetas acetil hidrolase, endopeptidase neutra, uroquinase, estreptoquinase, mieloperoxidase, superóxido dismutase, toxina botulínica, colagenase, hialuronidase, L-asparaginase, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, etc., embora não estejam limitados a isso.
[0089] O peptídeo fisiologicamente ativo pode incluir peptídeo-1 do tipo glucagon (GLP-1) e um análogo do mesmo, exendina e um análogo do mesmo, somatostatina e um análogo do mesmo, agonista e antagonista de LHRH (hormônio liberador de hormônio luteinizante), hormônio adrenocorticotrópico, hormônio de liberação de hormônio de crescimento, ocitocina, timosina alfa-1, fator de liberação de corticotropina, calcitonina, bivalirudina, um análogo de vasopressina, um fragmento de uma proteína fisiologicamente ativa, etc., embora não esteja limitado a isso.
[0090] O peptídeo da presente revelação pode ser útil para aumentar a meia-vida in vivo de outra proteína ou peptídeo fisiologicamente ativo. A proteína ou peptídeo de fusão pode ter aumentado a meia-vida in vivo devido ao aumento da retenção in vivo.
[0091] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, a composição da presente revelação é uma composição farmacêutica para imunossupressão.
[0092] A composição farmacêutica da presente revelação pode conter: (a) o polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico que codifica o mesmo ou um vetor contendo a molécula de ácido nucleico; e (b) um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0093] De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, a composição da presente revelação é uma composição farmacêutica para suprimir a rejeição de transplante de órgãos ou para prevenir ou tratar doenças autoimunes.
[0094] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para suprimir a imunidade ou rejeição de transplante de órgãos, que inclui uma etapa de administração da composição farmacêutica.
[0095] Em outro aspecto da presente revelação, a presente revelação fornece um método para prevenir ou tratar doenças autoimunes, que inclui uma etapa de administração da composição farmacêutica.
[0096] No presente relatório descritivo, o termo “doença autoimune” é usado de forma intercambiável com “distúrbio autoimune” e se refere a uma condição resultante de uma resposta imune anormal às próprias células, tecidos ou órgãos. O termo “doença inflamatória” é usado de forma intercambiável com o termo “distúrbio inflamatório” e se refere a uma condição caracterizada por inflamação, especificamente inflamação crônica. A doença autoimune pode ou não estar relacionada à inflamação. Além disso, a inflamação pode ou não causar doenças autoimunes.
[0097] Exemplos de doenças autoimunes que podem ser prevenidas ou tratadas pela composição farmacêutica da presente revelação incluem alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolípide, doença de Addison, doença autoimune da glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ovarite autoimune e testite, trombocitopenia autoimune, doença de Bechet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença celíaca-dermatite, dermatite atópica, asma, rinite, síndrome de disfunção imune de fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença por aglutinina a frio, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática, neurite por IgA, artrite juvenil, líquen plano, líquen doença de eniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes tipo I ou imunomediada, miastenia grave, pênfigo vulgar, anemia perniciosa,
poliarterite nodosa, policondrite, síndrome polendócrina autoimune, polimialgia reumática, polimiosite, dermatomiosite, hiperaldosteronismo primário, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reumatoide, sarcoidose, dermatosclerose, síndrome da pessoa rígida, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal, arterite de células gigantes, uterina ulcerativa, colo uterino granulomatose, embora não se limite a isso.
[0098] O carreador farmaceuticamente aceitável contido na composição farmacêutica da presente revelação é comumente usado e inclui lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, metil celulose, metil hidroxibenzoato, propil hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio, óleo mineral, etc., embora não seja limitado a isso. A composição farmacêutica da presente revelação pode ainda conter, além dos ingredientes descritos acima, um lubrificante, um umectante, um adoçante, um aromatizante, um emulsificante, um agente de suspensão, um conservante, etc. Carreadores e preparações farmaceuticamente aceitáveis adequados são descritos em detalhe em Remington's Pharmaceutical Sciences (19ª ed., 1995).
[0099] A composição farmacêutica da presente revelação pode ser administrada por via oral ou parentérica, especificamente parenteralmente, por exemplo, via injeção intravenosa, injeção tópica, injeção intraperitoneal, etc.
[0100] Uma dosagem de administração adequada da composição farmacêutica da presente revelação varia dependendo de fatores como método de formulação, método de administração, idade, peso corporal e sexo de um paciente, condição patológica, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibilidade à resposta. Um médico normalmente treinado pode facilmente determinar e prescrever uma dose de administração eficaz para o tratamento ou prevenção desejado. De acordo com uma modalidade exemplificadora específica da presente revelação, uma dosagem de administração diária da composição farmacêutica da presente revelação é de 0,0001 a 100 mg/kg.
[0101] A composição farmacêutica da presente revelação pode ser formulada de acordo com um método que pode ser facilmente realizado pelos versados na técnica em formas de dose única ou em embalagens de doses múltiplas usando um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A formulação pode ser uma solução em um óleo ou meio aquoso, uma suspensão, uma emulsão, um extrato, um pó, um grânulo, um comprimido ou uma cápsula e pode ainda conter um dispersante ou um estabilizador.
[0102] A composição farmacêutica da presente revelação pode ser usada sozinha ou em combinação com outra quimioterapia comum ou terapia biológica. A doença relacionada ao sistema imune pode ser tratada com mais eficácia pela terapia combinada.
EFEITOS VANTAJOSOS
[0103] As características e vantagens da presente revelação podem ser resumidas da seguinte forma: (i) A presente revelação fornece um polipeptídeo incluindo um mutante de receptor Fc-gama. (ii) A presente revelação também fornece um método para preparar o polipeptídeo. (iii) O mutante de receptor Fc-gama da presente revelação é otimizado substituindo uma parte de uma sequência de aminoácidos do receptor Fc-gama por uma sequência de aminoácidos diferente, de modo a fornecer uma excelente capacidade de ligação seletiva às imunoglobulinas. Portanto, o mesmo pode ser utilmente utilizado para aumentar a meia-vida in vivo dos fármacos, detectar e purificar imunoglobulinas, inibir rejeições de transplantes de órgãos ou prevenir ou tratar doenças autoimunes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0104] A Figura 1 ilustra esquematicamente o estabelecimento de uma biblioteca de mutante de FcγRIIa da presente revelação.
[0105] A Figura 2 mostra um processo de triagem de um mutante SH2A40 exibindo alta afinidade para IgG sérica humana.
[0106] A Figura 3 mostra um resultado mostrando que uma proteína FcγRIIa (32 kDa) foi purificada com alta pureza em SDS-PAGE.
[0107] A Figura 4 compara a capacidade de ligação de SH2A40 com um motivo de glicosilação canônica N-ligado adicionado a Fc.
[0108] A Figura 5 ilustra esquematicamente um processo de obtenção de SH2A40 purificado.
[0109] A Figura 6 mostra um resultado da investigação da atividade de SH2A40 executando ELISA.
[0110] A Figura 7 ilustra, esquematicamente, um processo de estabelecimento de uma biblioteca de mutante de FcγRIIa sem motivo de glicosilação canônica N-ligado formado.
[0111] A Figura 8 compara a capacidade de ligação de mutantes rastreados com o uso de uma biblioteca estabelecida e citometria de fluxo (MG2A28 e MG2A45) para Fc.
[0112] A Figura 9 mostra um resultado da purificação de mutantes rastreados.
[0113] A Figura 10 mostra um resultado ELISA da investigação da capacidade de ligação de mutantes rastreados para Fc.
[0114] A Figura 11 mostra um resultado de medição dos KD valores de mutantes de receptores Fc-gama e rituximab por interferometria de biocamada.
[0115] A Figura 12 compara a afinidade de mutantes rastreados com o uso de uma biblioteca estabelecida e citometria de fluxo (MG2A28 e MG2A45) para Fc.
[0116] A Figura 13 mostra um resultado da purificação de mutantes rastreados.
[0117] A Figura 14 mostra um resultado ELISA da investigação da capacidade de ligação de mutantes rastreados para Fc.
[0118] A Figura 15 mostra um resultado de medição dos valores KD de mutantes de receptores Fc-gama e rituximab por interferometria de biocamada.
[0119] A Figura 16 mostra um resultado ELISA da investigação da capacidade de ligação de mutantes de receptor Fc-gama à IgG sérica de camundongo.
[0120] A Figura 17 mostra um resultado da comparação da afinidade de FcγRIIb do tipo selvagem e FcγRIIb introduzido pela mutação MG2A45.1 (MG2B45.1) por soro humano IgG-FITC.
[0121] A Figura 18 mostra bevacizumab scFv, bevacizumab scFv-FcγRIIa do tipo selvagem e bevacizumab scFv-MG2A45.1 expresso em células de mamíferos.
[0122] A Figura 19 mostra um resultado de ensaio ELISA da análise da atividade de ligação ao VEGF do tipo selvagem de bevacizumab scFv, bevacizumab scFv- FcγRIIa e bevacizumab scFv-MG2A45.1 para bevacizumab scFv.
[0123] A Figura 20 mostra um resultado do ensaio ELISA da análise da atividade de ligação de IgG1 Fc (rituximab) de bevacizumab scFv, bevacizumab scFv-FcγRIIa tipo selvagem e bevacizumab scFv-MG2A45.1 para FcγRIIa.
MELHOR MODO
[0124] A seguir, a presente revelação será descrita em detalhes através de exemplos. No entanto, os exemplos a seguir são apenas para fins ilustrativos e será evidente para os versados na técnica que o escopo da presente revelação não é limitado pelos exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE MUTANTE FcγRIIa
[0125] Os genes FcγRIIa introduzidos por mutação aleatória foram preparados com o uso dos primers MJ no 160 e MJ no 161 baseados no vetor pMopac12-NlpA- FcγRIIa-FLAG, de modo que cerca de 0,2% da mutação aleatória ocorreu em FcγRIIa. Além disso, as inserções focadas com vários aminoácidos introduzidos foram preparadas pela introdução do códon degenerado NNK no sítio de ligação IgG Fc de FcγRIIa usando os primers MJ no 160, MJ no 161, p788, p789, p790, p791, p792 e p793 (Tabela 1). As duas inserções preparadas foram tratadas com a enzima de restrição SfiI (New England Biolab) e ligadas ao vetor. Em seguida, uma biblioteca de mutante FcγRIIa (tamanho da biblioteca: 2,2 x 109) foi construída transformando-se em E. coli Jude1 ((F’[Tn10(Tetr)proAB+lacIq∆(lacZ)M15] mcrA∆(mrr-hsdRMS- mcrBC)Φ80dlacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 araD139∆(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG) (Figura 1).
TABELA 1 Primer # Sequência (5 '→ 3')
GCGGGGTTTGCAGCACCAGMNNMNNMNNAAGCAC P788 (SEQ ID NO: 1)
GGTCAGATGCACCG
CGGTGCATCTGACCGTGCTTNNKNNKNNKCTGGTG P789 (SEQ ID NO: 2)
CTGCAAACCCCGC
GCTTTTGCCATTCTGAAAAAAGGTCACTTTMNNCAG P790 (SEQ ID NO: 3)
MNNMNNATCTTTCCAGCTATGGCAACGCAG
CTGCGTTGCCATAGCTGGAAAGATNNKNNKCTGNN P791 (SEQ ID NO: 4)
KAAAGTGACCTTTTTTCAGAATGGCAAAAGC
GCGGAATGCTAAAGGTCGGATCCAGMNNAGAMNNT P792 (SEQ ID NO: 5) TTCTGMNNTTTGCCATTCTGAAAAAAGGTCACTTTC
ACC
GGTGAAAGTGACCTTTTTTCAGAATGGCAAANNKCA P793 (SEQ ID NO: 6) GAAANNKTCTNNKCTGGATCCGACCTTTAGCATTCC
GC IIa Fw NdeI (SEQ ID NO: 7) GCGGAATTCCATATGCAGGCTGCCCCACCGAAAG IIa Rv HindIII (SEQ ID NO:
TAAGGGAAGCTTAATCACGCCCATCGGTGAGC 8) MJ no 1 (SEQ ID NO: 9) CCA GGC TTT ACA CTT TAT GC MJ no 2 (SEQ ID NO: 10) CTG CCC ATG TTG ACG ATT G MJ no 112 (SEQ ID NO: 11) CAGCGGTTTATCTTTCCAGCTATGGC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNGGTG MJ no 113 (SEQ ID NO: 12)
NNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKGATGTG MJ no 114 (SEQ ID NO: 13)
NNKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKTTTGTGN MJ no 115 (SEQ ID NO: 14)
NKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTCTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKCATGTG MJ no 116 (SEQ ID NO: 15)
NNKTTTTTTCAGAATGGCACAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKATTGTGN MJ no 117 (SEQ ID NO: 16)
NKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKTATGTGN MJ no 118 (SEQ ID NO: 17)
NKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNGGTG MJ no 119 (SEQ ID NO: 18)
NWKTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTG MJ no 120 (SEQ ID NO: 19)
GCGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC MJ no 121 (SEQ ID NO: 20) GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTG
Primer # Sequência (5 '→ 3')
GGCTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTG MJ no 122 (SEQ ID NO: 21)
CCGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTG MJ no 123 (SEQ ID NO: 22)
CGTTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC
GCCATAGCTGGAAAGATAAACCGCTGNNKNNKGTG MJ no 124 (SEQ ID NO: 23)
TGGTTTTTTCAGAATGGCAAAAGCCAGAAATTTTC o MJ n 160 (SEQ ID NO: 24) CGCAGCGAGAGGCCCAGCCGGCCATG MJ no 161 (SEQ ID NO: 25) CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCC
CGCAGCGAGCGCGCACTCCATGCAGGCTGCCCCA MJ no 162 (SEQ ID NO: 26)
CC MJ no 163 (SEQ ID NO: 27) CCCTAAAATCTAGAAATCACGCCCATCGGTGAGC MJ no 197 (SEQ ID NO: 28) CGGGAAAATTTCTTGGATTTTCCATTCTGGAAGAA
GCTGGAAGGACAAGCCTCTGGTCAATGTCGTGTTCT MJ no 198 (SEQ ID NO: 29)
TCCAGAATGGAAAATCCAAGAAATTTTCCCG
CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCCGGGCTCTTGGAC MJ no 199 (SEQ ID NO: 30)
AGTGATGGTCACAGGCTTG o MJ n 200 (SEQ ID NO: 31) CAGCCCAGCTACCATTTCAAGGCCAAC MJ no 201 (SEQ ID NO: 32) GTTGGCCTTGAAATGGTAGCTGGGCTG MJ no 202 (SEQ ID NO: 33) CATAGGCTACACGCAGTACTCATCCAAGC MJ no 203 (SEQ ID NO: 34) GCTTGGATGAGTACTGCGTGTAGCCTATG EXEMPLO 2. RASTREAMENTO DA BIBLIOTECA DE MUTANTE FcγRIIa ATRAVÉS
DA CULTURA BACTERIANA E CITOMETRIA DE FLUXO
[0126] 1 ml das células de biblioteca de mutante a FcγRIIa estabelecidas foram cultivadas durante 4 horas em caldo Terrific (TB) contendo 2% (em p/v) de glicose e cloranfenicol (40 µg/ml), sob a condição de 37 °C, agitando a 250 rpm. As células da biblioteca cultivadas foram inoculadas em um meio de TB a 1:100 e depois cultivadas a OD600 0,6 a 37 °C, enquanto agitavam a 250 rpm. Em seguida, após a cultura a 25 °C por 20 minutos para resfriamento, foi adicionado isopropil-1-tio-β-D- galactopiranosídeo 1 mM (IPTG) para induzir a expressão. Após a cultura estar completa, as células foram recuperadas e centrifugadas a 14.000 rpm por 1 minuto através da normalização de OD600. Após a colheita, as células foram ressuspensas adicionando 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e centrifugadas por 1 minuto. Esse processo de lavagem foi repetido duas vezes. Após ressuspensão em 1 ml de STE [sacarose 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0)], a membrana celular externa foi removida por rotação a 37 °C durante 30 minutos. Depois de centrifugação e descarte do sobrenadante, o remanescente foi ressuspenso através da adição de 1 ml de solução A [sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, MOPS10 mM, pH 6,8] e, em seguida, centrifugado. Após ressuspensão em 1 ml de uma solução de mistura preparada por 1 ml de solução A e 20 ml de uma solução de lisozima a 50 mg/ml, a camada de peptidoglicano foi removida por rotação a 37 °C por 15 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, o restante foi ressuspenso em 1 ml de PBS. Foram tomados 300 µl da solução resultante, combinados com 700 µl de PBS e uma sonda de IgG-FITC no soro humano (Sigma Aldrich) e depois marcados com a sonda fluorescente em esferoplastos por rotação à temperatura ambiente. Após a marcação, seguida de lavagem uma vez com 1 ml de PBS, as células 3% superiores que exibem alta fluorescência foram recuperadas por citometria de fluxo (classificador de células S3; Bio-Rad) e as células selecionadas foram classificadas novamente para aumentar a pureza. Após amplificação de genes por PCR a partir da amostra com o uso dos primers MJ no 160 e no 161 e polimerase Taq (Biosesang), uma sub-biblioteca amplificada por gene foi construída por ligação com tratamento com enzimas de restrição SfiI e transformação. Após repetir esse procedimento por um total de 4 ciclos, os mutantes SH2A40 (SEQ ID NO: 36 e 44) mostrando maior afinidade para IgG sérica humana do que a FcγRIIa de tipo selvagem (SEQ ID NO: 35 e 43) foram rastreados analisando os 40 clones individuais (Figura 2). EXEMPLO 3: CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE MUTANTE SH2A40
ISOLADO PARA EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0127] A fim de expressar o mutante SH2A40 rastreado nas células HEK293F, o pMAZ-FcγRIIa (tipo selvagem) e o mutante pMAZ-FcγRIIa (SH2A40) foram preparados por amplificação gênica por PCR usando a polimerase Vent e os primers MJ no 162 e MJ no 163, seguidos de ligação por tratamento com enzimas de restrição BssHII e XbaI (New England Biolab). Os genes clonados no vetor de expressão de células de mamífero pMAZ foram transfectados para células HEK293F e expressos temporariamente em uma escala de 300 ml. Após a conclusão da cultura, as células foram removidas por centrifugação a 2.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi tomado e equilibrado usando 25x PBS. A solução resultante foi filtrada através de um filtro superior de 0,2 µm (Merck Millipore). Após adição de 1 ml de uma pasta aquosa de Ni-NTA agarose (Qiagen) equilibrada com PBS, a solução foi agitada a 4 °C por 16 horas e depois conduzida para uma coluna de polipropileno (Thermo Fisher Scientific). A solução de passagem foi tomada, ligada a uma resina e depois lavada sequencialmente com 50 ml de 1x PBS, 25 ml de tampão imidazol 10 mM, 25 ml de tampão imidazol 20 mM e 200 µl de tampão imidazol 250 mM. A eluição foi realizada com 2,5 ml de tampão imidazol 250 mM. A proteína coletada foi concentrada com Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) e purificada por SDS-PAGE (Bio-Rad) (Figura 3). Foi confirmado que a proteína FcγRIIa (32 kDa) foi purificada com alta pureza em SDS- PAGE. EXEMPLO 4: ELISA COM O USO DE RITUXIMAB QUE CONSISTE NA SUBCLASSE IgG1 PARA ANÁLISE DE ATIVIDADE E CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE PROTEÍNA FcγRIIa PRODUZIDA ATRAVÉS DA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0128] 50 ml de rituximab diluído para 4 ug/ml com 0,05 M de Na2CO3 (pH 9,6) foi imobilizado sobre uma Microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e, em seguida, bloqueadas em 100 ul de BSA a 5% (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de proteínas FcγRIIa diluídas em série com uma solução de bloqueio foram adicionadas a cada poço e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi realizada com 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma-Aldrich) à temperatura ambiente por 1 hora e a lavagem foi realizada. Após o desenvolvimento da cor, adicionando 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída adicionando 50 µl de H2SO4 2M. Em seguida, a análise foi realizada com o espectrofotômetro Epoch para microplacas (BioTek). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Através do ELISA, a capacidade de ligação para a região Fc do rituximab e FcγRIIa de tipo selvagem, SH2A40, pode ser comparada e analisada. SH2A40 mostrou uma capacidade de ligação similar à de WT FcγRIIa devido ao fato de que um motivo de glicosilação canônico ligado a N foi recentemente gerado (Figura 4). EXEMPLO 5. CLONAGEM PARA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA MBP-FcγRIIa, EXPRESSÃO EM E.COLI E PURIFICAÇÃO
[0129] A fim de produzir o SH2A40 rastreado como uma proteína solúvel, a PCR foi conduzida com o uso de primers IIa_Fw_NdeI e IIa_Rv_HindIII. Após o tratamento com NdeI e HindIII (New England Biolab) e ligação com o vetor pET22b-MBP-TEV- His, o produto foi transformado em células BL21 (DE3). As células foram pré- cultivadas em meio de TB contendo 2% (em p/v) de glicose e ampicilina (100 µg/ml) a 37 °C, enquanto agitavam a 250 rpm. As células cultivadas foram inoculadas em meio de TB a 1:100 e, em seguida, cultivadas até OD600 0,6 a 37 °C, com agitação a 250 rpm. Posteriormente, após o cultivo das células a 18 °C por 20 minutos para resfriamento, a expressão foi induzida por 14 horas pela adição de IPTG 1 mM. Após o término da cultura, as células foram colhidas por centrifugação a 7.000 rpm por 10 minutos. As células foram sonicadas (5 segundos ligado/10 segundos desligado, 100 ciclos) para lise e centrifugadas a 15.000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 µm. O sobrenadante filtrado foi ligado a uma resina Ni-NTA, lavado com 100 ml de tampão imidazol 10 mM e 100 ml de tampão imidazol 20 mM e depois eluído com 4 ml de tampão imidazol 50 mM. A amostra eluída foi trocada por tampão com Tris-HCl 50 mM e o MBP-SH2A40 foi clivado em MBP e SH2A40 com o uso de TEV-GST. Em seguida, o TEV-GST e a proteína MBP foram removidos usando resina GST e resina amilose e apenas SH2A40 puro foi obtido (Figura 5). EXEMPLO 6. ANÁLISE DA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO A IgG1 DO MUTANTE FcγRIIa EXPRESSO EM E. COLI POR ELISA
[0130] O ELISA foi conduzido para investigar a atividade do SH2A40. 50 ml de rituximab diluída para 4 ug/ml com 0,05 M de Na2CO3 (pH 9,6) foi imobilizado sobre a microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueadas com 100 ul de leite desnatado a 4% (GenomicBase)
(em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente por 2 horas. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de FcγRIIa do tipo selvagem e SH2A40 diluídos em série com 1% de leite desnatado (em PBST a 0,05%) foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida à temperatura ambiente por 1 hora, utilizando 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma). Após a lavagem, seguida do desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a análise foi conduzida usando o espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek) (Figura 6). EXEMPLO 7: CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE MUTANTE FcγRIIa SEM
FORMAÇÃO DE MOTIVO DE GLICOSILAÇÃO CANÔNICO LIGADO A N
[0131] A biblioteca foi construída para rastrear mutantes FcγRIIa com elevada afinidade para Fc de IgG sem motivo de glicosilação canônico ligado a N (NXS/T) formado no mutante FcγRIIa (SH2A40: K117N, L159Q). A biblioteca foi construída enquanto se concentrava nas posições V116, K117 e T119 onde o motivo de glicosilação canônico ligado a N foi formado em SH2A40. A biblioteca foi construída usando SH2A40 como modelo. Um códon reduzido foi usado para evitar Cys não emparelhado (Figura 7).
1. SUB-BIBLIOTECA-1: SEM FORMAÇÃO DE ASN OU CYS NA 117ª POSIÇÃO
[0132] pMopac12-NlpA-FcγRIIa (SH2A40)-FLAG foi usado como modelo. O códon degenerado NNK foi usado nas posições 116 e 119 para codificar 20 aminoácidos, o códon reduzido NNG foi usado na posição 117 e codificou 13 aminoácidos e foram usados primers que codificam aminoácidos individuais para os 5 aminoácidos restantes (Gln, Phe, His, Ile, Tyr). O fragmento 1 na posição 116 frontal do gene FcγRIIa foi amplificado com o uso dos primers MJ no 160 e MJ no 112 e a polimerase Vent (New England Biolab), e o fragmento 2 na parte traseira foi amplificado com o uso de uma mistura de MJ no 113-MJ no 118 na mesma proporção e MJ no 161. Os dois fragmentos preparados foram montados com polimerase Vent e tratados com a enzima de restrição SfiI (New England Biolab).
2. SUB-BIBLIOTECA-2: SEM FORMAÇÃO DE SER, THR OU CYS NA 119ª
POSIÇÃO
[0133] pMopac12-NlpA-FcγRIIa (SH2A40)-FLAG foi usado como modelo. O códon degenerado NNK foi usado nas posições 116 e 117 para codificar 20 aminoácidos, o códon reduzido NNG foi usado na posição 119 para codificar 12 aminoácidos e foram usados primers que codificam aminoácidos individuais para os 5 aminoácidos restantes (Ala, Gly, Pro, Arg, Trp). O fragmento 1 na posição 116 frontal do gene FcγRIIa foi amplificado com o uso dos primers MJ no 160 e MJ no 112 e a polimerase Vent (New England Biolab), e o fragmento 2 na parte traseira foi amplificado com o uso de uma mistura de MJ no 119-MJ no 124 na mesma proporção e MJ no 161. Os dois fragmentos preparados foram montados com polimerase Vent e tratados com a enzima de restrição SfiI (New England Biolab).
[0134] Uma biblioteca de FcγRIIa foi construída através da transformação dos dois genes de sub-biblioteca tratados com as enzimas de restrição foram ligados em Jude1 (tamanho de biblioteca teórico: 4,3 x 104, tamanho de biblioteca experimental: 6,3 x 108). EXEMPLO 8: ISOLAMENTO DE MUTANTES COMO MG2A28, MG2A45, ETC. COM O USO DA BIBLIOTECA ESTABELECIDA POR CITOMETRIA DE FLUXO (ANÁLISE DE AFINIDADE PARA IgG SÉRIA HUMANA)
[0135] A biblioteca estabelecida foi incubada a 37 °C por 4 horas em 25 ml de TB + meio de glicose a 2% em um frasco de 250 ml, inoculada em um frasco de 500 ml contendo 100 ml de meio de TB a 1:100 e depois cultivada até OD 600 = 0,6. Após o resfriamento a 25 °C e 250 rpm por 20 minutos, a superexpressão foi realizada a 25 °C e 250 rpm por 5 horas, adicionando IPTG 1 mM. Após a superexpressão, o valor de OD600 foi medido e uma quantidade normalizada das células foi coletada por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. Após ressuspensão das células adicionando 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), a centrifugação foi realizada por 1 minuto. Esse procedimento de lavagem foi repetido duas vezes. Após ressuspensão em 1 ml de STE [sacarose 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0)], a membrana celular externa foi removida por rotação a 37 °C durante 30 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, a ressuspensão foi realizada por adição de 1 ml de solução A [sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, MOPS 10 mM, pH 6,8]. A solução resultante foi centrifugada. Após ressuspensão em 1 ml de uma solução de mistura preparada por 1 ml de solução A e 20 ml de uma solução de lisozima a 50 mg/ml, a camada de peptidoglicano foi removida por rotação a 37 °C por 15 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, o restante foi ressuspenso em 1 ml de PBS. Foram tomados 300 µl da solução resultante, combinados com 700 µl de PBS e uma sonda de IgG-FITC no soro humano (Sigma Aldrich) e depois marcados com a sonda fluorescente em esferoplastos por rotação à temperatura ambiente. Após a marcação, seguida de lavagem uma vez com 1 ml de PBS e diluição de 20 vezes em PBS, as células 3% superiores que exibiam alta fluorescência foram recuperadas por citometria de fluxo (classificador de células S3; Bio-Rad). Para um rastreamento mais eficaz, as células classificadas foram classificadas novamente. Após amplificação de genes por PCR a partir das células com o uso dos primers MJ no 1 e no 2 e polimerase Taq (Biosesang), uma sub-biblioteca amplificada por gene foi construída por ligação com tratamento com enzimas de restrição SfiI e transformação. Depois de repetir esse procedimento durante um total de 3 ciclos, os mutantes que mostram uma maior afinidade para a região Fc da IgG sérica humana foram pesquisados por análise da sequência de bases de mais de 50 clones individuais (Figura 8). EXEMPLO 9: CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE MUTANTE ISOLADO
PARA EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0136] A fim de expressar MG2A28 (SEQ ID NO: 37 e 45) e MG2A45 (SEQ ID NO: 38 e 46) dentre os mutantes rastreados em células HEK293F, mutantes pMAZ- FcγRIIa (MG2A28) e mutantes pMAZ-FcγRIIa (MG2A45) foram preparados pela amplificação de genes por PCR com uso de polimerase Vent e os primers MJ no 162 e MJ no 163, seguidos de ligação pelo tratamento com as enzimas de restrição BssHII e XbaI (New England Biolab). Os genes clonados no vetor de expressão de células de mamífero pMAZ foram transfectados para células HEK293F e expressos temporariamente em uma escala de 300 ml. Após a conclusão da cultura, as células foram removidas por centrifugação a 2.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi tomado e equilibrado usando 25x PBS. A solução resultante foi filtrada através de um filtro superior de 0,2 µm (Merck Millipore). Após adição de 1 ml de uma pasta aquosa de Ni-NTA agarose (Qiagen) equilibrada com PBS, a solução foi agitada a 4 °C por 16 horas e depois enviada para uma coluna de polipropileno (Thermo Fisher Scientific). A solução de passagem foi tomada, ligada a uma resina e depois lavada sequencialmente com 50 ml de 1x PBS, 25 ml de tampão imidazol 10 mM, 25 ml de tampão imidazol 20 mM e 200 µl de tampão imidazol 250 mM. A eluição foi realizada com 2,5 ml de tampão imidazol 250 mM. A proteína coletada foi concentrada com Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) e purificada por SDS-PAGE (Bio-Rad) (Figura 9). Foi confirmado que a proteína FcγRIIa (32 kDa) foi purificada com alta pureza em SDS- PAGE. EXEMPLO 10: ELISA PARA ANALISAR A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE MUTANTES PARA Fc COM O USO DE RITUXIMAB QUE CONSISTE EM SUBCLASSE IgG1
[0137] 50 ml de rituximab diluído para 4 ug/ml com Na2CO3 0,05 M (pH 9,6) foi imobilizado sobre a microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueadas com 100 ul de BSA a 5% (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de mutantes FcγRIIa diluídos em série com uma solução de bloqueio foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida à temperatura ambiente por 1 hora, com o uso de 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma). Após a lavagem, seguida do desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a análise foi conduzida com o uso do espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek) (Figura 10). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Através de ELISA, a capacidade de ligação para a região Fc dos mutantes rituximab e FcγRIIa pode ser comparada e analisada. EXEMPLO 11: MEDIÇÃO DO valor KD DE MUTANTE FcγRIIa e RITUXIMAB
ATRAVÉS INTERFEROMETRIA DE BIOCAMADA
[0138] A fim de medir a capacidade de ligação de IgG1, que é uma subclasse de IgG responsável por cerca de 70% ou mais de soro humano e usado principalmente em vários fármacos de anticorpos, a Fc, a afinidade dos mutantes de FcγRIIa foi medida com o uso de rituximab. A capacidade de ligação dos mutantes de FcγRIIa foi medida com o uso de Blitz (Fortebio). Para análise estável, o anticorpo rituximab foi imobilizado em um biossensor de 2ª geração reativo a amina (AR2G) (Fortebio) diluído com 40 µg/ml de uma solução de acetato de sódio (pH 5,0) e a capacidade de ligação foi analisada reagindo com mutantes de FcγRIIa (SH2A40, MG2A28, MG2A45 tipo selvagem) diluído em série com 1x tampão cinético (Fortebio) (Figura 11). O software Blitz Pro 1.2 (Fortebio) foi usado para calcular o equilíbrio de ligação constante (KD) (Tabela 3). Como resultado, foi confirmado que SH2A40, MG2A28 e MG2A45 rastreados na presente revelação têm uma capacidade de ligação aumentada em 3,57 vezes, 6,16 vezes e 8,26 vezes aumentada para Fc, respectivamente. EXEMPLO 12: ESTABELECIMENTO DA BIBLIOTECA DE PCR SUSCEPTÍVEL A ERROS DE FcγRIIa COM BASE EM MG2A28 E MG2A45 PARA MATURAÇÃO DE
AFINIDADE
[0139] A fim de construir uma biblioteca de mutante FcγRIIa com base em MG2A28 e MG2A45, foi conduzida uma PCR susceptível a erros usando pMopac12- NlpA-FcγRIIa (MG2A28, MG2A45)-FLAG como modelo. A técnica de PCR susceptível a erros com o uso de polimerase Taq (Takara) foi empregada para introduzir mutação de ponto aleatório na região FcγRIIa. A PCR foi conduzida de modo que os dois mutantes MG2A28 e MG2A45 existissem na mesma proporção de 50%:50% na biblioteca. A mutação pontual foi introduzida em 0,3% dos nucleotídeos dos genes totais de FcγRIIa usando os primers MJ no 160 e MJ no 161. Em seguida, uma biblioteca de FcγRIIa foi construída por meio de tratamento com enzima de restrição SfiI, ligação e transformação em Jude1 (tamanho da biblioteca: 2,6 x 109, taxa de erro experimental: 0,32%). Na biblioteca, os mutantes de FcγRIIa foram exibidos na membrana interna de E. coli. EXEMPLO 13: ISOLAMENTO DE MUTANTES COMO MG2A28.1, MG2A45.1, ETC.,
COM O USO DE BIBLIOTECA ESTABELECIDA E CITOMETRIA DE FLUXO (ANÁLISE DE AFINIDADE PARA IgG SÉRICA HUMANA)
[0140] A biblioteca estabelecida foi incubada a 37 °C por 4 horas com um frasco (1 ml) de 25 ml de TB+meio de glicose a 2% em um frasco de 250 ml e depois inoculada em um frasco de 500 ml contendo 100 ml de meio de TB a 1:100. Após a cultura até OD 600 = 0,6, seguida de resfriamento a 25 °C e 250 rpm por 20 minutos, a superexpressão foi realizada a 25 °C e 250 rpm por 5 horas, adicionando IPTG 1 mM. Após a superexpressão, o valor de OD 600 foi medido e uma quantidade normalizada das células foi coletada por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. Após ressuspensão das células adicionando 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), a centrifugação foi realizada por 1 minuto. Esse procedimento de lavagem foi repetido duas vezes. Após ressuspensão em 1 ml de STE [sacarose 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0)], a membrana celular externa foi removida por rotação a 37 °C durante 30 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, a ressuspensão foi realizada por adição de 1 ml de solução A [sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, MOPS 10 mM, pH 6,8]. A solução resultante foi centrifugada. Após ressuspensão em 1 ml de uma solução de mistura preparada por 1 ml de solução A e 20 ml de uma solução de lisozima a 50 mg/ml, a camada de peptidoglicano foi removida por rotação a 37 °C por 15 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, o restante foi ressuspenso em 1 ml de PBS. Foram tomados 300 µl da solução resultante, combinados com 700 µl de PBS e uma sonda de soro humano IgG-FITC (Sigma Aldrich) e depois marcados com a sonda fluorescente em esferoplastos por rotação à temperatura ambiente (1-2 ciclos: 20 nM, 3 ciclos: 5 nM). Após a marcação, seguida de lavagem uma vez com 1 ml de PBS e diluição de 20 vezes em PBS, as células 3% superiores que exibiam alta fluorescência foram recuperadas por citometria de fluxo (classificador de células S3; Bio-Rad). Para um rastreamento mais eficaz, as células classificadas foram classificadas novamente. Após amplificação de genes por PCR a partir das células com o uso dos primers MJ no 1 e MJ no 2 e polimerase Taq (Biosesang), uma sub-biblioteca amplificada por gene foi construída por ligação com tratamento com enzimas de restrição SfiI e transformação. Depois de repetir esse procedimento durante um total de 5 ciclos, analisou-se a intensidade da fluorescência devido à ligação a IgG-FITC de mais de 70 clones individuais. Com isso, os mutantes que mostraram alta afinidade para a região Fc da IgG sérica humana foram rastreados. Foi confirmado por sequenciação de bases que um mutante à base de MG2A28 e um mutante à base de MG2A45 foram isolados (Figura 12). EXEMPLO 14: CLONAGEM PARA EXPRESSÃO DE MUTANTES ISOLADOS,
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0141] A fim de expressar MG2A28.1 (SEQ ID NO: 39 e 47) e MG2A45.1 (SEQ ID NO: 40 e 48) dentre os mutantes rastreados em células HEK293F, mutante pMAZ- FcγRIIa (MG2A28.1) e mutante pMAZ- FcγRIIa (MG2A45.1) foram preparados por amplificação gênica por PCR com o uso de polimerase Vent e os primers MJ no 162 e MJ no 163, seguido de ligação pelo tratamento com as enzimas de restrição BssHII e XbaI (New England Biolab). Os genes clonados no vetor de expressão de células de mamífero pMAZ foram transfectados em células HEK293F e expressos temporariamente a uma escala de 300 ml. Após a conclusão da cultura, as células foram removidas por centrifugação a 2.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi tomado e equilibrado com o uso de 25x PBS. A solução resultante foi filtrada através de um filtro superior de 0,2 µm (Merck Millipore). Após adição de 1 ml de uma pasta aquosa de Ni-NTA agarose (Qiagen) equilibrada com PBS, a solução foi agitada a 4 °C por 16 horas e depois conduzida para uma coluna de polipropileno (Thermo Fisher Scientific). A solução de passagem foi tomada, ligada a uma resina e depois lavada sequencialmente com 50 ml de 1x PBS, 25 ml de tampão imidazol 10 mM, 25 ml de tampão imidazol 20 mM e 200 µl de tampão imidazol 250 mM. A eluição foi realizada com 2,5 ml de tampão imidazol 250 mM. A proteína coletada foi concentrada com Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) e purificada por SDS-PAGE (Bio-Rad) (Figura 13). Foi confirmado que a proteína FcγRIIa (32 kDa) foi purificada com alta pureza em SDS-PAGE. EXEMPLO 15: ELISA PARA ANALISAR A CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE MUTANTES PARA Fc COM O USO DE RITUXIMAB QUE CONSISTE EM SUBCLASSE IgG1
[0142] 50 ml de rituximab diluído para 4 ug/ml com Na2CO3 0,05 M (pH 9,6) foi imobilizado sobre microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueado com 100 ul de BSA a 5% (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de mutantes FcγRIIa diluídos em série com uma solução de bloqueio foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida à temperatura ambiente por 1 hora, com o uso de 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma). Após a lavagem, seguida do desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a análise foi conduzida com o uso do espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek) (Figura 14). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Através de ELISA, a capacidade de ligação para a região Fc dos mutantes rituximab e FcγRIIa (tipo selvagem, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1) pode ser comparada e analisada. EXEMPLO 16: MEDIÇÃO DO VALOR KD DE MUTANTE FcγRIIa e RITUXIMAB
ATRAVÉS INTERFEROMETRIA DE BIOCAMADA
[0143] A fim de medir a capacidade de ligação de IgG1, que é uma subclasse de IgG responsável por cerca de 70% ou mais de soro humano e usado principalmente em vários fármacos de anticorpos, a Fc, a afinidade dos mutantes de FcγRIIa foi medida com o uso de rituximab. A capacidade de ligação dos mutantes de FcγRIIa foi medida com o uso de Blitz (Fortebio). Para a análise estável, anticorpo rituximab foi imobilizado a um biossensor da 2ª geração reativo a amina (AR2G) (Fortebio) diluído com 40 ug/ml de uma solução de acetato de sódio (pH 5,0), e a capacidade de ligação foi analisada por reação com mutantes FcγRIIa (MG2A28.1, MG2A45.1) diluído em série com 1x tampão cinético (Fortebio) (Figura 15). O software Blitz Pro 1.2 (Fortebio) foi usado para calcular a constante de equilíbrio de ligação (KD) (Tabela 4). Como resultado, foi confirmado que MG2A28.1 e MG2A45.1 rastreados na presente revelação têm a capacidade de ligação aumentada em 5,39 e 32,09 vezes a Fc, respectivamente.
EXEMPLO 17: ANÁLISE DA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO A IgG SÉRICO DE
CAMUNDONGO POR ELISA PARA EXPERIMENTO DE MAMÍFEROS COM O USO DE MODELO DE CAMUNDONGO
[0144] 50 ul de IgG de soro de camundongo diluído para 4 ug/ml com Na2CO3 0,05 M (pH 9,6) foi imobilizado sobre a microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueadas com 100 ul de BSA a 5% (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente por 2 horas. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de mutantes FcγRIIa (tipo selvagem, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1) diluídos em série com uma solução de bloqueio foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida à temperatura ambiente por 1 hora, com o uso de 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma). Após a lavagem, seguida do desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a análise foi conduzida com o uso do espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek) (Figura 16). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Através de ELISA, a capacidade de ligação para a IgG sérica de camundongo e mutantes FcγRIIa (tipo selvagem, MG2A28, MG2A45, MG2A28.1, MG2A45.1) pode ser comparada e analisada. Todos os mutantes, excluindo MG2A28, mostraram afinidade semelhante ou superior à IgG sérica de camundongo quando comparados com o tipo selvagem. Especialmente, os mutantes MG2A45 e MG2A45.1 apresentaram a maior afinidade pelo IgG sérico do camundongo. EXEMPLO 18: INTRODUÇÃO DE MUTAÇÃO PONTUAL PARA INVESTIGAÇÃO DE AFINIDADE PARA Fc DE FcγRIIb QUE TEM CERCA DE 96% DE HOMOLOGIA COM FcγRIIa
[0145] O experimento foi conduzido para analisar o efeito dos mutantes pontuais rastreados em FcγRIIb (SEQ ID NO: 41 e 49). Para isso, o plasmídeo pMopac12-NlpA- FcγRIIb-FLAG foi usado como modelo e a técnica de mutagênese sítio-dirigida Quikchange (Agilent) foi empregada para introduzir R55H e L159Q dentre as mutações pontuais MG2A45.1 (R55H, K117N, T119V, L159Q, V171E) ao gene
FcγRIIb. Os primers MJ no 200, MJ no 201, MJ no 202 e MJ no 203 foram usados para a introdução de cada mutação pontual. Após a realização da PCR com turbo polimerase Pfu (Agilent), a incubação foi realizada a 37 °C por 3 horas para o tratamento com enzima de restrição DpnI (New England Biolab). Após a transformação do gene preparado, foi confirmado através do sequenciamento de bases que a mutação pontual foi introduzida com sucesso. A técnica de PCR de montagem foi usada para a introdução das mutações de três pontos K117N, T119V e V171E. Um plasmídeo com R55H e L159Q introduzido pela mutagênese sítio-dirigida Quikchange foi usado como molde. Dois fragmentos foram amplificados com o uso dos primers MJ no 160, MJ no 197, MJ no 198 e MJ no 199 e polimerase vent (New England Biolab), e MJ no 160 e MJ no 199 foram montados. Em seguida, através de tratamento com enzimas de restrição SfiI, ligação, transformação e sequenciação de bases, a preparação do gene pMopac12-NlpA-FcγRIIb(MG2B45.1)-FLAG no qual estavam inseridas todas as cinco mutações pontuais de MG2A45.1 foi concluída. EXEMPLO 19: COMPARAÇÃO DA AFINIDADE DE FcγRIIb DO TIPO SELVAGEM E FcγRIIb INTRODUZIDO POR MUTAÇÃO DE MG2A45.1 (MG2B45.1) IgG-FITC
SÉRICA HUMANA
[0146] A afinidade do mutante FcγRIIb (MG2B45.1) (SEQ ID NO: 42 e 50) para IgG-FITC sérica humana foi comparada com aquela do FcγRIIb de tipo selvagem. Um inóculo pré-cultivado em 5 ml de TB+meio de glicose a 2% foi inoculado em 5 ml de meio de TB a 1:100 até OD600 = 0,6. Após o resfriamento a 25 °C e 250 rpm por 20 minutos, a superexpressão foi realizada a 25 °C e 250 rpm por 5 horas, adicionando IPTG 1 mM. Após a superexpressão, o valor de OD600 foi medido e uma quantidade normalizada das células foi coletada por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. Após ressuspensão das células adicionando 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), a centrifugação foi realizada por 1 minuto. Esse procedimento de lavagem foi repetido duas vezes. Após ressuspensão em 1 ml de STE [sacarose 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0)], a membrana celular externa foi removida por rotação a 37 °C durante 30 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, a ressuspensão foi realizada por adição de 1 ml de solução A [sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, MOPS
10 mM, pH 6,8]. A solução resultante foi centrifugada. Após ressuspensão em 1 ml de uma solução de mistura preparada por 1 ml de solução A e 20 ml de uma solução de lisozima a 50 mg/ml, a camada de peptidoglicano foi removida por rotação a 37 °C por 15 minutos. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, o restante foi ressuspenso em 1 ml de PBS. Foram tomados 300 µl da solução resultante, combinados com 700 µl de PBS e uma sonda de soro humano IgG-FITC (Sigma Aldrich) e depois marcados com a sonda fluorescente em esferoplastos por rotação à temperatura ambiente (1-2 ciclos: 20 nM, 3 ciclos: 5 nM). Após a marcação, seguida de lavagem uma vez com 1 ml de PBS e diluição 20 vezes em PBS, o sinal de fluorescência do IgG-FITC humano ligado a FcγRIIb foi analisado com o uso de Guava (Merck Millipore) (Figura 17). EXEMPLO 20: CLONAGEM DE BEVACIZUMAB SCFV E MUTANTE BEVACIZUMAB SCFV-FcγRIIa PARA INVESTIGAÇÃO DE AUMENTO EM MEIA-VIDA SÉRICA
[0147] O gene VH foi amplificado com o uso da cadeia pesada de bevacizumab como modelo e com o uso de polimerase Vent e primers BR no 1 e BR no 2, e o gene VL foi amplificado com o uso da cadeia leve de bevacizumab como modelo e com o uso dos primers BR no 4 e BR no 5. Os genes amplificados foram montados com o uso de um ligante GS introduzido em um primer BR no 3, e o bevacizumab scFv foi preparado através do tratamento com enzimas de restrição BssHII e XbaI (New England Biolab), ligação e clonagem no vetor pMAZ, que é um vetor para expressão em células de mamíferos. Os mutantes FcγRIIa e FcγRIIa do tipo selvagem foram amplificados com o uso dos primers BR no 6 e BR no 7, respectivamente. Os genes FcγRIIa amplificados foram montados com o uso de um ligante GS introduzido em BR no 6 para obter os genes do tipo selvagem bevacizumab scFv-FcγRIIa e bevacizumab scFv-MG2A45.1. pMAZ-bevacizumab scFv, pMAZ-bevacizumab scFv-FcγRIIa tipo selvagem e pMAZ-bevacizumab scFv-MG2A45.1 foram preparados por tratamento dos genes amplificados com enzimas de restrição BssHII e XbaI (New England Biolab), ligação e clonagem do vetor pMAZ, que é um vetor para expressão em células de mamíferos. Os primers usados nesse exemplo estão descritos na Tabela 2.
TABELA 2 Primer no Sequência (5’→3’)
CGCAGCGAGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGA BR#1 (SEQ ID NO: 51)
GAGC BR#2 (SEQ ID NO: 52) ACTAGAGACAGTCACCAGTGTACCCT
AGGGTACACTGGTGACTGTCTCTAGTGGTGGAGGCGG
ATCAGGCGGTGGCGGCAGTGGAGGGGGTGGTAGCGG BR#3 (SEQ ID NO: 53)
CGGAGGAGGTTCCGACATCCAGATGACTCAATCACCCA GT
CCCTAAAATCTAGATCACTAGTGATGGTGATGATGATGT BR#4 (SEQ ID NO: 54)
GATCCGCCGGTCCGCTTAATCTCCACTTTGGTTC BR#5 (SEQ ID NO: 55) GGTCCGCTTAATCTCCACTTTGGTTC
GAACCAAAGTGGAGATTAAGCGGACCGGCGGAGGCGG BR#6 (SEQ ID NO: 56)
GAGTCAGGCTGCCCCACCGAAAG
TTTTAGGGTCTAGATCACTAGTGATGGTGATGATGATGT BR#7 (SEQ ID NO: 57)
GATCCGCCAATCACGCCCATCGGTGAGCTG EXEMPLO 21: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE BEVACIZUMAB SCFV E MUTANTE BEVACIZUMAB SCFV-FcγRIIa
[0148] Os genes preparados foram expressos em células Expi 293F temporariamente a uma escala de 300 ml. Após a conclusão da cultura, as células foram removidas por centrifugação a 7.500 rpm por 15 minutos, e o sobrenadante foi tomado e equilibrado usando 25x PBS. A solução resultante foi filtrada através de um filtro superior de 0,2 µm (Merck Millipore). Após adição de 1 ml de uma pasta aquosa de Ni-NTA agarose (Qiagen) equilibrada com PBS, a solução foi agitada a 4 °C por 16 horas e depois conduzida para uma coluna de polipropileno (Thermo Fisher Scientific). Em seguida, a solução foi lavada sequencialmente com 25 ml de tampão imidazol 10 mM, 25 ml de tampão imidazol 20 mM e 250 µl de tampão imidazol 250 mM. A eluição foi realizada com 4 ml de tampão imidazol 250 mM. A proteína coletada foi concentrada com Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) e purificada por SDS-PAGE (Bio- Rad) (Figura 18). EXEMPLO 22: ELISA COM O USO DE VEGF PARA ANÁLISE DE ATIVIDADE E
CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE BEVACIZUMAB SCFV E MUTANTE DE BEVACIZUMAB SCFV-FcγRIIa PRODUZIDO ATRAVÉS DE CULTURA DE
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0149] 50 ml de VEGF (Genscript) diluído a 500 ng/ml com Na2CO3 0,05 M (pH 9,6) foi imobilizado sobre a microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueado com 100 µl de BSA a 5% (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de bevacizumab scFv, bevacizumab scFv-FcγRIIa tipo selvagem e proteínas de bevacizumab scFv-MG2A45.1 diluídas em série com uma solução de bloqueio foram adicionadas a cada poço e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, 50 µl de 20 µg/ml de IgG sérica humana foram adicionados a cada poço para evitar a reticulação entre o domínio Fc do anticorpo secundário anticorpo anti-His anticorpo-HRP conjugado (Sigma-Aldrich) e FcγRIIa, e a reação foi conduzida em temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida em temperatura ambiente por 1 hora com o uso de 50 µl de conjugado anti-His-HRP. Após a lavagem, seguida do desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a absorvância foi analisada a 450 nm com o uso do Espectrofotômetro de microplacas da Epoch (BioTek). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Através de ELISA, a atividade de ligação do bevacizumab scFv fundido com os mutantes γRIIa para o VEGF pode ser analisada. Como resultado, confirmou-se que a FcγRIIa do tipo selvagem e mutante de FcγRIIa MG2A45.1 retêm a capacidade de ligação de VEGF bevacizumab característica de scFv após a fusão com o bevacizumab scFv (Figura 19). Além disso, foi confirmado que a proteína fundida com FcγRIIa apresentava maior capacidade de ligação em ELISA devido ao fato de que FcγRIIa tem uma tendência a formar um dímero por meio de ligação não covalente (Maxwell, KF, MS Powell, MD
Hulett, PA Barton, IF McKenzie, TP Garrett, e PM Hogarth, 1999. Crystal structure of the human leukocyte Fc receptor, FcγRIIa. Nat. Struct. Biol. 6: 437 a 442). EXEMPLO 23: ELISA COM O USO DE RITUXIMAB PARA ANÁLISE DA ATIVIDADE
E CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE BEVACIZUMAB SCFV E MUTANTE DE BEVACIZUMAB SCFV-FcγRIIa PRODUZIDO ATRAVÉS DE CULTURA DE
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
[0150] 50 ml de rituximab diluído para 4 ug/ml com Na2CO3 0,05 M (pH 9,6) foi imobilizado sobre a microplaca de 96 poços de Poliestireno de Alta Ligação de Fundo Plano (Costar) a 4 °C durante 16 horas e bloqueado com 100 ul de BSA a 5 % (em PBST a 0,05%) à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem com 180 µl de PBST a 0,05% por 4 vezes, 50 µl de bevacizumab scFv, bevacizumab scFv-FcγRIIa do tipo selvagem e proteínas de bevacizumab scFv-MG2A45.1 diluídas em série com uma solução de bloqueio foram adicionadas a cada poço e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a reação do anticorpo foi conduzida à temperatura ambiente por 1 hora usando 50 µl de conjugado anti-His-HRP (Sigma- Aldrich). Após a lavagem, seguida pelo desenvolvimento da cor pela adição de 50 µl da solução de substrato Ultra TMB-ELISA em 1 etapa (Thermo Fisher Scientific), a reação foi concluída com a adição de 50 µl de H2SO4 2 M e a absorvância foi analisada com o uso do espectrofotômetro de microplaca Epoch (BioTek). Todos os experimentos foram conduzidos em duplicado. Por meio de ELISA, foi confirmado que o tipo selvagem de bevacizumab scFv-FcγRIIa e o bevacizumab scFv-FcγRIIa- MG2A45.1 excluindo o bevacizumab scFv sem FcγRIIa mantêm a capacidade de ligação a rituximab que consiste em IgG1 Fc. Além disso, foi confirmado que a proteína de fusão MG2A45.1 com capacidade aprimorada de ligação a Fc mostra maior capacidade de ligação a rituximab, o que revela que as características do tipo selvagem FcγRIIa e seu mutante MG2A45.1 são mantidas após a fusão com o bevacizumab scFv (FIG 20).
[0151] Embora as modalidades exemplificadoras tenham sido mostradas e descritas, será entendido pelos versados na técnica que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser realizadas sem afastar-se do espírito e escopo desta revelação, conforme definido pelas reivindicações anexas.
Portanto, pretende-se que esta revelação não se limite às modalidades exemplificadoras particulares descritas como o melhor modo contemplado para realizar esta revelação, mas que esta revelação irá incluir todas as modalidades que se encontram dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende um mutante de receptor Fc-gama, em que o mutante é aquele em que o 117o aminoácido e o 159o aminoácido da sequência do receptor Fc-gama do tipo selvagem da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 são alterados.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante é um mutante de receptor Fc-gama contendo uma sequência em que o 117o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 é substituído por asparagina (N) e o 159o aminoácido é substituído com glutamina (Q).
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o mutante é um mutante de receptor Fc-gama que compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de um grupo que consiste no 55o aminoácido, no 86o aminoácido, no 119o aminoácido, no 127o aminoácido e o 171o aminoácido.
4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o mutante é um mutante de receptor Fc-gama que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de um grupo que consiste na substituição do 55o aminoácido por histidina (H), substituição do 86o aminoácido com ácido aspártico (D), substituição do 119o aminoácido por metionina (M) ou valina (V), substituição do 127o aminoácido por leucina (L) e substituição do 171o aminoácido por ácido glutâmico (E).
5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante que compreende a substituição de aminoácidos tem capacidade de ligação aprimorada a uma região Fc de um anticorpo IgG quando comparado com o receptor Fc-gama do tipo selvagem.
6. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo, tal como definido na reivindicação 1.
7. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, tal como definido na reivindicação 6.
8. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor,
tal como definido na reivindicação 7.
9. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, tal como definido na reivindicação 1, a molécula de ácido nucleico, tal como definida na reivindicação 6 ou o vetor, tal como definida na reivindicação 7.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a composição é para detectar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG compreendido em uma amostra.
11. Kit caracterizado pelo fato de que é para detectar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG que compreende a composição, tal como definida na reivindicação 10.
12. Uso da composição, tal como definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para suprimir a imunidade ou rejeição de transplante de órgão.
13. Uso da composição, tal como definida na reivindicação 9 caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar doenças autoimunes.
14. Proteína ou peptídeo de fusão caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo, tal como definido na reivindicação 1, está ligado a uma proteína fisiologicamente ativa ou a um peptídeo fisiologicamente ativo, em que a proteína ou peptídeo de fusão aumentou a meia-vida in vivo devido ao aumento da retenção in vivo.
15. Método para preparar um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que que compreende um mutante de receptor Fc-gama em que compreende: a) uma etapa de cultivo de uma célula hospedeira que compreende um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, tal como definido na reivindicação 1; e b) uma etapa de recuperação de um polipeptídeo expresso pela célula hospedeira.
16. Método para purificar um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG compreendido em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende:
a) uma etapa de ligação do polipeptídeo, tal como definido na reivindicação 1, a uma amostra que compreende um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG, misturando os mesmos juntos; e b) uma etapa de purificação do anticorpo IgG ou da região Fc do anticorpo IgG com o polipeptídeo ligado.
17. Método para rastrear um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma etapa de estabelecimento de uma biblioteca mutante de receptor Fc-gama, incluindo uma sequência em que o 117o aminoácido da SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 49 é substituído por asparagina (N) e o 159o aminoácido é substituído por glutamina (Q); e b) uma etapa de rastreamento de um mutante de receptor Fc-gama com capacidade de ligação aprimorada para um anticorpo IgG ou uma região Fc do anticorpo IgG quando comparado com o mutante de receptor Fc-gama, incluindo apenas a substituição das duas sequências de aminoácidos da biblioteca.
conceito de biblioteca FCγRIIa susceptível a erros susceptível a erros ou focalizada
Petição 870200000628, de 03/01/2020, pág. 64/84 conceito de biblioteca FCγRIIa focalizada sub-biblioteca #1 conector D1/D2 Erro alça B/C sub-biblioteca #2 Erro alça C'/E Erro
61 1/19 aleatorização NNK sub-biblioteca #3 Erro (tamanho de biblioteca teórico Erro
Construção de biblioteca susceptível a erros e focalizada tamanho de Erro biblioteca
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