BR112020012016A2

BR112020012016A2 - variantes com fragmento fc com uma afinidade aumentada para fcrn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor do fragmento fc

Info

Publication number: BR112020012016A2
Application number: BR112020012016-2A
Authority: BR
Inventors: Harry Meade; Céline MONNET; Philippe Mondon
Original assignee: Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-11-24
Also published as: CN111601821A; FR3075200B1; FR3075200A1; RU2020119543A; CA3084602A1; EP3724221A1; KR20200098512A; AU2018382593A1; JP2023134604A; MX2020006013A; WO2019115773A1; US20210214434A1; JP2021508444A; CN111601821B

Abstract

A presente invenção se refere a uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para, pelo menos, um receptor do fragmento Fc (FcR) escolhido a partir dos receptores FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) e FcyRIIa (CD32a), em relação à do polipeptídeo parental, caracterizada por compreender: (i) as quatro mutações 334N, 352S, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação escolhida entre 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; a numeração é a do índice EU ou o equivalente Kabat.

Description

“VARIANTES COM FRAGMENTO Fc COM UMA AFINIDADE AUMENTADA PARA FcRn E UMA AFINIDADE AUMENTADA PARA PELO MENOS UM RECEPTOR DO FRAGMENTO Fc”

[0001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo (também chamada variante) que compreende uma região Fc mutada e com afinidade aumentada para o receptor FcRn, bem como afinidade aumentada para, pelo menos, um receptor Fc (FcR) relativo a um polipeptídeo parental.

[0002] Um anticorpo consiste em um tetrâmero de cadeias pesadas e leves. As duas cadeias leves são idênticas entre si, enquanto as duas cadeias pesadas são idênticas e conectadas por pontes dissulfeto. Existem cinco tipos de cadeias pesadas (alfa, gama, delta, épsilon, mu), que determinam as classes de imunoglobulina (IgA, IgG, I1gD, IgD, IgE, IgM). O grupo de cadeias leves inclui dois subtipos, lambda e kappa.

[0003] AslgGs são anticorpos solúveis que podem ser encontrados no sangue e em outros fluidos corporais. IgG é uma glicoproteína em forma de Y com um peso molecular aproximado de 150 kDa, consistindo em duas cadeias pesadas e duas leves. Cada cadeia se destaca por uma região constante e uma região variável. Os dois domínios carbóxi-terminais das cadeias pesada formam o fragmento Fc, enquanto os domínios amino-terminais das cadeias pesadas e cadeias leves reconhecem o antígeno e são chamados de o fragmento Fab.

[0004] As proteínas de fusão Fc são criadas por uma combinação de um fragmento Fc de anticorpo com um domínio proteico que fornece a especificidade para um determinado alvo terapêutico. Exemplos são combinações do fragmento Fc com qualquer tipo de proteínas terapêuticas ou fragmentos do mesmo.

[0005] Os polipeptídeos Fc, em particular fragmentos Fc, anticorpos terapêuticos e proteínas de fusão Fc, são usados atualmente para tratar várias doenças, como artrite reumatoide, psoríase, esclerose múltipla e muitas formas de câncer. Os anticorpos terapêuticos podem ser anticorpos monocilonais ou policlonais. Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma única linhagem de células produtoras de anticorpos, que mostra especificidade idêntica para um único antígeno. As proteínas terapêuticas de fusão Fc são usadas ou desenvolvidas como fármacos contra doenças autoimunes e/ou componente inflamatório, como etanercept (Amgen's Enbrel, que é um receptor de TNF ligado a Fc) ou Alefacept (Biogen Idec's Amevive, que é LFA -3 ligado à porção Fc da IgG1 humana).

[0006] Os polipeptídeos Fc, como os fragmentos Fc, os anticorpos Fc e as proteínas de fusão, têm, em particular, uma atividade dependente da ligação de sua parte Fc aos seus receptores, ou seja, FCRn e os receptores do fragmento Fc (FcR), como receptores FcyRI (CD64), FcRilla (CD160) e FceyRlla (CD320).

[0007] Um dos efeitos desejados em terapias envolvendo interações do polipeptídeo Fc com receptores de fragmentos Fc (FcR) é a inibição da ativação do sistema imunológico pela ligação a receptores Fc na superfície das células efetoras. Particularmente, no contexto do tratamento de doenças inflamatórias e/ou autoimunes que envolvem autoanticorpos e/ou citocinas, as terapias baseadas em Fc podem atuar bloqueando os receptores Fc e, assim, competindo com os autoanticorpos pelo acesso a esses receptores. Isso resulta na inibição de atividades diretas normalmente mediadas por autoanticorpos (por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos, citotoxicidade dependente de complemento ou fagocitose celular dependente do anticorpo), e diminuição da ativação do sistema imunológico, incluindo a liberação de citocina. Além disso, como o receptor FcRn está envolvido na reciclagem de anticorpos, bloqueá-los com polipeptídeos Fc permite a eliminação mais rápida de autoanticorpos, reduzindo assim sua meia-vida. É por isso que os tratamentos baseados em fragmentos Fc são particularmente adequados para doenças autoimunes e/ou inflamatórias, desencadeadas por estimulação descontrolada das células do sistema imunológico, em particular por autoanticorpos e/ou citocinas.

[0008] Aterapia básica proposta para o tratamento dessas doenças é uma terapia de imunoglobulina intravenosa (IVIG ou IVig) que consiste em administrar intravenosamente aos pacientes imunoglobulinas (na maioria das vezes IgG) a partir de pools de doações de plasma humano. É geralmente aceito que essas lgGs agem, em particular, bloqueando os receptores Fc e, assim, competindo com os autoanticorpos pelo acesso a esses receptores. Mais recentemente, os fragmentos Fc foram desenvolvidos com o objetivo de modificar suas propriedades de ligação ao receptor Fc. No entanto, sua eficácia ainda precisa ser demonstrada.

[0009] Ainda é necessário otimizar esses fragmentos Fc, em particular para aumentar a meia-vida e/ou a eficácia terapêutica.

[0010] Orequerente desenvolveu agora fragmentos Fc particulares que exibem atividade melhorada, em particular por uma afinidade de ligação FcRn aprimorada. Esses fragmentos Fc podem ser utilizados em terapia e são particularmente adequados para o tratamento de doenças inflamatórias e/ou autoimunes, a fim de trazer maior efetividade ao produto que os contém.

[0011] Em particular, esses fragmentos podem exibir um bloqueio mais eficiente dos receptores Fc presentes nas células do sistema imunológico, que são então menos ou não mais acessíveis para a ligação de autoanticorpos, cuja atividade é então inibida.

[0012] Além disso, os fragmentos Fc tornam possível bloquear o receptor FcRn com mais eficiência e, assim, eliminam os autoanticorpos mais rapidamente.

[0013] Além disso, alguns desses fragmentos Fc específicos têm, como demonstrado nos exemplos, melhor inibição da citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do que IVIG. Portanto, tornam possível reduzir a toxicidade de autoanticorpos patogênicos, como os envolvidos em doenças inflamatórias e/ou autoimunes.

[0014] A presente invenção fornece assim uma variante de um polipeptídeo parental que possui propriedades otimizadas relacionadas à atividade funcional mediada pela região Fc.

[0015] A presente invenção refere-se, assim, a uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FCRn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor Fc (FcR) selecionado a partir de receptores FcyRI (CD64), FeyRllla (CD16a) e FeyRlla (CD320), em relação ao polipeptídeo parental, caracterizado por compreender: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0016] De acordo com uma modalidade, a variante de acordo com a invenção compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240|, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L2421, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260l, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R2921, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q2951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305], V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0017] Essa variante é denominada “variante de acordo com a invenção”, “mutante de acordo com a invenção” ou “polipeptídeo de acordo com a invenção”.

[0018] Preferencialmente, a variante de acordo com a invenção tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para todos os receptores FcyRI (CD64), Fey RIlla (CD16a) e FeyRlla (CD32a).

[0019] De preferência, além disso, a variante de acordo com a invenção é capaz de inibir a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), atribuída a uma modificação da ligação às proteínas do complemento, em particular C1iq. Essa inibição é significativamente melhorada em comparação com a conferida pela IVIG.

[0020] De preferência, a variante de acordo com a invenção é diferente da variante que consiste em um fragmento Fc, em particular I9G1, tendo as cinco mutações N434Y, K334N, P352S, V397M e A378V, e produzida nas células HEK293, em que a numeração é aquela do índice EU ou equivalente em Kabat. Assim, preferencialmente, a variante de acordo com a invenção é diferente do fragmento Fc, em particular I1gG1, N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produzido em células HEK293, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0021] Ao longo deste pedido, a numeração de resíduos na região Fc é a da cadeia pesada de imunoglobulina de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat et a/. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed,., Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991). O termo “índice EU ou equivalente em Kabat” refere-se à numeração nos EUA dos resíduos dos anticorpos Ig9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanos. Isso é ilustrado no site da IMGT (http: Ilvww.imat.ora/IMGTScientificChart/Numberina/Hu IGHGnber.html).

[0022] Por “polipeptídeo” ou “proteína” entende-se uma sequência compreendendo pelo menos 100 aminoácidos covalentemente ligados.

[0023] Por “aminoácido” entende-se um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente ou análogos não naturais.

[0024] Otermo “posição” significa uma posição na sequência de um polipeptídeo. Para a região Fc, as posições são numeradas de acordo com o Índice EU ou equivalente em Kabat.

[0025] O termo “anticorpos” é usado no sentido cotidiano. Corresponde a um tetrâmero que compreende pelo menos uma região Fc e duas regiões variáveis. Os anticorpos compreendem, mas não estão limitados a, imunoglobulinas de comprimento total, anticorpos monocionais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanos. A porção amino-terminal de cada cadeia pesada compreende uma região variável de cerca de 100 a 110 aminoácidos responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Em cada região variável, três laços são reunidos para formar um local de ligação ao antígeno. Cada um dos loops é chamado de região determinante de complementariedade (doravante denominada “CDR”). A porção carbóxi-terminal de cada cadeia pesada define uma região constante que é a principal responsável pela função efetora.

[0026] As lgGs têm várias subclasses, em particular I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4. As subclasses de IgM são, em particular, I9M1 e IgM2. Assim, por “isotipo” entende-se uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas de suas regiões constantes. Os isotipos conhecidos de imunoglobulinas humanas são IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA], IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE.

[0027] As IlgGs de comprimento total são tetrâmeros e consistem em dois pares idênticos de duas cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que cada cadeia leve compreende os domínios VL e CL e cada cadeia pesada compreende os domínios VH, Cy1 (também chamado CH1), Cy2 (também chamado CH2) e Cy3 (também chamado CH3). No contexto de uma Ig humana G1, “CH1” refere-se às posições 118-215, “CH2” refere-se às posições 231 a 340 e “CH3” refere-se às posições 341-447 de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat. A cadeia pesada de IgG também inclui um domínio de dobradiça flexível no terminal N, que se refere aos íons positivos 216-230 no caso de IgG1. A faixa inferior da dobradiça refere-se às posições 226 a 230 de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat.

[0028] Por “região variável" entende-se a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios lg codificados substancialmente por qualquer um dos genes VK, VA e/ou VH que compõem as cadeias pesadas kappa, lambda e imunoglobulina, respectivamente. As regiões variáveis incluem regiões determinantes de complementariedade (CDRs) e regiões de estrutura (FRs).

[0029] O termo “Fc” ou “região Fc” refere-se à região constante de um anticorpo, excluindo o primeiro domínio da região constante de imunoglobulina (CH1). Assim Fc refere-se aos últimos dois domínios (CH2 e CH3) da IgG1 região constante e à dobradiça N-terminal flexível desses domínios. Para uma IgG1 humana, a região Fc corresponde ao resíduo C226 na sua extremidade carboximétrica, isto é, os resíduos da posição 226 a 447, em que a numeração está de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat. À região Fc utilizada pode ainda compreender uma porção da região da dobradiça superior localizada entre as posições 216-226, de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat; neste caso, a região Fc utilizada corresponde aos resíduos das posições 216 a 447, 217 a 447, 218 a 447, 219 a 447, 220 a 447, 221 a 447, 222 a 447, 223 a 447, 224 a 447 ou 225 ao 447, onde a numeração é de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat. De um modo preferencial, neste caso, a região Fc utilizada corresponde aos resíduos de posição 216-447, em que a numeração é de acordo com o índice EU ou equivalente em Kabat.

[0030] De preferência, a região Fc utilizada é escolhida a partir das sequências SEQ ID NO: 1 a 10 e 14.

[0031] Por “polipeptídeo parental” entende-se um polipeptídeo de referência. O dito polipeptídeo parental pode ser de origem natural ou sintética. No contexto da presente invenção, o polipeptídeo parental compreende uma região Fc, referida como a “região Fc parental”. Esta região Fc pode ser selecionada do grupo de regiões Fc do tipo selvagem, seus fragmentos e mutantes. De preferência, o polipeptídeo parental compreende um fragmento Fc humano, preferencialmente um fragmento Fc de uma IgG1 humana ou uma IgG2 humana. O polipeptídeo parental pode incluir modificações de aminoácidos preexistentes na região Fc (por exemplo, mutante Fc) em relação às regiões Fc do tipo selvagem.

[0032] De um modo vantajoso, o polipeptídeo parental pode ser uma região Fc isolada (isto é, um fragmento Fc, como tal), uma sequência derivada de uma região Fc isolada, um anticorpo, um fragmento de anticorpo compreendendo uma região Fc, uma proteína de fusão que compreende uma região Fc ou um conjugado Fc, sendo esta lista não limitativa.

[0033] Por“sequência derivada de uma região Fc isolada” entende- se uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões Fc isoladas ligadas entre si, como um scFc (cadeia única de Fc) ou um multímero Fc. Por “proteína de fusão compreendendo uma região Fc" entende-se uma sequência de polipeptídeos fundida com uma região Fc, em que a dita sequência de polipeptídeos é preferencialmente selecionada de regiões variáveis de qualquer anticorpo, sequências que ligam um receptor ao seu ligante, moléculas de adesão, ligantes, enzimas, citocinas e quimiocinas. Por “conjugado Fc” entende- se um composto que é o resultado do acoplamento químico de uma região Fc com um parceiro de conjugação. O parceiro de conjugação pode ser proteína ou não proteína. A reação de acoplamento geralmente utiliza grupos funcionais na região Fc e no parceiro de conjugação. Vários grupos de ligação são conhecidos na técnica anterior como sendo adequados para a síntese de um conjugado; por exemplo, aglutinantes homo ou heterobifuncionais são bem conhecidos (consulte o catálogo da Pierce Chemical Company, 2005-2006, seção técnica sobre agentes de reticulação, páginas 321 a 350). Os parceiros de conjugação adequados incluem proteínas terapêuticas, marcadores, agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos, toxinas e seus fragmentos ativos. As toxinas e fragmentos adequados incluem toxina da difteria, exotoxina A, ricina, abrina, saporina, gelonina, calicheolina, auristatina E e F e mertansina.

[0034] Vantajosamente, o polipeptídeo parental - e, portanto, o polipeptídeo de acordo com a invenção - consiste em uma região Fc.

[0035] Vantajosamente, o polipeptídeo parental - e, portanto, o polipeptídeo de acordo com a invenção - é um anticorpo.

[0036] Por “mutação” entende-se uma alteração de pelo menos um aminoácido da sequência de um polipeptídeo, incluindo uma alteração de pelo menos um aminoácido da região Fc do polipeptídeo parental. O polipeptídeo mutado assim obtido é um polipeptídeo variante; é um polipeptídeo de acordo com a invenção. Um tal polipeptídeo compreende uma região Fc mutada, em relação ao polipeptídeo parental. Preferencialmente, a mutação é uma substituição, uma inserção ou uma deleção de pelo menos um aminoácido.

[0037] Por “substituição' entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental por outro aminoácido. Por exemplo, a substituição N434S refere-se a um polipeptídeo variante, neste caso, uma variante para a qual a asparagina na posição 434 é substituída por serina.

[0038] Por “inserção de aminoácido” ou “inserção” entende-se a adição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental. Por exemplo, a inserção G> 235-236 refere-se a uma inserção de glicina entre as posições 235 e 236.

[0039] Por “deleção de aminoácidos” ou “deleção” significa a deleção de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental. Por exemplo, E294del refere-se à remoção de ácido glutâmico na posição 294.

[0040] De preferência, é utilizado o seguinte marcador de mutação: “4348” ou “N4348” e significa que o polipeptídeo parental compreende asparagina na posição 434, que é substituída por serina na variante. No caso de uma combinação de substituições, o formato preferencial é “2591/315D/434Y" ou

“V259//N315D/N434Y”. Isso significa que existem três substituições na variante, nas posições 259, 315 e 434, e que o aminoácido na posição 259 do polipeptídeo parental, ou seja, valina, é substituído por isoleucina, que o aminoácido na posição 315 do polipeptídeo parental, asparagina, é substituído por ácido aspártico, e que o aminoácido na posição 434 do polipeptídeo parental, asparagina, é substituído por tirosina.

[0041] Por “FcRn” ou “receptor Fc neonatal”, como aqui utilizado, entende-se uma proteína que se liga à região Fc de IgG e é codificada pelo menos em parte por um gene FcRn. Como é conhecido na técnica anterior, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, frequentemente referidos como cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é beta-2- microglobulina, enquanto a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. Salvo indicação em contrário no presente documento, a proteína FCRn ou FcRn refere- se ao complexo da cadeia a com beta-2-microglobulina. Em humanos, o gene que codifica FcRn é chamado FCGRT.

[0042] De preferência, a variante de acordo com a invenção tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn, em relação à do polipeptídeo parental, por uma razão pelo menos igual a 2, preferencialmente maior que 5, preferencialmente maior que 5, mais preferencialmente maior que 10, ainda mais preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 20, ainda mais preferencialmente maior que 25, mais preferencialmente maior que 30.

[0043] Preferencialmente, a variante de acordo com a invenção tem uma meia-vida aumentada em comparação com a do polipeptídeo parental. De preferência, a variante de acordo com a invenção tem uma meia-vida aumentada em relação à do polipeptídeo parental, em uma razão pelo menos igual a 2, preferencialmente maior que 5, mais preferencialmente maior que 10, ainda mais preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 20, ainda mais preferencialmente maior que 25, mais preferencialmente maior que 30.

[0044] Uma das principais funções do FcRn é conhecida como reciclagem de IgG. Consiste em extrair IgG da via do catabolismo endotelial das proteínas plasmáticas para restaurá-las intactas à circulação. Essa reciclagem explica sua meia-vida em condições fisiológicas normais (trêê semanas para IgG), mantendo altas concentrações plasmáticas. A transcitose da IgG de um polo para o outro do epitélio ou endotélio é a segunda principal função do FcRn para garantir sua biodistribuição no organismo.

[0045] De preferência, a variante de acordo com a invenção tem uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor do fragmento Fc (FcR) escolhido entre os receptores FceyRI (CD64), FeyRilla (CD16a) e FeyRlla (CD320ag), em relação à do polipeptídeo parental, por uma razão pelo menos igual a 2, preferencialmente maior que 5, mais preferencialmente maior que 10, ainda mais preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 20, ainda mais preferencialmente maior que 20, de modo particular, ainda mais preferencialmente maior que 25, mais preferencialmente maior que

30.

[0046] O receptor FcyRI (CD64) está envolvido na fagocitose e na ativação celular. O receptor FcyRlilla (CD160) também está envolvido na atividade dependente de Fc, incluindo ADCC e fagocitose; possui um polimorfismo V/F na posição 158. O receptor FcyRlla (CD32a) está, por sua vez, envolvido na ativação plaquetária e fagocitose; tem um polimorfismo H/R na posição 131.

[0047] De preferência, a variante de acordo com a invenção tem tanto uma afinidade aumentada para o receptor FCcRn quanto um aumento da afinidade para todos os receptores FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD16a0) e FeyRlla (CD320).

[0048] A afinidade de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc para um FcR pode ser avaliada por métodos bem conhecidos na técnica anterior. Por exemplo, os indivíduos versados na técnica podem determinar a afinidade (Kd) usando ressonância plasmônica de superfície (SPR).

Alternativamente, aqueles versados na técnica podem executar um teste ELISA apropriado. Um ensaio ELISA apropriado compara as forças de ligação do Fc parental e do Fc mutado. Os sinais detectados específicos para o Fc mutado e o Fc parental são comparados. A afinidade de ligação pode ser determinada indiferentemente avaliando polipeptídeos inteiros ou avaliando regiões Fc isoladas dos mesmos. Alternativamente, aqueles versados na técnica podem executar um ensaio competitivo apropriado. Um ensaio competitivo apropriado é usado para determinar a capacidade do Fc mutado para inibir a ligação de um ligante FCR marcado quando estes são incubados simultaneamente com células que expressam esses receptores. A ligação do ligante marcado ao FcR pode ser avaliada, por exemplo, por citometria de fluxo. A afinidade de ligação do Fc mutado em FcR é então determinada através da avaliação da variabilidade da intensidade média de fluorescência emitida pelo ligante marcado ligado ao FcR.

[0049] Preferencialmente, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende de 3 a 20 mutações em relação ao polipeptídeo parental, preferencialmente de 4 a 20 mutações. Por “de 3 a 20 modificações de aminoácidos” significa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 e 20 mutações de aminoácidos. Preferencialmente, compreende de 4 a 15 mutações, mais preferencialmente de 4 a 10 mutações em relação ao polipeptídeo parental.

[0050] Ainda mais preferencialmente, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender pelo menos uma combinação de 5 mutações, em que a dita combinação compreende as quatro mutações (i) como descrito acima e pelo menos uma mutação (ii) como descrito acima, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0051] Ainda mais preferencialmente, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma combinação de 6 mutações, em que a dita combinação compreende as quatro mutações (i) como descrito acima, pelo menos uma mutação (ii) como descrito acima e pelo menos uma mutação (iii) como descrito acima, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0052] De preferência, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende as seguintes mutações: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; e quando uma mutação (iii) está presente, é selecionada entre K290G e Y296W, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0053] De preferência, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende as seguintes mutações: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; e (iii) pelo menos uma mutação selecionada entre K290G e Y296W, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0054] De preferência, a região Fc mutada do polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma combinação de mutações escolhidas das combinações: N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V e N434Y/K334N/P352S/V397M/A3S78V/Y296W.

[0055] De preferência, o polipeptídeo de acordo com a invenção é produzido em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos.

[0056] De preferência, o polipeptídeo de acordo com a invenção é produzido em animais transgênicos não humanos, preferencialmente em mamíferos não humanos transgênicos, mais preferencialmente em suas células epiteliais mamárias.

[0057] Por “mamífero não humano transgênico” entende-se um mamífero escolhido, em particular, entre gado bovino, porcos, cabras, ovelhas e roedores, de preferência entre cabras, camundongos, porcos, coelhos, ovelhas e vacas. De um modo preferencial, o animal não humano transgênico ou o mamífero não humano transgênico é uma cabra transgênica.

[0058] De preferência, a variante de acordo com a invenção compreende pelo menos as cinco mutações N434Y, K334N, P352S, V397M e A378V em seu fragmento Fc e é produzida em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos ou em animais não humanos transgênicos, preferencialmente em mamíferos não humanos transgênicos, como uma cabra. Essa variante tem afinidade aumentada para o receptor FCRn e afinidade aumentada para todos os receptores FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD16a) e FcyRlla (CD32a).

[0059] Assim, preferencialmente, a variante de acordo com a invenção é a variante Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produzida em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos. Alternativamente, de um modo preferencial, a variante de acordo com a invenção é a variante Fc N434Y/K334N/P352S/V397 M/A378V produzida em animais não humanos transgênicos, de preferência em mamíferos não humanos transgênicos, tais como uma cabra. Essa variante tem afinidade aumentada para o receptor FcRn e afinidade aumentada para todos os receptores FcyRI (CD64), FeyRllla (CD16a) e FceyRila (CD320). De preferência, a variante de acordo com a invenção compõe a sequência SEQ ID NO: 11 ou a sequência SEQ ID NO: 15.

[0060] Alternativamente, de modo preferencial, a variante de acordo com a invenção é a variante Fe N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W produzida em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos. Alternativamente, de um modo preferencial, a variante de acordo com a invenção é a variante Fc NA434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W produzida em animais não humanos transgênicos, de preferência em mamíferos não humanos transgênicos, tais como uma cabra. Essa variante tem afinidade aumentada para o receptor FcRn e afinidade aumentada para todos os receptores FcyRI (CD64), FeyRllla (CD16a) e FeyRlla (CD320a).

[0061] De preferência, o método para produzir uma variante de acordo com a invenção compreende a expressão da dita variante em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos.

[0062] Assim, a presente invenção também se refere a um método para produzir uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor Fc (FCcR) selecionado de FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD160) e FeyRlla (CD320) receptores, em relação à do polipeptídeo parental, em que a dita variante compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 38%K; e em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, o dito método compreende a expressão da dita variante em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos.

[0063] De preferência, a dita variante compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242|, L242K L242P, L2428S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259l, V259L, T260A, T260H, T260|, T260M, T260N, T260, T260, T260 V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, E291R, R29 E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, V302, V302S, V303S, V303Y, S304T,

V305A, V305F, V3051, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do Índice EU ou equivalente em Kabat.

[0064] Em particular, esse método compreende as seguintes etapas: a) preparar uma sequência de DNA compreendendo uma sequência que codifica a variante, uma sequência que codifica um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de mamífero e uma sequência que codifica um peptídeo sinal que permita a secreção da dita variante; b) introduzir a sequência de DNA obtida em a), em um embrião de mamífero não humano, para obter um mamífero não humano transgênico que expressa a variante codificada pela dita sequência de DNA obtida em a) na glândula mamária; e c) recuperar a variante no leite produzido pelo mamífero não humano transgênico obtida em b).

[0065] A etapa a) compreende assim a preparação de uma sequência de DNA que compreende uma sequência que codifica a variante, uma sequência que codifica um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de leite de mamífero e uma sequência que codifica um peptídeo sinal, permitindo a secreção da dita variante. Essa etapa está ilustrada na Figura 1.

[0066] A sequência que codifica a variante é uma sequência de DNA que codifica a variante de acordo com a invenção.

[0067] Por exemplo, essa variante tem a sequência SEQ ID NO: 11. Com o peptídeo sinal, a sequência correspondente é a sequência SEQ ID NO:

13.

[0068] Em outro exemplo, essa variante tem a sequência SEQ ID NO: 15. Com o peptídeo sinal, a sequência correspondente é a sequência SEQ ID NO: 16.

[0069] A sequência de codificação para um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de mamífero torna possível expressar a variante no leite. Os indivíduos versados na técnica sabem como escolher um tal promotor.

[0070] No contexto do presente pedido, um peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos, preferencialmente de 2 a 30 aminoácidos, localizada no terminal N da variante polipeptídica Fc, servindo para endereçá-la no leite de mamífero. De preferência, a sequência de codificação para um peptídeo sinal é interposta entre a sequência de codificação para a variante e o promotor. Sem essa sequência, a variante permaneceria no tecido mamário, em que a purificação seria difícil e exigiria o sacrifício do animal hospedeiro. O peptídeo sinal pode ser clivado após a secreção. A sequência de codificação para o sinal peptídico pode ser uma que está naturalmente associada a um polipeptídeo parental de acordo com a invenção. Alternativamente, a sequência de codificação para o peptídeo sinal pode ser a da proteína do leite da qual o promotor é derivado, isto é, quando o gene da proteína do leite é digerido para isolar o promotor, um fragmento de DNA é selecionado compreendendo o promotor e a sequência de codificação do peptídeo sinal diretamente a jusante do promotor. Outra alternativa é usar uma sequência de sinal derivada de outra proteína secretada que não seja a proteína do leite normalmente expressa a partir do promotor, nem um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[0071] De preferência, o peptídeo sinal tem a sequência SEQ ID NO: 12.

[0072] A sequência de DNA utilizada pode compreender códons otimizados.

[0073] A otimização do códon visa substituir os códons naturais por códons cujo RNA de transferência (RNAt) transportando os aminoácidos é mais comum no tipo de célula em questão. A mobilização de tRNAs frequentemente encontrados tem a grande vantagem de aumentar a velocidade de tradução de RNAs mensageiros (mMRNAs) e, portanto, de aumentar o título final (Carton, JM et al., Protein Expr Purif, 2007). A otimização de sequência também atua na predição de estruturas secundárias de MRNA que podem retardar a leitura pelo complexo ribossômico. A otimização da sequência também afeta a porcentagem de G/C que está diretamente relacionada à meia-vida dos MRNAs e, portanto, ao seu potencial de serem traduzidos (Chechetkin, J. of Theoryical Biology 242, 2006 922 a 934).

[0074] A otimização do códon pode ser realizada pela substituição de códons naturais usando tabelas de frequência de códons (Tabela de Uso de Códons) para mamíferos e mais especificamente para homo sapiens. Existem algoritmos disponíveis na internet e disponibilizados pelos fornecedores de genes sintéticos (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) que possibilitam a otimização dessa sequência.

[0075] De preferência, a etapa a) compreende as seguintes etapas: (a1) preparar uma sequência de DNA compreendendo uma sequência que codifica a variante de acordo com a invenção, diretamente fundida no seu terminal N a uma sequência que codifica um peptídeo sinal que permite a secreção da dita variante; (a2) introduzir a sequência de DNA obtida em (a1) em um vetor compreendendo uma sequência que codifica um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de leite de mamífero; (a3) digerir o dito vetor obtido em (a2), a fim de obter uma sequência de DNA compreendendo a sequência que codifica um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de leite de mamífero, em que a sequência de DNA compreende uma sequência que codifica a variante da invenção diretamente fundida em seu terminal N a uma sequência de codificação para um peptídeo sinal.

[0076] Em outras palavras, de preferência, no final da etapa a), obtemos uma sequência de DNA compreendendo, do terminal N ao C, a sequência de codificação para um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de mamífero, fundido à sequência de codificação para um peptídeo sinal, fundido em si à sequência de codificação da variante de acordo com a invenção.

[0077] Em seguida, o processo de acordo com a invenção compreende uma etapa b) de introdução da sequência de DNA obtida em a) em um embrião de mamífero não humano, a fim de obter um mamífero não humano transgênico que expressa a variante codificada pela dita sequência de DNA obtida em a) na glândula mamária.

[0078] Finalmente, o processo de acordo com a invenção compreende uma etapa c) de recuperação da variante no leite produzido pelo mamífero não humano transgênico obtido em b).

[0079] As etapas b) e c) são conhecidas da técnica anterior, em particular da patente EP0264166.

[0080] De preferência, esse processo compreende, após a etapa c), uma etapa de purificação d) do leite recuperado. A etapa de purificação d) pode ser realizada por qualquer processo conhecido da técnica anterior, em particular por purificação na proteína A. Mais uma vez, essa etapa é descrita, em particular, na patente EPO0264166.

[0081] A presente invenção também se refere a uma sequência de DNA compreendendo um gene que codifica uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada pelo receptor FCRn e uma afinidade aumentada por pelo menos um receptor de fragmento Fc (FcR) escolhido entre receptores FcyRI (CD64), FceyRlilla (CD160) e FeyRlila CD32a0), em relação à do polipeptídeo parental, em que a dita variante compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, o dito gene estar sob o controle de um promotor transcricional de caseína ou soro de mamífero que não controla naturalmente a transcrição do dito gene, em que a dita sequência de DNA compreende ainda uma sequência que codifica um peptídeo sinal permitindo a secreção da dita variante interposta entre a sequência que codifica a variante e o promotor.

[0082] Em uma modalidade específica, a dita variante outro compreende pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240l, V 240M, V240N, V2408S, F241H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242], L242K, L242P, L2428S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258|, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260N T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, 8267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, R290Y, P291R, P291R, P291 E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q2951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300l, Y300V, R300, R300 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0083] A presente invenção também se refere a uma sequência de DNA compreendendo um gene que codifica uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor de fragmento Fc (FcR) selecionado entre receptores FcyRI (CD64), FeyRllla (CD16a) e FeyRlila (CD32a0), em relação à do polipeptídeo parental, em que a dita variante compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada dentre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, em que a dita sequência de DNA opcionalmente compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinal que permite a secreção da dita variante.

[0084] Em uma modalidade específica, a dita variante compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240I, V 240M, V240N, V2408S, F241H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242], L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F2438, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259|, V259L, T260A, T260H, T260, T260, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S8267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R2921, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295|, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300l, Y300V, R300, Y300, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305], V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

[0085] Alternativamente, o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser produzido em células de mamífero cultivadas. As células preferenciais são a linhagem de rato YB2/0, a linhagem de hamster CHO, em particular as linhagens Lec13 CHO dhfr e CHO, as células PER C6*“ (Crucell), NSO, SP2/0, HeLa, células BHK ou COS, células HEK293. De preferência, a linhagem de hamster CHO é usada.

[0086] Assim, a presente invenção também se refere a um processo para produzir uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor Fc (FCcR) selecionado dos receptores FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD16a) e FcyRlla (CD320), em relação ao polipeptídeo parental, em que a dita variante compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; e em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, em que o dito processo compreende expressar a dita variante em células de mamíferos em cultura.

[0087] Em uma modalidade específica, a referida variante compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240l, V240M, V24ON, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242], L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259], V259L, T260A, T260H, T2 601, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, R291, P291G, P291G, R29, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940Q, E294R, E294T, E294V, Q2951, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300l, R300, Y300W, R300, Y300W, R300, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305|, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

Em particular, esse processo compreende as seguintes etapas: a) preparar uma sequência de DNA que codifica a variante; b) introduzir a sequência de DNA obtida em a) nas células de mamíferos em cultura. A introdução pode ser realizada de forma transitória ou estável (isto é, integração da sequência de DNA obtida em a) no genoma das células); e c) expressar a variante das células obtidas em b), depois d) opcionalmente, recuperar a variante no meio de cultura.

[0088] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo de acordo com a invenção e (ii) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0089] O objeto da presente invenção também é uma composição farmacêutica compreendendo (i) a variante que consiste em um fragmento Fc, em particular IgG1, exibindo as cinco mutações N434Y, K334N, P352S, V397M e A378V, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat e (ii) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. De preferência, a composição da presente invenção compreende (i) a variante que consiste em um fragmento Fc, em particular IgG1, com as seis mutações N434Y, K334N, P352S, V397M e A378V, Y296W, sendo a numeração a do índice UE ou equivalente em Kabat, e (ii) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0090] O objeto da presente invenção é também o polipeptídeo de acordo com a invenção ou a composição como descrito acima, para sua utilização como um medicamento.

[0091] O objeto da presente invenção é também o uso da variante que consiste em um fragmento Fc, em particular IgG1, exibindo as cinco mutações N434Y, K334N, P352S, V397M e A378V, em que a numeração é a do Índice EU ou equivalente em Kabat (isto é, variante N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V) como um medicamento. Em uma modalidade específica, o objeto da presente invenção também é o uso da variante que consiste em um fragmento Fc, em particular IgG1, apresentando as seis mutações N434Y, Y296W, K334N, P352S, V397M, A378V e Y296W, em que a numeração é a do índice eu ou equivalente em Kabat (isto é, variante N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W), como medicamento.

[0092] Como indicado acima, vantajosamente, o polipeptídeo parental - e, portanto, o polipeptídeo de acordo com a invenção - é um anticorpo. Neste caso, o anticorpo pode ser dirigido contra um antígeno selecionado a partir de um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um antígeno fúngico, uma toxina, uma membrana ou citosina circulante e um receptor de membrana.

[0093] Quando o anticorpo é direcionado contra um antígeno tumoral, seu uso é particularmente adequado no tratamento de cânceres. Por “câncer” entende-se qualquer condição fisiológica caracterizada por uma proliferação anormal de células. Exemplos de câncer incluem carcinomas,

linfomas, —blastomas, “sarcomas (incluindo lipossarcomas), tumores neuroendócrinos, mesoteliomas, meningiomas, adenocarcinomas, melanomas, leucemias e neoplasias linfoides, sendo esta lista não exaustiva.

[0094] Quando o anticorpo é direcionado contra um antígeno viral, seu uso é particularmente útil no tratamento de infecções virais. As infecções virais incluem infecções causadas pelo HIV, um retrovírus, um vírus Coxsackie, vírus da varíola, gripe, febre amarela, Nilo Ocidental, um citomegalovírus, um rotavírus ou hepatite B ou C, sendo esta lista não exaustiva.

[0095] Quando o anticorpo é direcionado contra uma toxina, seu uso é particularmente útil no tratamento de infecções bacterianas, por exemplo, infecções por toxina tetânica, toxina da difteria, toxinas de antraz Bacillus anthracis ou no tratamento de infecções por toxinas botulínicas, toxinas de ricina, shigatoxinas, sendo esta lista não exaustiva.

[0096] Quando o anticorpo é direcionado contra uma citocina, seu uso é particularmente adequado no tratamento de doenças inflamatórias e/ou autoimunes. As doenças inflamatórias e/ou autoimunes incluem púrpura trombocitopênica idiopática (PTI), rejeição de transplantes e órgãos, doença do enxerto contra o hospedeiro, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, vários tipos de esclerose, síndrome de Sjôgren primária (ou síndrome de Gougerot-Sjôgren), autoimune polineuropatias como esclerose múltipla, diabetes tipo |, hepatite autoimune, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artrite por gota, doença celíaca, doença de Crohn, tireoidite crônica Hashimoto (hipotireoidismo), doença de Adisson, hepatite autoimune, Basedow (hipertireoidismo), colite ulcerativa, vasculite e vasculite sistêmica associada a ANCA (anticorpos anticitoplasmáticos aos neutrófilos), citopenia autoimune e outras complicações hematológicas em adultos e crianças, como trombocitopenia autoimune aguda ou crônica, anemias hemolíticas autoimunes, doença hemolítica do recém-nascido (MHN), doença aglutinina fria hemofilia autoimune; Síndrome de Goodpasture, nefropatias extra membranosas, doenças cutâneas autoimunes bolhosas, miastenia gravis refratária,

crioglobulinemia mista, psoríase, artrite crônica juvenil, miosite inflamatória, dermatomiosite e distúrbios autoimunes sistêmicos da criança, incluindo síndrome antifosfolípide, doença do tecido conjuntivo, inflamação autoimune pulmonar, Síndrome de Guillain-Barré, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica (PDCI), tireoidite autoimune, melite, miastenia gravis, doença autoimune inflamatória do olho, neuromielite óptica (doença de Devia), esclerodermia, pênfigo, diabetes resistente à insulina, polimiosite, anemia de Biermer, Doença de Wegener, Horton, periartrite nodosa e síndrome de Churg e Strauss, doença de Still, policondrite atrófica, mal-estar de Behçet, gamopatia monoclonal, granulomatose de Wegener, lúpus, colite ulcerativa, artrite psoriática, sarcoidose, colite colágena, dermatite herpetiforme febre mediterrânea familiar, glomerulonefrite por IgA, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, oftalmia simpática, síndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter e síndrome uveo-meningoencefálica.

[0097] Outras doenças inflamatórias também estão incluídas, como síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), artrite séptica aguda, artrite adjuvante, encefalomielite alérgica, rinite alérgica, vasculite alérgica, alergia, asma, aterosclerose, inflamação crônica causada por infecções bacterianas ou virais crônicas, doença crônica pulmonar obstrutiva (DPOC), doença coronariana, encefalite, doença inflamatória intestinal, osteólise inflamatória, inflamação associada a reações de hipersensibilidade aguda e tardia, inflamação associada a tumores, lesão de nervo periférico ou doenças desmielinizantes, inflamação associada a trauma tecidual, como queimaduras e isquemia, inflamação devido à meningite, síndrome de falência de múltiplos órgãos (síndrome de disfunção de múltiplos órgãos, MODS), fibrose pulmonar, sepse e choque séptico, síndrome de Stevens-Johnson, artrite indiferenciada e espondiloartropatias indiferenciadas. Em uma modalidade particular da invenção, a doença autoimune é a púrpura trombótica idiopática (ITP) e a polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP).

[0098] De preferência, a patologia autoimune ou inflamatória é selecionada a partir de púrpura trombocitopênica imunológica (também chamada de púrpura trombocitopênica idiopática ou ITP), neuromielite óptica ou doença desviante (NMO) e esclerose múltipla. A esclerose múltipla e, em particular, a encefalomielite autoimune experimental (EAE) são estudadas graças a um modelo.

[0099] As sequências descritas neste pedido podem ser resumidas da seguinte forma: gem 4 1 Região Fc de 1IgG1|CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE humano G1m1,17 | VTCVWVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT (resíduos 226 a 447 de | KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK acordo com índice EU ou | CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP equivalente em Kabat)| SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG sem a região N-terminal | QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW de dobradiça superior QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 2 Região Fc de 1IgG2|CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV humano sem a região N- | TOVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK terminal! de dobradiça | PREEQFNSTFRVVSVLTVVHODWLNGKEYKC superior KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS

REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 3 Região Fc de 1gG3|CPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE humano sem a região N- | VTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKT terminal de dobradiça | KPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK superior CKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP

SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSG QPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

TES 4 Região Fc de IgG4|CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE humano sem a região N- | VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT terminal de dobradiça | KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK superior CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP

SQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM

HEALHNHYTOKSLSLSLGK Região Fc de IgGT|CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE humano G1im3 sem a | VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT região Nterminal de | KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK dobradiça superior CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP

SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 6 Região Fc de IgGT|EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP humano G1m1,17 sem a | KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV região N-terminal de | DSGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ dobradiça superior | DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP (resíduos 216 a 447 de | REPQVYTLPPSR acordo com índice EU 94 | ne TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP equivalente em Kabal) | ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 7 Região Fc de IgG2|ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL humano sem a região N- | MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGV terminal de dobradiça | EVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDW superior LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGOQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS

LSLSPGK Região Fc de 1gG3|ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP humano sem a região N- | EPASCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA terminal: de dobradiça | PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV superior DVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

YNSTFRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRF

TQKSLSLSPGK Região Fc de IgG4|ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT humano sem a região N- | LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG terminal: de dobradiça | VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD superior WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR

EPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Região Fc de 1IgG1|EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP humano G1mô3 sem a | KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV região — N-terminal de | DOVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ dobradiça superior DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK E Variante Fc ABA-184AY | DATHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI

SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQ VYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLS

LSPGK í 13 Variante Fc ASA-184AY | MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELL com peptídeo sinal GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS (isto é, fusão de SEQ ID HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS NO :12 com SEQ ID NO TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA 1) PIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHYHYTQKSLSLSPGK 14 Região Fc de 1IgG1|DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI humano G1m1,17 com | SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV resíduos 221 a 447 de | HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN acordo com índice EU ou | GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV equivalente em Kabat YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGK Variante Fc ABA-184EY | DAKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI A SrorameraeoramDara

HNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWLN EE VYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLS

LSPGK 16 Variante Fc ASA-184EY | MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELL com peptídeo sinal GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS (isto é, fusão de SEQ ID HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQWN NO :12 com SEQ ID NO STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP 15) APIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQ

VSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

[0100] A presente invenção será mais bem compreendida mediante a leitura dos seguintes exemplos.

[0101] As legendas das figuras são as seguintes: Figura 1: Produção da variante ASA-184AY no leite de cabra e camundongo usando o vetor Bc451

[0102] A) O vetor beta-caseína, Bc451, foi digerido com Xhol. No vetor Bc451, o fragmento Notl-Notl é o fragmento procariótico. O fragmento Notl (15730) - Xhol é a sequência genômica 3' que contém o sinal poliA. O fragmento BamHI - Xhol é a região promotora da beta-caseína.

[0103] B) O fragmento Sall contendo a região de codificação da variante Fc ASBA-184AY (isto é, FO3179 ASA-184AY 884 pb) foi inserido no vetor, para gerar o construto do gene BC3180 FC ASA-184AY (C).

[0104] D)O fragmento de DNA para microinjeção foi então isolado a partir do vetor procariótico. Para fazer isso, o BC3180 foi digerido com Not! e Nrul. O fragmento de 16,4 kb, contendo o gene Fc (que codifica a variante ASA-

184AY) sob o controle do promotor de beta-caseína, foi então purificado por eluição em gel.

Figura 2: Resultados de testes em um modelo orentive de artrite induzida por transferência de soro de camundongo K/BXN

[0105] A doença foi induzida através da transferência de 10 ml! de soro K/BxXN por via intravenosa em DO para camundongos C57/BI/6J. As moléculas de teste foram administradas intraperitonealmente uma vez em DO, 2 h antes da injeção do soro de camundongo K/BXN.

[0106] O escore clínico é obtido pela soma do índice de quatro pernas:

[0107] O=normal,1= inchaço de uma articulação, 2 = inchaço de mais de uma articulação e 3 = inchaço grave de toda a articulação (unidades arbitrárias).

Figura 3: Resultados de testes em um modelo terapêutico de artrite induzida pela transferência de soro de camundongo K/BxN

[0108] A doença foi induzida através da transferência de 10 ml! de soro K/BxN por via intravenosa em DO para camundongos C57/BI/6J. As moléculas de teste foram administradas uma vez intraperitonealmente em DO, 72 horas após a injeção do soro de camundongo K/BxN (indicado por linhas pontilhadas).

[0109] O escore clínico é obtido pela soma do índice de quatro pernas:

[0110] O= normal, 1 = inchaço de uma articulação, 2 = inchaço de mais de uma articulação e 3 = inchaço grave de toda a articulação (unidades arbitrárias).

Figura 4: Resultados de testes de ligação de Fc e IqglV a células sanitárias

[0111] As variantes de IglV ou Fc de acordo com a invenção marcadas com Alexa foram incubadas a 65 nM (10 pug/ml para Fc em 2% de CSF PBS) com células-alvo por 20 minutos em gelo. Após 2 lavagens em 2% de LCR,

as células foram suspensas em 500 ml de Isofluxo antes da análise citométrica de fluxo.

[0112] Os resultados são os seguintes:

[0113] A) Células B marcadas com anti-CD19 (“% de células B positivas”);

[0114] B) Células NK marcadas com anti-CD56 (“% de células NK positivas”);

[0115] C) Monócitos marcados com anti-CD14, na presença de lglV (“% de células positivas + IglV”);

[0116] D) Monócitos CD1I16+ marcados com anti-CD14 e com o anticorpo anti-CD16 3G8, na presença de IglV (“% de células positivas + IglV”);

[0117] E) Neutrófilos marcados com anti-CD15, na presença de IglV (“% de células positivas + IglV”);

[0118] F) Células NKmarcadas com anti-CD56, na presença de IgG ou Fc WT (“% de células positivas”).

Figura 5: Resultados de testes ADCC, ativação das células Jurkat CD64 e CDC

[0119] A) Inibição da ativação de células Jurkat CD64:

[0120] Células Raji (50 ml a 5x10º células/ml) foram misturadas com Rituxan (50 ml para 2 mº/ml), as células de Jurkat que expressam CD64 humano (Jurkat-H-CD64) (25 ml! em 5x10º células/ml), PMA (50 ml a 40 ng/ml), depois incubadas com IglV ou a variante de acordo com a invenção (RFC ASA-184AY) a 1.950 nM.

[0121] Após uma noite de incubação, as placas foram centrifugadas (125 g por 1 minuto), e a IL2 contida no sobrenadante foi avaliada por ELISA.

[0122] Os resultados foram expressos em porcentagem em relação ao IglV, de acordo com a seguinte fórmula: (IL-2 IglV/IL-2 da amostra) X100.

[0123] B)Inibição do ADCC:

[0124] As células efetoras (células mononucleares) (25 ml a 8x107 células/ml) e RBCs Rh-positivos (25 ml a 4x107 células/ml finais) foram incubadas com diferentes concentrações (de O a 75 ng/ml) de anticorpo anti-Rh D, com uma razão Efetor/Alvo de 2/1. Após 16 horas de incubação, a lise foi estimada quantificando a hemoglobina liberada no sobrenadante usando um substrato específico (DAF).

[0125] Osresultados são expressos como uma porcentagem de lise específica em função da quantidade de anticorpo. A inibição do ADCC foi induzida pela variante IgG ou Fc de acordo com a invenção (RFC ASA-184AY) adicionada a 33 nM.

[0126] Os resultados são expressos em por cento, em que 100% e 0% são valores obtidos com IglV a 650 nM e O nM, respectivamente, de acordo com a seguinte fórmula: [(ADCC com amostra de 33 nM - ADCC sem IVIg)/(ADCC com IglV a 33 nM - ADCC sem IVlg) x100].

[0127] C) Atividade de inibição do CDC:

[0128] As células Raji foram incubadas por 30 minutos com uma concentração final de 50 ng/ml de rituximabe. Uma solução de soro de coelho jovem diluída em 1/10 e previamente incubada com a variante de Fc de acordo com a invenção (rFc ASA-184AY) ou IglV (volívol) durante 1 h a 37 ºC foi adicionada. Após 1 hora de incubação a 37 ºC, as placas foram centrifugadas (125 g por 1 minuto) e o CDC foi estimado medindo a LDH intracelular liberada no meio de cultura. Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição e comparados com IgG e controle negativo (Fc sem função Fc, isto é, rFc neg), 100% correspondendo a uma inibição completa da atividade lítica e 0% ao valor de controle obtido sem Fc ou laglV.

Figura 6: Resultados dos testes de ligação de células

[0129] Asvariantes IglV, Fc-Rec (tipo selvagem Fc), Fe MST-HN ou Fc de acordo com a invenção (ASA-184AY CHO, ASA-184EY CHO) marcadas com Alexa-Fluorº foram incubadas a 65 nM (10 pg/ml) para Fc em 2% de CSF (fator de estimulação de colônias) PBS com células-alvo por 20 minutos em gelo. Após 2 lavagens em 2% de CSF PBS, as células foram suspensas em 500 ul de

Isofluxo antes da análise citométrica de fluxo. Os testes são realizados nas seguintes células-alvo: - células Natural Killer (NK) marcadas com anti-CD56; - Monócitos marcados com anti-CD14; - monócitos CD16+ marcados com anticorpo anti-CD14 e anti-CD16 3G8; - Neutrófilos marcados com anti-CD15.

Figura 7: Resultados de testes em um modelo in vivo de púrpura trombocitopênica idiopática (ITP)

[0130] A doença foi induzida em camundongos que expressam FcRn humanizado injetando um anticorpo antiplaquetário 6A6-hIlgG1 (0,3 pg/g de peso corporal) por via intravenosa para a depleção de plaquetas, também chamadas trombócitos, de camundongos. O controle negativo (“CTL PBS”), IglV (1.000 mg/kg), fragmento Fce-Rec (Fc-selvagem) (380 e 750 mg/kg), fragmento Fc MST-HN (190 mg/kg) e a variante da invenção Fc ASA-184AY CHO (190 mg/kg e 380 mg/kg), foram administrados intraperitonealmente 2 horas antes da depleção de plaquetas. A contagem de plaquetas foi determinada com um sistema Advia Hematology (Bayer). O número de plaquetas antes da injeção de anticorpos foi ajustado em 100%.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação de variantes (fragmentos Fc mutados), de acordo com a invenção, produzidas no leite de animais transgênicos e caracterização das ditas variantes |. Materiais e métodos Princípio:

[0131] Um fragmento Fc de acordo com a invenção pode ser produzido no leite de animais transgênicos, colocando a sequência de codificação do fragmento Fc em um vetor de expressão específico do leite. O vetor pode ser introduzido no genoma de um camundongo ou cabra transgênico por microinjeção. Após a triagem e identificação de um animal com o transgene,

as fêmeas são reproduzidas. Após o parto, a ordenha das fêmeas permite a recuperação de seu leite, no qual o Fc pode ser secretado após a expressão do promotor específico do leite.

Sequência de proter5as da variante Fc ASA-184AY (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y):

[0132] "DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVS

LTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

[0133] Um peptídeo sinal (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO: 12) está ligado ao N-terminal da sequência proteica, de modo a obter a sequência SEQ ID NO: 13. Isso permite a secreção da proteína no leite, uma vez expressa.

Otimização da sequência nucleotídica:

[0134] A sequência nucleotídica foi otimizada para expressão na glândula mamária de cabra. Para isso, a sequência foi otimizada para a espécie de Bos taurus pelo algoritmo de um provedor de gene sintético (como o GeneArt).

Vetor de expressão:

[0135] O vetor de expressão de beta-caseína de cabra (Bc451) foi usado para a produção da variante ASA-184AY no leite de camundongo e cabra (veja a Figura 1).

[0136] O vetor beta-caseína, Bc4 51, foi digerido com Xhol (Figura 1A). O fragmento Sall contendo a região de codificação da variante Fc ASBA- 184AY foi inserido para gerar o construto do gene BC3180 FC ASA-184AY (Figuras 1B e 1C).

[0137] O fragmento de DNA para microinjeção foi então isolado do vetor procariótico.

[0138] O BC3180 foi digerido com Notl e Nrul (Figura 1D). O fragmento de 16,4 kb liberado contendo o gene Fc sob o controle do promotor de beta-caseína foi então purificado por eluição em gel. Esse DNA foi então usado no estágio de microinjeção.

Produção no camundongo:

[0139] O fragmento de DNA foi inserido por microinjeção em embriõêês de camundongos pré-implantação. Os embriões foram então implantados em fêmeas pseudo-grávidas. Os filhotes que nasceram foram rastreados quanto à presença do transgene por análise de PCR.

Expressão em cabras:

[0140] O fragmento de DNA preparado para microinjeção também pode ser utilizado para a produção da variante Fc ASA-184AY no leite de cabra.

EXEMPLO 2: Preparação de variantes (fragmentos Fc mutados), de acordo com a invenção, produzidas em células HEK e caracterização das ditas variantes |. Materiais e métodos de produção

[0141] Cada mutação de interesse no fragmento Fc da sequência SEQ ID NO: 14 foi inserida por sobreposição de PCR usando dois conjuntos de iniciadores adaptados para integrar a mutação-alvo (ou mutações- alvo) com o códon (ou códons) que codifica o aminoácido desejado. Vantajosamente, quando as mutações a serem inseridas estão próximas da sequência de Fc, elas são adicionadas através do mesmo oligonucleotídeo. Os fragmentos assim obtidos por PCR foram combinados e o fragmento resultante foi amplificado por PCR usando protocolos padrão. O produto de PCR foi purificado em gel de agarose a 1% (p/v), digerido com as enzimas de restrição apropriadas e clonado.

[0142] O fragmento Fc recombinante foi produzido por transfecção transitória (por lipofecção) em células HEK293 (células 293-F, InvitroOGen Freestyle) em meio F17 suplementado com L-glutamina usando o vetor pCEP4. Após 8 dias de cultura, o sobrenadante é clarificado por centrifugação e filtrado através de um filtro de 0,2 um. O fragmento Fc é então purificado na proteína Hi-

Trap A e a eluição é efetuada com tampão de citrato 25 mM pH = 3,0, neutralizado e dialisado em PBS antes da esterilização por filtração (0,2 pm).

Ill Testes de ligação Octetº (tecnologia BLI “Interferometria de Biocamada”, dispositivo: Byte RED96, Fortebio, Pall) Protocolos: Ligação ao FcRn humano (hFcRn):

[0143] O receptor de hFcRn biotinilado é imobilizado em biossensores de estreptavidina, diluído a 0,7 ug/ml em tampão de corrida (tampão fosfato 0,1 M, NaCl 150 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 6). As variantes de acordo com a invenção, WT e IglV, foram testadas a 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 e O NM em tampão de corrida (200 nM = 10 ug/ml para Fc).

[0144] -Projeto do teste:

[0145] Linha de base 1 x 120 s no tampão de corrida

[0146] Carregamento de 300 s: o receptor é carregado nos biossensores,

[0147] Linha de base 2 x 60 s no tampão de corrida

[0148] Associação de 60 s: amostras (Fc ou IVlg) são adicionadas aos biossensores carregados no hFcRn

[0149] Dissociação de 30 s no tampão de corrida

[0150] Regeneração de 120 s em tampão de regeneração (tampão fosfato 0,1 M, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 7,8).

[0151] -Interpretação dos resultados:

[0152] As curvas de associação e dissociação (primeiros 10 s) são usadas para calcular as constantes cinéticas de associação (Kon) e dissociação (koff) usando um modelo de associação 1/1. KD (nM) é então calculada (Kon/koff).

Link para os receptores hCD16aV e hcD32aH:

[0153] O receptor HisTag hocD16aV (Sistema R&D) ou hocD32aH (terapêutica PX) é imobilizado em um biossensores anti-Penta-HIS (HIS 1 K),

diluído a 1 ug/ml em tampão cinético (Pall). As variantes Fc de acordo com a invenção, WT e IglV, foram testadas a 1.000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15e O nM em tampão cinético.

[0154] - Carregamento antes de cada amostra

[0155] - Projeto do teste: Todas as etapas são realizadas em tampão cinético (Pall)

[0156] Linhade base 1x60s

[0157] Carregamento de 400 s

[0158] Linhadebase2x60s

[0159] Associação de 60 s

[0160] Dissociação de 30 s

[0161] Regeneração de 5 s em tampão de regeneração (10 mM de glicina de pH 1,5/Neutralização: PBS).

[0162] -Interpretação dos resultados:

[0163] As curvas de associação e dissociação (primeiros 5 s) são usadas para calcular as constantes cinéticas de associação (Kon) e dissociação (Kkoff) usando um modelo de associação 1/1. KD (nM) é então calculada (Kon/koff).

Resultados:

[0164] Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1 [ASA-184AY(HEK)[ 1320 | 141 [| 78 [| o | 3130 | 297 | DP = desvio padrão

[0165] Os resultados mostram que a variante Fc ABA 184AY (HEK) de acordo com a invenção exibe uma afinidade aumentada para o receptor hFcRn e uma afinidade aumentada para os receptores FcyRllla (CD16a) e FceyRlla (CD32a), e isso comparado ao Fc parental não mutado (Fc-WT), mas também comparado a IVIG.

Ill. Ensaios de artrite baseados em modelo induzidos por transferência sérica de camundongo K/BxN Protocolo:

[0166] O modelo K/BxN foi gerado cruzando os camundongos transgênicos do receptor de células T KRN com a cepa de camundongo NOD. Os camundongos K/BxN F1 desenvolvem espontaneamente uma doença entre 3 e 5 semanas de idade e compartilham muitas características clínicas com a artrite reumatoide humana.

[0167] A doença foi induzida através da transferência de 10 ml de soro de camundongo K/BxXN por via intravenosa em DO a camundongos C57/BV6J. As moléculas testadas foram administtadas uma vez intraperitonealmente em DO, 2 h antes ou 72 horas após a injeção do soro de camundongo K/BxN.

[0168] Os camundongos foram monitorados diariamente quanto a sinais e sintomas de artrite para avaliar a incidência e gravidade adicionando o índice de quatro pernas:

[0169] O = normal, 1= inchaço de uma articulação, 2 = inchaço de mais de uma articulação e 3 = inchaço grave de toda a articulação.

Resultados:

[0170] Os camundongos que receberam soro K/BxN desenvolveram artrite na articulação. A doença foi caracterizada por um aumento no tamanho do tornozelo, levando a um aumento no escore clínico. Esses camundongos apresentaram um aumento significativo no escore clínico e na espessura do tornozelo em comparação aos camundongos de controle tratados com solução salina.

[0171] 1- Modelo preventivo:

[0172] Administrado 2 h antes da injeção sérica de camundongo K/BxN, o tratamento com 750 mg/kg de fragmento Fc de tipo selvagem (Fc WT) reduziu significativamente o escore clínico em comparação com o grupo sérico de camundongos K/BxN.

[0173] O tratamento com a variante Fc ASA-184AY (HEK) de acordo com a invenção reduziu significativamente o escore clínico de maneira semelhante ao fragmento Fc WT, mas a uma dose 15 vezes menor (50 mg/kg) (Figura 2).

[0174] 2-Modelo terapêutico:

[0175] 72 horas após a injeção do soro de camundongo K/BxN, a IgG administrada a 2 g/kg não reduziu significativamente o escore clínico em comparação com o grupo tratado com soro de camundongo K/BxN.

[0176] No entanto, o tratamento com o fragmento Fc WT a 750 mg/kg (dose molecular equivalente a 2 g/kg de IVIG) reduziu significativamente o escore clínico em comparação com o grupo tratado com soro de camundongo K/BxN. Além disso, o tratamento com a variante Fc ASBA-184AY (HEK) de acordo com a invenção reduziu significativamente o escore clínico de maneira semelhante ao fragmento Fc-WT, mas a uma dose 4 vezes menor (190 mg/kg) (Figura 3).

IV. Testes celulares in vitro Protocolos: Avaliação da ligação de fragmentos Fc e Ig IV a células sanguíneas:

[0177] As variantes de lglV ou Fc de acordo com a invenção marcadas com Alexa foram incubadas a 65 nM (10 ug/ml para Fc em 2% de CSF PBS) com células-alvo por 20 minutos em gelo. Após 2 lavagens em 2% de LCR, as células foram suspensas em 500 ml de Isofluxo antes da análise citométrica de fluxo. As células B, células NK, monócitos e neutrófilos foram marcados especificamente com anti-CD19, anti-CD56, anti-CDI4 e anti-CDi5, respectivamente. O receptor FCcyRIII (CD16) foi demonstrado usando o anticorpo anti-CD16 3G8.

Inibição do ADCC:

[0178] Para imitar a lise de glóbulos vermelhos observada na púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), envolvendo os autoanticorpos do paciente com ITP, uma lise de glóbulos vermelhos mediada por células efetoras na presença de um anticorpo monoclonal antiRhesus D (RhD) foi conduzida e a capacidade de diferentes quantidades de imunoglobulinas polivalentes (IVlg) ou fragmentos de Fc recombinantes mutados ou não mutados, de inibir essa lise, por exemplo, por competição com anti-RhD para fixação de receptores de Fc na superfície da célula efetora, foi avaliada.

[0179] A citotoxicidade de anticorpos anti-RhD foi estudada pela técnica do ADCC. Resumidamente, células efetoras (células mononucleares) (25 a 8x107 células/ml) e eritrócitos Rh-positivos (25 a 4x107 células/ml finais) foram incubadas com diferentes concentrações (0 a 75 ng/ml) de anticorpos anti-RhD, com uma razão Efetor/Alvo de 2/1. Após 16 horas de incubação, a lise foi estimada quantificando a hemoglobina liberada no sobrenadante usando um substrato específico (DAF).

[0180] Osresultados são expressos como uma porcentagem de lise específica em função da quantidade de anticorpo. A inibição do ADCC induzida por IglV ou pela variante Fc de acordo com a invenção (RFC AZSA-184AY) adicionada a 33 nM foi avaliada.

[0181] Os resultados são expressos em porcentagem, em que 100% e 0% são os valores obtidos com IglV a 650 nM e O nM, respectivamente, de acordo com a seguinte fórmula: [(ADCC com amostra de 33 nM - ADCC sem IVIg)/(ADCC com IglV a 33 nM - ADCC sem IVlg) x100].

Inibição da ativação de células Jurkat CD64:

[0182] Esse teste estima a capacidade das variantes Fc, de acordo com a invenção, ou IVIG (IgG total) de inibir a secreção de IL2 por células Jurkat que expressam CD64 humano (Jurkat-H-CD64) induzido pela linhagem celular Raji com Rituxan.

[0183] Resumidamente, as células Raji (50 ml a 5x106 células/ml) foram misturadas com Rituxan (50mi a 2 mg/ml), células Jurkat H-CD64 (25 ml a 5x10º células/ml, um éster de forbol (PMA, 50 ml a 40 ng/ml), depois incubadas com a variante IglV ou Fc de acordo com a invenção a 1.950 nM.

[0184] Após uma noite de incubação, as placas foram centrifugadas (125 g por 1 minuto) e o NL2 contido no sobrenadante foi avaliado por ELISA.

[0185] Os resultados foram expressos em porcentagem em relação ao IglV, de acordo com a seguinte fórmula: (IL-2 IglV/IL-2 da amostra) X100.

Atividade inibitória do CDC:

[0186] Este ensaio estima a capacidade da variante Fc, de acordo com a invenção, ou IVIG para inibir a atividade CDC mediada por rituximabe na linhagem celular Raji na presença de soro de coelho como fonte de complemento. Resumidamente, as células Raji foram incubadas por 30 minutos a uma concentração final de 50 ng/ml de rituximabe. Uma solução de soro de coelho jovem diluído 1/10 e previamente incubada com a variante de acordo com a invenção ou IglV (vol/ívol) durante 1 h a 37 ºC, foi adicionada. Após 1 hora de incubação a 37 ºC, as placas foram centrifugadas (125 g por 1 minuto) e o CDC foi estimado medindo a LDH intracelular liberada no meio de cultura.

[0187] Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição e c comparados ao IG IV e controle negativo (Fc sem função Fc), 100% correspondendo a uma inibição completa da atividade lítica e 0% ao valor de controle obtido sem Fc ou IVIG.

Resultados:

[0188] Os resultados são mostrados nas Figuras 4e 5.

[0189] Como mostrado na Figura 5, a variante Fc, de acordo com a invenção, (ASA-184AY (HEK)) tem uma melhor inibição da atividade das células Jurkat que expressam CD64, do ADCC e do CDC, em comparação com o IVlg. Esses resultados mostram que uma variante de acordo com a invenção, como A3SA-184AY, pode ser eficaz para o tratamento de patologias envolvendo autoanticorpos do paciente, em particular bloqueando os receptores Fc nas células efetoras do paciente (ver Figura 4).

EXEMPLO 3: Preparação de variantes (fragmentos Fc mutados) de acordo com a invenção, produzidas em células CHO

[0190] O fragmento Fc recombinante pode ser obtido da SEQ ID NO: 14 da mesma maneira que a descrita no Exemplo 2. Esse fragmento Fc mutado pode ser produzido por transfecção em células CHO-S com a ajuda de lipofecção como o Freestyle Max Reagent (Thermofisher) usando um vetor otimizado para expressão nessa linhagem celular. As células CHO-S são cultivadas em meio CD FortiCHO + glutamina 8 mM, sob condições agitadas a 135 rom em uma atmosfera controlada (8% de CO»), a 37 ºC. No dia anterior ao dia da transfecção, as células foram semeadas a uma densidade de 6,10º células/ml.

[0191] Nodia da transfecção, o DNA linearizado (50 ug) e 50 ul de agente de transfecção (TA) são pré-incubados separadamente em meio Opti- Pro SFM e depois misturados e incubados por 20 minutos para permitir a formação do complexo DNA/AT. O todo é então adicionado a uma preparação celular de 1,10º células/m! em um volume de 30 ml. Após 48 horas de incubação, são adicionados agentes de transfecção (Neomicina 1 g/| e Metotrexato 200 nM) às células. A densidade e a viabilidade celular são determinadas a cada 3 a 4 dias e os volumes de cultura adaptados para manter uma densidade celular superior a 6,10º células/ml. Quando a viabilidade é superior a 90%, os pools estáveis obtidos são salvos por congelação criostática e as produções em condições agitadas são realizadas no modo “batelada alimentada” por 10 dias, com adição de 49/| ou 6g/I de glicose durante a produção. No final da produção, as células e o sobrenadante são separados por centrifugação. As células são removidas e o sobrenadante é colhido, concentrado e filtrado a 0,22 um.

[0192] O fragmento Fc é então purificado por cromatografia de afinidade em uma resina de proteína A (proteína A HiTrap, GE Healthcare). Após captura no tampão PBS de resina equilibrado, o fragmento Fc é eluído com tampão citrato 25 mM pH = 3,0, seguido por neutralização rápida do pH com IM Tris e depois dialisado em tampão PBS antes da esterilização por filtração (0,2 pm).

EXEMPLO 4: Testes de ligação das variantes de FcRn, CD16aH CD16aV, CD64 e CD32a produzidas em células CHO e no leite de cabra transgênica

[0193] Os ensaios de ligação ao receptor Fc são realizados com as seguintes moléculas:

[0194] - Variantes da invenção — ASA-184AY CHO (K334N/P352S/A3S78V/V397M/N434Y), ASA-184EY CHO (Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produzidas em células CHO de acordo com o processo dado no exemplo 3, ASA-184AY TGg produzido na cabra transgênica de acordo com o processo descrito no Exemplo 1; [0195) - O fragmento Fc MST-HN contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, descrito na literatura como tendo uma ligação otimizada apenas ao receptor FcRn (Ulrichts et a/., JCI, 2018) foi produzido em células HEK-293. (Células 293-F, InvitroGen Freestyle);

[0196] —- Um fragmento Fc Fce-WT ou Fe-Rec do tipo selvagem obteve por digestão com papaína uma IgG1 produzida no leite de cabra transgênica;

[0197] —IVIG.

Ligação ao FcRn humano (hFcRn):

[0198] A ligação ao FcRn é estudada por ensaio competitivo, utilizando células Rituxan (Rituxan-A488) marcadas com A488 e células Jurkat que expressam o receptor FcRn (Jurkat-FcRn).

[0199] As células Jurkat-FcRn são semeadas em uma placa de 96 poços (fundo V) a uma concentração de 2,105 células por poço. As células são então incubadas por 20 minutos a 4 ºC com as moléculas de teste diluídas em tampão nas seguintes concentrações finais: 167 po/ml; 83 po/ml; 42 po/ml; 21 ug/ml; 10 po/ml; 5 pg/ml; 3 po/ml; 1 pg/ml; O pg/ml e simultaneamente com 25 pg/ml de Rituxan-A488.

[0200] As células são então lavadas por adição de 100 ul de PBS a pH 6 e centrifugada a 1.700 rpm durante 3 minutos a 4 ºC. O sobrenadante é então removido e 300 ul de PBS frio são adicionados a pH 6.

[0201] A ligação de Rituxan-A488 a FcRn expressa por células Jurkat-FcRn é avaliada por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência média (MFI) observada é expressa como uma percentagem, em que 100% é o valor obtido com Rituxan-A488 sozinho, e 0% o valor na ausência de Rituxan- A488. As concentrações moleculares necessárias para induzir 50% de inibição da ligação do Rituxan-A488 ao FcRn das células Jurkat-FcRn são calculadas usando o “Prism Software”.

[0202] Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2 QE Pa 51 184AY CHO | 184EY CHO | 184AY TGg |HN |WT Inibição da 50%, nM

[0203] Os resultados mostram que as variantes Fc ASA-184AY CHO, Fc ASA-184EY CHO e ASA-184AY-TGg mostram aumento da inibição da ligação de Rituxan- A488 (x100 em comparação com IVIG). As variantes da invenção mostram uma afinidade de ligação a FcRn equivalente à observada com o fragmento Fc MST-HN descrito na literatura como otimizada apenas para FcRn (Ulrichts et a/, JCI, 2018).

Ligação a receptores hCD64 e hCD16aH, hCD16aV, hcD32aH, hCD32aR: * Ligação a CD64 humano (hCD64)

[0204] AligaçãoaCD64 humano é estudada por ensaio competitivo utilizando células Rituxan-A488 e Jurkat que expressam o receptor CD64 (Jurkat-CD64).

[0205] As células Jurkat-CD64 são semeadas em uma placa de 96 poços (fundo em V) a uma concentração de 2,10º células por poço. As células são então incubadas durante 20 minutos a 4 ºC com as moléculas de teste diluídas no tampão com as concentrações finais: 167 ug/ml; 83 pg/ml; 42 ug/ml; 21 pg/ml; 10 po/ml; 5 po/ml; 3 pg/ml; 1 po/ml; O uo/ml, e simultaneamente com po/ml de Rituxan-A488.

[0206] As células são então lavadas por adição de 1 uulde PBS a pH 6 e centrifugadas a 1.700 rpm durante 3 minutos a 4 “C. O sobrenadante é então removido e 300 ul de PBS frio são adicionados a pH 6.

[0207] A ligação de Rituxan-A488 a CD64 expressa por células Jurkat-CD64 é avaliada por citometria de fluxo. As intensidades de fluorescência média (MFI) observadas são expressas como uma percentagem, em que 100% é o valor obtido com Rituxan-A488 sozinho, e 0% é o valor na ausência de Rituxan-A488. As concentrações moleculares necessárias para induzir 50% de inibição da ligação de Rituxan-A488 a CD64 de células Jurkat-CD64 são calculadas utilizando o “Prism Software”.

* Ligação ao CD32aH e CD32aR

[0208] A ligação do receptor de CD32 humano é estudada pelo ensaio competitivo utilizando células HEK-Rituxan A488 e transfectadas com receptores CD32aH e CD32aR (HEK-CD32).

[0209] As células HEK-CD32 são semeadas em uma placa de 96 poços (fundo V) a uma concentração de 2,10º células por poço. As células são então incubadas por 20 minutos a 4 ºC com as moléculas de teste diluídas em tampão nas seguintes concentrações finais: 333 ug/ml; 167 po/ml, 83 ug/ml; 42 upo/ml; 21 puo/ml; 10 pg/ml; 5 pg/ml; 3 pg/ml; 1 po/ml; O po/ml, e simultaneamente com 30 ug/ml de Rituxan-A488.

[0210] As células são então lavadas por adição de 100 ul de PBS a pH 6 e centrifugada a 1.700 rpm durante 3 minutos a 4 ºC. O sobrenadante é então removido e 300 ul de PBS frio são adicionados a pH 6.

[0211] A ligação de Rituxan-A488 a CD32aH e CD32aR expressa por células HEK-CD32 é avaliada por citometria de fluxo. As intensidades de fluorescência média (MFI) observadas são expressas como uma porcentagem, em que 100% é o valor obtido apenas com o Rituxan-A488 e 0% é o valor na ausência de Rituxan-A488. As concentrações moleculares necessárias para induzir 50% de inibição da ligação do Rituxan-A488 ao CD32aH e CD32aR das células HEK-CD32 são calculadas usando o “Prism Software".

* Ligação a hCD16aH

[0212] A ligação ao CDI6aH humano é estudada por ensaio competitivo, utilizando um anticorpo anti-CD16 3G8 murino marcado com ficoeritrina (3G8-PE) e células Jurkat transfectadas com o receptor CD16aH humano (Jurkat-CD16aH).

[0213] As células Jurkat-CD16aH são semeadas em uma placa de 96 poços (fundo V) a uma concentração de 2,10” células por poço. As células são então incubadas por 20 minutos a 4 ºC com as moléculas de teste diluídas em tampão nas seguintes concentrações finais: 83 pg/ml; 42 pg/ml; 21 pg/ml; 10 ug/ml; 5 po/ml; 3 pg/ml; 1 pg/ml; O ug/ml e simultaneamente com 0,5 ug/ml de mAb 3G8-PE.

[0214] As células são então lavadas por adição de 1 ul de PBS a pH 6 e centrifugada a 1.700 rpm durante 3 minutos a 4 ºC. O sobrenadante é então removido e 300 ul de PBS frio são adicionados a pH 6.

[0215] A ligação do mAb 3G8-PE a CD16aH expressa por células Jurkat-CD16aH é avaliada por citometria de fluxo. As intensidades de fluorescência média (MFI) observadas são expressas como uma percentagem, em que 100% é o valor obtido com o mAb 3G8 sozinho-PE, e 0% é o valor na ausência de mAb 3G8-PE. As concentrações moleculares necessárias para induzir 50% de inibição da ligação do mAb 3G8-PE a CD16aH de células Jurkat- CD16aH, são calculadas usando o “Prism Software”.

[0216] Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

[0217] Os resultados mostram que as variantes ABA-184AY CHO Fc, ABA-184EY CHO Fc e ABA-184AY TGg têm uma afinidade aumentada para os receptores FcyRlilla (CD160), FcyRI (CD64) e FeyRlila (CD320), em comparação com o Fc não mutado (Fc-WT), mas também comparado ao IVIG.

[0218] Os mutantes da invenção mostram uma afinidade muito aumentada para os receptores FcyRllla (CD16a), FcyRI (CD64) e FeyRlla (CD32a) em comparação com MST-HN.

* Ligação ao CD16aV humano:

[0219] O receptor HisTag hoD16aV (Sistema R&D) é imobilizado em biossensores anti-Penta-HIS (HIS 1 K), diluído a 1 ug/ml em tampão cinético (Pall). As moléculas foram testadas em concentrações de 1.000, 500, 250, 125, 62,5, 31, 25, 158 O nM em tampão cinético.

[0220] - Carregamento antes de cada amostra

[0221] - Projeto do teste: Todas as etapas são realizadas em tampão cinético (Pall)

[0222] Linha de base 1 x60s

[0223] Carregamento de 400 s

[0224] Linha de base 2x60s

[0225] Associação em 60 s

[0226] Dissociação em 30 s

[0227] Regeneração em 5 s em tampão de regeneração (10 mM de glicina de pH 1,5/Neutralização: PBS).

[0228] -Interpretação dos resultados:

[0229] As curvas de associação e dissociação (primeiros 5 s) são usadas para calcular as constantes cinéticas de associação (Kon) e dissociação (Kkoff) usando um modelo de associação 1/1. KD (nM) é então calculada (kon/koff).

[0230] Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4 DP: desvio padrão

[0231] Os resultados mostram que as variantes Fc ASA-184AY CHO, Fc ASA-184EY CHO e ASA-184AY TGg mostram um aumento de ligação para o receptor FcyRlIlla-V humano (CD16a-V), e isso comparado ao Fc não mutado (Fc- WT), mas também em comparação com IgM e fragmento Fc MST- HN contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.

EXEMPLO 5: Testes de Inibição de ADCC e de ativação de células Jurkat de variantes produzidas em células CHO e em leite de cabra transgênica

[0232] Os testes de inibição do ADCC e de ativação de células Jurkat são realizados com as seguintes moléculas:

[0233] - Variantes da invenção ASA-184AY cHO (K334N/P352S/A3S78V/V397M/N434Y), A3SA-184EY CHO

(Y296W/K334N/P3528S/A378V/V397M/N434Y) produzidas em células CHO de acordo com o processo dado no Exemplo 3,

[0234] - O fragmento Fc MST-HN contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, descrito na literatura como tendo uma ligação optimizada apenas para o receptor FcRn (Ulrichts et a/, JCI, 2018) foi produzido em células HEK-293 (Células 293-F, Freestyle InvitroGen),

[0235] —- Um fragmento Fc “Fc-Rec” ou “Fc-WT” do tipo selvagem, obteve por digestão com papaína uma IgG1 produzida no leite de cabra transgênica,

[0236] —IglV.

* Teste de inibição de ADCC:

[0237] Para imitar a lise de glóbulos vermelhos observada na púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), envolvendo os autoanticorpos do paciente com ITP, uma lise de glóbulos vermelhos mediada por células efetoras na presença de um anticorpo monoclonal anti-humano Rhesus D (RhD) foi conduzida e a capacidade de diferentes quantidades de imunoglobulinas polivalentes (IGMV) ou fragmentos de Fc recombinantes mutados ou não mutados, para inibir essa lise, por exemplo, por competição com anti-RhD para a fixação de receptores Fc na superfície das células efetoras, foi avaliada.

[0238] A citotoxicidade dos anticorpos anti-RhD foi estudada pela técnica de ADCC. Resumidamente, células efetoras (células mononucleares) (25 a 8x107 células/ml) e eritrócitos Rh-positivos (25 a 4x107 células/ml finais) foram incubados com diferentes concentrações (0 a 75 ng/ml) de anticorpos anti-RhD, com uma razão Efetor/Alvo de 2/1. Após 16 horas de incubação, a lise foi estimada quantificando a hemoglobina liberada no sobrenadante usando um substrato específico (DAF).

[0239] Os resultados são expressos como uma porcentagem de lise específica em função da quantidade de anticorpo. A inibição de ADCC é induzida pelas moléculas testadas (IM, MST-HN, Fc-WT ASA-184AY CHO, ASA-184EY CHO) em concentrações de 500, 50, 5, 0,5 ug/ml. para MST-HN, Fce-WT A3SA-

184AY CHO, ASA- 184EY CHO e 1500, 150, 15, 1,5 pugíml para IglV. As concentrações das moléculas para induzir 25% ou 50% de inibição foram calculadas com o “Prism Software”.

[0240] Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5 o Pensa 5 TS 184AY CHO |184EY |HN cHO Inibição da lise dos anti-D (IC 25%, nM Inibição da lise dos anti-D (IC 50%, nM

[0241] Os resultados mostram que as variantes Fc, ABA-184AY CHO e ASA-184EY CHO, mostram uma inibição da lise dos glóbulos vermelhos por um aumento do anticorpo anti-Rhesus D em comparação com o Fc não mutado (Fc-WT), mas também em comparação com IVIG.

[0242] Além disso, a inibição de ASA-184AY CHO ou ASA-184EY CHO é bastante aumentada em comparação com o fragmento Fc, MST-HN, contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.

* Inibição da ativação de células Jurkat CD64:

[0243] Esse teste estima a capacidade das variantes Fc de acordo com a invenção ou IVIG (IgG total) de inibir a secreção de IL2 por células Jurkat que expressam CD64 humano (Jurkat-H-CD64) induzido pela linhagem celular Raji com Rituxan.

[0244] Resumidamente, as células Raji (50 ml a 5x10º células/ml) foram misturadas com Rituxan (50 ml a 2 mg/ml), células Jurkat H-CD64 (25 ml a 5x10º células/ml), um éster de forbol (PMA, 50 ml a 40 ng/ml), depois incubadas com a variante IGVI ou Fc, de acordo com a invenção, a 1.950 nM.

[0245] Após uma noite de incubação, as placas foram centrifugadas (125 g por 1 minuto) e o NL2 contido no sobrenadante foi avaliado por ELISA.

[0246] A inibição da secreção de IL2 foi induzida por IVIG, Fe-WT, MST-HN ou variantes Fc de acordo com a invenção (A3A-184AY CHO ou A3A- 184EY CHO) adicionada a 50 e 100 pug/ml para Fc-WT, fragmentos MST-HN ou variantes de Fc de acordo com a invenção (ASA-184AY CHO ou ASA-184EY CHO), e 150 e 300 pg/ml para IGVI.

[0247] As concentrações da molécula para induzir 25% ou 50% de inibição foram calculadas com "Prism Software”.

[0248] Os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6 a a E O 184AY CHO | 184EY CHO |HN =| wWr Inibição da secreção de IL- (IC 25%, nM) Inibição da secreção de IL- EsTEL e e 1C 50%, nM

[0249] Os resultados mostram que as variantes Fc ASA-184AY- CHO e AS3A-184EY-CHO mostram inibição aumentada da secreção de |L2 em comparação com Fc não mutado (Fc-WT), mas também em comparação com IVIG.

[0250] Além disso, a inibição do RFC ASA-184AY CHO ou A3SA- 184EY CHO é bastante aumentada em comparação com o fragmento Fc MST- HN contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.

EXEMPLO 6: Testes de ligação da variante Fc às células sanguíneas

[0251] Os testes de ligação de células sanguíneas são realizados com as seguintes moléculas:

[0252] - Variantes da invenção — ASA-184AY CHO (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), ASA-184EY CHO (Y296W/K334N/P352S/A378V/V397 M/N434Y) produzidas em células CHO, de acordo com o processo descrito no exemplo 3, ASBA-184AY TGg produzido na cabra transgênica de acordo com o processo descrito no Exemplo 1,

[0253] - O fragmento Fc MST-HN contendo as mutações M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, descrito na literatura como tendo uma ligação otimizada apenas ao receptor FcRn (Ulrichts et a/, JCI, 2018), foi produzido em células HEK-293 (células 293-F, Freestyle InvitroGen),

[0254] — Um fragmento Fc “Fc-Rec” ou “Fce-WT” do tipo selvagem, obteve por digestão com papaína uma IgG1 produzida no leite de cabra transgênica,

[0255] -IglV.

[0256] As moléculas marcadas com o marcador Alexa Fluorº (marcador de proteína altamente fluorescente) foram incubadas a 65 nM (10 vpg/ml para Fc em 2% de CSF PBS) com células-alvo por 20 minutos em gelo.

[0257] Após 2 lavagens em 2% de LCR, as células foram suspensas em 500 ml de Isofluxo antes da análise citométrica de fluxo. Os testes são realizados nas seguintes células: - células Natural Killer (NK) marcadas com anti-CD56 (“% de células NK positivas”); - Monócitos marcados com anti-CD14 (“% de células positivas”); - Monócitos CD16+ marcados com anti-CD14 e com o anticorpo anti- CD16 3G8 (“% de células positivas”); - Neutrófilos marcados com anti-CD15 (“% de células positivas”).

[0258] O receptor FcyRIll (CD16) foi demonstrado usando o anticorpo anti-CD16 3G8.

[0259] Os resultados mostram que as variantes Fc ASA-184AY CHO, A3A-184EY CHO e A3SA-184AY TGg, qualquer que seja o modo de produção, oferecem maior ligação em comparação com o Fc não mutado (Fc-

Rec), mas também em comparação com o lglV. Além disso, a ligação de ASA- 184AY ou ASA-184EY é bastante aumentada em comparação com o fragmento MST-HN para células NK, monócitos CD16+ e neutrófilos (ver Figura 6).

EXEMPLO 7: Testes de modelo in vivo de púrpura trombocitopênica idiopática (ITP)

[0260] A doença foi induzida em camundongos que expressam um FcRn humanizado (fundo de gene B6 heterozigoto 276 mFcRn -/- hnFcRnTg (The Jackson Laboratory)) através da injeção de um anticorpo antiplaquetas 6A6- hlgG1 (0,3 pg/g de peso corporal) por via intravenosa para a depleção das plaquetas. É realizado um exame de sangue (número de trombócitos) 24 horas antes da injeção de 6A6-hlgG1, 4 horas após a indução da doença. O IglV (1.000 mg/kg), Fce-Rec (380 e 750 mg/kg), Fc MST-HN (190 mg/kg) e Fc ASA-184AY CHO (190 mg/kg e 380 mg/kg), foram administrados por via intraperitoneal 2 horas antes da depleção plaquetária.

[0261] A contagem de plaquetas foi determinada com um sistema Advia Hematology (Bayer). O número de plaquetas antes da injeção de anticorpos foi fixado em 100%.

[0262] O anticorpo antiplaquetas 6A6-hlgG1 (0,3 ug/g) permite a depleção de 90% das plaquetas.

[0263] A administração de candidatos a fármacos 2 horas antes da depleção de plaquetas pode restaurar (Figura 7): * 100% de plaquetas para ABA 184AY CHO em uma dose de 380 mg/kg; * 106% de plaquetas para ASA-184AY CHO em uma dose de 190 mg/kg; * 90% de plaquetas para IglV em uma dose de 1.000 mg/kg; * 64% de plaquetas para Fc-WT em uma dose de 750 g/kg; * 75% de plaquetas para Fc-WT em uma dose de 380 mg/kg; * 61% das plaquetas para a variante MST-HN em uma dose de 190 mg/kg.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de um polipeptídeo parental que compreende um fragmento Fc, em que a dita variante tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn e uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor Fc (FCcR) selecionado a partir de FcyRI (CD64), FeyRilla (CD160) e FeyRlla (CD32a), em relação à do polipeptídeo parental, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240l, V240M, V240N, V240S, F241H, F24 1Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242], L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258|1, E258R, E258M, E2580Q, E258Y, V259C, V259|, V259L, T260A, T260H, T260, T260, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, R291, P291G, P291G, R29, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V Q295I, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300l, R300, Y300W, R300, R1 V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

3. Variante, de acordo com as reivindicações | ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M;

(ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; e (iii) pelo menos uma mutação selecionada entre K290G e Y296W, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

4. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade aumentada para o receptor FcRn, em relação à do polipeptídeo parental, de uma razão pelo menos igual a 2, preferencialmente maior que 5, mais preferencialmente maior que 10, ainda mais preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 20, ainda mais preferencialmente maior que 25, mais preferencialmente maior que 30.

5. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que tem uma afinidade aumentada para pelo menos um receptor Fc (FcR) selecionado dentre os receptores FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD16a) e FceyRlla (CD320), em relação à do polipeptídeo parental, de uma razão pelo menos igual a 2, preferencialmente maior que 5, mais preferencialmente maior que 10, ainda mais preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 15, de modo particular, preferencialmente maior que 20, ainda mais preferencialmente maior que 25, mais preferencialmente maior que 30.

6. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é produzida em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos.

7. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é produzida em animais não humanos transgênicos, de preferência em mamíferos não humanos transgênicos.

8. Variante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o animal não humano transgênico é uma cabra transgênica.

9. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo parental compreende um fragmento Fc parental que é um fragmento Fc humano, preferencialmente um fragmento Fc de uma IgG1 humana ou uma IgG2 humana, mais preferencialmente escolhido dentre as sequências SEQ ID NO: 1 a 10 e 14.

10. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir de um fragmento Fc isolado, uma sequência derivada de um fragmento Fc isolado, um anticorpo, um fragmento de anticorpo compreendendo um fragmento Fc e uma proteína de fusão compreendendo um Fragmento Fc.

11. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é dirigida contra um antígeno selecionado de um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um antígeno fúngico, uma toxina, uma membrana ou citocina circundante, um receptor de membrana.

12. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para uso como fármaco.

13. Variante, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma patologia autoimune ou inflamatória, preferencialmente selecionada de púrpura trombocitopênica imunológica, neuromielite óptica ou doença de Devic e esclerose múltipla.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma variante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Processo de produção de uma variante de um polipeptídeo parental que compreende um fragmento Fc, em que a dita variante tem afinidade aumentada para o receptor FcRn e afinidade aumentada para, pelo menos, um receptor Fc (FcR) selecionado dos receptores FcyRI (CD64), FeyRllla (CD160) e FeyRlila (CD320), em relação ao polipeptídeo parental, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, em que o dito processo compreende expressar a dita variante em células epiteliais mamárias de mamíferos não humanos transgênicos ou o dito processo compreende expressar a dita variante em células de mamíferos em cultura.

16. Processo para produzir uma variante de um polipeptídeo parental que compreende um fragmento Fc, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita variante compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc escolhido entre Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242|, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258], E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259|, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R292|, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q2951, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300l, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305l, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

17. Processo de produção de uma variante de um polipeptídeo que compreende um fragmento Fc, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) preparar uma sequência de DNA compreendendo uma sequência que codifica a variante, uma sequência que codifica um promotor de caseína de mamífero ou um promotor de soro de mamífero e uma sequência que codifica um peptídeo sinal que permita a secreção da dita variante; b) introduzir a sequência de DNA obtida em (a) em um embrião de mamífero não humano, para obter um mamífero não humano transgênico que expressa a variante codificada pela dita sequência de DNA obtida em (a) na glândula mamária; e c) recuperar a variante no leite produzido pelo mamífero não humano transgênico obtido em (b).

18. Processo para a produção de uma variante de um polipeptídeo que compreende um fragmento Fc, de acordo com uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o mamífero não humano transgênico é selecionado a partir de bovinos, porcos, cabras, ovelhas e roedores, preferencialmente a partir de cabras, de camundongos, de porcos, de coelhos, de ovelhas e de vacas.

19. Processo para produzir uma variante de um polipeptídeo que compreende um fragmento Fc, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) preparar uma sequência de DNA que codifica a variante; b) introduzir a sequência de DNA obtida em (a) nas células de mamíferos em cultura transitória ou estável; Cc) expressar a variante das células obtidas em (b), e d) recuperar a variante no meio de cultura.

20. Sequência de DNA que compreende um gene que codifica uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, em que a dita variante tem afinidade aumentada para o receptor FCRn e uma afinidade aumentada para, pelo menos, um receptor Fc (FcR) selecionado entre os receptores FcyRI (CD64), FeyRlilla (CD160) e FeyRlila (CD320), em relação ao polipeptídeo parental, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende: (i) as quatro mutações 334N, 3528, 378V e 397M; e (ii) pelo menos uma mutação selecionada entre 434Y, 4348, 226G, P228L, P228R, 2308, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T e 389K; em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat, em que a dita sequência de DNA opcionalmente compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinal permitindo a secreção da dita variante.

21. Sequência de DNA que compreende um gene que codifica uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo um fragmento Fc, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende ainda pelo menos uma mutação (iii) no fragmento Fc selecionado entre Y296W, K290G, V240H, V240l, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242], L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259], V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290H, K290L, K290H, K290L K290Y, P291G, P291Q, P291R, R292|, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294R, E294T, E294 Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R e V305S, em que a numeração é a do índice EU ou equivalente em Kabat.

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