PT1534335E

PT1534335E - Anticorpos específicos de fcγriib e processos para a sua utilização

Info

Publication number: PT1534335E
Application number: PT03788456T
Authority: PT
Inventors: Scott Koenig; Maria-Concetta Veri
Original assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2012-02-28
Also published as: EP1534335B2; US20040185045A1; ES2381617T9; IL228069A0; HK1079979A1; US7425619B2; DK1534335T3; WO2004016750A3; ATE536188T1; EP1534335A4; EP1534335B9; US20050215767A1; AU2003262650B2; JP4459810B2; AU2003262650A1; EP1534335B1; IL166843A; EP2371389A3; ES2381617T5; EP1534335A2

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE FcyRIIB E PROCESSOS PARA

A SUA UTILIZAÇÃO

1. DOMÍNIO TÉCNICO A presente invenção tem por objecto anticorpos ou fragmentos desses anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB, particularmente a FcyRIIB humana, com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos ou fragmentos desses anticorpos se ligam a FcyRIIA, particularmente a FcyRIIA humana. A presente invenção tem por objecto processos para melhorar o efeito terapêutico dos anticorpos por meio da administração dos anticorpos da presente invenção para melhorar a função efectora dos anticorpos terapêuticos. A presente invenção também tem por objecto processos para melhorar a eficácia de uma composição de uma vacina, por meio da administração dos anticorpos da presente invenção.

2. ANTECEDENTES

2.1 RECEPTORES DE Fc E OS SEUS PAPÉIS NO SISTEMA IMUNITÁRIO A interacção de complexos de anticorpo - antigénio com células do sistema imunitário resulta numa vasta gama de respostas, que vão desde as funções efectoras, tais como citotoxicidade dependente do anticorpo, desgranulação de mastócitos e fagocitose aos sinais imunomoduladores, tais como regulação da proliferação de linfócitos e secreção de anticorpos. Todas estas interacções são iniciadas através da ligação do dominio Fc dos anticorpos ou de complexos imunitários aos receptores da superfície de células 1 especializadas em células hematopoiéticas. A diversidade de respostas celulares desencadeadas por anticorpos e complexos imunitários resulta da heterogeneidade estrutural dos receptores de Fc. Os receptores de Fc compartilham domínios de ligandos estruturalmente relacionados que, presumivelmente medeiam a sinalização intracelular.

Os receptores de Fc, elementos da superfamília de genes de imunoglobulina das proteínas, são glicoproteínas que se podem ligar à porção Fc das moléculas de imunoglobulinas. Cada elemento da família reconhece as imunoglobulinas de um ou mais isotipos através de um domínio de reconhecimento na cadeia de um dos receptores de Fc. Os receptores de Fc são definidos pela sua especificidade para subtipos de imunoglobulinas. Os receptores de Fc para IgG são referidos como FcyR, para IgE como FcsR e para IgA como FcaR. Diferentes células acessórias comportam receptores de Fc para anticorpos de diferentes isotipos e o isotipo do anticorpo determina quais células acessórias que serão envolvidas numa dada resposta (revisto por Ravetch J.V. et al. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. 2002, The Journal of Clinicai Investigation, 2 (109): 161-1681; Ravetch J.V. et al. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78 (4): 553-60). Os diferentes receptores de Fc, as células que os expressam e a especificidade do seu isotipo estão resumidos no quadro 1 (adaptado de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York). 2

Receptores de Fcy

Cada elemento desta família é uma glicoproteína de membrana integral, possuindo domínios extracelulares relacionados com um conjunto C2 de domínios relacionados com a imunoglobulina, um domínio abrangendo uma única membrana e um domínio intracitoplásmico de comprimento variável. Há três FcyRs conhecidas, designados por FcyRI(CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII(CD16). Os três receptores são codificados por genes distintos, no entanto, a extensa homologia entre os três membros da família sugere que têm origem num progenitor comum, talvez por duplicação de genes. A presente invenção foca-se especificamente em FcyRII(CD32) .

FcyRII (CD32)

As proteínas FcyRII são glicoproteínas de membrana integral de 40 KDa que se ligam apenas a IgG complexada devido a uma baixa afinidade para a Ig monomérica (106 M_1) . Este receptor é o R de Fcy mais amplamente expresso, presente em todas as células hematopoiéticas, incluindo monócitos, macrófagos, células B, células AN (assassinas naturais, em inglês NK) , neutrófilos, mastócitos e plaquetas. FcyRII tem apenas duas regiões semelhantes a imunoglobulinas na sua cadeia de ligação da imunoglobulina e, portanto, com uma afinidade muito menor para a IgG do que para a FcyRI. Há três genes humanos de FcyRII (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C), ligando-se todos eles a IgG em complexos de agregados ou imunitários.

Diferenças distintas dentro dos domínios citoplásmicos de FcyRII-A e FcyRII-B criam duas respostas funcionalmente heterogéneas à ligação do receptor. A diferença fundamental 3 é que a isoforma A inicia a sinalização intracelular levando à activação das células, tais como fagocitose e explosão respiratória, enquanto a isoforma B inicia sinais inibidores, por exemplo, inibindo a activação das células B.

Sinalizaçao através de FcyRs

Tanto os sinais de activação como os inibidores são transduzidos através da ligação que se segue a FcyRs. Estas funções, diametralmente opostas, resultam de diferenças estruturais entre as diferentes isoformas dos receptores. Dois domínios distintos dentro dos domínios citoplasmáticos de sinalização do receptor chamados elementos de activação à base da tirosina imunoreceptora (EATI, em inglês ITAM) ou elementos de _inibição à base da tirosina imunoreceptora (EITI, em inglês ITIM) são responsáveis por respostas diferentes. 0 recrutamento de diferentes enzimas cito-plásmicas para estas estruturas dita o resultado das respostas celulares mediadas por FcyR. Os complexos de FcyR contendo EATI incluem FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, enquanto os complexos contendo EITI incluem apenas FcyRIIB.

Os neutrófilos humanos expressam o gene de FcyRIIA. 0 agrupamento de FcyRIIA por via de complexos imunitários ou reticulações específicas de anticorpos serve para agregar EATI juntamente com as cinases associadas ao receptor que facilitam a fosforilação de EATI. A fosforilação de EATI serve como um local de encaixe para a cinase Sik, cuja activação resulta na activação de substratos a jusante (por exemplo, PI3K) . A activação celular leva à libertação de mediadores pró-inflamatórios. 4 0 gene de FcyRIIB é expresso em linfócitos B; o seu domínio extracelular é 96 % idêntico a FcyRIIA e liga-se aos complexos de IgG de forma indistinguível. A presença de um EITI no domínio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclasse inibidora de FcyR. Recentemente estabeleceu-se a base molecular desta inibição. Quando coligadas, em conjunto com um FcyR de activação, a EITI, na FcyRIIB, torna-se fosforilada e atrai o domínio SH2 do polifosfato de inosital 5'-fosfatase (SHIP), que hidrolisa mensageiros de fosfoinositol libertados como consequência da activação de tirosina-cinase mediada por FcyR contendo EATI, prevenindo, consequentemente, o influxo de Ca++ intracelular. Assim, a reticulação de FcyRIIB amortece a resposta de activação para a ligação de FcyR e inibe a capacidade de resposta celular. A activação de células B, a proliferação de células Β e a secreção de anticorpos é assim abortada. QUADRO 1. Receptores para as regiões Fc de isotipos de imunoglobulina

Receptor FcyRI (CD64) FcyRII-A (ΧΔ32) FcyRI I-B2 (ΧΔ32) FcyRII-BI (ΧΔ32) FcyRI II (CD16) FceRI FcaRI (CD89) Ligação IgGl 108 M"1 IgGl 2 x 106 M"1 IgGl 2 x ΙΟ6 rr1 IgGl 2 x IO6 M"1 IgGl 5 x 105 M"1 IgGl IO10 M"1 IgGl, IgA2 ΙΟ7 ΝΓ1 Tipo de célula Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células dendríticas Macrófagos Neutrofilos Eosinófilos Células dendríticas Plaquetas Células de Langerhan Macrófagos Células B Mastócitos Células AN Eosinófilos Macrófagos Neutrófilos Mastócitos Mastócitos Eosinófilos Basófilos Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Efeito da ligação Absorção Estimulação Activação da explosão respiratória Indução de morte Libertação de grânulos absorvidos Absorção Inibição da estimulação Sem absorção Inibição da estimulação Indução da morte Secreção de grânulos Absorção Indução da morte

2.2 DOENÇAS RELEVANTES 5

2.2.1 CANCRO A neoplasia ou tumor é uma massa neoplásica resultante do crescimento descontrolado e anormal das células que pode ser benigna ou maligna. Os tumores benignos geralmente permanecem localizados. Os tumores malignos são colectivamente denominados cancros. 0 termo "maligno", em geral, significa que o tumor pode invadir e destruir as estruturas do corpo vizinhas e espalhar-se para locais distantes para causar a morte (para revisão, ver Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2a Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122). 0 cancro pode surgir em muitos locais do corpo e comportar-se de maneira diferente conforme a sua origem. As células cancerosas destroem a parte do corpo de que são originárias e depois espalham-se para outra (s) parte (s) do corpo onde começam um novo crescimento e causam mais destruição.

Mais de 1,2 milhões de americanos desenvolvem cancro todos os anos. 0 cancro é a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos e, se as tendências actuais continuarem, espera-se que o cancro seja a principal causa de morte até o ano 2010. Os cancros do pulmão e da próstata são os cancros assassinos de topo para os homens nos Estados Unidos. Os cancros do pulmão e da mama são os cancros assassinos de topo para as mulheres nos Estados Unidos. Um em cada dois homens nos Estados Unidos terá um diagnóstico de cancro nalgum momento da sua vida. Uma em cada três mulheres, nos Estados Unidos, terão um diagnóstico de cancro em algum momento da sua vida.

Ainda não se encontrou uma cura para o cancro. As opções de tratamento actuais, tais como tratamento 6 cirúrgico, quimioterapia e radiação, são muitas vezes ineficazes ou apresentam efeitos colaterais graves.

Terapêutica do cancro

Actualmente, a terapia de cancro pode envolver cirurgia, quimioterapia, terapia hormonal e/ou tratamento com radiação para erradicar células neoplásicas num doente (Ver, por exemplo, Stockdale, 1998, "Principies of Câncer Patient Management", em Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., capítulo 12, secção IV) . Recentemente, a terapêutica do cancro também pode envolver terapia biológica ou imunoterapia. Todas estas abordagens apresentam desvantagens significativas para o doente. A cirurgia, por exemplo, pode ser contra-indicada devido à saúde do doente ou pode ser inaceitável para o doente. Além disso, a cirurgia pode não remover completamente o tecido neoplásico. A radioterapia só é eficaz quando o tecido neoplásico apresenta uma maior sensibilidade à radiação do que o tecido normal, e a radioterapia também pode muitas vezes provocar efeitos secundários graves. A terapia hormonal raramente é dada como um único agente e, embora possa ser eficaz, é frequentemente usada para prevenir ou retardar a recorrência do cancro após outros tratamentos terem removido a maioria das células cancerosas. As terapias biológicas / imunoterapias são em número limitado e podem produzir efeitos colaterais, como erupções ou inchaços, sintomas semelhantes à gripe, incluindo febre, calafrios e fadiga, problemas no tracto digestivo ou reações alérgicas.

No que respeita à quimioterapia, há uma variedade de agentes quimioterapêuticos disponíveis para o tratamento do cancro. Uma maioria significativa dos agentes quimio- 7 terapêuticos para o cancro agem inibindo a síntese de ADN directa ou indirectamente por inibição da biossíntese dos precursores de trifosfato de desoxirribonucleótido, para impedir a replicação do ADN e, concomitante, a divisão celular {Ver, por exemplo, Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, oitava Ed. (Pergamom Press, New York, 1990)). Estes agentes, que incluem agentes de alquilação, tal como nitrosureia, anti-metabólitos, tais como o metotrexato e a hidroxiureia e outros agentes, tais como etopósidos, campatecinas, bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, etc., embora não necessariamente do ciclo celular específico, matam as células durante a fase S por causa de seu efeito sobre a replicação do ADN. Outros agentes, especificamente a colchicina e os alcaloides de vinca, como vinblastina e vincristina, interferem com a junção dos microtúbulos, resultando na paragem da mitose. Os protocolos de quimioterapia geralmente envolvem a administração de uma combinação de agentes quimioterapêuticos para aumentar a eficácia do tratamento.

Apesar da disponibilidade de uma variedade de agentes quimioterapêuticos, a quimioterapia tem muitos inconvenientes {ver, por exemplo, Stockdale, 1998, "Principies Of Câncer Patient Management" em Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., cap. 12, sec. 10) . Quase todos os agentes quimioterapêuticos são tóxicos e a quimioterapia provoca efeitos colaterais significativos e muitas vezes perigosos, incluindo náuseas severas, depressão da medula óssea, imunossupressão, etc. Além disso, mesmo com a administração de combinações de agentes quimioterapêuticos, muitas células tumorais são resistentes ou desenvolvem resistência aos agentes quimioterapêuticos. Na verdade, essas células, resistentes a agentes quimioterapêuticos particulares usados no protocolo de tratamento, muitas vezes revelam-se resistentes a outros fármacos, mesmo aos agentes que actuam por mecanismos diferentes dos mecanismos de acção dos fármacos usadas no tratamento especifico; este fenómeno é denominado fármaco pleiotrópico ou resistência a múltiplos fármacos. Assim, por causa da resistência aos fármacos, muitos cancros provaram ser refractários aos protocolos de tratamento quimioterapêutico normalizado. Há uma necessidade significativa de tratamentos alternativos do cancro, particularmente para o tratamento de cancro que se mostrou refractário a tratamentos padrão de cancro, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapia hormonal. Uma alternativa promissora é a imunoterapia, na qual as células cancerosas são especificamente orientadas pelos anticorpos específicos dos antigénios do cancro. Grandes esforços têm sido direccionados para dominar a especificidade da resposta imunitária, por exemplo, a tecnologia do hibridoma permitiu o desenvolvimento de anticorpos monoclonais selectivos para o tumor (ver Green M.C. et al., 2000 Câncer Treat Rev., 26: 269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26 (supl. 14): 43-51) e nos últimos anos, a Food and Drug Administration aprovou os primeiros Acm (anticorpos monoclonais) para a terapia de cancro: rituxina (anti-CD20) para linfoma não Hodgkin e herceptina [anti-(c-erb-2/HER-2)] para o cancro da mama metástico (Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Câncer Res., 3: 86-90) . No entanto, a potência da função efectora dos anticorpos, por exemplo, para mediar a citotoxicidade celular dependente do anticorpo ("CCDA, em inglês ADCC") é um obstáculo a tal tratamento. São assim necessários processos para melhorar a eficácia dessa imunoterapia. 9

2.2.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS E DOENÇAS AUTOIMUNES A inflamação é um processo pelo qual a fórmula leucocitária do sangue e os produtos químicos protegem os nossos órgãos de infecções por substâncias estranhas, tais como bactérias e vírus. Geralmente é caracterizada por dor, inchaço, calor e vermelhidão da área afectada. Produtos químicos conhecidos, tal como as citocinas e as prosta-glandinas controlam este processo e são libertadas numa cascata ordenada e auto-limitativa no sangue ou nos tecidos afectados. Esta libertação de produtos químicos aumenta o fluxo sanguíneo para a área da lesão ou da infecção e pode resultar em vermelhidão e calor. Alguns dos produtos químicos causam uma perda de fluido para os tecidos, resultando em inchaço. Este processo de protecção pode estimular os nervos e causar dor. Estas alterações, quando ocorrem por um período limitado, numa área relevante, funcionam em benefício do corpo.

Em doenças auto-imunes e/ou inflamatórias, o sistema imunitário desencadeia uma resposta inflamatória quando não há substâncias estranhas para lutar e o sistema imunitário de proteção normal do organismo provoca danos aos seus próprios tecidos por se auto-atacar, por engano. Existem muitas doenças auto-imunes diferentes que afectam o corpo de maneiras diferentes. Por exemplo, o cérebro é afectado em indivíduos com esclerose múltipla, o intestino é afectado em indivíduos com doença de Crohn e a membrana sinovial, o osso e a cartilagem de várias articulações são afectados em indivíduos com artrite reumatóide. À medida que os distúrbuios auto-imunes progridem na destruição de um ou mais tipos de tecidos do corpo, pode resultar o crescimento anormal de um órgão ou alterações no funcionamento do órgão. A doença auto-imune pode afectar 10 somente um órgão ou um tipo de tecido ou pode afectar múltiplos órgãos e tecidos. Os órgãos e tecidos que são normalmente afectados por distúrbios autoimunes incluem glóbulos vermelhos, vasos sanguíneos, tecidos conjuntivos, glândulas endócrinas (por exemplo, a tiróide ou o pâncreas), músculos, articulações e pele. Exemplos de doenças auto-imunes incluem, mas não se limitam a tiroidite de Hashimoto, anemia perniciosa, doença de Addison, diabetes do tipo 1, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso, esclerose múltipla, doença auto-imune do ouvido interno, miastenia gravis, síndrome de Reiter, doença de Graves, hepatite auto-imune, polipose adenomatosa familiar e colite ulcerosa. A artrite reumatóide (AR) e a artrite a reumatóide juvenil são tipos de artrite inflamatória. A artrite é um termo geral que descreve a inflamação nas articulações. Alguns, mas não todos os tipos de artrite são o resultado de inflamação mal direcionada. Além da artrite reumatóide, outros tipos de artrite associada com a inflamação incluem o seguinte: artrite psoriática, síndrome de Reiter, artrite da espondilite anquilosante e artrite gotosa. A artrite reumatóide é um tipo de artrite crónica que ocorre nas articulações em ambos os lados do corpo (tal como ambas as mãos, pulsos ou joelhos). Essa simetria ajuda a distinguir a artrite reumatóide de outros tipos de artrite. Além de afectar as articulações, a artrite reumatóide pode ocasionalmente afectar a pele, os olhos, os pulmões, o coração, o sangue e os nervos. A artrite reumatóide afecta cerca de 1 % da população mundial e é potencialmente incapacitante. Existem aproximadamente 2,9 milhões de casos de artrite reumatóide nos Estados Unidos. As mulheres são duas a três vezes mais 11 afectadas do que os homens. A idade típica em que a artrite reumatóide ocorre é entre 25 e 50 anos. A artrite reumatóide juvenil afecta 71.000 jovens norte-americanos (com idade inferior a dezoito) afectando seis vezes mais as raparigas do que os rapazes. A artrite reumatóide é uma doença auto-imune em que o sistema imunitário do corpo identifica incorrectamente, como estranhas, as membranas sinoviais que segregam o fluido lubrificante nas articulações. Resulta uma inflamação e a cartilagem e os tecidos em torno das articulações são danificados ou destruídos. Em casos graves, esta inflamação estende-se a outros tecidos articulares e à cartilagem ao redor, em que pode corroer a erosão ou a destruição de ossos e cartilagens e levar a deformidades articulares. O corpo substitui o tecido danificado por tecido cicatricial, fazendo com que espaços normais dentro das articulações se tornem estreitos e os ossos se fundam. A artrite reumatóide cria rigidez, inchaço, fadiga, anemia, perda de peso, febre e, muitas vezes, dor incapacitante. Alguns sintomas comuns da artrite reumatóide incluem rigidez articular ao despertar, que dura uma hora ou mais, inchaço num dedo específico ou nas articulações do punho; inchaço nos tecidos moles em torno das articulações; e inchaço em ambos os lados da articulação. O inchaço pode ocorrer com ou sem dor e pode piorar progressivamente ou permanecer igual durante anos antes de progredir. O diagnóstico da artrite reumatóide baseia-se numa combinação de factores, incluindo: a localização específica e a simetria de articulações dolorosas, a presença de rigidez das articulações de manhã, a presença de inchaços e nódulos sob a pele (nódulos reumatóides), resultados dos 12 exames por raios X que sugerem artrite reumatóide e/ou resultados positivos de uma análise de sangue chamado de factor reumatóide. Muitas pessoas, mas não todas, com artrite reumatóide têm o anticorpo do factor reumatóide no seu sangue. 0 factor reumatóide pode estar presente em pessoas que não têm artrite reumatóide. Outras doenças também podem causar a produção do factor reumatóide no sangue. É por isso que o diagnóstico da artrite reumatóide se baseia numa combinação de vários factores e não apenas na presença do factor reumatóide no sangue. 0 curso típico da doença é um dos sintomas persistentes, mas flutuantes das articulações e, passados cerca de 10 anos, 90 % dos doentes que sofrem vão exibir danos estruturais nos ossos e na cartilagem. Uma pequena percentagem terá uma curta doença, que desaparece completamente e outra pequena percentagem terá uma doença muito grave, com muitas deformidades articulares e, ocasionalmente, outras manifestações da doença. O processo inflamatório causa erosão ou destruição do osso e da cartilagem nas articulações. Na artrite reumatóide, há um ciclo auto-imune de apresentação persistente de antigénios, a estimulação das células T, a secreção de citocinas, a activação de células sinoviais e a destruição da articulação. A doença tem um impacto importante no indivíduo e na sociedade, causando dor significativa, disfunção e incapacidade, bem como milhões de dólares em despesas de saúde e salários perdidos. (Ver, por exemplo o sítio da Web NIH e o sítio da Web NIAID).

As terapêuticas actualmente disponíveis para a artrite concentram-se na redução da inflamação das articulações com medicamentos anti-inflamatórios ou imunossupressores. A primeira linha de tratamento de qualquer artrite é geralmente a utilização de anti-inflamatórios como 13 aspirina, ibuprofeno e inibidores de Cox-2, tais como celecoxib e rofecoxib. Os "fármacos de segunda linha" incluem ouro, metotrexato e esteróides. Embora se trate de tratamentos bem estabelecidos para a artrite, muito poucos doentes têm remissões apenas com estas linhas de tratamento. Os recentes avanços na compreensão da patogénese da artrite reumatóide têm levado ao uso de metotrexato em combinação com anticorpos de citocinas ou receptores solúveis recombinantes. Por exemplo, têm sido usados receptores solúveis recombinantes para o factor de necrose tumoral (FNT)-oí, em combinação com o metotrexato, no tratamento da artrite. No entanto, apenas cerca de 50 % dos doentes tratados com uma combinação de metotrexato e agentes anti-FNT-α tais como receptores solúveis recombinantes para FNT-α exibem uma melhoria clinica significativa. Muitos doentes permanecem refratários, apesar do tratamento. Ainda existem questões de difícil tratamento para doentes com artrite reumatóide. Muitos tratamentos actuais têm uma alta incidência de efeitos colaterais ou não podem impedir completamente a progressão da doença. Até o momento, nenhum tratamento tem sido o ideal e não há cura. São necessárias novas terapêuticas que tratem de forma mais eficaz a artrite reumatóide e outros distúrbios auto-imunes.

2.2.3 ALERGIA

As reacções alérgicas medidadas pelo sistema imunitário (hipersensibilidade) classificam-se em quatro tipos (I-IV), de acordo com os mecanismos subjacentes que levam à expressão dos sintomas alérgicos. As reações alérgicas do tipo I são caracterizadas pela libertação de substâncias vasoactivas, mediada por IgE, tal como a histamina dos mastócitos e basófilos. A libertação destas 14 substâncias e a manifestação subsequente de sintomas alérgicos são iniciadas pela reticulação de IgE ligada ao alergeno com o seu receptor na superfície de mastócitos e basófilos. Em indivíduos que sofrem de reações alérgicas do tipo I, a exposição a um alergeno, pela segunda vez, leva à produção de altos níveis de anticorpos IgE específicos para o alergeno, como resultado do envolvimento das células B e T da memória na interacção das células 3 necessárias para a produção de IgE. Os elevados níveis de anticorpos IgE produzidos causam um aumento da reticulação dos receptores de IgE nos mastócitos e basófilos por meio da IgE ligada ao alergeno que, por sua vez, leva à activação destas células e à libertação de mediadores farmacológicos que são responsáveis pelas manifestações clínicas de doenças alérgicas do tipo I.

Identificaram-se e caracterizaram-se dois receptores com afinidades diferentes para IgE. 0 receptor de alta afinidade (FcsRI) é expresso na superfície de mastócitos e de basófilos. 0 receptor de baixa afinidade (FcsRII/CD23) é expresso em muitos tipos de células, incluindo células B, células T, macrófagos, eosinófilos e células de Langerhan. A elevada afinidade do receptor de IgE consiste em três subunidades (cadeias alfa, beta e gama). Vários estudos demonstram que apenas a cadeia alfa está envolvida na ligação de IgE, enquanto as cadeias beta e gama (que são proteínas da transmembrana ou citoplasmáticas) são necessárias para os eventos de transdução de sinal. A identificação das estruturas de IgE necessárias para que IgE se ligue a FcsRI em mastócitos e basófilos é de extrema importância na elaboração de estratégias para o tratamento ou a prevenção de alergias mediadas por IgE. Por exemplo, a explicação de que o sítio de ligação do receptor de IgE pode levar à identificação de péptidos ou moléculas 15 pequenas que bloqueiam a ligação da IgE às células que comportam o receptor in vivo.

Actualmente, as reações alérgicas mediadas por IgE são tratadas com fármacos tais como anti-histaminicos e corticosteróides que tentam aliviar os sintomas associados a reacções alérgicas ao contrabalançar os efeitos das substâncias vasoactivas libertadas dos mastócitos e basófilos. Altas doses de anti-histaminicos e corticosteróides têm efeitos colaterais prejudiciais (por exemplo, distúrbios do sistema nervoso central, obstipação, etc.)· Assim, são necessários outros processos para tratar as reações alérgicas do tipo I.

Uma abordagem para o tratamento de distúrbios alérgicos do tipo I tem sido a produção de anticorpos monoclonais que reagem com IgE (livre) solúvel em soro, o bloqueio da ligação de IgE ao seu receptor em mastócitos e basófilos e a não ligação de IgE ao receptor (ou seja, não são anafilactogénicas) . Dois desses anticorpos monoclonais estão em estágios avançados de desenvolvimento clinico para o tratamento de reacções alérgicas mediadas por IgE {ver, por exemplo, Chang, TW, 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62) .

Um dos tratamentos mais promissores para reações alérgicas mediadas por IgE é a imunização activa contra epitopos apropriados não anafilactogénicos na IgE endógena. Stanworth et al. (patente norte-americana U.S. n°. 5.601.821) descreveu uma estratégia que envolve o uso de um péptido derivado do domínio CsH4 da IgE humana acoplado a uma proteína veicular heteróloga como uma vacina contra a alergia. No entanto, este péptido tem demonstrado que não induz a produção de anticorpos que reagem com a IgE 16 endógena solúvel. Além disso, Hellman (patente norte-americana n° . 5.653.980) propôs composições de vacinas anti-IgE baseadas na fusão dos domínios CtH2-CsH3 de comprimento completo (cerca de 220 aminoácidos de comprimento) com uma proteína veicular exógena. No entanto, os anticorpos induzidos pelas composições das vacinas anti-IgE propostos por Hellman muito provavelmente irão resultar em anafilaxia dado que os anticorpos contra algumas partes dos domínios CsH2 e CsH3 da molécula de IgE têm demonstrado que reticulam o receptor de IgE na superfície dos mastócitos e basófilos e levam à produção de mediadores de anafilaxia {Ver, por exemplo, Stadler et al., 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102: 121-126). Portanto, permanece a necessidade de um tratamento de reações alérgicas mediadas por IgE que não induza anticorpos anafilácticos. A preocupação significativa sobre a indução de anafilaxia que resultou no desenvolvimento de uma outra abordagem para o tratamento de doenças alérgicas do tipo I consiste em mimotopes que poderiam induzir a produção de anticorpos policlonais anti-IgE quando administrados a animais {ver, por exemplo, Rudolf, et al., 1998, Journal of Immunology 160: 3315-3321). Kricek et al. (publicação internacional No. WO 97/31948), bibliotecas de péptidos de exibição de fagos rastreadas com o anticorpo monoclonal BSWI7 para identificar mimotopes de péptidos que poderiam imitar a conformação da ligação dos receptores de IgE. Estes mimotopes poderiam presumivelmente ser usados para induzir anticorpos policlonais que reagem com IgE natural livre, mas não com a IgE ligada ao receptor, bem como bloqueiam a ligação de IgE ao seu receptor. Kriek et al. descreveram mimotopes de péptidos que não são homólogas de 17 nenhuma parte da molécula de IgE e são assim diferentes dos péptidos descritos na presente invenção.

Como evidenciado por um levantamento sobre a técnica, continua a haver uma necessidade de melhorar a eficácia terapêutica dos métodos actuais de tratamento ou de prevenção de doenças como cancro, doenças auto-imunes, distúrbios inflamatórios ou alergia. Em particular, há uma necessidade de melhorar a função efectora, particularmente o efeito citotóxico de anticorpos terapêuticos utilizados no tratamento de cancro. 0 estado actual da técnica é também a falta de tratamento ou de prevenção de distúrbios alérgicos (por exemplo, seja por terapia com anticorpos ou terapia com vacinas).

3. SUMÁRIO

Os domínios extracelulares de FcyRIIA e FcyRIIB são 95 % idênticos e assim compartilham numerosos epítopos. No entanto, FcyRIIA e FcyRIIB apresentam actividades muito diferentes. A diferença fundamental é que a FcyRIIA inicia a sinalização intracelular levando à activação de células, tais como fagocitose e explosão respiratória, enquanto a FcyRIIB inicia a sinalização inibidora. Antes da presente invenção, tanto quanto é do conhecimento dos requerentes, não foram identificados anticorpos que distinguem entre FcyRIIA endógena humana e FcyRIIB endógena humana expressas em células humanas (ver, Weinrich et al., Hybridoma 15 (1996) 109-116; Micklem et al., J. Immunol. 6 (1990) 2295-2303 e Budde et al., "Specificity of CD32 mAb for FcgRIIa, FcgRIIbl and FcgRIIb2 expressed in transfected mouse B cells and BHK-21 cells"; em: Schlossman et al., Leukocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens Oxford University Press, N.Y. (1995) 828-832) . Tendo em vista as 18 suas actividades distintivas e o seu papel na regulação de respostas imunitárias, são necessários esses anticorpos que reconhecem FcyRIIB humana endógena e FcyRIIA não endógena humana. A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta desses anticorpos específicos de FcyRIIB humana endógena. A presente invenção tem por objecto as modalidades caracterizadas nas reivindicações. Assim, tem por objecto um anticorpo IgG isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente ao domínio extracelular de FcyRIIB humana expressa endogenamente nas células humanas com uma afinidade pelo menos 10 vezes maior do que a que o referido domínio variável se liga a FcyRIIA expressa endogenamente numa célula humana, em que a referida ligação específica é feita por via do domínio variável. Em modalidades particulares, os anticorpos da presente invenção competem em relação à ligação de FcyRIIB ao anticorpo produzido pela linha de células de hibridoma 2Β6, com o número de acesso na ATCC PTA-4591 ou ao anticorpo produzido pela linha de células de hibridoma 3H7, com o número de acesso na ATCC PTA-4592. A presente invenção também tem por objecto um anticorpo IgG isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente ao domínio extracelular da FcyRIIB humana expressa endogenamente numa célula humana com uma afinidade pelo menos 10 vezes maior do que o referido domínio variável se liga a FcyRIIA expressa endogenamente numa célula humana, em que a referida ligação específica se faz por via do domínio variável, domínio variável esse que bloqueia a ligação de Ig-Fc a FcyRIIB e aumenta a activação das células Β para serem utilizadas no tratamento de cancro. A presente invenção também tem por objecto um anticorpo IgG isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente ao domínio extracelular de FcyRIIB humana 19 expressa endogenamente numa célula humana com uma afinidade pelo menos 10 vezes maior do que o referido domínio variável se liga a FcyRIIA expressa endogenamente numa células humana, em que a referida ligação específica é feita por via do domínio variável para ser utilizado numa composição de vacina, estando o referido anticorpo ou um seu fragmento numa quantidade eficaz para potenciar a resposta imunitária de um indivíduo à referida composição de vacina. A presente invenção ainda tem por objecto composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade relevante, sob o ponto de vista terapêutico, de um anticorpo ou de um fragmento da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Descreve-se aqui um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB, particularmente a FcyRIIB humana, mais particularmente FcyRIIB endógena humana com uma afinidade maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA, particularmente a FcyRIIA humana, mais particularmente FcyRIIA endógena humana. Tal como se utiliza aqui, "endógena" significa FcyRIIB ou FcyRIIA que é endogenamente expressa na célula ou expressa de forma recombinante numa célula de mamífero, mas não é expressa numa célula bacteriana ou isolada e desnaturada. Em certas modalidades, o anticorpo ou um seu fragmento liga-se a FcyRIIB com uma afinidade pelo menos 2 vezes maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIsA. Noutras modalidades, o anticorpo ou um seu fragmento liga-se a FcyRIIB com uma afinidade pelo menos 4 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 104, pelo menos 105, pelo menos 106, pelo menos 107 ou pelo menos 108 vezes maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA. Numa modalidade preferida, o referido anticorpo ou um seu 20 fragmento liga-se a FcyRIIB com uma afinidade 100 vezes, 1000 vezes, 104 vezes, 105 vezes, 106 vezes, 107 vezes ou 108 vezes maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento de liga a FcyRIIA. Preferivelmente, estas afinidades de ligação são determinadas com a IgG monomérica e não a IgG agregada e a ligação é feita através do domínio variável (por exemplo, os fragmentos Fab têm uma característica de ligação similar). Numa modalidade, o anticorpo aqui descrito não é o anticorpo monoclonal designado por KB61, conforme divulgado em Pulford et al, 1986 Immunology 57: 71-76 ou o anticorpo monoclonal II8D2 divulgado em Weinrich et al, 1996, Hybridoma 15: 109-116. Numa outra modalidade específica, o anticorpo aqui descrito não se liga ao mesmo epítopo e/ou compete pela ligação com KD61 ou II8D2. De preferência, o anticorpo aqui descrito não se liga à sequência de aminoácidos SDPNFSI correspondente às posições 135 a 141 da isoforma de FcyRIIB2.

Descreve-se aqui um anticorpo isolado ou um seu fragmento, que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA, conforme determinado por qualquer processo padrão conhecido na técnica para avaliar as especificidades. A presente invenção tem por objecto um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA como determinado, por exemplo, por "western blot" ou radioimunoensaio. A presente invenção tem por objecto um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA, como determinado, por exemplo, num ensaio por ELISA, num 21 intervalo linear para a ligação a FcyRIIB. Numa modalidade, a presente invenção tem por objecto um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga especif icamente a FcyRIIB produzida em qualquer sistema bacteriano ou de mamíferos, com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA, conforme determinado num ensaio por ELISA.

Numa modalidade particular, a presente invenção tem por objecto um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA e o domínio constante do referido anticorpo ainda tem uma afinidade maior para pelo menos um ou mais receptores de activação de Fc. Ainda noutra modalidade específica, o referido receptor de activação de Fc é FcyRIII.

Numa modalidade, o referido anticorpo ou um seu fragmento bloqueia o local de ligação de IgG de FcyRIIB e bloqueia a ligação do agregado de IgG marcadas para FcyRIIB, por exemplo, num ensaio de bloqueio por ELISA. Numa modalidade particular, o referido anticorpo ou um seu fragmento bloqueia assim a ligação do agregado de IgG marcado, num ensaio de bloqueio de ELISA de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 99,9 %. Ainda noutra modalidade particular, o anticorpo ou um seu fragmento bloqueia completamente a ligação dos referidos agregados de IgG marcados, no referido ensaio de ELISA.

Numa outra modalidade, o referido anticorpo ou um seu fragmento bloqueia o local de ligação de IgG de FcyRIIB e bloqueia a ligação do agregado de IgG marcado a FcyRIIB, como determinado num ensaio de coloração dupla por SCAF (separação de células activada por fluorescência) . 22 A presente invenção abrange o uso de anticorpos que regulam (ou seja, agonizam ou antagonizam) a actividade de FcyRIIB. Numa modalidade, os anticorpos da presente invenção agonizam pelo menos uma actividade de FcyRIIB, isto é, provocam a sinalização. Apesar de não ser a intenção estar ligado a qualquer mecanismo de acção, os anticorpos agonistas da presente invenção podem imitar agrupamentos de FcyRIIB levando à atenuação da resposta de activação para a ligação de FcyR e a inibição da resposta celular.

Numa outra modalidade, os anticorpos da presente invenção antagonizam pelo menos uma actividade de FcyRIIB, isto é, bloqueiam a sinalização. Por exemplo, os anticorpos bloqueiam a ligação de IgG agregadas a FcyRIIB. A presente invenção tem por objecto anticorpos que inibem a activação de mastócitos induzida por FcsRI. A presente invenção ainda tem por objecto anticorpos anti-FcyRIIB que inibem a activação de macrófagos mediada por FcyRIIA em células monociticas. A presente invenção também tem por objecto anticorpos anti-FcYRIIB que inibem a sinalização mediada por receptores de células B.

Numa modalidade particular, os anticorpos anti-FcYRII bloqueiam o sitio de ligação do ligando de FcyRIIB. Numa modalidade mais especifica, a actividade de bloqueio pode bloquear a regulação negativa da activação provocada por um complexo imunitário e, consequentemente, melhorar a resposta imunitária. Numa outra modalidade especifica, o aumento da resposta imunitária representa um aumento da resposta celular dependente de anticorpos. Numa outra modalidade especifica, os anticorpos anti-FcYRIIB bloqueiam 23 a reticulação dos receptores de FcyRIIB com as células B e/ou os receptores Fc, levando à activação das células B, mastócitos, células dendríticas ou macrófagos. A presente invenção engloba a produção de novos anticorpos monoclonais, com especificidades para FcyRIIB relativamente a FcyRIIA. Em particular, a presente invenção tem por objecto um processo para produzir anticorpos monoclonais de FcyRIIB que se ligam especificamente a FcyRIIB, particularmente FcyRIIB humana, com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos monoclonais se ligam a FcyRIIA, particularmente FcyRIIA humana, compreendendo o referido processo: (a) a imunização de um ou mais ratos transgénicos comportando FcyRIIA com FcyRIIB purificada ou um seu fragmento imunogénico; (b) a produção de linhas de células de hibridoma a partir de células do baço dos referidos ratos; (c) o rastreio das referidas linhas de células de hibridoma para uma ou mais linhas de células de hibridoma que produzem anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que os anticorpos se ligam a FcyRIIA. A presente invenção engloba qualquer anticorpo produzido pelo referido método. Numa modalidade especifica, a presente invenção tem por objecto um processo para produzir anticorpos monoclonais de FcyRIIB que se ligam especificamente a FcyRIIB, particularmente FcyRIIB humana, com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos monoclonais se ligam a FcyRIIA, particularmente FcyRIIA humana, compreendendo o referido processo: (a) a imunização de um ou mais ratos transgénicos, comportando FcyRIIA com FcyRIIB purificada ou um seu fragmento imunogénico; (b) o reforço da imunização dos referidos ratos, durante o tempo suficiente para provocar uma resposta imunitária; (c) a produção de linhas de células de hibridoma a partir de células do baço dos referidos ratos; 24 (d) o rastreio das referidas linhas de células de hibridoma para uma ou mais linhas de células de hibridoma que produzem anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que os anticorpos que se ligam a FcyRIIA. Numa modalidade preferida, os referidos ratos levam um reforço da imunização pelo menos quatro vezes durante um período de quatro meses. Numa modalidade, os referidos ratos são imunizados com FcyRIIB purificada, que tenha sido misturada com adjuvantes conhecidos na técnica, para aumentar a resposta imunitária nos referidos ratos. Numa modalidade particular, o referido fragmento imuno-génico é o domínio extracelular solúvel de FcyRIIB. As linhas de células de hibridoma podem ser rastreadas usando técnicas padrão conhecidas na técnica (por exemplo, ELISA).

Numa modalidade preferida, a presente invenção tem por objecto um anticorpo monoclonal produzido pelo clone 2Β6 ou 3H7, com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. Noutra modalidade, a presente invenção tem por objecto um anticorpo isolado ou um seu fragmento que concorre para a ligação com o anticorpo monoclonal produzido pelo clone 2B6 ou 3H7 e se liga a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA e/ou se liga ao mesmo epítopo de FcyRIIB como o anticorpo monoclonal produzido a partir do clone 2B6 ou 3H7 e se liga a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu se liga a FcyRIIA. Além disso, a presente invenção tem por objecto as linhas de células de hibridoma 2B6 ou 3H7, com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente.

Os processos aqui descritos também abrangem os polinucleótidos que codificam os anticorpos da presente 25 invenção. Numa modalidade, a presente invenção tem por objecto uma sequência isolada de ácidos nucleicos que codifica uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou de um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA. A presente invenção também tem por objecto um vector compreendendo o referido ácido nucleico. A presente invenção tem ainda por objecto um vector composto por uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada e uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve, em que as referidas cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo ou de um seu fragmento se ligam especificamente a FcyRIIB com uma afinidade maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se ligam a FcyRIIA. Numa modalidade específica, o referido vector é um vector de expressão. A presente invenção ainda tem por objecto células hospedeiras contendo os vectores ou polinucleótidos codificando os anticorpos da presente invenção. De preferência, a presente invenção engloba polinucleótidos que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos produzidos pelos clones de hibridoma depositados, com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente ou partes dele, por exemplo, RDC (regiões de determinação de complementaridade), domínios variáveis, etc. A presente invenção ainda tem por objecto processos para a produção dos anticorpos da presente invenção ou dos seus fragmentos. Os anticorpos aqui descritos ou os seus fragmentos podem ser produzidos por qualquer processo conhecido na técnica para a produção de anticorpos, em particular, pela secreção de células de hibridoma de cultura, síntese química ou por técnicas de expressão 26 recombinante conhecidas na técnica. Numa modalidade especifica, a presente invenção tem por objecto um processo para produzir, de forma recombinante, um anticorpo especifico de FcyRIIB, em que o referido processo compreende: (i) a cultura, em condições adequadas para a expressão dos referidos anticorpos num meio, uma célula hospedeira que contém uma molécula de um primeiro ácido nucleico, operacionalmente ligados a um promotor heterólogo e um segundo ácido nucleico ligado operacionalmente ao mesmo promotor heterólogo ou a promotor heterólogo diferente, em que os referidos primeiro ácido nucleico e segundo ácido nucleico codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve, respectivamente, de um anticorpo ou de um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA; e (ii) a recuperação do referido anticorpo do referido meio.

De preferência, os anticorpos aqui descritos são anticorpos monoclonais e, mais preferencialmente, são anticorpos humanizados ou humanos. Numa modalidade especifica, os anticorpos ligam-se ao domínio extracelular da FcyRIIB humana. Numa outra modalidade específica, os anticorpos reconhecem especificamente ou selectivamente um ou mais epítopos de FcyRIIB. Outra modalidade da presente invenção engloba o uso da tecnologia de exibição de fagos para aumentar a afinidade dos anticorpos aqui descritos, para FcyRIIB. Qualquer processo de triagem conhecido na técnica pode ser usado para identificar anticorpos mutantes com uma avidez aumentada para FcyRIIB (por exemplo, ELISA) . Numa outra modalidade específica, os anticorpos são 27

rastreados utilizando ensaios de rastreio de anticorpos bem conhecidos na técnica (por exemplo, ensaios BIACORE) para identificar anticorpos com uma taxa de Koff inferior a 3xlCT A presente invenção abrange o uso dos anticorpos aqui descritos para detectar especificamente a presença de FcyRIIB (ou seja, FcyRIIB e não FcyRIIA) numa amostra biológica. A activação e os receptores inibidores de Fc, por exemplo, FcyRIIA e FcyRIIB são críticos para a função equilibrada destes receptores e as próprias respostas imunitárias celulares. A descrição engloba o uso dos anticorpos aqui descritos para o tratamento de qualquer doença relacionada com a perda desse equilíbrio e o controlo regulado nas vias de sinalização do receptor de Fc. Assim, os anticorpos de FcyRIIB da presente invenção têm usos na regulação da resposta imunitária, por exemplo, na inibição da resposta imunitária em conexão com doenças auto-imunes ou inflamatórias ou respostas alérgicas. Os anticorpos de FcyRIIB da presente invenção podem também ser usados para alterar certas funções efectoras para melhorar, por exemplo, a citotoxicidade terapêutica mediada por anticorpos.

Os anticorpos aqui descritos são úteis para prevenção ou o tratamento de cancro, por exemplo, numa modalidade, como uma terapêutica com um único agente. Numa modalidade, os anticorpos são úteis para a prevenção ou o tratamento de células Β malignas, principalmente linfoma não Hodgkin ou leucemia linfocítica crónica. Noutra modalidade, os anticorpos são úteis para a prevenção ou o tratamento de cancro, particularmente potenciando a actividade citotóxica 28 de anticorpos terapêuticos específicos do antigénio do cancro com actividade citotóxica para aumentar a morte da célula tumoral e/ou para aumentar a actividade citotóxica celular dependente do anticorpo (CCDA, em inglês "ADCC"), a actividade citotóxica dependente do complemento ("CDC") ou a fagocitose dos anticorpos terapêuticos. A presente invenção providencia um processo de tratamento do cancro num doente com um cancro caracterizado por um antigénio do cancro, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um primeiro anticorpo ou de um fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se ligam a FcyRIIA e um segundo anticorpo que se liga especificamente ao referido antigénio do cancro e é citotóxico. A presente invenção também tem por objecto um processo de tratamento do cancro num doente com um cancro caracterizado por um antigénio do cancro, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um anticorpo ou de um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA, cujo domínio constante tem ainda uma afinidade maior para um ou mais receptores de activação de Fc, quando o anticorpo é monomérico, tal como FcyRIIA e um anticorpo que se liga especificamente ao referido antigénio do cancro e é citotóxico. Numa modalidade particular, o referido receptor de activação de Fc é FcyRIIA.

Noutra modalidade, a presente invenção providencia um processo para aumentar o efeito citotóxico mediado por um anticorpo num indivíduo a ser tratado com um anticorpo citotóxico, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de um anticorpo aqui 29 descrito ou de um seu fragmento, numa quantidade suficiente para aumentar a efeito citotóxico do referido anticorpo citotóxico. Ainda noutra modalidade, a presente invenção providencia um processo para aumentar o efeito citotóxico mediado por um anticorpo num indivíduo a ser tratado com um anticorpo citotóxico, em que o referido processo compreende a administração ao referido doente, de um anticorpo aqui descrito ou de um seu fragmento, tendo ainda uma afinidade aumentada para um receptor de activação de Fc, quando monomérico, numa quantidade suficiente para aumentar a efeito citotóxico do referido anticorpo citotóxico. Ainda noutra modalidade, a presente invenção tem por objecto um processo que compreende ainda a administração de uma ou mais terapêuticas adicionais contra o cancro. A presente invenção ainda tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende (i) uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, do anticorpo ou de um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA; e (ii) um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção tem por objecto, adicionalmente, uma composição farmacêutica que compreende (i) uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, do anticorpo ou de um seu fragmento que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA; (ii) um anticorpo citotóxico que se liga especificamente a um antigénio do cancro; e (iii) um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com qualquer anticorpo terapêutico que medeia seu efeito terapêutico por meio da morte celular 30 para potenciar a actividade terapêutica do anticorpo. Numa modalidade particular, os anticorpos potenciam a actividade terapêutica do anticorpo por meio do aumento da função efectora mediada pelo anticorpo. Noutra modalidade da presente invenção, os anticorpos potenciam a actividade terapêutica de anticorpos citotóxicos por aumento da fagocitose e da opsonização das células tumorais-alvo. Ainda noutra modalidade, os anticorpos potenciam a actividade terapêutica do anticorpo, pelo aumento da citotoxicidade mediada por células dependentes dos anticorpos ("CCDA") na destruição das células tumorais-alvo .

Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos, em combinação com um anticorpo terapêutico que não medeia seu efeito terapêutico por meio da morte celular para potenciar a actividade terapêutica do anticorpo. Numa modalidade especifica, a presente invenção abrange o uso de anticorpos em combinação com um anticorpo terapêutico que induz a apoptose com actividade agonisitca, por exemplo, um anticorpo anti-Fas. Os anticorpos terapêuticos que induzem a apoptose podem ser específicos para qualquer receptor de morte conhecido na técnica para a regulação da via da apoptose, por exemplo, o elemento da família dos receptores RFNT. A presente invenção abrange a utilização dos anticorpos aqui descritos para bloquear a progressão das células do tumor e as metástases mediadas por macrófagos. Os anticorpos são particularmente úteis no tratamento de tumores sólidos, quando ocorre infiltração de macrófagos. Os anticorpos antagonistas são particularmente úteis para controlar, por exemplo, a redução ou a eliminação, das metástases das células tumorais, por meio da redução ou a 31 eliminação da população de macrófagos que estão localizados no local do tumor. A presente invenção ainda engloba anticorpos que destroem ou eliminam eficazmente células efectoras imunitárias para além dos macrófagos que expressam FcyRIIB, por exemplo, células dendríticas. A depleção ou a eliminação eficaz das células efectoras imunitárias, usando os anticorpos da presente invenção, podem variar desde uma redução, na população de células efectoras, de 50 %, 60 % , 70 %, 80 %, de preferência, de 90 % e, ainda mais preferencialmente, de 99 %.

Nalgumas modalidades, os anticorpos agonistas aqui descritos são particularmente úteis para o tratamento de tumores de origem não hematopoiética, incluindo tumores de células de melanoma. Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com anticorpos terapêuticos que se ligam imuno-especificamente aos antigénios do tumor que não são expressos nas próprias células do tumor, mas antes na envolvente reactiva que apoia o tumor, células não malignas compreendendo o estroma tumoral. Numa modalidade preferida, utiliza-se um anticorpo aqui descrito em combinação com um anticorpo que se liga imuno-especificamente a um antigénio do tumor numa célula de fibroblastos, por exemplo, a proteína de activação dos fibroblastos (PAF). A presente invenção providencia um processo para tratar uma doença auto-imune num doente que dele necessite, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais anticorpos aqui descritos. A presente invenção também tem por objecto um processo para tratar uma doença auto-imune num doente que dele necessite, em que o referido processo compreende a administração, ao 32 referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais agentes anti-inflamatórios e/ou um ou mais agentes imuno-moduladores. A presente invenção também tem por objecto um processo para tratar uma doença inflamatória num doente que dele necessite, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais anticorpos aqui descritos. A presente invenção também tem por objecto um processo para tratar uma doença inflamatória num doente que dele necessite, em que o referido processo compreende ainda a administração, ao referido doente, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais agentes anti-inf lamatórios e/ou um ou mais agentes imuno-moduladores. A presente invenção tem por objecto um processo para aumentar uma resposta imunológica de uma composição de vacina num indivíduo, em que o referido processo compreende a administração, ao referido indivíduo, de um anticorpo ou de um seu fragmento, que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA e uma composição de uma vacina, de modo que o referido anticorpo ou um seu fragmento seja administrado, numa quantidade eficaz, para melhorar a resposta imunológica à referida composição de vacina no referido indivíduo. Os anticorpos aqui descritos podem ser usados para melhorar uma resposta humoral e/ou mediada por células contra o antigénio (s) da composição da vacina. Os anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com qualquer vacina conhecida na técnica. A presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos para prevenir ou tratar uma doença particular, em que uma 33 resposta imunitária aumentada, contra um antigénio em particular ou contra antigénios, é eficaz para tratar ou prevenir a doença ou o distúrbio. A presente invenção também tem por objecto um processo para melhorar a terapêutica imunológica para um agente infeccioso em que os anticorpos aqui descritos são administrados a um doente que já está infectado por um agente patogénico, tal como VIH ou VSH, para melhorar a opsonização e a fagocitose das células infectadas. A presente invenção tem por objecto um processo de tratamento de doenças com sinalização mediada por uma apoptose deficiente, por exemplo, cancro e doenças auto-imunes. Numa modalidade especifica, a presente invenção engloba um processo para tratar uma doença com apoptose deficiente mediada por Fas, compreende a administração de um anticorpo aqui descrito em combinação com um anticorpo anti-Fas.

Noutra modalidade, a presente invenção tem por objecto um processo de diagnóstico de uma doença auto-imune num indivíduo, compreendendo: (i) o contacto de uma amostra biológica do referido indivíduo com uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção e (ii) a detecção da ligação do referido anticorpo ou de um seu fragmento, em que a detecção do referido marcador detectável, acima de um nível inicial ou de um nível padrão, indica que o referido indivíduo tem uma doença auto-imune. A presente invenção também tem por objecto um processo para tratar ou prevenir uma doença alérgica mediada por IgE num doente que disso necessite, em que o referido processo compreende a administração, ao referido doente, de uma 34 quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, dos anticorpos agonistas aqui descritos. A presente invenção também tem por objecto um processo para tratar ou prevenir uma doença alérgica mediada por IgE num doente que disso necessite, compreendendo a administração, ao referido doente, dos anticorpos aqui descritos em combinação com outros anticorpos terapêuticos ou composições de vacinas usadas para o tratamento ou a prevenção de distúrbios alégicos mediados por IgE.

3.1 DEFINIÇÕES

Tal como se utiliza aqui, a expressão "que se liga especificamente a FcyRIIB" e termos análogos referem-se a anticorpos ou aos seus fragmentos que especificamente se ligam a FcyRIIB" ou a um seu fragmento e não se ligam especificamente a outros receptores de Fc, em particular a FcyRIIA. Além disso, é entendido, por um especialista na matéria, que um anticorpo que se liga especif icamente a FcyRIIB pode ligar-se através do domínio variável ou do domínio constante do anticorpo. Se o anticorpo que se liga especificamente a FcyRIIB, se liga através do seu domínio variável, um especialista na matéria entenderá que não está agregado, ou seja, é monomérico. Um anticorpo que se liga especificamente a FcyRIIB pode ligar-se a outros péptidos ou polipéptidos com menor afinidade, como determinado, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outros ensaios conhecido na técnica. De preferência, os anticorpos ou os fragmentos que se ligam especificamente a FcyRIIB ou a um seu fragmento não reticulam com outros antigénios. Os anticorpos ou fragmentos que se ligam especificamente a FcyRIIB podem ser identificados, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore ou outras técnicas conhecidas pelos especialistas nesta técnica. Um anticorpo ou um seu 35 fragmento liga-se especificamente a uma FcyRIIB quando se liga a FcyRIIB com uma maior afinidade do que qualquer antigénio reticulado, conforme determinado utilizando técnicas experimentais, tais como "western blots", radioimunoensaios (RIA) e ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA) . Ver, por exemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, segunda edição, Raven Press, New York nas páginas 332-336 para uma discussão acerca da especificidade do anticorpo.

Tal como usados aqui, os termos "anticorpo" e "anticorpos" referem-se a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecificos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos, anticorpos camelizados, cadeia única de Fvs (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')f Fvs ligados por dissulfureto (sdFv), intracorpos e anticorpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id e anticorpos anti-anti-Id para anticorpos da presente invenção) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer uma das situações anteriores. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos activos sob o ponto de vista imunológico de moléculas de imunoglobulinas, ou seja, moléculas que contêm um sitio de ligação do antigénio. As moléculas de imunoglobulinas podem ser de qualquer tipo, (por exemplo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , classe (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasse.

Tal como se usa aqui, o termo "derivado", no contexto doa polipéptidos ou das proteínas refere-se a um polipéptido ou a uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tenham sido alterados pela introdução de substituições, supressões ou adições de resíduos de 36 conforme usado neste aminoácidos. 0 termo "derivado", documento, também se refere a um polipéptido ou a uma proteína que tenha sido modificado, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipéptido ou à proteína. Por exemplo, mas não a título de limitação, um anticorpo pode ser modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos conhecidos de proteção/ bloqueio, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou a outra proteína, etc. Um polipéptido ou uma proteína derivados podem ser produzidos por modificações químicas utilizando técnicas conhecidas dos especialistas na matéria, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, um polipéptido ou uma proteína derivados possuem uma função similar ou idêntica à do polipéptido ou da proteína dos quais derivaram.

Tal como usado aqui, o termo "derivado", no contexto de um derivado não proteico, refere-se a uma segunda molécula orgânica ou inorgânica que é formada com base na estrutura de uma primeira molécula orgânica ou inorgânica. Um derivado de uma molécula orgânica inclui, mas não se limita a uma molécula modificada, por exemplo, pela adição ou supressão de um grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo ou amina. Uma molécula orgânica também pode ser esterifiçada, alquilada e/ou fosforilada.

Tal como se utiliza aqui, os termos "distúrbio" e "doença" são usados intermutavelmente para se referir a um estado clínico num indivíduo. Em particular, a expressão "doença auto-imune" é usada de forma intermutável com a expressão "distúrbio auto-imune" para se referir a um 37 estado clínico num indivíduo caracterizada por uma lesão celular, de um tecido ou de um órgão causada por uma reação imunológica do indivíduo às suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. A expressão "doença inflamatória" é usada de forma intermutável com a expressão "distúrbio inflamatório" para se referir a um estado clínico, num indivíduo, caracterizado por inflamação, de preferência inflamação crónica. As doenças auto-imunes podem ou não estar associadas com a inflamação. Além disso, a inflamação pode ou não ser causada por doenças auto-imunes. Assim, certos distúrbios podem ser caracterizados tanto como distúrbios auto-imunes como distúrbios inflamatórios.

Tal como usado aqui, o termo "cancro" refere-se a uma neoplasia ou a um tumor resultante do crescimento descontrolado e anormal de células. Tal como usado aqui, cancro inclui, explicitamente, leucemias e linfomas. Nalgumas modalidades, cancro refere-se a um tumor benigno, que permaneceu localizado. Noutras modalidades, cancro refere-se a um tumor maligno, que invadiu e destruiu as estruturas do corpo vizinhas e se espalhou para locais distantes. Nalgumas modalidades, o cancro está associado a um antigénio específico do cancro.

Tal como usado aqui, a expressão "agente imuno-regulador" e as suas variações, inclui mas não se limita a agentes imunomoduladores, referem-se a um agente que modula o sistema imunitário do hospedeiro. Em certas modalidades, um agente imunomodulador é um agente imunossupressor. Nalgumas modalidades, um agente imunomodulador é um agente imuno-estimulador. Agentes imunomoduladores incluem, mas não se limitam a moléculas pequenas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas inorgânicas, agentes miméticos e moléculas orgânicas. 38

Tal como usado aqui, o termo "epítopo" refere-se a um fragmento de um polipéptido ou de uma proteína com actividade antigénica ou imunogénica num animal, de preferência num mamífero e, mais preferivelmente, num ser humano. Um epítopo com actividade imunogénica é um fragmento de uma proteína ou de um polipéptido que provoca uma resposta do anticorpo num animal. Um epítopo com actividade antigénica é um fragmento de um polipéptido ou de uma proteína a que um anticorpo se liga immunoespecificamente conforme determinado por qualquer processo conhecido de um especialista na matéria, por exemplo, imunoensaios. Os epítopos antigénicos não precisam, necessariamente, de ser imunogénicos.

Tal como usado aqui, o termo "fragmento" refere-se a um péptido ou a um polipéptido ( compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 10 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 15 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 20 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 25 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 40 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 50 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 60 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 70 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 80 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 90 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 100 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 125 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 150 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 75 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 200 resíduos contíguos de aminoácidos ou em pelo menos 250 resíduos contíguos de 39 aminoácidos da sequência de aminoácidos de outro polipéptido. Numa modalidade especifica, um fragmento de um polipéptido retém pelo menos uma função do polipéptido.

Tal como usadas aqui, as expressões "ácidos nucleicos" e "sequências de nucleótidos" incluem moléculas de ADN (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) , moléculas de ARN (por exemplo, ARNm) , combinações de moléculas de ADN e ARN ou moléculas híbridas de ADN/ARN e os análogos de moléculas de ADN ou de ARN. Esses análogos podem ser gerados utilizando, por exemplo, análogos de nucleótidos, que incluem, mas não não se limitam a inosina ou bases tritiladas. Esses análogos podem igualmente incluir moléculas de ADN ou de ARN compreendendo estruturas modificadas que conferem atributos benéficos às moléculas, tais como, por exemplo, resistência a nuclease ou uma maior capacidade de atravessar as membranas celulares. Os ácidos nucleicos ou as sequências de nucleótidos podem ser de hélice simples, de hélice dupla, podem conter porções de hélice simples e de hélice dupla e podem conter porções de hélice tripla mas, de preferência, são ADN de hélice dupla.

Tal como usada aqui, uma "quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico" refere-se à quantidade de agente terapêutico suficiente para tratar uma doença ou um distúrbio associados a FcyRIIB e qualquer doença relacionada com a perda de regulação na via de sinalização do receptor de Fc ou para melhorar a eficácia terapêutica de um outro tratamento, por exemplo, anticorpos terapêuticos, terapia de vacinas, etc. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico pode referir-se à quantidade de agente terapêutico suficiente para retardar ou minimizar o aparecimento da doença, por exemplo, atrasar ou minimizar a propagação do cancro. A quantidade eficaz 40 sob o ponto de vista terapêutico também pode referir-se à quantidade de agente terapêutico que proporciona um beneficio terapêutico no tratamento de uma doença. Além disso, uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, no que diz respeito a um agente terapêutico da presente invenção significa que a quantidade de agente terapêutico, sozinho ou em combinação com outras terapias, que providenciam um beneficio terapêutico no tratamento de uma doença, por exemplo, suficiente para melhorar a eficácia terapêutica de um anticorpo terapêutico suficiente para tratar uma doença. Usado em conjunto com uma quantidade de anticorpo de FcyRIIB aqui descrito, o termo pode englobar uma quantidade que melhora a terapia em geral, reduz ou evita efeitos indesejáveis ou aumenta a eficácia terapêutica ou sinergias com outro agente terapêutico.

Tal como usados aqui, os termos "agente profiláctico" e "agentes profilácticos" referem-se a qualquer agente (s) que pode ser usado na prevenção de uma doença ou na prevenção da recorrência ou na disseminação de uma doença. Uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista profiláctico, pode referir-se à quantidade de agente profiláctico suficiente para prevenir a recorrência ou a disseminação de doenças hiperproliferativas, particularmente cancro ou a ocorrência de tais doenças num doente, incluindo, mas não se limitando a pessoas predispostas a doenças hiperproliferativas, por exemplo, os geneticamente predispostos para o cancro ou previamente expostos a agentes cancerígenos. Uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista profiláctico também se pode referir à quantidade de agente profiláctico que proporciona um benefício profiláctico no tratamento de uma doença. Além disso, uma quantidade eficaz sob o ponto de vista profiláctico, no que respeita a um 41 agente profiláctico da presente invenção, significa que a quantidade de agente profilático isoladamente ou em combinação com outros agentes, que providencia um beneficio profiláctico na prevenção da doença. Usado em ligação com uma quantidade de um anticorpo FcyRIIB aqui descrito, o termo pode englobar uma quantidade que melhora a profilaxia em geral ou aumenta a eficácia profiláctica ou as sinergias com outro agente profiláctico, tal como, mas não se limitando a um anticorpo terapêutico. Tal como usados aqui, os termos "prevenir" e "prevenção" referem-se à prevenção da recidiva ou ao aparecimento de um ou mais sintomas de um distúrbio num indivíduo, resultantes da administração de um agente profiláctico ou terapêutico.

Tal como usado aqui, o termo "em combinação" refere-se ao uso de mais de um agentes profiláctico e/ou terapêutico. 0 uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que os agentes profilácticos e/ou terapêuticos são administrados a um indivíduo com um distúrbio. Pode-se administrar, a um indivíduo com um distúrbio, um primeiro agente profiláctico ou terapêutico antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente ou subsequentemente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) à administração de um segundo agente profiláctico ou terapêutico, a um indivíduo com um distúrbio. 42

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGURA 1: Ligação directa do anticorpo produzido a partir do clone 3H7 a FcyRIIB e FcyRIIA. A A ligação directa dos anticorpos de algumas das culturas de hibridomas aos FcyRII foi comparada com um anticorpo anti-FcylI comercialmente disponível, num ensaio por ELISA, em que a placa foi revestida com os receptores. Incubaram-se, na placa, diferentes diluições (1:10) dos sobrenadantes. Os anticorpos ligados foram detectados com um anticorpo de cabra, anti-murganho conjugado com PRS e a densidade óptica foi monitorizada a 650 nm. B A ligação directa do anticorpo da cultura de hibridoma 3H7 (sobrenadante n. 7 da figura IA) , na forma impura (painel esquerdo) e purificada (painel direito), a FcyRIIA e FcylIB foram comparadas utilizando o mesmo ensaio de ELISA que em IA. FIGURA 2: Comparação da ligação a FcyRIIB do anticorpo produzido a partir do hibridoma 3H7 e da IgG humana agregada biotinilada. A capacidade do anticorpo 3H7 para competir com IgG humana agregada biotinilada na ligação a FcyRIIB foi medida usando uma experiência de bloqueio por meio de ELISA. A placa de ELISA revestida com FcylIB foi incubada com o sobrenadante contendo o anticorpo 3H7 e com um sobrenadante das mesmas células de hibridoma, mas não contendo o anticorpo (controlo negativo). 43

Adicionaram-se então, à placa, diferentes diluições (1:3) partindo de 2 00 ng/poço de IgG humana biotinilada e agregada e os agregados ligados foram detectados com um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre, a reação foi desenvolvida com TMB e a densidade óptica foi monitorizada a 650 nm. FIGURA 3: Comparação da ligação directa do anticorpo 3H7 a FcyIIB produzida num sistema bacteriano ou de mamíferos. A ligação directa do anticorpo 3H7 a FcyIIB foi medida usando um ensaio de ELISA. Comparou-se a ligação a FcyIIB produzida numa bactéria ou num mamífero. A titulação do anticorpo iniciou-se directamente do sobrenadante seguida de diluições a 1:10. O anticorpo ligado foi detectado com um anticorpo de cabra, anti-murganho, conjugado com PRS (peroxidase de rábano-silvestre) , a reacção foi desenvolvida com TMB e a densidade óptica foi monitorizada a 650 nm. FIGURA 4: Ligação directa do anticorpo 3H7 a FcyIIB, FcyIIB e FcyIIB. A ligação directa do anticorpo 3H7 purificado a FcyIIB, FcyIIB and FcyIIB, expressa num sistema de mamíferos foi comparada através do ensaio por ELISA. A placa de ELISA foi revestida com os três receptores (100 ng/poço). Diferentes diluições do anticorpo 3H7 purificado foram incubadas na placa revestida. Utilizou-se um anticorpo de cabra anti-murganho, conjugado com PRS para a detecção da 44 ligação especifica do anticorpo, a reacção foi desenvolvida com TMB e a densidade óptica foi monitorizada a 650 nm. FIGURA 5: Comparação da capacidade de ligação directa a FcyIIB e FcyIIB do anticorpo purificado a partir do clone 2B6 com outros três anticorpos monoclonais, disponíveis comercialmente, contra FcyRII. A ligação do anticorpo 2B6 a FcyIIB (painel superior direito) e a FcyIIB (painel superior esquerdo) é comparada com a de outros três anticorpos, disponíveis no mercado, produzidos em função de FcyIIB. O formato de ELISA utilizado é o mesmo que foi descrito na figura 4. FIGURA 6: Competição na ligação a FcyIIB do anticorpo produzido a partir de clone 2B6 e IgG humana agregada biotinilada.

Painel A A capacidade do anticorpo presente no sobrenadante do clone 2B6 para competir pela ligação a FcyRIIB com IgG humana agregada biotinilada foi medida usando uma experiência de bloqueio por ELISA. Comparou-se a capacidade de competição do anticorpo 2B6 com a de um sobrenadante negativo de hibridoma e com a de anticorpo 3H7.

Incubou-se uma placa de ELISA revestida com FcyRIIB com diferentes diluições (1:10) dos sobrenadantes. Depois daa lavagens a placa foi incubada com uma quantia fixa de IgG humana agregada biotinilado (1 mg/poço) e os agregados ligados foram detectados com o conjugado de estreptavidina-PRS. A reacção 45 foi desenvolvida com TMB e a densidade óptica foi monitorizada a 650 nm.

Painel B descrito no painel A, com o anticorpo 2B6 purificado e os dados de uma concentração do anticorpo de bloqueio utilizado (4 mg/poço) foram representados num diagrama de barras. 2B6 para bloquear a IgG humana agregada que se liga a FcyIIB foi comparada com o controlo do isotipo de IgGl de rato. FIGURA 7: Competição do anticorpo 2B6 e de IgG humana agregada biotinilada na ligação a FcyIIB usando um ensaio de coloração dupla por meio de SCAF.

Realizou-se um ensaio de SCAF de dupla coloração para caracterizar o anticorpo 2B6 usando células de 0HC-K1 que tinham sido estavelmente transfectadas com FcyIIB de comprimento completo, de mamífero.

Painel A

As células transfectantes foram coradas com o controlo do isotipo de IgGl de rato seguido de um anticorpo de cabra anti-rato conjugado com FITC e estreptavidina-PE.

Painel B

As células transfectantes foram coradas com IgG humana agregada biotinilada depois de terem sido coradas com o controlo de isotipo de IgGl de rato e marcadas com um anticorpo de cabra anti-rato conjugado com FITC para detectar o anticorpo monoclonal ligado e com o conjugado de estreptavidina-PE para detectar os agregados ligados. 46

Painel C

As células foram coradas com o anticorpo 2B6, o anticorpo foi removido por lavagens e as células foram incubadas com IgG humana agregada biotinilada. As células foram lavadas e marcadas com um anticorpo de cabra anti-rato conjugado com FITC para detectar o anticorpo monoclonal ligado e com o conjugado de estreptavidina-PE para detectar os agregados ligados. FIGURA 8: Anticorpos monoclonais anti-FcYlIB e CD20 co-coradas com linfócitos B humanos.

Coraram-se células de sangue humano ("camada de células brancas") com anticorpo anti-CD20 conjugado com FITC, para selecionar a população de linfócitos B, assim como 3H7 e2B6. Os anticorpos anti-FcYlIB ligados foram detectados com um anticorpo de cabra anti-rato conjugado com PE. A. As células foram co-corados com o anticorpo anti-CD20-FITC e o controlo do isotipo de IgGl de rato. B. As células foram co-corados com o anticorpo anti-CD20-FITC e o anticorpo 3H7. B. As células foram co-corados com o anticorpo anti-CD20-FITC e o anticorpo 2B6. FIGURA 9: Coloração de células de OHC expressando FcyIIB. A. As células de OHC/IIB foram coradas com o controlo do isotipo de IgGl de rato (painel esquerdo) e o anticorpo 3H7 (painel direito). 47 B. As células de OHC/IIB foram coradas com o controlo do isotipo de IgGl de rato (painel esquerdo) e do anticorpo 2B6 (painel direito) Os anticorpos ligados às células foram marcados com um anticorpo de cabra anti-rato conjugado com PE. FIGURA 10: Ensaio de libertação de β-hexaminidase. A. Representação esquemática do ensaio de libertação de β-hexaminidase. Os transfectantes que expressam FcyIIB humana foram sensibilizados com IgE de ratos e receberam um reforço de fragmentos de F(ab')2 de IgG policlonal de cabra anti-rato para agregar FcsRI. A reticulação ocorre por causa da capacidade do anticorpo monoclonal para reconhecer a cadeia leve do anticorpo IgE de murino ligado a FcsRI. Os transfectantes sensibilizados com IgE de murino e pré-incubados com o anticorpo 2B6 também foram reforçados com fragmentos de F(ab')2 de uma IgG policlonal de cabra anti-rato para reticular FcsRI a FcyIIB. B. A libertação de β-hexoaminidase induzida por F(ab)2 de cabra anti-rato em células de RBL-2H3 que expressam FcyIIB humana. A actividade de libertação de β-hexosaminidase é expressa em percentagem da actividade libertada em relação à actividade total. FIGURA 11: As linhas de células de carcinoma do ovário e da mama expressam Her2/neu a níveis variados. A coloração de A) IGROV-1 do ovário com ch4D5 purificado, B) OVCAR-8 de ovários com anticorpo 4D5 48 purificado e C) As células SKBR-3 de cancro da mama com ch4D5 purificado seguido de ficoeritrina (PE) conjugada com anticorpo anti-humano de cabra. A IgGl de controlo do isotipo relevante está indicada à esquerda da coloração com anticorpos anti-Her2neu. FIGURA 12: Os monócitos purificados expressam todas as FcyRs: A. MDM obtida do dador 1, B. MDM obtida do dador 2/ propagada em soro humano ou soro humano e FEC-GM (factor de estimulação de granulócitos e macrófagos) . C. Monócitos descongelados e corados imediatamente. Os macrófagos derivados de monócitos foram corados com anticorpos específicos para o receptor de FcyIIB humana. 0 histograma do sólido em cada gráfico representa a coloração de fundo. 0 histograma claro, dentro de cada painel, representa a coloração com anticorpos anti-humanos específicos de FcyIIB.

FIGURA 13: Ch4D5 medeia CCDA eficazmente com linhas de células de cancro do ovário e da mama usando CMSP (células mononucleares de sangue periférico, em inglês PBMC) . A lise específica subtraída da lise independente do anticorpo está ilustrada para A) linha de células de tumor do ovário, IGROV-1 numa proporção de efector: alvo de 75:1 e para B) linha celular de tumor de mama SKBR-3 numa proporção efector:alvo de 49 50:1 com concentração diferente de ch4D5, conforme indicado. FIGURA 14 A coloração histoquímica de ascites de ovário humano mostra células de tumores e outras células inflamatórias. A) . Coloração com Η & E de ascites de uma doente com tumor do ovário. Podem ser identificadas três células neoplásicas pelo tamanho e forma irregulares, citoplasma espalhado e núcleo denso irregular. B) . Coloração com Giemsa de ascites não transformadas de uma doente com tumor seroso do ovário mostra duas células mesoteliais colocadas costas com costas indicadas por setas curtas. Também se mostra um agregado de cinco células epiteliais malignas indicado pela seta longa. São visíveis eritrócitos em segundo plano. C) . Coloração com Giemsa de outra doente com tumor seroso do ovário indica um agregado de células composto por células mesoteliais, linfócitos e células epiteliais neoplásicas (seta).

5. DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS

5.1 ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE FcyIIB A presente invenção abrange anticorpos (de preferência anticorpos monoclonais) ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a FcyIIB, de preferência a FcyIIB humana, mais preferencialmente a FcyIIB endógena humana com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam a FcYlIa, de preferência, 50

FcyIIB humana, mais preferencialmente FcyIIB humana endógena. Preferencialmente os anticorpos aqui descritos ligam-se ao domínio extracelular da FcyIIB humano endógena. Em certas modalidades, os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos ligam-se a FcyIIB com uma afinidade duas vezes, quatro vezes, 6 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 104 vezes, 105 vezes, 106 vezes, 107 vezes ou 108 vezes maior do que a que os referidos anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam a FcyRIIA. Numa modalidade particular, o anticorpo é um anticorpo monoclonal de rato produzido pelo clone 2B6 ou 3H7, com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. Os hibridomas que produzem os anticorpos da presente invenção foram depositados, em 13 de Agosto de 2002, na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110) , de acordo com as disposições do Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Fins dos Procedimentos de Patentes e aos quais foram atribuídos os números de acesso PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. Numa modalidade específica, a presente invenção engloba um anticorpo com a cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N ° 2 e a cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 4. Numa modalidade preferida, os anticorpos aqui descritos são humanos ou foram humanizadas, de preferência uma versão humanizada do anticorpo produzido pelo clone 3H7 ou 2B6. Ainda noutra modalidade preferida, os anticorpos aqui descritos ainda não se ligam aos receptores de activação de Fc, por exemplo, FcyIIIA, FcyIIIB, etc.

Numa modalidade particular, os anticorpos aqui descritos ou os fragmentos dos mesmos agonizam em pelo menos uma actividade de FcyIIB. Numa modalidade, a referida 51 actividade é a inibição da sinalização mediada pelo receptor de células B. Noutra modalidade, os anticorpos agonistas aqui descritos inibem a activação de células B, a proliferação de células B, a produção de anticorpos, o influxo de cálcio intracelular das células B, a progressão do ciclo celular ou a actividade de uma ou mais moléculas de sinalização a jusante na via de transdução de sinal de FcyIIB. Ainda noutra modalidade, os anticorpos agonistas aumentam a fosforilação de FcyIIB ou o recrutamento de SHIP. Numa outra modalidade, os anticorpos agonistas inibem a actividade da cinase MAP ou o recrutamento de Akt na via de sinalização mediada pelo receptor de células B. Noutra modalidade, os anticorpos agonistas agonizam a inibição, mediada por FcyRIIB, da sinalização de FcsRI. Numa modalidade particular, os referidos anticorpos inibem a activação de mastócitos induzida por Fcsl, a mobilização de cálcio, a desgranulação, a produção de citocinas ou a libertação de serotonina. Noutra modalidade, os anticorpos agonistas estimulam a fosforilação de FcyIIB, estimulam o recrutamento de SHIP, estimulam a fosforilação de SHIP e sua associação com Shc ou inibem a activação de membros da família das cinases MAP (por exemplo, Erkl, Erk2,lNK, p38, etc. ) . Ainda noutra modalidade, os anticorpos agonista aumentam a fosforilação de tirosina de p62dok e a sua associação com SHIP e rasGAP. Noutra modalidade, os anticorpos agonistas inibem a fagocitose mediada por FcyR em monócitos ou macrófagos.

Noutra modalidade, os anticorpos aqui descritos ou os fragmentos dos mesmos antagonizam pelo menos uma actividade de FcyIIB. Numa modalidade, a referida actividade é a activação da sinalização mediada pelo receptor de células B. Numa modalidade particular, os anticorpos antagonistas aumentam a actividade das células B, a proliferação das 52 células B, produção de anticorpos, o influxo de cálcio intracelular ou actividade de uma ou mais moléculas de sinalização a jusante na via de transdução de sinal de FcyRIIB. Ainda noutra modalidade particular, os anticorpos antagonistas diminuem a fosforilação de FcyRIIB ou o recrutamento de SHIP. Numa outra modalidade, os anticorpos antagonistas aumentam a actividade da cinase MAP ou o recrutamento de Akt na via de sinalização mediada pelo receptor de células B. Noutra modalidade, os anticorpos antagonistas antagonizam a inibição, mediada por FcyRIIB, da sinalização de FcsRI. Numa modalidade particular, os anticorpos antagonistas aumentam a activação de mastócitos induzida por FcsRI, a mobilização de cálcio, a desgranulação, a produção de citocinas ou a libertação de serotonina. Noutra modalidade, os anticorpos antagonistas inibem a fosforilação de FcyIIB, inibem o recrutamento de SHIP, inibem a fosforilação de SHIP e sua associação com Shc, aumentam a activação de membros da família das cinases MAP (por exemplo, Erkl, Erk2, JNK, p38, etc.). Ainda noutra modalidade, os anticorpos antagonistas inibem a fosforilação de tirosina de p62dok e a sua associação com SHIP e rasGAP. Noutra modalidade, os anticorpos antagonistas aumentam a fagocitose mediada por FcyR em monócitos ou macrófagos. Noutra modalidade, os anticorpos antagonistas evitam a fagocitose, a depuração de partículas opsonizadas por macrófagos esplénicos.

Os anticorpos aqui descritos não se limitam a anticorpos monoclonais, anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos recombinantemente, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos camelizados, de cadeia única Fvs (scFv), anticorpos de cadeia única. Fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs (sdFv) ligados a bisulfureto, 53 intracorpos e fragmentos que se ligam a epítopos de qualquer um dos anteriores. Em particular, os anticorpos utilizados nos processos aqui descritos incluem moléculas de imunoglobulinas e porções activas, sob o ponto de vista imunológico, de moléculas de imunoglobulinas, ou seja, moléculas que contêm um sitio de ligação do antigénio que se liga imunoespecificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que a referida molécula de imunoglobulina se liga a FcyRIIB.

Os anticorpos utilizados nos processos aqui descritos podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos (por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, murinos, burros, ovelhas, coelhos, cabras, cobaias, camelos, cavalos ou galinhas). De preferência, os anticorpos são anticorpos monoclonais humanos ou humanizados. Tal como se utiliza aqui, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que comportam a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou bibliotecas de imunoglobulina humana sintética que codificam sequências ou de ratos que expressam anticorpos de genes humanos.

Os anticorpos utilizados nos processos aqui descritos podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou com uma multiespecificidade maior. Os anticorpos multi-específicos podem ligar-se imunoespecificamente a diferentes epitopos de FcyRIIB ou podem ligar-se imunoespecificamente tanto a um epítopo de FcyRIIB, assim como a um epítopo heterólogo, tal como um polipéptido heterólogo ou um material sólido de apoio. Ver, por exemplo, publicações internacionais n°. WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 e WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; patentes norte-americanas U.S: Nos. 54 4.474.893, 4.714.681, 4.925.64Β, 5.573.920 e 5.601.819; e Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553; Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 47-66.

Em modalidades particulares, os anticorpos aqui descritos são multi-especificos, com especificidades para FcyRIIB e para um antigénio do cancro ou qualquer outro marcador da superfície celular específico para uma célula projectada para ser morta, por exemplo, no tratamento ou na prevenção de uma determinada doença ou distúrbio ou para outros receptores de Fc, por exemplo FcyIIA, FcyIIB, etc.

Numa modalidade específica, um anticorpo utilizado nos processos aqui descritos é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio (por exemplo, compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (RDC), de preferência todas as 6 RDC) do anticorpo produzido pelo clone 2B6 ou 3H7, com os números de acesso na ATCC PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente (por exemplo, RDC3 de cadeia pesada). Numa outra modalidade, um anticorpo utilizado nos processos aqui descritos liga-se ao mesmo epítopo mque o anticorpo monoclonal de rato produzido a partir do clone 2B6 ou 3H7, com os números de acesso na ATCC PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente e/ou compete com o anticorpo monoclonal de rato produzido a partir do clone 2B6 ou 3H7, com os números de acesso na ATCC PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente, como determinado, por exemplo, num ensaio de ELISA ou outros imunoensaio comparativo adequado e também se liga a FcyRIIB com uma afinidade maior do que aquela que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIB. 55

Os anticorpos utilizados nos processos aqui descritos incluem derivados que estão modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal como essa ligação covalente. Por exemplo, mas não a titulo de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos conhecidos de protecção/ bloqueio, clivagem proteolitica, ligação a um ligante celular ou a outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por meio de técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo de anticorpos em seres humanos e nos ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados. Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de seres humanos. Os anticorpos humanos podem ser preparados por meio de uma variedade de processos conhecidos na técnica, incluindo os processos de exibição de fagos descritos antes utilizando bibliotecas de anticorpos derivados de sequências de imunoglobulina humana. Ver também as patentes norte-americanas U.S. n° 4.444.887 e 4.716.111; e publicação internacional Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando murganhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que 56 podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de genes de imunoglobulina humana de cadeia pesada e leve podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de murganhos. Alternativamente, a região variável humana, a região constante e a região de diversidade podem ser introduzidas em células estaminais embrionárias de murganhos, para além dos genes humanos de cadeia pesada e leve. Os genes de imunoglobulina de murganho, de cadeia pesada e leve, podem tornar-se não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a eliminação homozigótica da região JP previne a produção endógena de anticorpos. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e micro-injectadas em blastócitos para produzir murganhos quiméricos. Os murganhos quiméricos são então criados para produzir uma descendência homozigótica que expressa anticorpos humanos. Os ratos transgénicos são imunizados utilizando metodologias convencionais com um antigénio seleccionado, por exemplo, todo ou uma parte de um polipéptido da presente invenção. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos a partir de ratos transgénicos imunizados usando a tecnologia convencional do hibridoma. Os transgenes da imunoglobulina humana comportados pelos ratos transgénicos reorganizados durante a diferenciação das células B e, posteriormente, submetidos a uma mudança de classe e a uma mutação somática. Assim, utilizando essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE úteis sob o ponto de vista terapêutico. Para uma revisão desta teoria para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar, (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93) . Para uma discussão detalhada desta tecnologia para a produção de 57 anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção desses anticorpos, ver, por exemplo, as publicações internacionais n° WO 98/24893, WO 96/34096 e WO 96/33735; e as patentes norte-americanas U.S. n°. 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 e 5.939.598. Além disso, empresas tais como a Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e a Medarex (Princeton, NJ) podem estar envolvidas no fornecimento de anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado utilizando uma tecnologia similar à descrita antes.

Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes partes do anticorpo derivam de diferentes moléculas de imunoglobulina tais como os anticorpos que têm uma região variável derivada de um anticorpo não humano e uma região constante de imunoglobulina humana. Os processos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; e patentes norte-americanas U.S. Nos. 6.311.415, 5.807.715, 4.816.567 e 4.816.397. Os anticorpos quiméricos compreendendo uma ou mais RDC de espécies não humanas e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de RDC (EP 239.400; publicação internacional No. 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), folheamento ou revestimento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7: 805; e Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969) e arrastamento de cadeia (patente norte-americana U.S. No. 5.565.332). 58

Muitas vezes, os resíduos nas regiões estruturais serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo dador da RDC para alterar, preferencialmente melhorar a ligação do antigénio. Estas substituições estruturais são identificadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, modelando as interacções da RDC e os resíduos estruturais para identificar os resíduos estruturais importantes para a ligação do antigénio e a comparação de sequências para identificar resíduos estruturais raros em posições particulares. (Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. No. 5.585.089; e Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323.)

Um anticorpo humanizado é um anticorpo, uma sua variante ou um seu fragmento, que é capaz de se ligar a um antigénio pré-determinado e que compreende uma região estrutural que tenha praticamente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma RDC que tenha praticamente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado compreende praticamente todos de pelo menos um e, normalmente, dois domínios variáveis, em que todas ou quase todas as regiões RDC correspondem às de uma imunoglobulina não humana (isto é, um anticorpos dador) e todas ou quase todas as regiões estruturais são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. De preferência, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Normalmente, o anticorpo irá conter tanto a cadeia leve, como, pelo menos o domínio da variável de uma cadeia pesada. 0 anticorpo também pode incluir as regiões da cadeia pesada CPI, a charneira, CP2, CP3 e CP4. O anticorpo humanizado pode ser seleccionado a partir de qualquer classe de imuno- 59 globulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isotipo, incluindo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Geralmente, o domínio constante é um domínio constante de fixação do complemento em que se deseja que o anticorpo humanizado exiba actividade citotóxica e a classe é normalmente IgGi. Quando essa actividade citotóxica não é desejável, o domínio constante pode ser da classe da IgG2. 0 anticorpo humanizado pode incluir sequências de mais do que uma classe ou isotipo e selecionando domínios constantes particulares para optimizar as funções efectoras desejadas está dentro das competências da técnica. As regiões estruturais e as RDC de um anticorpo humanizado não precisam de corresponder exactamente às sequências parentais, por exemplo, a RDC dadora ou a estrutura de consenso pode ser mutagenizada pela substituição, inserção ou supressão de pelo menos um resíduo de modo que a RDC ou o resíduo estrutural nesse sítio não corresponde a nenhum consenso nem ao anticorpo de importação. Tais mutações, no entanto, não serão extensivas. Normalmente, pelo menos 75 % dos resíduos de anticorpos humanizados irá corresponder aos da região estrutural parental (RE) e sequências de RDC, com mais frequência 90 % e mais preferivelmente superior a 95 %. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo mas não se limitando a enxerto de RDC (patente europeia No. EP 239.400; publicação internacional n°. WO 91/09967; e patentes norte-americanas U.S. n°. 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), folheamento ou revestimento (patentes europeias Nos. EP 592,106 e EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969), arrastamento de cadeia (patente norte-americana No. 5.565.332) e técnicas descritas, por exemplo as patentes norte-americanas n°. 6.407.213. 5.766.886. 60 5.585.089, publicação internacional No. WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119-25, Caídas et al., 2000, Protein Eng. 13: 353-60, Morea et al., 2000, Methods 20: 267-79, Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678- co 1 Roguska et al ., 1996, Protein Eng. 9: 895-904, Couto et al, 1995, Câncer Res. 55 (23 Sup): 5973s.5977s, Couto et al, 1995, Câncer Res. 55: 1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150: 409-10, Pedersen et al, 1994, J. Mol. Biol. 235: 59-73, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323 e Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. Muitas vezes, os resíduos estruturais nas regiões estruturais serão substituídos com o resíduo correspondente a partir do anticorpo dador da RDC para alterar, de preferência, melhorar a ligação do antigénio. Estas substituições estruturais são identificadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, modelando interacções da RDC e os resíduos estruturais para identificar os resíduos estruturais importantes para a ligação do antigénio e a comparação de sequências para identificar resíduos estruturais raros em posições particulares. (Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. No. 5.585.089; e Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323. )

Além disso, os anticorpos aqui descritos podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo utilizando técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria. (Ver, por exemplo, Greenspan e Bona, 1989, FASEB J. 7: 437-444; e Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147: 2429-2438). A presente invenção tem por objecto processos empregando o uso de polinucleótidos compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando um anticorpo aqui descrito ou um seu fragmento. 61 A presente invenção engloba anticorpos de domínio único, incluindo anticorpos de domínio único camelizados {ver, por exemplo, Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sei. 26: 230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1: 253; Reichmann e Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231: 25; publicação internacional Nos. WO 94/04678 e WO 94/25591; patente norte-americana U.S. No. 6.005.079). Numa modalidade, a presente invenção providencia anticorpos de domínio único, compreendendo dois domínios VP com modificações tais como as que vão formar anticorpos de domínio único.

Os processos aqui descritos incluem também o uso de anticorpos ou dos seus fragmentos que têm semi-períodos de vida {por exemplo, semi-períodos de vida no soro) num mamífero, de preferência um ser humano, superior a 15 dias, de preferência superior a 20 dias, superior a 25 dias, superior a 30 dias, superior a 35 dias, superior a 40 dias, superior a 45 dias, superior a 2 meses, superior a 3 meses, superior a 4 meses ou superior a 5 meses. O aumento dos semi-períodos de vida dos anticorpos ou dos seus fragmentos num mamífero, de preferência num ser humano, resulta num título sérico superior dos referidos anticorpos ou dos fragmentos dos anticorpos no mamífero e, portanto, reduz a frequência de administração dos referidos anticorpos ou dos seus fragmentos e/ou reduz a concentração dos referidos anticorpos ou dos fragmentos dos anticorpos a serem administrados. Os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que tenham aumentado os seus semi-períodos de vida in vivo podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas pelos especialistas nesta técnica. Por exemplo, os anticorpos ou os seus fragmentos, com semi-períodos de vida aumentados, in vivo, podem ser gerados através da modificação (por exemplo, a substituição, a supressão ou a adição) de 62 resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interacção entre o domínio Fc e o receptor de FcRn. Os anticorpos podem ser tratados por engenharia genética pelos processos descritos em Ward et al. para aumentar os seus semi-períodos de vida biológica (ver U.S. 6.277.375 Bl). Por exemplo, os anticorpos aqui descritos podem ser tratados por engenharia genética no domínio charneira com Fc para aumentarem, in vivo, o seu semi-período de vida no soro.

Os anticorpos ou os seus fragmentos, com semi-períodos de vida aumentados in vivo, podem ser gerados, ligando os referidos anticorpos ou moléculas poliméricas dos fragmentos dos anticorpos tais como polietilenoglicol (PEG) de elevado peso molecular. 0 PEG pode ligar-se aos referidos anticorpos ou aos seus fragmentos com ou sem um ligante multifuncional, quer através de uma conjugação, específica do sítio, do PEG ao terminal N- ou C- dos referidos anticorpos ou fragmentos dos anticorpos ou através dos grupos epsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. Vai usar-se a derivação de polímeros lineares ou ramificados que resulta numa perda mínima da actividade biológica. 0 grau de conjugação pode ser monitorizado de muito perto por EGPA-SDS e espectrometria de massa para assegurar a conjugação apropriada das moléculas de PEG com os anticorpos. 0 PEG que não reagiu pode ser separado dos conjugados de anticorpos-PEG, por exemplo, por cromatografia por exclusão de dimensão ou de permuta iónica.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser modificados pelos processos e agentes de acoplamento descrito por Davis et al. (Ver U.S. 4,179,337) para providenciar composições que podem ser injectadas no 63 sistema circulatório de mamíferos sem praticamente nenhuma resposta imunogénica. A presente invenção também engloba a utilização de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um dos anticorpos aqui descritos com mutações (por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos) na estrutura ou nas regiões variáveis. De preferência, as mutações nestes anticorpos mantêm ou aumentam a avidez e/ou a afinidade dos anticorpos para o antigénio específico a que se ligam imuno-especificamente. Podem utilizar-se técnicas-padrão conhecidas dos especialistas nesta técnica (por exemplo, os imuno-ensaios) para fazer o ensaio de afinidade de um anticorpo com um antigénio específico. A presente invenção inclui anticorpos que têm modificações, de preferência na região Fc, que modificam a afinidade de ligação do anticorpo a uma ou mais FcyR. Os processos para a modificação de anticorpos com a ligação modificada em uma ou mais das FcyR são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, publicação PCT Nos. WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089 e patentes norte-americanas US Nos. 5.843.597 e 5.642.821. A presente invenção engloba qualquer uma das mutações descritas nos pedidos da patente norte-americana US Nos. 60/439.498, registada em 9 de Janeiro de 2003 e na 60/456,041, registada em 19 de Março de, 2003. Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba anticorpos que alteraram a afinidade para a activação de uma FcyR, por exemplo, FcyRIIIA. Preferencialmente, essas modificações também vão alterar a função efectora mediada por Fc. As modificações que afectam a função efectora mediada por Fc são bem conhecidas na técnica (ver U.S. 6.194.551). 64

Os aminoácidos que podem ser modificados, de acordo com o processo aqui descrito, incluem mas não se limitam a prolina 329, prolina 331 e lisina 322. A prolina 329, a 331 e a lisina 322 são preferencialmente substituídas por alanina, no entanto, a substituição por qualquer outro aminoácido também está contemplada. Ver publicação internacional No.: WO 00/42072 e U.S. 6.194.551.

Numa modalidade particular, a modificação da região Fc compreende uma ou mais mutações na região Fc. As mutações (uma ou mais) na região Fc podem resultar num anticorpo com uma função efectora alterada, mediada por anticorpos, uma ligação alterada a outros receptores de Fc (por exemplo, a receptores de activação de Fc) , uma actividade CCDA alterada ou uma actividade de ligação alterada de Clq ou uma actividade de citotoxicidade dependente do complemento alterada ou qualquer combinação destas. A presente invenção também providencia anticorpos com o teor de oligossacáridos alterado. Oligossacáridos, tal como se usa aqui, refere-se a hidratos de carbono contendo dois ou mais açúcares simples e os dois termos podem ser usados indistintamente neste documento. As moléculas de hidratos de carbono aqui descritas serão descritas com referência à nomenclatura normalmente usada na técnica. Para uma revisão sobre a química dos hidratos de carbono ver, por exemplo, Hubbard et al., 1981 Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583. Esta nomenclatura inclui, por exemplo, Man, que representa manose; GlcNAc que representa 2-N-acetilglicosamina; Gal que representa galactose, Fuc para fucose e Glc para glicose. Os ácidos siálico são descritos pela notação abreviada NeuNAc para o ácido 5-N-acetilneuramínico e NeuNGc para o 5 glicolneuramínico. 65

Em geral, os anticorpos contêm partes de hidratos de carbono em posições conservadas na região constante da cadeia pesada e até 30 % das IgG humanas têm uma região Fab glicosilada. A IgG tem uma estrutura única de hidrato de carbono biantenária ligada a N em Asn 297 que reside no domínio CP2 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15: 26-32) . A IgG humana normalmente tem um hidrato de carbono com a seguinte estrutura; GlcNAc (Fucose)-GlcNAc-Man (ManGlcNAc)2 · No entanto, ocorrem variações, entre as IgG, no teor de hidrato de carbono, o que leva a fuma unção alterada, ver, por exemplo, Jassal et al., 2001 Bichem. Biophys. Res. Commun. 288: 243-9; Groenink et al., 1996 J. Immunol. 26: 1404-7; Boyd et al, 1995 Mol. Immunol. 32: 1311-8; Kumpel et al, 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51. A presente invenção engloba anticorpos que compreendem uma variação na parte de hidrato de carbono que está ligada a Asn 297. Numa modalidade, a parte de hidrato de carbono tem uma galactose e/ou galactose-ácido siálico em um ou ambos os terminais GlcNAc e/ou um terceiro braço de GlcNAc (bissectando GlcNAc).

Nalgumas modalidades, os anticorpos aqui descritos estão praticamente isentos de um ou mais grupos de açúcar seleccionados, por exemplo, entre um ou mais resíduos de ácido siálico, um ou mais resíduos de galactose, um ou mais resíduos de fucose. Pode-se preparar um anticorpo praticamente isento de um ou mais dos grupos de açúcar selecionados, utilizando processos comuns conhecidos pelos especialistas na matéria, incluindo, por exemplo, a produção recombinante de um anticorpo numa célula hospedeira que está com um defeito na adição dos grupos de açúcar selecionados com a parte de hidrato de carbono do 66 anticorpo, de tal forma que cerca de 90-100 % do anticorpo tem falta, na sua composição dos grupos de açúcar seleccionados ligados à parte de hidrato de carbono. Processos alternativos para preparar esses anticorpos incluem, por exemplo, a cultura de células em condições que impedem ou reduzem a adição de um ou mais grupos seleccionados de açúcar ou a eliminação pós-translacionais de um ou mais grupos de açúcar seleccionados.

Numa modalidade especifica, a presente invenção engloba um processo para produzir uma preparação de anticorpos praticamente homogénea, em que cerca de 80-100 % do anticorpo na composição tem falta de fucose na sua porção de hidrato de carbono, por exemplo, a ligação de hidrato de carbono em Asn 297. O anticorpo pode ser preparado, por exemplo, por meio (a) da utilização de uma célula hospedeira tratada por engenharia genética que é deficiente no metabolismo da fucose de tal modo que tem uma capacidade reduzida para fucosilar as proteínas aí expressas; (b) da cultura de células em condições que impeçam ou reduzam a fusocsilação; (c) da eliminação post-translacional de fucose, por exemplo, com uma enzima fucosidase; ou (d) da purificação do anticorpo por forma a seleccionar para o produto que não está fucosilado. Mais preferencialmente, os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo desejado são expressos em células hospedeiras que têm uma capacidade reduzida para fucosilar o anticorpo expresso nelas. De preferência, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês (OHC) deficiente em di-hidrofolato redutase, por exemplo, uma célula de OHC Lee 13 (linha de células mutantes de OHC resistente a lectina; Ribka e Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12 (1) ; 51-62; Ripka et al., 1986 Arch. Biochem. Biophys. 249 (2): 533-45), 0HC-K1, DUX-B 11, 0HC-DP12 ou OHC-DG44, que tenham 67 sido modificadas por isso o anticorpo praticamente não é fucosiladado. Assim, a célula pode exibir uma expressão alterada e/ou uma actividade alterada para a enzima fucoisltransferase ou outra enzima ou outro substrato envolvidos na adição de fucose ao oligossacárido ligado a N, por isso a enzima tem uma actividade diminuída e/ou um nível de expressão reduzido na célula. Sobre processos para produzir anticorpos com o teor de fucose alterado, ver, por exemplo, WO 03/035835 e Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277 (30): 26733-40.

Nalgumas modalidades, as modificações dos hidratos de carbono alterados regulam uma ou mais das seguintes situações: solubilização do anticorpo, facilitação do transporte subcelular e secreção do anticorpo, promoção da junção de anticorpos, integridade conformacional e função efectora mediada por anticorpos. Numa modalidade específica, as modificações dos hidratos de carbono alterados aumentam a função efectora mediada por anticorpos em relação aos anticorpos a que falta a modificação dos hidratos de carbono. As modificações dos hidratos de carbono que levam a uma função efectora alterada, mediada pelo anticorpo, são bem conhecidas na técnica (por exemplo, ver Shields R.L. et al., 2001, J. Biol. Chem. 277 (30) : 26733-40; Davies J. et al., 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74 (4): 288-294). Noutra modalidade específica, as modificações dos hidratos de carbono alterados aumentam a ligação dos anticorpos da presente invenção ao receptor de FcyRIIB. A alteração das modificações dos hidratos de carbono, de acordo com os processos aqui descritos inclui, por exemplo, o aumento do teor de hidrato de carbono do anticorpo ou diminuindo o teor de hidrato de carbono do anticorpo. Os processos para alterar os teores de hidratos de carbono são conhecidos dos 68 especialistas nesta técnica, ver, por exemplo, Wallick et ai., 1988, Journal of Exp. Med. 168 (3): 1099-1109/ Tao et al., 1989 Journal of Immunology, 143 (8): 2595-2601; Routledge et al., 1995 Transplantation, 60 (8): 847-53, Whitney et al. 2003; Nature Biotechnology, 21: 414-21, Shields et al. 2002 Journal of Biological Chemistry, 277 (30): 26733-40.

Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba anticorpos compreendendo um ou mais sítios de glicosilação, de modo que uma ou mais partes de hidratos de carbono estão ligadas covalentemente ao anticorpo. Noutras modalidades, a presente invenção engloba anticorpos compreendendo um ou mais sítios de glicosilação e uma ou mais modificações na região Fc, tal como as descritas supra e as conhecidas por um especialista na matéria. Em modalidades preferidas, uma ou mais das modificações na região Fc aumentam a afinidade do anticorpo para uma FcyR de activação, por exemplo, FryRIIIA, em relação ao anticorpo compreendendo as regiões Fc de tipo selvagem. Os anticorpos aqui descritos com um ou mais sítios de glicosilação e/ou uma ou mais modificações na região Fc têm uma função efectora aumentada, mediada pelo anticorpo, por exemplo, a actividade CCDA aumentada. Nalgumas modalidades, a presente invenção ainda inclui anticorpos compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos que são directa ou indirectamente conhecidas por interagirem com uma parte de hidrato de carbono do anticorpo, incluindo, mas não se limitando a aminoácidos nas posições 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 e 301. Os aminoácidos que, directa ou indirectamente, interagem com uma parte de hidrato de carbono são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7. 69 A presente invenção engloba anticorpos que tenham sido modificados através da introdução de um ou mais sítios de glicosilação em um ou mais sítios dos anticorpos, de preferência sem alterar a funcionalidade do anticorpo, por exemplo, a actividade de ligação a FcyRIIB. Os sítios de glicosilação podem ser introduzidos na região variável e/ou constante dos anticorpos aqui descritos. Tal como se usa aqui, "sítios de glicosilação" incluem qualquer sequência específica de aminoácidos num anticorpo ao qual um oligossacárido (ou seja, hidratos de carbono contendo dois ou mais açúcares simples ligados entre si) se irá ligar específica e covalentemente. As cadeias laterais dos oligossacáridos estão normalmente ligadas à estrutura de um anticorpo quer através das ligações N- ou 0-. A glicosilação ligada a N refere-se à ligação de uma parte de oligossacárido à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de uma parte de oligossacárido a um ácido de hidroxiamino, por exemplo, serina ou treonina. Os anticorpos podem compreender um ou mais sítios de glicosilação, incluindo sítios de glicosilação ligados a N e ligados a 0. Qualquer sítio de glicosilação, para a glicosilação ligada a N- ou ligada a 0-, conhecido na técnica pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Um exemplo de um sítio de glicosilação ligado a N- que é útil, de acordo com os processos aqui descritos, é a sequência de aminoácidos: Asn-X-Tre/Ser, em que X pode ser qualquer aminoácido e Tre/Ser indica uma treonina ou uma serina. Tal sítio ou sítios podem ser introduzidos num anticorpo da presente invenção usando processos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, "In Vitro Mutagenesis," Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, capítulo 8, pp. 106-116,. 70

Um exemplo de um processo para a introdução de um sitio de glicosilação num anticorpo pode incluir: a modificação ou a mutação de uma sequência de aminoácidos do anticorpo para se obter a sequência desejada de Asn-X-Ter/Ser.

Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba processos para modificar o teor de hidrato de carbono de um anticorpo aqui descrito, adicionando ou excluindo um sitio de glicosilação. Os processos para modificar o teor de hidratos de carbono dos anticorpos são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo a patente norte-americana U.S. No. 6.218.149; EP 0 359 096 Bl; a publicação U.S. No. 2002/0028486; WO 03/035835; a publicação U.S. No. 2003/0115614; a patente norte-americana U.S. No. 6.218.149; a patente U.S. No. 6.472,511.

Noutras modalidades, a presente invenção engloba processos de modificação do teor de hidrato de carbono de um anticorpo aqui descrito, por meio da eliminação de uma ou mais partes de hidrato de carbono endógeno do anticorpo. A presente invenção ainda engloba processos de modificação de uma função efectora de um anticorpo aqui descrito, em que o processo compreende a modificação do teor de hidrato de carbono do anticorpo usando os processos aqui descritos ou conhecidos na técnica.

As técnicas padrão conhecidas dos especialistas na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleótidos codificando um anticorpo ou um seu fragmento, incluindo, por exemplo, a mutagénese dirigida ao sitio e a mutagénese mediada por RCP, o que resulta em substituições de aminoácidos. De preferência, os derivados 71 incluem menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação ao anticorpo original ou a um seu fragmento. Numa modalidade preferida, os derivados têm substituições conservadoras de aminoácidos feitas em um ou mais dos resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. A presente invenção também engloba anticorpos ou fragmentos dos mesmos que compreendem uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada variável e/ou uma cadeia leve variável que é pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e/ou da cadeia leve do anticorpo monoclonal de rato produzido pelo clone 2B6 ou 3H7 com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. A determinação da identidade percentual das duas sequências de aminoácidos pode ser determinada por qualquer processo conhecido para um especialista na matéria, incluindo as pesquisas de proteínas por BLAST. A presente invenção também engloba o uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos ou os seus fragmentos se ligam a FcyRIIA, em que os referidos anticorpos ou os fragmentos de anticorpos são codificados por uma sequência de nucleótidos que híbrida com a sequência de nucleótidos do anticorpo monoclonal de rato produzido pelo clone 2B6 ou 3H7 com os números de 72 acesso, da ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente, em condições rigorosas. Numa modalidade preferida, a presente invenção tem por objecto anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que os referidos anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam a FcyRIIA, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpos compreendem uma cadeia leve variável e/ou uma cadeia pesada variável codificadas por uma sequência de nucleótidos que híbrida em condições rigorosas para a sequência de nucleótidos da cadeia leve variável e/ou a cadeia pesada variável do anticorpo monoclonal de rato produzida pelo clone 2B6 ou 3H7 com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente, em condições rigorosas. Numa outra modalidade preferida, a presente invenção tem por objecto anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que os referidos anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam a FcyRIIA, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais RDC codificadas por uma sequência de nucleótidos que híbrida, em condições rigorosas, com a sequência de nucleótidos de uma ou mais RDC do anticorpo monoclonal de rato produzido pelo clone 2B6 ou 3H7 com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. Condições de hibridização severas incluem, mas não se limitam a hibridação com o ADN ligado ao filtro em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), a cerca de 45 °C, seguido de uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC/SDS a 0,1 %, a cerca de 50-65 °C, condições altamente rigorosas tal como hibridação com o ADN ligado ao filtro em 6X SSC, a cerca de 45 °C, seguida de uma ou mais lavagens em 0,1 X SSC/SDS a 0,2 %, a cerca de 60 °C, ou qualquer outra condição de hibridação rigorosa conhecida dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, 73 F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular

Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley and Sons, Inc., NY at páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3) .

5.1.1 CONJUGADOS DE ANTICORPOS A presente invenção engloba anticorpos fundidos ou conjugados quimicamente ou de forma recombinante (incluindo conjugações tanto covalente como não covalente) com polipéptidos heterólogos (isto é, um polipéptido não relacionado; ou uma parte dele, de preferência pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos, 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos do polipéptido) para gerar proteínas de fusão. A fusão não precisa necessariamente de ser directa, mas pode ocorrer através das sequências do ligando. Os anticorpos podem ser usados, por exemplo, para atingir polipéptidos heterólogos com tipos de célula específicas, seja in vitro ou in vivo, através da fusão ou da conjugação dos anticorpos com anticorpos específicos para receptores específicos da superfície celular. Os anticorpos fundidos ou conjugados com polipéptidos heterólogos podem também ser utilizados em imunoensaios in vitro e processos de purificação usando processos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, publicação PCT número WO 93/2 1232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett., 39: 91-99, 1994; patente norte- americana 5.474.981; Gillies et al., PNAS, 89: 1428-1432, 1992; e Fell et al., J. Immunol., 146: 2446-2452, 1991.

Além disso, um anticorpo pode ser conjugado com um agente terapêutico ou uma parte de fármaco que modifica uma dada resposta biológica. Os agentes terapêuticos ou partes 74 de fármacos não são preparados como limitativos em relação aos agentes químicos terapêuticos clássicos. Por exemplo, a parte de fármaco pode ser uma proteína ou um polipéptido que tenham a actividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas (isto é, PE-40) ou toxina da difteria, ricina, gelonina e proteína antiviral da erva-dos-cancros, uma proteína tal como um factor de necrose do tumor, interferões incluindo, mas não se limitando a interferão α (IFN-α), interferão β (IFN-β), factor de crescimento dos nervos (FCN), factor de crescimento derivado de plaquetas (FCDP), activador do plasminogénio de tecidos (APT), um agente apoptótico (por exemplo, FNT-a, FNT-β, AIM I tal como descrito na publicação PCT n° WO 97/33899) , AIM II (ver, publicação PCT n° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., J. Immunol., 6: 1567-1574, 1994) e VEGI (publicação PCT n° WO 99/23105) , um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico (por exemplo, angioestatina ou endoestatina) ou um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma linfocina (por exemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos ("FEC-GM") e factor de estimulação de colónias de granulócitos ("FEC-G"), factor de estimulação de colónias de macrófagos ("FEC-M") ou um factor de crescimento (por exemplo, hormona de crescimento ("HC")); proteases ou ribonucleases.

Os anticorpos podem fundir-se com sequências marcadoras, tais como um péptido para facilitar a purificação. Em modalidades preferidas, uma sequência marcadora de aminoácidos é um péptido de hexa-histidina, tal como um marcador fornecido num vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre 75 outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Tal como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 86:821-824, 1989, por exemplo, a hexa-histidina providencia uma purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores de péptidos úteis para a purificação incluem, mas não se limitam a um marcador de hemaglutinina "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Cell. 37:7 67 1984) e o marcador "flag" (Knappik et al., Biotechniques, 17 (4): 754-761, 1994). A presente invenção também inclui composições que compreendem polipéptidos heterólogos fundidos ou conjugados com os fragmentos de anticorpos. Por exemplo, os polipéptidos heterólogos podem ser fundido ou conjugados com um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2 ou uma parte dele. Os processos para a fusão ou a conjugação de polipéptidos com as porções de anticorpos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as patentes norte-americanas n° 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; International Publication Nos. WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154: 5590-5600; e Vil et al., 1992, PNAS 89: 11337- 11341.

Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através das técnicas de arrastamento de genes, arrastamento de elementos, arrastamento de exões e/ou arrastamento de codões (colectivamente referidas como "arrastamento de ADN"). 0 arrastamento de ADN pode ser utilizado para alterar as actividades dos anticorpos aqui descritos ou os seus fragmentos (por exemplo, anticorpos ou os seus fragmentos com afinidades maiores e menores taxas de 76 genericamente, dissociação). Ver, genericamente, as patentes norte-americanas n°. 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; e 5.837.458 e Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265; e Lorenzo e Blasco, 1998, BioTechniques 24: 308. Os anticorpos ou os seus fragmentos ou os anticorpos codificados ou fragmentos dos mesmos podem ser alterados submetendo-os a mutagénese aleatória por RCP de tentativa e erro, a inserção aleatória de nucleótidos ou outros processos, antes da recombinação. Uma ou mais porções de um polinucleótido que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, cujas porções se ligam especificamente a FcyRIIB podem ser recombinados com um ou mais componentes, elementos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas. A presente invenção também engloba anticorpos conjugados com um agente de diagnóstico ou terapêutico ou qualquer outra molécula para a qual se deseje aumentar o semi-periodo de vida no soro. Os anticorpos podem ser usados para diagnóstico, por exemplo, para monitorizar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença, anomalia ou infecção como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radio-activos, metais que emitem positrões e iões de metais paramagnéticos não radioactivos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada quer directamente com o anticorpo ou indirectamente, através de um produto 77 intermédio (tal como, por exemplo, um ligante conhecido na técnica) utilizando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. n° 4.741.900 para iões metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para se utilizarem em diagnósticos. Esses diagnósticos e a detecção podem ser realizados pelo acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis, incluindo, mas não se limitando a várias enzimas, enzimas que incluem mas não se limitam a peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; complexos de grupos prostéticos, tais como, mas não se limitando a estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não se limitando a umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; material luminescente, tal como, mas não se limitando a luminol; materiais bioluminescentes tais como, mas não se limitando a luciferase, luciferina e aequorina; material radioactivo tal como, mas não se limitando a bismuto (213Bi) , carbono (14C) , cómio (51Cr) , cobalto (57Co ) , flúor (18f) , gadolinio (153Gd, 159Gd) , gálio (68Ga, 67Ga) , germânio (68Ge; i , hólmio ( 166Ho ) , indio (115In, 113 T _ 112 T 111T^\ π / 131 τ 125T 123T 121 τ\ η _ ^ a ^

In, In, In) , iodo ( I, I, I, I) , lantamo (140La) , lutécio (177Lu) , manganês (54Mn) , molibdénio (99Mo), paladio ( Pd) , fosforo ( P) , praseodimio ( Pr) , promecio (149Pm) , rénio (186Re, 188Re) , ródio (105Rh) , ruténio (97Ru), samário (153Sm) , escândio (47Sc) , selénio (75Se) , estrôncio (85Sr) , enxofre (35s), tecnécio (99Tc) , tálio (20Ti), estanho (113Sn, 117Sn) , tritio (3H) , xenon (133Xe) , itérbio (169Yb, 175Yb) , itrio (90Y) , zinco (65Zn) / metais que emitem positrões utilizando várias tomografias de emissão de positrões e iões metálicos paramagnéticos não radioactivos. 78

Um anticorpo pode ser conjugado com uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um elemento radioactivo (por exemplo, alfa-emissores, gama-emissores, etc. ) . As citotoxinas ou agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaina, tetra-caína, lidocaina, propranolol e puromicina e os seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem, mas não se limitam a antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfano, di-bromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cisdicloro-diamina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Além disso, um anticorpo pode ser conjugado com partes terapêuticas, tais como materiais radioativos ou quelantes macrociclicos úteis para conjugar iões radiometálicos (ver antes os exemplos de materiais radioactivos). Em certas modalidades, o quelante macrociclico é o ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,Ν',N",N"-tetra-acético (DOTA), que se pode ligar ao anticorpo através de uma molécula do 79 ligante. Essas moléculas ligantes são normalmente conhecidas na técnica e estão descritas em Denardo et al., 1998, Clin Câncer Res. 4: 2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943-50.

As técnicas para conjugar essas partes terapêuticas com os anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Mareei Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; e Thorpe et al., Immunol Rev., 62: 119-58, 1982.

Administra-se um anticorpo ou um seu fragmento, com ou sem uma parte terapêutica conjugada, isoladamente ou em combinação com factores citotóxico e/ou citocinas que podem ser usados como um agente terapêutico.

Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, tal como descrito por Segai na patente norte-americana U.S. No. 4.676.980. 80

Os anticorpos também se podem ligar a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou para a purificação do antigénio-alvo. Esses suportes sólidos incluem, mas não se limitam a, vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno.

5.2 IMUNIZAÇÃO, TRIAGEM, IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma grande variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de hibridoma, tecnologias recombinantedes e de exibição de fagos ou uma combinação entre elas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos através de técnicas de hibridoma, incluindo as conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed 1988); Hammerling, et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). A expressão "anticorpo monoclonal", tal como se usa aqui, não se limita a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que deriva de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago e não ao processo pelo qual ele é produzido.

Os processos para a produção e a triagem de anticorpos específicos usando a tecnologia de hibridoma são processos de rotina e bem conhecidas na técnica. Num exemplo não limitativo, os ratos podem ser imunizados com um antigénio de interesse ou com uma célula que expressando esse antigénio. Uma vez que se detecte uma resposta imunitária, por exemplo, quando se detectam anticorpos específicos para 81 o antigénio no soro de rato, colhe-se o baço do rato e isolam-se os esplenócitos. Os esplenócitos são então fundidos por meio de técnicas bem conhecidas para quaisquer células de mieloma adequadas. Seleccinam-se hibridomas e faz-se a sua clonagem por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então analisados por processos conhecidos na técnica para as células que segregam anticorpos capazes de se ligarem ao antigénio. Pode-se gerar fluido de ascites, que geralmente contêm níveis elevados de anticorpos, por inoculção de murganhos, intraperitonealmente, com clones positivos de hibridomas.

Numa modalidade particular, a presente invenção providencia um processo para a produção de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que os referidos anticorpos monoclonais se ligam a FcyRIIA compreendendo: a imunização de um ou mais ratos transgénicos com FcyRIIA (ver US 5.877.396 e US 5.824.487) com o domínio extracelular purificado de FcyRIIB humana, aminoácidos 1-180/ produção de linhas de células de hibridoma a partir de células do baço dos referidos ratos, triagem das referidas linhas de células de hibridoma para uma ou mais linhas de células de hibridoma que produzem anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que os referidos anticorpos se ligam a FcyRIIA. Numa outra modalidade específica, a presente invenção tem por objecto um processo para produzir anticorpos monoclonais de FcyRIIB que se ligam especificamente a FcyRIIB, particularmente a FcyRIIB humana, com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos monoclonais se ligam a FcyRIIA, compreendendo o referido processo: a imunização de um ou mais ratos transgénicos com FcyRIIA com FcyRIIB purificada ou com um seu fragmento imunogénico, o reforço da imunização dos 82 referidos ratos, o número suficiente de vezes para provocar uma resposta imunitária, a produção de linhas de células de hibridoma a partir de células do baço dos referidos um ou mais ratos, o rastreio das referidas linhas de células de hibridoma para uma ou mais linhas de células de hibridoma que produzem anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que os referidos anticorpos se ligam a FcyRIIA. Numa modalidade, os referidos ratos são imunizados com FcyRIIB purificada, que tinha sido misturada com qualquer adjuvante conhecido na técnica, para aumentar a resposta imunitária. Os adjuvantes que podem ser usados nos processos aqui descritos incluem, mas não se limitam a adjuvantes de proteína; adjuvantes bacterianos, por exemplo, bactérias completas (BCG, Corynebacterium parvum, Salmonella minnesota) e componentes bacterianos, incluindo a estrutura da parede das células, dimicolato de trealose, lípidos A de monofosforilo, resíduo de metanol extraível (RME, em inglês MER) do bacilo da tuberculose, adjuvante de Freund completo ou incompleto; adjuvantes virais; adjuvantes químicos, por exemplo, hidróxido de alumínio, acetato de iodo e hemisuccinador de colesterilo; adjuvantes de ADN nu. Outros adjuvantes que podem ser usados nos processos aqui descritos incluem, toxina da cólera, proteínas de paropox, MF-59 (Chiron Corporation; ver também Bieg et al., 1999, Autoimmunity, 31 (1) : 15-24), MPL® (Corixa Corporation; ver também Lodmell D.L et al., 2000 Vaccine, 18: 1059-1066; Ulrich et al., 2000, Methods in Molecular Medicine, 273-282; Johnson et al., 1999, Journal of Medicinal Chemistry, 42: 4640-4649; Baldridge et al., 1999 Methods, 19: 103-107), adjuvante RC-529 (Corixa Corporation; o composto principal da biblioteca dos produtos químicos dos 4-fosfatos de aminoalquil-glicosaminida da Corixas AGP), ver também www.corixacom) e o adjuvante DETOX™ (Corixa Corporation; o adjuvante DETOX™ 83 inclui o adjuvante MPL® (lipido A de monofosforilo) e estrutura das paredes de células micobacterianas; ver também Eton et al., 1998, Clin. Câncer Res, 4 (3): 619-27; e Gubta R. et al., 1995, Vaccine, 13 (14): 1263-76.)

Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos de Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulinas, utilizando enzimas tais como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos de F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a cadeia leve completa e região variável, a região CPI de cadeia charneira da cadeia pesada.

Por exemplo, os anticorpos também podem ser gerados usando vários processos de exibição de fagos conhecidos na técnica. Nos processos de exibição de fagos, domínios funcionais dos anticorpos são exibidos na superfície das partículas de fagos que comportam as sequências de polinucleótidos que os codificam. Numa modalidade particular, esses fagos podem ser utilizados para mostrar domínios de ligação do antigénio, tal como Fab e Fv ou Fv estabilizado com uma ligação de dissulfureto, expressa a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humanos ou de murino). Os fagos que expressam um domínio de ligação do antigénio que se liga ao antigénio de interesse podem ser seleccionados ou identificados com antigénio, por exemplo, utilizando um antigénio marcado ou um antigénio ligado ou capturado numa superfície sólida ou numa pérola. Os fagos utilizados nestes processos são normalmente fagos filamentosos incluindo fd e M13. Os domínios de ligação do antigénio são expressos como uma proteína recombinante fundida quer com 84 uma proteína do gene III ou do gene VIII de fago. Exemplos de processos de exibição de fagos que podem ser usados para preparar as imunoglobulinas ou os seus fragmentos aqui descritos incluem os descritos em Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene, 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280, 1994; pedido de patente PCT No. PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; e patentes norte-americanas US Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108.

Tal como descrito nas referências anteriores, depois da selecção de fagos, o anticorpo que codifica as regiões do fago pode ser isolado e utilizado para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos ou qualquer dos fragmentos desejados e expressos num hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insectos, células de plantas, leveduras e bactérias, por exemplo, tal como se descreve em detalhe a seguir. Por exemplo, também se podem utilizar técnicas para produzir, de forma recombinante, os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 usando processos conhecidos na técnica, como os divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12 (6): 864-869, 1992; e Sawai et al., AJRI, 34:26-34,1995; e Better et al., Science, 240: 1041-1043, 1988.

Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir uma única cadeia de Fvs e anticorpos incluem as descritas nas patentes norte-americanas U.S. Nos. 4.946.778 85 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu et al., PNAS, 90: 7995-7999, 1993; e Skerra et al., Science, 240: 1038-1040, 1988. A tecnologia de exibição de fagos pode ser usada para aumentar a afinidade de um anticorpo da presente invenção para FcyRIIB. Esta técnica poderia ser útil na obtenção de anticorpos de elevada afinidade que poderiam ser usados nos processos combinatórios aqui descritos. A tecnologia, denominada aqui como maturação de afinidade, utiliza a mutagénese ou a deslocação da RDC e a re-selecção usando FcyRIIB ou um seu fragmento antigénico para identificar anticorpos que se ligam com maior afinidade ao antigénio quando comparados com os anticorpos iniciais ou parentais (ver, por exemplo, Glaser et al., 1992, J. Immunology 149: 3903). A mutagenização de codões completos em vez de nucleótidos simples resulta num repertório semi-aleatório de mutações de aminoácidos. Podem ser construídas bibliotecas que consistem num conjunto de variantes de clones cada uma das quais difere da outra por uma única alteração de um aminoácido numa única RDC e que contêm variantes que representam cada possível substituição de aminoácido para cada resíduo de RDC. Mutantes com afinidade de ligação acrescida para o antigénio podem ser rastreados fazendo contactar os mutantes imobilizados com o antigénio marcado. Qualquer processo de triagem conhecido na técnica pode ser usado para identificar anticorpos mutantes com uma avidez aumentada para o antigénio (por exemplo, ELISA) (ver Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad Sei. USA 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155: 1994) . Também é possível a deslocação da RDC que torna aleatória a cadeia leve (ver Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263: 551). 86

Os anticorpos aqui descritos podem ser ainda caracterizados pelo mapeamento dos epitopos, de modo que se possam selecionar os anticorpos que tenham maior especificidade para FcyRIIB em comparação com FcyRIIA. Os processos de mapeamento de epitopos dos anticorpos são bem conhecidos na técnica e estão englobados nos processos da presente invenção. Em certas modalidades, as proteínas de fusão compreendendo uma ou mais regiões da FcyRIIB podem ser usadas no mapeamento do epítopo de um anticorpo aqui descrito. Numa modalidade específica, a proteína de fusão contém a sequência de aminoácidos de uma região de uma FcyRIIB fundida com a porção Fc da IgG2 humana. Cada proteína de fusão pode ainda compreender substituições de aminoácidos de certas regiões do receptor com a região correspondente a partir de um receptor homólogo, por exemplo, FcgRIIA, como se mostra no quadro 2 a seguir. pMGXl25 e pMGXl32 contêm o sítio de ligação de IgG do receptor de FcyRIIB, o primeiro com o terminal C de FcyRIIB e o último com o terminal C de FcyRIIA e podem ser usados para diferenciar a ligação do terminal C. Os outros têm substituições de FcyRIIA no sítio de ligação de IgG e, quer no terminal N de FcyIIA ou de FcyIIB. Estas moléculas podem ajudar a determinar a parte da molécula receptora onde os anticorpos se ligam.

Quadro 2. Lista das proteínas de fusão que podem ser utilizadas para investigar o epítopo dos anticorpos monoclonais anti-FcYRIIB Os resíduos 172 a 180 pertencem ao sítio de ligação de IgG da FcyRIIA e B. Os aminoácidos específicos da sequência de FcyRIIA estão a negro.

Plasmido Receptor Ter N 172-180 Ter C pMGX125 R Ilb Ilb KKFSRSDPN APS------SS (Ilb) pMGX12 6 Rlla/b lia QKFSRLDPN APS------SS (Ilb) pMGX127 lia QKFSRLDPT APS------SS (Ilb) 87 pMGX12 8 Ilb KKFSRLDPT APS----- -ss (Ilb) pMGX129 lia QKFSHLDPT APS----- -ss (Ilb) pMGX130 Ilb KKFSHLDPT APS----- 3S ( Ilb) pMGX131 lia QKFSRLDPN VPSMGSSS (lia pMGX132 Ilb KKFSRSDPN VPSMGSSS (lia pMGX133 RIIa-131R lia QKFSRLDPT VPSMGSSS (lia pMGX134 RIIa-131H lia QKFSHLDPT VPSMGSSS (lia pMGX135 Ilb KKFSRLDPT VPSMGSSS (lia pMGX13 6 Ilb KKFSHLDPT VPSMGSSS (lia

As proteínas de fusão podem ser usadas em qualquer ensaio bioquímico para a determinação da ligação a um anticorpo anti-FcYRIIB da presente invenção, por exemplo, um ensaio por ELISA. Noutras modalidades, pode-se fazer mais uma confirmação da especificidade do epítopo usando péptidos com resíduos específicos substituídos pelos da sequência de FcyRIIA. A presente invenção engloba a caracterização dos anticorpos produzidos pelos processos aqui descritos usando alguns ensaios de caracterização para identificar a função dos anticorpos, particularmente a actividade para regular a sinalização de FcyRIIB. Por exemplo, os ensaios de caracterização aqui descritos podem medir a fosforilação dos resíduos de tirosina no elemento EITI de FcyRIIB ou medir a inibição da mobilização de cálcio gerada pelo receptor de células B. Os ensaios de caracterização aqui descritos podem ser ensaios à base de células ou isentos de células.

Tem sido bem estabelecido na técnica que, nos mastócitos, a co-agregação de FcyRIIB com o receptor de IgE de elevada afinidade, FcsRI, leva à inibição da desgranulação induzida pelo antigénio, à mobilização de cálcio e à produção de citocinas (Metcalfe D.D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77: 1033; Long E.O. 1999 Annu Rev.

Immunol 17: 875). Os detalhes moleculares da via de sinalização foram recentemente elucidados (Ott V. L., 2002, J. Immunol. 162 (9) : 4430-9) . Uma vez co-agregado com

FcsRI, FcyRIIB é rapidamente fosforilada em tirosina no seu elemento EITI e depois recruta inositol-5-fosfatase (SHIP) contendo uma homologia 2 com Src, polifosfato de inosital 5-fosfatase contendo um domínio SH2 que, por sua vez, é fosforilado e se associa com She e p62dok (p62dok é o protótipo de uma família de moléculas de adaptador, que inclui domínios de sinalização tal como um domínio de homologia do terminal amino de plasquestrina (domínio PH) , um domínio PTB e uma região do terminal carboxi contendo elementos PXXP e numerosos sítios de fosforilação (Carpino et al., 1997 Cell, 88: 197; Yamanshi et al., 1997, Cell, 88 : 205) .

A presente invenção engloba a caracterização dos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos, na regulação de uma ou mais respostas mediadas por IgE. De preferência, as linhas de células que co-expressam o receptor de elevada afinidade para IgE e o receptor de baixa afinidade para FcyRIIB serão usadas para caracterizar os anticorpos anti-FcyRIIB na regulação de respostas mediadas por IgE. Numa modalidade específica, as células de uma linha de células de leucemia basofílica de rato (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. 1981 Eur. J Immunol. 11:317) transfectadas com FcyRIIB humana de comprimento completo serão usadas nos processos aqui descritos. RBL-2H3 é uma linha de células de rato bem caracterizada que tem sido amplamente utilizada para estudar os mecanismos de sinalização subsequentes à activação de células mediada por IgE. Quando expressa em células RBL-2H3 e co-agregadas com FcsRI, a FcyRIIB inibe a mobilização de cálcio induzida por FceRI, a desgranulação e 89 a produção de citocinas (Malbec et al., 1998, J. Intmumol. 160: 1647; Daeron et al., 1995 J. Clin. Invest. 95: 577; Ott et al., 2002 J. of Immunol. 168:4430-4439).

Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba a caracterização dos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos quanto à inibição da activação de mastócitos induzida por FcsRI. Por exemplo, as células de uma linha de células de leucemia basofilica de rato (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. 1981 Eur. J. Immunol.il: 317) que tenham sido transfectadas com FcyRIIB são sensibilizadas com IgE e estimuladas quer com fragmentos F(ab')2 de IgG de coelho anti-rato, para agregar apenas FcsRI quer com IgG completa de coelho anti-rato para co-agregar FcyRIIB e FcsRI. Neste sistema, a regulação indirecta de moléculas de sinalização a jusante pode ser analisada após a adição dos anticorpos aqui descritos, em relação às células sensibilizadas e estimuladas. Por exemplo, pode-se analisar a fosforilação de FcyRIIB em tirosina e o recrutamento e fosforilação de SHIP, a activação de membros da família das cinases MAP, incluindo mas não se limitando a Erkl, Erk2, JNK ou p38; e a fosforilação de p62dok em tirosina e a sua associação com SHIP e RasGAP.

Um exemplo de um ensaio para determinar a inibição da activação de mastócitos induzida por FcsRI, por meio dos anticorpos aqui descritos, pode compreender o seguinte: a transfecção de células RBL-H23 humanas com FcyRIIB; a sensibilização das células RBL-H23 com IgE; a estimulação de células RBL-H23 quer com um F(ab')2 de IgG de coelho anti-rato (para agregar apenas FcsRI e provocar a sinalização mediada por FcsRI, como controlo) ou a estimulação de células RBL-H23 com IgG completa de coelho anti-rato (para co-agregar FcyRIIB e FcsRI, resultando na inibição da sinalização mediada por FcsRI). As células que 90 tenham sido estimuladas com anticorpos IgG completos de coelho anti-rato podem ainda ser pré-incubados com os anticorpos aqui descritos. A medição da actividade dependente de FcsRI das células que tinham sido pré-incubadas com os anticorpos aqui descritos e as células que não tenham sido pré-incubadas com os referidos anticorpos e a comparação dos níveis de actividade dependente de FcsRI nessas células, irá indicar uma regulação da actividade dependente de FcsRI, pelos referidos anticorpos. 0 exemplo do ensaio descrito antes pode ser usado, por exemplo, para identificar anticorpos que bloqueiam a ligação do ligando (IgG) ao receptor de FcyRIIB e antagonizam a inibição da sinalização de FcsRI mediada por FcyRIIB, por meio da prevenção da co-agregação de FcyRIIB e FcsRI. Do mesmo modo, este ensaio identifica os anticorpos que aumentam a co-agregação de FcyRIIB e FcsRI e que agonizam a inibição da sinalização de FcsRI mediada por FcyRIIB, através da promoção da co-agregação de FcyRIIB e FcsRI.

Numa modalidade preferida, a actividade dependente de FcsRI é pelo menos uma ou mais das seguintes: regulação das moléculas de sinalização a jusante (por exemplo, a regulação do estado de fosforilação de FcyRIIB, a regulação do recrutamento de SHIP, a regulação da actividade da cinase MAP, a regulação do estado de fosforilação de SHIP, a regulação da associação de SHIP e She e SHIP e Shc, a regulação do estado de fosforilação de p62dok, a regulação da associação de p62dok e SHIP, a regulação da associação de p62dok e RasGAP, a regulação da mobilização de cálcio, a regulação da desgranulação e a regulação da produção de citocinas. Ainda noutra modalidade preferida, a actividade dependente de FcsRI é a libertação de serotonina e/ou o 91 influxo extracelular de Ca++ e/ou a activação de mastócitos dependente de IgE. É conhecido de um especialista na matéria que a co-agregação de FcyRMB e FcsRI estimula a fosforilação de FcyRIIB em tirosina, estimula o recrutamento de SHIP, estimula a fosforilação de SHIP em tirosina e a associação com Shc e inibe a activação de membros da família das cinases MAP, incluindo, mas não se limitando a Erkl, Erk2, JNK, p38. Também é conhecido dos especialistas na matéria que a co-agregação de FcyRIIB e FcsRI estimula o aumento da fosforilação em tirosina de p62dok e a sua associação com SHIP e RasGAP.

Nalgumas modalidades, os anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos são caracterizados pela sua capacidade para regular uma resposta mediada por IgE através da monitorização e/ou da medição da desgranulação de mastócitos ou basófilos, de preferência num ensaio à base de células. De preferência, os mastócitos ou os basófilos que se utilizam nesses ensaios foram tratados por engenharia genética para conter FcyRIIB humana usando processos padrão recombinantes conhecido dos especialistas na matéria. Numa modalidade especifica, os anticorpos anti-FcyRIIB são caracterizados pela sua capacidade para regular uma resposta, mediada por IgE, num ensaio de libertação de β-hexosaminidase (enzima contida nos grânulos) à base de células. A libertação de β-hexosaminidase, a partir de mastócitos e de basófilos, é um evento primário em condições alérgicas e inflamatórias agudas (Aketani et al., 2001 Immunol. Lett. 75: 185-9; Aketani et al., 2000 Anal. Chem. 72: 2653-8). A libertação de outros mediadores inflamatórios, incluindo mas não se limitando a serotonina e a histamina, pode ser analisada para medir uma resposta mediada por IgE, em conformidade com os processos aqui descritos. Apesar de não ter a intenção de estar vinculado 92 a um mecanismo especifico de acção, a libertação de grânulos, tal como os que contêm β-hexosaminidase, a partir de mastócitos e basófilos, é um processo dependente da concentração intracelular de cálcio que é iniciada pela reticulação de FcsRI com o antigénio polivalente.

Um exemplo de um ensaio para caracterizar os anticorpos anti-FcYRIIB, aqui descritos, na mediação de uma resposta mediada por IgE é um ensaio de libertação de β-hexosaminidase, compreendendo o seguinte: a transfecção de células RBL-H23 com FcyRIIB humana; a sensibilização das células apenas com IgE de rato ou com IgE de rato e um anticorpo anti-FcYRIIB aqui descrito que estimula as células com diferentes concentrações de F(ab)2 de cabra anti-rato, de preferência num intervalo de 0,03 pg/mL a 30 pg/mL, durante cerca de 1 hora; a colheita do sobrenadante; a lise das células; e a medição da actividade de β-hexosaminidase libertada no sobrenadante por meio de um ensaio colorimétrico, por exemplo, utilizando p-nitrofenilo N-acetil^-D-glucosaminida. A actividade de libertação de β-hexosaminidase é expressa como percentagem da actividade libertada em relação à actividade total. A actividade da β-hexosaminidase libertada será medida e comparada em células tratadas apenas com o antigénio; apenas com IgE; com IgE e o anticorpo anti-FcYRIIB aqui descrito. Apesar de não ter a intenção de estar vinculado a um mecanismo especifico de acção, quando as células são sensibilizadas apenas com IgE de rato e reforçadas com fragmentos F(ab)2 de uma IgG policlonal de cabra anti-rato, ocorre a agregação e a reticulação de FcsRI dado que o anticorpo policlonal reconhece a cadeia leve da IgE de murino ligada a FcsRI, o que por sua vez leva à activação e à desgranulação de mastócitos. Por outro lado, quando as células são sensibilizadas com IgE de rato e um anticorpo anti-FcYRIIB 93 da presente invenção e reforçados com fragmentos F(ab)2 de uma IgG policlonal de cabra anti-rato ocorre a reticulação de FcsRI and FcyRIIB, resultando na inibição da desgranulação induzida por FcsRI. Em qualquer caso, F(ab)2 de cabra anti-rato induz uma libertação de β-hexoaminidase dependente da dose. Nalgumas modalidades, os anticorpos anti-FcYRIIB ligados ao receptor de FcyRIIB e reticulados com FcsRI não afectam a activação da via inibidora, ou seja, não há alteração no nível de desgranulação na presença de um anticorpo anti-FcYRIIB. Noutras modalidades, os anticorpos anti-FcYRIIB medeiam uma activação mais forte do receptor inibidor, FcyRIIB, quando ligados pelo anticorpo anti-FcYRIIB, permitindo uma reticulação eficaz ligada a FcsRI e a activação da via inibidora do homo-agregado de FcyRIIB. A presente invenção também engloba a caracterização do efeito dos anticorpos anti-FcYRIIB, aqui descritos, na resposta celular mediada pela IgE utilizando ensaios de mobilização de cálcio utilizando metodologias conhecidas pelos especialistas na matéria. Um exemplo de um ensaio de mobilização de cálcio pode incluir o seguinte: a iniciação de basófilos ou mastócitos com IgE; a incubação das células com um indicador de cálcio, por exemplo, Fura 2; a estimulação de células tal como descrito supra; e a monitorização e/ou a quantificação da concentração de cálcio intracelular por exemplo, utilizando citometria de fluxo. A presente invenção engloba a monitorização e/ou a quantificação de concentração de cálcio intracelular por qualquer processo conhecido por um especialista na matéria.

Em modalidades preferidas, os anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos inibem a activação das células mediada pela IgE. Noutras modalidades, os anticorpos anti-FcYRIIB aqui 94 descritos bloqueiam as vias inibidoras reguladas por FcyRIIB ou bloqueiam o sitio de ligação do ligando na FcyRIIB e assim aumentam a resposta imunitária. A capacidade para estudar os mastócitos humanos tem sido limitada pela ausência de culturas adequadas de mastócitos humanos a longo prazo. Recentemente estabeleceram-se duas novas linhas de mastócitos humanos dependentes do factor das células estaminais, designadas por LAD1 e LAD2, a partir de aspirados de medula óssea de um doente com sarcoma/leucemia dos mastócitos (Kirshenbaum et al., Leukemia research, no prelo) . Ambas as linhas de células já foram descritas por expressarem FcsRI e vários marcadores de mastócitos humanos. A presente invenção engloba a utilização das células LAD 1 e 2 nos processos da presente invenção para avaliar o efeito dos anticorpos da presente invenção nas respostas mediadas por IgE. Numa modalidade especifica, podem utilizar-se os ensaios de libertação de β-hexosaminidase, à base de células, tal como os descritos supra, em células LAD para determinar qualquer regulação da resposta mediada por IgE por meio dos anticorpos anti-FcyRIIB aqui descritos. Num exemplo de um ensaio, iniciam-se os mastócitos humanos, por exemplo LAD 1, com IgE humana quimérica anti-nitrofenol (NP) e reforçam-se com BSA-NP, o antigénio polivalente, e monitoriza-se a desgranulação das células medindo a β-hexosamninidase libertada no sobrenadante (Kirshenbaum et al., 2002, Leukemia research, no prelo).

Nalgumas modalidades, se os mastócitos humanos têm uma baixa expressão de FcyRIIB endógenas, como determinado usando processos-padrão conhecidos na técnica, por exemplo, coloração por SCAF, pode ser difícil controlar e/ou detectar diferenças na activação da via inibidora mediada 95 pelos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos. A presente invenção engloba assim processos alternativos, em que a expressão de FcyRIIB pode ser regulada através da utilização de citocinas e condições particulares de crescimento. FcyRIIB tem sido descrita como sendo altamente estimulada em linhas de células de monócitos humanos, por exemplo THP1 e U937 (Tridandapani et al., 2002, J. Biol Chem., 277 (7): 5082-5089) e em monócitos humanos primários (Pricop et al., 2001, J. of Immunol., 166: 531-537) por meio de IL4. A diferenciação de células U937 com dibutirilo cíclico AMP tem sido descrita por aumentar a expressão de FcyRB (Cameron et al., 2002 Immunology Letters 83, 171-179). Assim, a expressão endógena de FcyRIIB em mastócitos humanos, para serem usados nos processos da presente invenção, podem ser regulada usando citocinas, por exemplo, IL-4, IL-13, a fim de aumentar a sensibilidade de detecção. A presente invenção também engloba a caracterização dos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos para a inibição da sinalização mediada pelo receptor de células B (RCB). A sinalização mediada pode RCB pode incluir pelo menos uma ou mais respostas biológicas a jusante, tal como a activação e a proliferação de células B, a produção de anticorpos, etc. A co-agregação de FcyRIIB e RCB leva ainda à inibição da progressão do ciclo celular e da sobrevivência celular. Além disso, a co-agregação de FcyRIIB e RCB leva à inibição da sinalização mediada por RCB.

Especificamente, a sinalização mediada por RCB compreende pelo menos um ou mais dos seguintes: a regulação das moléculas de sinalização a jusante (por exemplo, estado de fosforilação de FcyRIIB, recrutamento de SHIP, localização de Btk e/ou PLCy, actividade da cinase MAP, recrutamento de Akt (sinal anti-apoptótico) , a mobilização 96 de cálcio, a progressão do ciclo celular e a proliferação celular.

Apesar de inúmeras funções efectoras da inibição da sinalização de RCB mediada por FcyRIIB serem mediadas através de SHIP, recentemente, tem sido demonstrado que as células B activadas por lipopolissacáridos (LPS) de ratos deficientes em SHIP apresentam uma inibição significativa da mobilização de cálcio mediada por FcyRIIB, produção de lns(l,4,5)P3 e fosforilação de Akt e Erk (Brauweiler A. et al., 2001, Journal of Immunology, 167 (1) : 204-211) . De acordo com isto, as células B ex vivo de ratos deficientes em SHIP podem ser usadas para caracterizar os anticorpos aqui descritos. Um exemplo de um ensaio para determinar a inibição da sinalização de RCB mediada por FcyRIIB por meio dos anticorpos pode compreender o seguinte: isolamento de células B do baço de ratos deficientes em SHIP, activação das referidas células com lipopolissacárido, e estimulação das referidas células quer com um F(ab')2 anti-IgM para agregar RCB ou com anti-IgM para co-agregar RCB com FcyRIIB. As células que tenham sido estimuladas com anti-IgM intacta, para co-agregar RCB com FcyRIIB, podem ainda ser pré-incubadas com os anticorpos da presente invenção. A actividade das células, dependente de FcyRIIB, pode ser medida por técnicas-padrão conhecidas na técnica. A comparação do nível de actividade dependente de FcyRIIB em células que tenham sido pré-incubadas com os anticorpos aqui descritos e as células que não foram pré-incubadas e a comparação dos níveis irá indicar uma regulação da actividade dependente de FcyRIIB por meio dos referidos anticorpos. A medição da actividade dependente de FcyRIIB pode incluir, por exemplo, a medição da mobilização do cálcio 97 intracelular por citometria de fluxo, medindo a fosforilação de Akt e/ou Erk, medindo a acumulação de PI (3,4, 5)P3 mediada por RCB ou medindo a proliferação de células B mediada por FcyRIIB.

Os ensaios podem ser usados, por exemplo, para identificar anticorpos que regulam a inibição da sinalização de RCB mediada por FcyRIIB, bloqueando o sitio de ligação do ligando (IgG) ao receptor de FcyRIIB e antagonizando a inibição da sinalização de RCB mediada por FcyRIIB, impedindo a co-agregação de FcyRIIB e RCB. Os ensaios também podem ser usados para identificar anticorpos que aumentam a co-agregação de FcyRIIB e RCB e agonizam a inibição da sinalização de RCB mediada por FcyRIIB. A presente invenção tem por objecto a caracterização dos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos quanto à sinalização, mediada por FcyRIIB, em monócitos/macrófagos humanos. A co-agregação de FcyRIIB com um receptor que comporta o elemento de activação à base de tirosina imunoreceptora (EATI) actua para regular de forma decrescente a fagocitose mediada por FcyRIIB usando SHIP como o seu efector (Tridandapani et al. 2002; J. Biol. Chem. 277 (7) : (5082-9) . A co-agregação de FcyRIIA com FcyRIIB resulta numa fosforilação rápida do resíduo de tirosina no elemento ΕΙΤΙ de FcyRIIB, lavando a um aumento da fosforilação de SHIP, à associação de SHIP com Shc e à fosforilação de proteínas com um peso molecular de 120 e 60-65 kDa. Além disso, a co-agregação de FcyRIIA com FcyRIIB resulta na regulação decrescente da fosforilação da Akt, que é uma cinase de serina-treonina que está envolvida na regulação celular e serve para suprimir a apoptose. 98 A presente invenção ainda engloba a caracterização dos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos quanto à sua inibição de fagocitose, em seres humanos, mediada por FcyR. Por exemplo, as células de uma linha celular monocitica humana THP-1 podem ser estimuladas tanto com fragmentos Fab do anticorpo monoclonal IV. 3 de rato contra FcyRII, como com um anticorpo de cabra anti-rato (para agregar apenas FcyRIIA) ou com o anticorpo monoclonal completo N.3 de rato e o anticorpo de cabra anti-rato (para co-agregar FcyRIIA e FcyRIIB). Neste sistema, a regulação de moléculas de sinalização a jusante, tal como a fosforilação de FcyRIIB em tirosina, a fosforilação de SHIP, a associação de SHIP com Shc, a fosforilação de Akt e a fosforilação de proteínas com o peso molecular de 120 e 60-65 kDa pode ser ensaiada, após a adição dos anticorpos aqui descritos, para as células estimuladas. Além disso, a eficiência fagocitica dependente de FcyRIIB, da linha de células de monócitos, pode ser medida directamente na presença e na ausência dos anticorpos da presente invenção.

Outro exemplo de ensaio para determinar a inibição da fagocitose mediada por FcyR em monócitos/macrófagos humanos, por meio dos anticorpos aqui descritos podem incluir o seguinte: a estimulação de células THP-1 tanto com um dos Fab do anticorpo IV. 3 anti-FcYRII de rato, como com um anticorpo caprino anti-rato (para agregar apenas FcyRIIA e estimular a sinalização mediada por FcyRIIA); ou com anticorpo de rato anti-FcYRII e anticorpo caprino anti-rato para co-agregar FcyRIIA e FcyRIIB e inibir a sinalização mediada por FcyRIIA. As células que tenham sido estimuladas com o anticorpo de rato anti-FcYRII e o anticorpo caprino anti-rato podem ainda ser pré-incubadas com os anticorpos aqui descritos. A medição da actividade dependente FcyRIIA das células estimuladas que tenham sido 99 pré-incubadas com os referidos anticorpos e as células que não tenham sido pré-incubadas com os referidos anticorpos e a comparação dos níveis de actividade dependente de FcyRIIA nestas células, irá indicar uma regulação da actividade, dependente de FcyRIIA, pelos referidos anticorpos. 0 exemplo do ensaio descrito antes pode ser usado, por exemplo, para identificar anticorpos que bloqueiam a ligação do ligando do receptor de FcyRIIB e antagonizam a inibição da sinalização de FcyRIIA, mediada por FcyRIIB, por meio da prevenção da co-agregação de FcyRIIB e FcyRIIA. Este ensaio, do mesmo modo, identifica anticorpos que melhoram co-agregação de FcyRIIB e FcyRIIA e agoniza a inibição da sinalizaçãode FcyRIIA mediada por FcyRIIB.

Numa outra modalidade, a presente invenção tem por objecto caracterizar a função dos anticorpos aqui descritos, medindo a capacidade das células THP-1 para fagocitar glóbulos vermelhos de ovelhas opsonizados com IgG e fluoresceinados (GVO, em inglês SRBC) por processos previamente descritos (Tridandapani et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480-7) . Por exemplo, um exemplo de um ensaio para medir a fagocitose compreende: o tratamento de células THP-1 com os anticorpos aqui descritos ou com um anticorpo de controlo que não se liga a FcyRII, a comparação dos níveis de actividade das referidas células, em que a diferença nas actividades das células (por exemplo, actividade de reajuste (o número de células THP-1 que se ligam aos GVO revestidos com IgG), a actividade de aderência (o número total de GVO ligados a células THP-1) e a taxa fagocítica) indicaria uma regulação da actividade dependente de FcyRIIA, por meio dos anticorpos. 100

Este ensaio pode ser usado para identificar, por exemplo, anticorpos que bloqueiam a ligação do ligando do receptor de FcyRIIB e antagonizam a inibição da fagocitose mediada por FcyRIIB. Este ensaio também pode identificar anticorpos que aumentam a sinalização de FcyRIIA mediada por FcyRIIB.

Numa modalidade preferida, os anticorpos aqui descritos regulam a actividade dependente de FcyRIIB em monócitos/macrófagos humanos em pelo menos uma ou mais das seguintes formas: regulação de moléculas de sinalização a jusante (por exemplo, regulação do estado de fosforilação de FcyRIIB, regulação da fosforilação de SHIP, regulação da associação de SHIP e Shc, regulação da fosforilação de Akt, regulação da fosforilação de proteínas adicionais em torno de 120 e 60-65 kDa) e regulação da fagocitose. A presente invenção abrange a caracterização dos anticorpos aqui descritos usando ensaios conhecido pelos especialistas na técnica para identificar o efeito dos anticorpos na função das células efectoras de anticorpos terapêuticos, por exemplo, a sua capacidade para aumentar a actividade CCDA específica do tumor dos anticorpos terapêuticos. Os anticorpos terapêuticos que podem ser utilizados de acordo com os processos aqui descritos incluem, mas não se limitam a anticorpos anti-tumor, anticorpos anti-virais, anticorpos anti-microbianos (por exemplo parasitas bacterianos e unicelulares), cujos exemplos são citados aqui (secção 5.4.6). Em particular, a presente invenção abrange a caracterização dos anticorpos aqui descritos quanto aos seus efeitos na função das células efectoras mediada por FcyR dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, anticorpos monoclonais específicos do tumor. Exemplos de funções das células 101 efectoras que podem ser analisadas de acordo com a presente invenção, incluem, mas não se limitam a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose, opsonização, opsonofagocitose, ligação de Clq e citotoxicidade mediada por células dependentes do complemento. Qualquer análise à base de células ou isenta de células, conhecida pelos especialistas na matéria, pode ser utilizada (para ensaios com células efectoras, ver Penissia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92/ Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44 (10): 841-8/ Lehmann et al., 2000 J.Immunol. Methods, 24 (1-2): 229-42/ Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64/ Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81/ Ding et al., 1998, Immunity 8: 403-411).

Os anticorpos aqui descritos podem ser analisados quanto ao seu efeito sobre a actividade CCDA mediada por FcyR dos anticorpos terapêuticos em células efectoras, por exemplo, as células assassinas naturais, usando qualquer um dos processos-padrão conhecidos pelos especialistas na matéria {ver, por exemplo Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). "Citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo" and "CCDA", conforme se usa aqui, tem o seu significado normal e habitual na técnica e refere-se a uma reacção in vítro mediada por células em que as células citotóxicas não especificas que expressam FcyRs (por exemplo, células monociticas, tal como células assassinas naturais (AN) e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula-alvo e, posteriormente, causam a lise da célula-alvo. Em principio, qualquer célula efectora com uma FcyR de activação pode ser accionada para mediar a CCDA. As células primárias para mediar a CCDA são células AN, que expressam apenas FcyRIII, enquanto os 102 monócitos, conforme o seu estado de activação, de localização ou de diferenciação, podem expressar FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Para uma revisão da expressão de FcyR em células hematopoiéticas ver, por exemplo, Ravetch et al., 1991, Annu Rev. Immunol., 9: 457-92.

As células efectoras são leucócitos que expressam uma ou mais FcyR e desempenham funções efectoras. De preferência, as células expressam, pelo menos, FcyRIII e desempenham a função efectora de CCDA. As células efectoras que podem ser usadas nos processos aqui descritos incluem mas não se limitam às células mononucleares do sangue periférico (CMSP, em inglês PBMC), células assassinas naturais (AN), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidas as CMSP e as células AN. As células efectoras podem ser isoladas a partir de uma sua fonte natural, por exemplo, de sangue ou das CMSP como aqui descrito. De preferência, as células efectoras utilizadas nos ensaios de CCDA aqui descritos são células mononucleares do sangue periférico (CMSP), que são purificadas, de preferência, a partir do sangue humano normal, usando métodos-padrão conhecidos dos especialistas na matéria, por exemplo, utilizando a centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Paque. Por exemplo, as CMSP podem ser isoladas por camadas de sangue em Ficoll-Hypaque e centrifugando as células a 500 g, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A camada de leucócitos pode ser colhida como células efectoras. Outras células efectoras que podem ser utilizadas nos ensaios de CCDA aqui descritos incluem, mas não se limitam a macrófagos derivados de monócitos (MDM) . Os MDM que são usados como células efectoras nos processos da presente invenção, obtêm-se, de preferência, como concentrados congelados ou usam-se frescos, (por exemplo, da Advanced Biotechnologies, 103 MD). Nas modalidades mais preferidas, utilizam-se monócitos humanos purificados como células efectoras nos processos aqui descritos. Os monócitos humanos purificados expressam os receptores de activação, FcyRIIIA e FcyRIIA e o receptor inibidor, FcyRIIB. Os monócitos humanos estão comercialmente disponíveis e podem ser obtidos como concentrados congelados, descongelam-se em meio básico contendo 10 % de AB de soro humano ou em meio básico com soro humano e 25-50 ng/mL de FRC-GM. Os níveis de expressão das FcyR nas células podem ser determinados directamente, por exemplo, usando uma análise de SCAF. Alternativamente, deixam-se as células maturar com macrófagos e depois coram-se já que o nível de expressão de FcyRIIB está aumentado nos macrófagos. Os anticorpos que podem ser utilizados na determinação do nível de expressão de FcyR incluem, mas não se limitam aos anticorpos anti-humanos FcyRIIA, por exemplo, anticorpos IV.3-FITC; anticorpos anti-FcYR, por exemplo, 32.2 FITC; e anticorpos anti-FcYRIIIA, por exemplo, CD16-PE, 3G8. Mais preferencialmente, os MDM são estimulados com IFNy e ainda tratados com citocinas, por exemplo, 200 unidades/mL de FEC-GM e/ou FEC-M, que são relatadas para melhorar a viabilidade dos monócitos em cultura. Apesar de não ser a intenção estar vinculada a um mecanismo específico de acção, IFFNy regula de forma crescente a expressão de FcyR, particularmente FcyRI e FcyRIIIA. A expressão de várias FcyR nas células efectoras, para se usarem nos processos aqui descritos, pode ser determinada pela análise por SCAF usando métodos conhecidos dos especialistas na matéria.

As células-alvo utilizadas nos ensaios de CCDA aqui descritas incluem, mas não se limitam a linhas de células de cancro da mama, por exemplo, com o número de acesso, na ATCC, ΗΤΒ-30 (ver, por exemplo, Tremp et al., 1976, Câncer 104

Res. 33-41); linfócitos B; as células derivadas de linfoma de Burkitts, por exemplo, células Raji, com o número de acesso, na ATCC, CCL-86 (ver, por exemplo, Epstein et al., 1965, J. Natl. Câncer Inst. 34: 231-240), células de Daudi com o número de acesso, na ATCC, CCL-213 (ver, por exemplo, Klein et al., 1968, Câncer Res. 28: 1300-10); linhas de células de carcinoma do ovário, por exemplo, OVCAR-3 [ver, por exemplo, Hamilton, Young et al 1983), SK-OV-3, PA-1, CAOV3, OV-90 e IGROV-1 (disponível no repositório do NCI Benard et al, 1985, Câncer Research, 45: 4.970-9) . As células-alvo devem ser reconhecidas pelo sítio de ligação do antigénio do anticorpo a ser analisado. As células-alvo para serem usadas nos processos aqui descritos podem ter um nível de expressão baixo, médio ou alto de um antigénio do cancro. Os níveis de expressão do antigénio do cancro podem ser determinados utilizando processos comuns conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, análise por SCAF. Por exemplo, a presente invenção abrange o uso de células de cancro de ovário, em que HER2/neu é expresso a diferentes níveis, tais como IGROV-1 (caracterizada por uma baixa expressão de HER2/neu) ou OVCAR-3 (caracterizada por uma elevada expressão de Her2/neu). Outras linhas de células de carcinoma do ovário que podem ser usadas como células-alvo nos processos aqui descritos incluem OVCAR-8 (Hamilton et al., 1983, Câncer Res. 43: 5379-89); SK-OV-3, OVCAR-4. Outras linhas de células de cancro da mama que podem ser usadas nos processos aqui descritos incluem BT-549, MCF7 e HS578T, todas disponíveis no repositório do NCI .

Um exemplo de ensaio para determinar o efeito dos anticorpos aqui descritos na actividade CCDA de anticorpos terapêuticos baseia-se num ensaio de libertação de 51Cr que compreende: a marcação de células-alvo com [ 51Cr ] Na2CrC>4 105 (esta molécula da membrana permeável da célula é normalmente usada para a marcação, dado que se liga às proteínas citoplasmáticas e, embora se liberte espontaneamente das células com uma cinética lenta, liberta-se massivamente no seguimento da necrose das células-alvo); de preferência, as células-alvo expressam um ou mais antigénios do tumor, as células-alvo de opsonização com um ou mais anticorpos que se ligam imunoespecificamente aos antigénios do tumor expressos na superfície celular das células-alvo, na presença e na ausência de um anticorpo aqui descrito, por exemplo 2B6, 3H7, combinando as células-alvo opsonizadas e radiomarcadas com células efectoras numa placa microtituladora, numa proporção apropriada entre células-alvo e células efectoras; a incubação da mistura de células de preferência durante 16-18 horas, preferencialmente a 37 °C; a recolha dos sobrenadantes; e a análise da radioactividade nas amostras de sobrenadantes. A citotoxicidade dos anticorpos terapêuticos, na presença e na ausência dos anticorpos da presente invenção, pode então ser determinada, por exemplo, usando a seguinte fórmula: % de lise = CCDA/CCIA (experimental cpm - perda do alvo cpm) / (lise do detergente cpm - perda do alvo cpm) x 100 %. Alternativamente, a % de lise = (CCDA-AICC) / (libertação máxima - libertação espontânea). A lise específica pode ser calculada utilizando a fórmula: lise específica = % de lise com as moléculas da presente invenção - % de lise na ausência das moléculas da presente invenção. Pode-se gerar um gráfico fazendo variar qualquer quer a proporção de células-alvo: células efectoras ou a concentração dos anticorpos.

Ainda noutra modalidade, os anticorpos aqui descritos são caracterizados pela citotoxicidade celular dependente de anticorpos (CCDA) , de acordo com o processo descrito 106 anteriormente, ver, por exemplo, Ding et al., Immunity. 1998, 8:403-11;

Nalgumas modalidades, a presente invenção abrange a caracterização da função dos anticorpos aqui descritos para reforçar a actividade CCDA dos anticorpos terapêuticos num ensaio basicamente in vitro e/ou num modelo animal.

Numa modalidade especifica, a presente invenção engloba a determinação da função dos anticorpos aqui descrito no reforço da CCDA especifica do tumor usando um modelo de cancro do ovário e/ou um modelo de cancro da mama.

De preferência, os ensaios de CCDA aqui descritos são feitos usando mais do que uma linha de células de cancro, caracterizada pela expressão de pelo menos um antigénio do cancro, em que o nivel de expressão do antigénio do cancro varia entre as linhas de células cancerígenas usadas. Apesar de não ser intenção estar vinculado a um mecanismo específico de acção, realizando os ensaios de CCDA em mais do que uma linha de células em que o nível de expressão do antigénio do cancro é variado, vai permitir a determinação da severidada da depuração do tumor dos anticorpos da presente invenção. Numa modalidade, os ensaios de CCDA são feitos usando duas linhas de células cancerosas compreendendo uma primeira linha de células de cancro e uma segunda linha de células de cancro, em que a primeira linha de células de cancro é caracterizada por um nível elevado de expressão de um antigénio do cancro e a segunda linha de células de cancro é caracterizada por um nível baixo de expressão do antigénio do cancro. 107

Num exemplo de ensaio, 0VCAR3, uma linha de células de carcinoma do ovário pode servir como tumor-alvo expressando os antigénios do tumor, HER2/neu e TAG-72; monócitos humanos, que expressam a activação de FcyRIIA e a inibição de FcyRIIB, podem ser usadas como efectores; e os anticorpos de murino específicos do tumor, 4D5 e CC49, podem ser usados como anticorpos específicosdo do tumor. As células de OVCAR-3 estão disponíveis na ATCC e podem ser derivadas a partir de ascites malignas de um doente com adenocarcinoma papilar progressivo do ovário após quimioterapia de combinação. Hamilton, Young, et al., 1983. De preferência, as células de OVCAR-3 propagam-se em meio complementado com 0,01 mg/ml de insulina de bovino. Pode-se injectar 2 x 106 células de OVCAR-3 viáveis por via subcutânea (s.c) em ratos NOD-SCID atímicos com idade e peso adequados, com Matrigel (Becton Dickinson). O peso estimado do tumor pode ser calculado pela fórmula: comprimento - (largura)2/2 e, de preferência, não ultrapassa 3 gramas. Consoante a ancoragem, o tumor pode ser isolado após 6-8 semanas e as células podem ser dissociadas, adicionando 1 pg de colagenase (Sigma) por grama de tumor após a incubação durante a noite. As células podem então ser injectadas i.p. para o estabelecimento do modelo de xenotransplante e ensaiadas como alvos em ensaios de CCDA, tal como descrito aqui, para ensaiar a CCDA aumentada dos anticorpos específicos do tumor, por exemplo, CC49 e 4D5, por meio dos anticorpos anti-FcyRIIB da presente invenção.

Os hibridomas que segregam os anticorpos CC49 e 4D5 estão disponíveis na ATCC e as sequências dos nucleótidos de cadeia pesada e de cadeia leve estão no domínio público. Ricon, Gourlie, et al., 1993; Cárter, Preser et al., 1992. De preferência, os anticorpos 4D5 e CC49 tornam-se 108 quiméricos usando processos-padrão conhecidos por especialistas na matéria para que a sequência da Fc humana, por exemplo, a região constante humana de IgGl, é enxertada na região variável dos anticorpos de murinos, a fim de providenciar a função efectora. Os anticorpos quiméricos 4D5 e CC49 ligam-se através da sua região variável às linhas de células alvo e por via da sua região Fc com a FcyRs expressa em células efectoras humanas. CC49 é dirigido a TAG-72; uma mucina de elevado peso molecular que é altamente expressa em muitas células de adenocarcinoma e carcinomas do ovário. Lastroria et ai., 1998; Szpak et ai., 1989; Sheer et ai., 1988. 4D5 é direccionado para HER2/neu, o receptor do factor de crescimento epidérmico (Cárter et al 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285-9). Os anticorpos aqui descritos podem ser então utilizados para investigar o aumento da actividade de CCDA dos anticorpos específicos do tumor, bloqueando a FcyRIIB inibidora. Apesar de não ser intenção estar vinculado a um mecanismo de acção específico, considera-se que, após a activação das células efectoras que expressam pelo menos uma FcyR de activação, por exemplo, FcyRIIA, a expressão do receptor inibidor (FcyRIIB) aumenta e isto limita a depuração de tumores à medida que a actividade de CCDA da FcyRIIA é suprimida. No entanto, os anticorpos aqui descritos podem servir como um anticorpo de bloqueio, ou seja, um anticorpo que irá impedir o sinal inibidor de ser activado e, assim, o sinal de activação, por exemplo, a actividade de CCDA, será mantida por um período mais longo e pode resultar numa depuração mais potente do tumor.

De preferência, os anticorpos aqui descritos para uso em ensaios de CCDA foram modificados para incluir pelo menos uma modificação de aminoácidos, de modo que a sua função efectora tenha sido diminuída, mais preferivelmente 109 abolida. Nalgumas modalidades, os anticorpos foram modificados para incluir pelo menos uma modificação de aminoácido que reduz a ligação a uma FcyR de activação, por exemplo, FcyRIIIA, mantendo FcyRIIIA a actividade máxima de bloqueio da FcyRIIB, em comparação com um anticorpo de tipo selvagem aqui descrito. Os anticorpos aqui descritos podem ser modificados de acordo com qualquer processo conhecido pelos especialistas na matéria ou divulgados neste documento. Qualquer modificação de aminoácidos que seja conhecida por perturbar a função efectora pode ser utilizada de acordo com os processos aqui descritos. Nalgumas modalidades, os anticorpos aqui descritos são modificados de modo que a posição 265 é modificada, por exemplo, a posição 265 é substituído por alanina. Em modalidades preferidas, a região constante de um anticorpo de murino da presente invenção é trocada com a região constante humana correspondente compreendendo uma substituição do aminoácido, na posição 265, com alanina, de modo que a função efectora é abolida enquanto se mantém a actividade de bloqueio de FcyRIIB. Uma mudança de um único aminoácido, na posição 265 da cadeia pesada de IgGl tem mostrado para reduzir significativamente a ligação a FcyR com base em ensaios de ELISA e resultado numa redução da massa tumoral. Ver, Shields et al., 2002 and Clynes et al., 2000. Noutras modalidades, os anticorpos aqui descritos são modificadas de modo que a posição 297 é modificada, por exemplo, a posição 297 é substituída com glutamina, para que o sítio de glicosilação ligado a N seja eliminado. Ver, Sheilds et al., 2001/ Sondermann et al., 2000; Jefferis et al., 1995. A modificação neste sítio tem sido referida como abolindo toda a interacção com FcyRs. Em modalidades preferidas, a região constante de um anticorpo de murino 110 aqui descrita é trocada com a região constante humana correspondente compreendendo uma substituição do aminoácido, na posição 265 e/ou 297, de modo que a função efectora é abolida enquanto se mantém a actividade de bloqueio de FcyRIIB.

Um exemplo de ensaio para determinar a actividade de CCDA dos anticorpos específicos do tumor na presença e na ausência dos anticorpos aqui descritos é um ensaio não radioactivo, à base de európio fluorescente (BATDA, Perkin Elmer) e pode compreender o seguinte: marcar as células alvos com um éster acteoxilmetilo de ésteres que reforçam a fluorescência, que forma um ligando hidrofílico (TDA) com a membrana das células por hidrólise dos ésteres; este complexo é incapaz de sair da célula e é libertado somente após a lise da célula pelos efectores; adicionar os alvos marcados às células efectoras na presença de anticorpos anti-tumorais e um anticorpo aqui descrito; incubar a mistura do alvo e das células efectoras durante 6 a 16 horas, de preferência a 37 °C. Pode-se avaliar a extensão da actividade de CCDA através da medição da quantidade de ligando que se liberta e interage com o európio (reagente DELFIA; PerkinElmer). 0 ligando e o európio formam um quelato muito estável e altamente fluorescentes (EuTDA) e o valor da fluorescência medida é directamente proporcional ao número de células lisadas. A percentagem específica da lise pode ser calculada utilizando a fórmula: (Lise experimental - lise espontânea/ lise total -lise espontânea) x 100 %. A actividade das AN será excluída com um anticorpo F(ab)2 do anticorpo de coelho anti-asialo Gmi, (WAKO Pure Chemical, Richmond, VA) no ensaio de CCDA. Este ensaio in vitro pode ser usado como referência para estabelecer as condições para o modelo de clearance do tumor in vivo, conforme divulgado aqui. 111

Nalgumas modalidades, se a sensibilidade do ensaio de CCDA à base de fluorescência é demasiado baixo para detectar a actividade de CCDA dos anticorpos terapêuticos, a presente invenção abrange os ensaios de CCDA com base radioactiva, tal como o ensaio de libertação de 51Cr. Os ensaios com base radioactiva podem ser feitos em substituição ou em combinação com os ensaios de CCDA.

Um exemplo de um ensaio de libertação de 51Cr para caracterizar os anticorpos aqui descritos pode incluir o seguinte: marcação de 1-2 X106 células OVCAR-3 com 50 pCi de 51Cr durante 12 h; tripsinização das células; adição de 5 x 103 células a uma placa de 96 poços; opsonização das células-alvo com anticorpos 4D5 e CC49, na presença e na ausência de um anticorpo aqui descrito, a uma concentração especifica, de preferência de 4D5 e CC49, a uma concentração variando de 1 - 15 pg/mL; adição das células-alvo opsonizadas a macrófagos derivados de monócitos (MDM) (células efectoras); de preferência, numa proporção que varia de 10:1 a 100:1; incubação da mistura de células durante 16 - 18 horas, a 37 °C; recolha dos sobrenadantes; e análise da radioactividade no sobrenadante. A cito-toxicidade de 4D5 e CC49, na presença e na ausência de um anticorpo aqui descrito, pode então ser determinada, por exemplo, usando a seguinte fórmula: % lise = (experimental cpm-perda alvo cpm)/(lise do detergente cpm-perda-alvo cpm) x 100 %. Alternativamente, a % de lise = (CCDA-AICC) / (libertação máxima - libertação espontânea). A lise especifica pode ser calculada utilizando a fórmula: lise especifica = % de lise com as moléculas da presente invenção - % de lise na ausência das moléculas da presente invenção. Pode-se gerar um gráfico fazendo variar quer a 112 proporção entre células-alvo e células efectoras ou concentração dos anticorpos.

Nalgumas modalidades, quando os ensaios de CCDA com base na fluorescência e/ou os ensaios de CCDA com base radioactividade não são suficientemente sensíveis para a detecção da actividade de CCDA dos anticorpos terapêuticos, na presença de um anticorpo aqui descrito, a presente invenção abrange o ensaio de citotoxicidade mediado por monócitos, conforme descrito anteriormente. Kleinerman, Gano, et al., 1995. IFN-γ tem demonstrado que estimula os

monócitos tornando-os tumoricidas ín vitro. Adams & Marino 1981. Nalgumas modalidades, vai usar-se uma modificação do ensaio de citotoxicidade mediado por monócitos usando células OVCAR-3 e monócitos activados se tanto o ensaio à base de európio como o ensaio de 51Cr não resultarem na libertação da detecção da actividade CCDA. Um exemplo de um ensaio de citotoxicidade mediado por monócitos pode incluir o seguinte: incubação das células do tumor na fase de crescimento exponencial, durante a noite, com 3 [H] timidina 0,5 pCi; lavagem das células para eliminar o marcador não ligado; tripsinização das células; adição das células-alvo marcadas a monócitos activados por IFN-γ aderentes (células efectoras) numa proporção de células efectoras-alvo variando de 100:1 a 10:1, durantea 24 horas, de preferência a 37 °C; eliminação das células não aderentes; re-alimentação das células com meio fresco; e cultura das células durante mais dois dias. De preferência, o ensaio é realizado na ausência de anticorpo, na presença de 1-15 pg/mL de anticorpo anti-tumor e com monócitos activados quer pré-incubados com um anticorpo anti-FcYRIIB (1-15 pg/mL) ou co-incubados com um anticorpo anti-FcYRIIB e células tumorais. O ensaio é realizado, preferencialmente, em paralelo usando monócitos não tratados. A 113 radioactividade dos lisados pode ser determinada pela fórmula: [radioactividade (cpm) das células-alvo em cultura com monócitos e anticorpos radioactividade das células-alvo em cultura com monócitos na presença de IFNy e anticorpos] / radioactividade das células-alvo em cultura com monócitos e anticorpos x 100.

Nalgumas modalidades, a actividade, in vivo, dos anticorpos de FcyRIIB aqui descritos, é determinada em modelos de tumores humanos xenoenxertados. Os tumores podem ser estabelecidos utilizando qualquer uma das linhas de células cancerosas descritas supra. Nalgumas modalidades, os tumores serão estabelecidos com duas linhas de células de cancro, onde a primeira linha de células de cancro é caracterizada por uma baixa expressão de um antigénio do cancro e uma segunda linha de células de cancro, em que a segunda linha de células de cancro é caracterizada por uma elevada expressão do mesmo antigénio do cancro. A clearance do tumor pode então ser determinada usando processos conhecidos dos especialistas na matéria, usando um anticorpo anti-tumoral que se liga imunoespecificamente ao antigénio do cancro na primeira e na segunda linhas de células cancerosas e um modelo apropriado de rato, por exemplo, um modelo de rato nu Balb/c (por exemplo, Jackson Laboratories, Taconic), com monócitos humanos transferidos adoptivamente e as MDM como células efectoras. Qualquer um dos anticorpos descritos supra pode então ser testado neste modelo de animal para avaliar o papel do anticorpo anti-FcyRIIB aqui descrito na clearance do tumor. 114

Um exemplo de um método para analisar in vivo a actividade de um anticorpo aqui descrito pode incluir o seguinte: estabelecimento de um modelo de xenoenxerto em murino utilizando uma linha de células de cancro caracterizada pela expressão de um antigénio do cancro e a determinação do efeito de um anticorpo aqui descrito num anticorpo especifico para o antigénio do cancro expresso na linha celular de cancro na mediação da clearance do tumor. De preferência, a actividade in vivo é ensaiada em paralelo usando duas linhas de células de cancro, em que a primeira linha de células de cancro é caracterizada por um primeiro antigénio do cancro expresso em níveis baixos e uma segunda linha de células de cancro, caracterizada pela mesmo antigénio do cancro ser expressa a um nível mais elevado em relação à primeira linha de células cancerosas. Estas experiências vão assim aumentar o rigor da avaliação do papel de um anticorpo aqui descrito na clearance do tumor. Por exemplo, os tumores podem ser estabelecidos com a linha de células IGROV-1 e pode-se avaliar o efeito de um anticorpo anti-FcYRIIB aqui descrito na clearance tumor de um anticorpo específico Her2/neu. Os ratos podem ser colocados em grupos de 4 e ser monitorizados três vezes por semana. A fim de estabelecer os modelos de tumor de xenoenxerto, pode-se injectar 5xl06 células viáveis, por exemplo, de IGROV-1, SKBR3, por exemplo, s.c. em ratos, por exemplo com três anos e peso compatível de animal fêmea, pelado, atímico usando, por exemplo, Matrigel (Becton Dickinson) . 0 peso estimado do tumor pode ser calculado pela fórmula: comprimento x (largura)2/02 e, de preferência não ultrapassa 3 gramas. Para fazer a passagem in vivo das células para expansão, dependendo da ancoragem, o tumor pode ser isolado e as células podem ser dissociadas, por exemplo, adicionando colagenase, de preferência 1 pg por grama de tumor, a 37 °C. A injecção de células IGROV-1 por 115 via s.c. é a preferida. A injecção de células-1 IGROV s.c. dá origem a tumores de crescimento rápido, enquanto a via i.p. induz uma carcinomatose peritoneal que mata os ratos em 2 meses (Benard et al., 1985, Câncer Res. 45: 4970-9). Dado que as células IGROV-1 formam tumores no prazo de 5 semanas, no dia 1 após a injecção das células tumorais, os monócitos, como efectores, são co-injectados i.p. junto com um anticorpo terapêutico especifico para Her2/neu, por exemplo, Ch4D5 e um anticorpo aqui descrito; por exemplo, o anticorpo quimérico 2B6 ou 3H7, tal como descrito supra. De preferência, os anticorpos são injectados a 4 pg de cada por cada grama de peso corporal do rato (per) . A injecção inicial será seguida de injecções semanais de anticorpos durante 4-6 semanas. As células efectoras humanas serão repostas uma vez em cada duas semanas. Um grupo de ratos não receberá nenhum anticorpo terapêutico, mas vai ser injectado com um anticorpo quimérico 4D5 compreendendo uma mutação N297A e IgGl humana como anticorpos de controlo do isotipo para os anticorpos anti-tumor e anti-FcYRIIB, respectivamente. 0 quadro 3 a seguir é um exemplo de uma configuração para estudos de clearance de tumores, de acordo com a presente invenção. Como se mostra no quadro 3, serão necessários seis grupos de 48 ratos cada um deles a necessitar de um ensaio sobre o papel de um anticorpo aqui descrito na clearance do tumor, em que se usa uma combinação de células alvo e células efectoras e em que se usam duas combinações diferentes de concentração de anticorpos. No grupo A, injectam-se apenas células tumorais; no grupo B injectam-se células tumorais e monócitos; no grupo C, injectam-se células tumorais, monócitos e um anticorpo anti-tumor (ch4D5); no grupo D, injectam-se células tumorais, monócitos, anticorpo anti- 116 tumor e um anticorpo anti-FcYRII; no grupo E, injectam-se as células tumorais, monócitos e um anticorpo anti-FcYRIIB; no grupo F, injectam-se células tumorais, monócitos, Ch4D5 (N297A) e IgGl humana. Será entendido, por um especialista na matéria, que as várias concentrações de anticorpos de várias combinações de anticorpos podem ser analisadas nos modelos de tumor descritos. De preferência, os estudos que usam uma linha de células de cancro da mama, por exemplo, SKBR3, são feitos em paralelo com a experiência descrita antes. QUADRO 3 8 ratos/ grupo Célula de tumor s. c dia 0 Monócitos i.p. no dia 1 ch4D5 a 4 pg/g de per dia 1 Lp ch4D5 N297A a 4 pg/g de per dia 1 Lp ch2B6 N297A a 4 pg/g de per dia 1 Lp IgGl humana 4 pg/g de per dia 1 i.p A + - - - - - B + + - - - - C + + + - - - D + + + - + - Ξ + + - - + - F + + - + - + 0 ponto final dos modelos de tumor xenoenxertados é determinado com base na dimensão dos tumores, no peso dos ratos, no tempo de sobrevida e nos exames histoquimico e histopatológico do cancro, usando processos conhecidos pelos especialistas na matéria. Cada um dos grupos de ratos, no quadro 3, será avaliado. Os ratos são monitorizados, de preferência, três vezes por semana. Os critérios para o crescimento do tumor podem ser distensão abdominal, presença de massa palpável na cavidade peritoneal. De preferência fazem-se as estimativas do peso do tumor versus os dias após a inoculação. Uma comparação 117 entre os critérios referidos antes, dos ratos no grupo D, em relação aos dos outros grupos vai definir o papel de um anticorpo da presente invenção no aumento da clearance do tumor. De preferência, os animais tratados com anticorpos estarão sob observação durante mais 2 meses, segundo o grupo de controlo.

Em modalidades alternativas, podem-se usar ratos sujeitos a "knock in" de FcyRIIB humana, ratos que expressam FcyRIIB humana em células efectoras de murino, para estabelecer a actividade in vivo dos anticorpos aqui descritos, em vez de transferir adoptivamente células efectoras. Os ratos iniciadores que expressam FcyRIIB humana podem ser gerados por introdução ("knocking in") de FcyRIIB humana no sitio de FcyRIIB de rato. Os ratos iniciadores podem então ser novamente cruzados com os ratos nus iniciais e irão expressar o receptor de FcyRIIB humana. As células efectoras de murino resulantes irão expressar a activação endógena de FcyRI e GcyRIIIA e os receptores humanos inibidores de FcyRIIB. A actividade in vivo dos anticorpos aqui descritos pode ainda ser ensaiada num modelo de murino com xenoenxerto com células derivadas de tumor humano primário, tal como células derivadas de carcinomas humanos primários do ovário e da mama. As amostras de ascites e derrames pleurais de doentes com cancro podem ser analisadas quanto à expressão de Her2/neu, usando processos conhecidos dos especialistas na matéria. As amostras de doentes com carcinoma de ovário podem ser tratadas fazendo rodar as ascites a 6370 g, durante 20 minutos, a 4 °C, fazendo a

lise dos glóbulos vermelhos e lavando as células com SBF (soro bovino fetal) . Uma vez determinada a expressão de Her2/neu em células tumorais, em duas amostras, pode-se 118 selecionar a média e um elemento de elevada expressão para inoculação s.c. para estabeler o modelo de tumor de xenoenxerto. As ascites isoladas serão injectadas i.p. em ratos para expandir as células. Aproximadamente 10 ratos podem ser injectados i.p. e cada ascite dos ratos vai ser sujeita a várias passagens para se obter ascites de um total de 20 ratos, que podem ser usados para injectar um grupo de 80 ratos. As amostras de derrames pleurais podem ser tratadas utilizando um processo semelhante ao das ascites. As células tumorais de Her2/neu+, a partir de amostras de derrames pleurais, podem ser injectadas na parte superior direita e esquerda das patas dos ratos.

Nalgumas modalidades, se a percentagem de células neoplásicas, nas amostras de ascites ou de derrames pleurais, for baixa em comparação com outros subconjuntos celulares, as células neoplásicas podem ser expandidas in vitro. Noutras modalidades, as células tumorais podem ser purificadas usando pérolas magnéticas revestidas com o anticorpo CC49 (anti-TAG-72) , como descrito anteriormente, ver, por exemplo, Barker et al., 2001, Gynecol. Oncol. 82: 57, 63. Resumidamente, as pérolas magnéticas revestidas com o anticorpo CC49 podem ser usadas para separar as células do tumor do ovário que serão separadas das pérolas por um período de incubação durante a noite, a 37 °C. Nalgumas modalidades, se as células tumorais não têm o antigénio TAG-72, pode-se usar a depleção negativa usando um cocktail de anticorpos, tal como os fornecidos pela Stem Cell Technologies, Inc., Canadá, para enriquecer as células tumorais.

Noutras modalidades, outros marcadores de tumores, para além Her2/neu, podem ser usados para separar as células tumorais obtidas a partir de amostras de ascites e 119 de derrames pleurais de células não tumorais. No caso de derrame pleural ou de tecido mamário, tem sido relatado recentemente que CD44 (uma molécula de adesão), B38.1 (um marcador especifico para o cancro da mama/ovário), CD24 (uma molécula de adesão) podem ser usados como marcadores, ver, por exemplo, AI Hajj, et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 3983, 8. Uma vez purificadas, as células tumorais podem ser injectadas s.c. em ratos para a expansão.

De preferência, faz-se imunohistoquimica e histoquimica em ascites e derrame pleural de doentes para analisar caracteristicas estruturais da neoplasia. Tais processos são conhecidos dos especialistas na matéria e estão abrangidos pela presente invenção. Os marcadores que podem ser monitorizados incluem, por exemplo, citoqueratina (para identificar células neoplásicas do ovário mesoteliais das células inflamatórias e mesenquimais); calretinina (para separar as células as células mesoteliais das células neoplásicas positivas para Her2neu); e CD45 (para separar as células inflamatórias do resto da população de células nas amostras). Os marcadores adicionais que podem ser utilizados incluem CD3 (células T) , CD20 (células B) , CD56 (células AN) e CD 14 (monócitos) . Será entendido por um especialista na matéria que os processos de imunohistoquimica e histoquimica descritos supra, são aplicados analogamente a qualquer célula de tumor para uso nos processos da presente invenção. Após a inoculação s.c. de células tumorais, os ratos são seguidosNo que respeita as alterações clinicas e anatómicas. Quando necessário, os ratos podem ser necropsiados para correlacionar a carga tumoral total com a localização de órgãos específicos. 120

Numa modalidade especifica, os tumores são estabelecidos usando células OVCAR-3 e ascites de carcinoma humano.do ovário. As ascites contêm, de preferência, tanto os alvos efectores como os tumorais para a análise dos anticorpos. As linhas de células OVCAR-3 são transferidas, de preferência, com monócitos como efectores. Ambas as fontes de tumor de ovário podem então ser transferidas, de forma adoptiva, para ratos pelados e NOD/SCID e pode-se determinar a clearance do tumor com anticorpos específicos do tumor e os anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos.

De preferência, as células OVCAR-3 propagam-se em meio complementado com 0,01 mg/ml de insulina de bovino. Pode-se injectar 2 x 106 células de OVCAR-3 por via subcutânea (s.c) em ratos atímicos com idade e peso combinados NOD-SCID, com Matrigel (Becton Dickinson). O peso estimado do tumor pode ser calculado pela fórmula: comprimento (largura)2/2 e, de preferência, não ultrapassa 3 gramas. Consoante a ancoragem, o tumor pode ser isolado após 6-8 semanas e as células podem ser dissociadas, adicionando 1 pg de colagenase (Sigma) por grama de tumor após a incubação durante a noite. As células podem então ser injectadas i.p. para o estabelecimento do modelo de xenotransplante e para serem analisadas como alvos em ensaios de CCDA tal como descrito aqui para ensaiar o aumento de CCDA causado pelos anticorpos anti-FcYRIIB aqui descritos.

As injeções i.p. das preparações de células tumorais, tal como descrito antes irão desenvolver distensões abdominais devido à formação de ascites, que serão colhidas por lavagem da cavidade peritoneal para recolher as células do tumor. Pode-se injectar, in vivo, i.p. 10 x 106 células OVCAR-3 submetidas a uma passagem, no dia 0, em oito ratos por grupo, conforme se mostra no quadro 4. Tem sido 121 relatado que a injecção de 11,5 x 106 células resulta numa distensão abdominal visível em 40-50 dias. Hamilton, Young, et al., 1983. Aos 28 e 42 dias após a injecção das células tumorais, os anticorpos terapêuticos, por exemplo, ch4D5 e chCC49 (que tinham sido preparados como descrito supra) e um anticorpo aqui descrito, por exemplo, 2B6, será co-injectado, a 2 pg e 5 pg por grama de peso corporal do rato, para momento no tempo. A injecção de anticorpos anti-tumorais, em dois momentos antes do estabelecimento do tumor, vai permitir a avaliação da clearance do tumor em vários estágios de crescimento dado que a expressão ideal dos marcadores tumorais pode variar. Nos grupos de ratos que não recebem anticorpos pode-se simular as injecções com uma solução salina estéril tamponada com fosfato (STF).

QUADRO 4 ESTABELECIMENTO DO MODELO DE TUMOR EM RATOS 8 Ratos por grupo Células de tumor i.p. Dia 0 Monócitos i.p. Dia 26 Anticorpo Ch CC49 2 pg/g de peso corporal do rato Dia 28 Anticorpo anti-CD32B 2 pg/gm de peso corporal do rato Dia 28 A + - - - B + + - - C + + + D + + + + E + + - + QUADRO 5 ANTICORPOS D Dl D2 D3 C Cl Ξ EI DIA 28 CC4 9 QUADRO 2 2 5 5 QUADRO 2 5 QUADRO 2 0 2B6 QUADRO 2 5 2 5 QUADRO 2 0 QUADRO2 5 DIA 42 CC4 9 2 2 5 5 2 5 0 0 2B6 2 5 2 5 0 0 2 5 122

Como se mostra nos quadros 4 e 5, serão necessários 10 grupos de 8 ratos cada, para avaliar o papel do anticorpo anti-FcYRIIB no reforço da clearance de tumores. No grupo A, injectam-se apenas as células tumorais; no grupo B injectam-se células de tumor e monócitos; no grupo C, injectam-se células tumorais, monócitos e um anticorpo anti-tumor; no grupo D, injectam-se as células tumorais, um anticorpo anti-tumor, um anticorpo anti-FcYRIIB e monócitos e no grupo E injecta-se um anticorpo anti-FcYRIIB e monócitos. Comparando os resultados obtidos no grupo D com os dos outros grupos de ratos, irá definir-se o papel dos anticorpos anti-FcYRIIB no aumento da taxa de eliminação do tumor.

Nalgumas modalidades, as ascites de carcinoma do ovário dos doentes podem ser usadas como fontes de células tumorais para determinar a actividade in vivo dos anticorpos aqui descritos. Cerca de 18-20 amostras de ascites de carcinoma de ovário podem ser obtidas de doentes. O modelo de tumor de xenoenxerto pode ser estabelecido para três amostras de ascites de carcinoma do ovário. Estas amostras podem ser tratadas por centrifugação das ascites a 2500 g, durante 20 minutos, a 4 °C; por lise dos glóbulos vermelhos seguida de lavagem das células com STF. As células podem ser tratadas da seguinte forma: as lâminas são coradas para as análises histopatológica e imunoquimica usando processos conhecidos dos especialistas na matéria, antes do estabelecimento do modelo de tumor xenoenxertado para analisar a percentagem de células neoplásicas versus a população de células efectoras e outros subconjuntos celulares que podem influenciar o estabelecimento do modelo de tumor. Após a avaliação de células neoplásicas e das células efectoras adequadas na amostra, conforme determinado por processos imuno- 123 histoquímicos, as ascites podem ser injectadas directamente, intra-peritonealmente, em ratos NOD-SCID e Nude para estabelecer os tumores. A eliminação do tumor e o papel dos anticorpos anti-FcYRIIB podem então ser analisados, como descrito supra.

5.2.1 POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM UM ANTICORPO A presente invenção também inclui polinucleótidos que codificam os anticorpos aqui descritos (por exemplo, anticorpo monoclonal de rato produzido a partir do clone 2B6 ou 3H7, com os números de acesso, na ATCC, PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente) ou de outros anticorpos monoclonais produzidos pelos processos de imunização aqui descritos e as suas versões humanizadas e processos para a sua produção. A presente invenção abrange o polinucleótido que codifica a cadeia pesada do anticorpo 2B6, com o número de acesso, na ATCC, PTA-4591, conforme descrito na SEQ ID No. 1. A presente invenção também engloba o polinucleótido que codifica a cadeia leve do anticorpo 2B6, com o número de acesso, na ATCC, PTA-4591, conforme descrito na SEQ ID No. 3.

Os processos da presente invenção também abrangem os polinucleótidos que hibridam em condições rigorosas por exemplo, condições de elevado rigor, condições de rigor intermédio ou condições de menor rigor, com polinucleótidos que codificam um anticorpo da presente invenção. A hibridação pode ser realizada sob várias condições rigorosas. A titulo de exemplo e não limitativo, os procedimentos usando condições de pouco rigor são os seguintes (ver também Shilo e Weinberg, 1981, Proc. Natl. 124

Acad. Sei. U.S.A. 78, 6789-6792). Os filtros contendo ADN são pré-tratados durante 6 h, a 40 °C, numa solução contendo formamida a 35 %, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP a 0,1 %, Ficoll a 1 %, ASB a 1 % e 500 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. As hibridações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: usam-se sondas marcadas com 5-20 X 106 cpm de 32P e PVP a 0,02 %, Ficoll a 0,02 %, ASB a 0,2 % e 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão, sulfato de dextrano a 10 % (p/vol) . Os filtros são incubados na mistura de hibridação, durante 18-20 h, a 40 °C e depois são lavados, durante 1,5 h, a 55 °C numa solução contendo 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM e SDS a 0,1 %. A solução de lavagem é substituída por uma solução fresca e incubada durante mais 1,5 h, a 60 °C. Os filtros são secos com papel absorvente e expostos para autoradiografia. Se necessário, os filtros são lavados uma terceira vez, a 65-68 °C e são novamente expostos ao filme. Outras condições pouco rigorosas que podem ser utilizadas são bem conhecidas na técnica (por exemplo, como as que se usam nas hibridaçõesde ede spécies cruzadas). A título de exemplo e não limitativo, os procedimentos que usam condições de elevado rigor, são os seguintes. A pré-hibridação de filtros contendo ADN realiza-se durante 8 h até a uma noite, a 65 °C, num tampão composto por 6X SSC, de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP a 0,02 %, Ficoll a 0,02 %, ASB a 0,02 % e 500 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridados durante 48 h, a 65 °C, numa mistura de pré-hibridação contendo 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 5-20 X 106 cpm de uma sonda marcada com 32P. A lavagem dos filtros é feita a 37 °C, durante 1 h, numa solução contendo 2X SSC, PVP a 0,01 %, Ficoll a 0,01 % e ASB a 0,01 %. Segue-se uma lavagem em 0,1X SSC, a 50 °C, durante 45 min antes da autoradiografia. Outras condições de grande rigor que podem 125 ser utilizadas são bem conhecidas na técnica.A selecção de condições adequadas para tal rigor é bem conhecida na técnica {ver, por exemplo, Sambrook et al. 1989, Clonagem Molecular, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; ver também, Ausubel et al eds, em Current Protocols in Molecular Biology, series of laboratory technique manuais© 1987-1997, Current Protocols © 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc. ver especialmente, Dyson, 1991, "Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis," em: Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Vol. 2, T.A. Brown, ed., pp. 111-156, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, RU).

Os polinucleótidos podem ser obtidos e a sequência de nucleótidos dos polinucleótidos pode ser determinada, por qualquer processo conhecido na técnica.

Um polinucleótido que codifica um anticorpo pode ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de ADNc gerada a partir quer de ácidos nucleicos, de preferência poli A + ARN, isolados a partir de qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tal como as células de hibridoma seleccionadas para expressar um anticorpo da presente invenção, por exemplo 2B6 ou 3H7) por hibridição com sondas especificas da Ig e/ou amplificação por RCP usando iniciadores sintéticos hibridizáveis com as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem utilizando uma sonda de oligonucleótidos especifica para a sequência genética particular para identificar, por exemplo, um clone de ADNc a partir de uma biblioteca de ADNc que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por RCP podem então ser clonados em vectores de clonagem 126 replicáveis usando qualquer processo bem conhecido na técnica.

Uma vez que a sequência de nucleótidos do anticorpo esteja determinada, a sequência de nucleótidos do anticorpo pode ser manipulada usando processos bem conhecidos na técnica da manipulação de sequências de nucleótidos, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénese dirigida ao sitio, RCP, etc. {ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY), para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos.

Numa modalidade especifica, insere-se uma ou mais das RDC nas regiões da estrutura utilizando técnicas de rotina de ADN recombinante. As regiões estruturais podem ser de ocorrência natural ou regiões estruturais de consenso e, de preferência, regiões estruturais humana (ver, por exemplo, Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479 para uma lista de regiões de estrutura humana). De preferência, o polinucleótido gerado pela combinação das regiões estruturais e as RDC codificam um anticorpo que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo se liga a FcyRBA. De preferência, tal como discutido supra, pode-se fazer uma ou mais substituições de aminoácidos dentro das regiões estruturais e, de preferência, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação dos anticorpos da presente invenção a FcyRIIB. 127

Noutra modalidade, podem rastrear-se bibliotecas humanas ou quaisquer outras bibliotecas disponíveis na técnica, por meio de técnicas-padrão de rastreio conhecidas na técnica, para clonar os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos aqui descritos.

5.2.2 EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE ANTICORPOS

Uma vez obtida uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo aqui descrito, o vector para a produção do anticorpo pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Os processos, que são bem conhecidos pelos especialistas na matéria, podem ser usados para a construção de vectores de expressão contendo as sequências de codificação do anticorpo e sinais de controlo apropriados transcricionais e translacionais. Estes processos incluem, por exemplo, técnicas recombinantes do ADN in vitro, técnicas de síntese e recombinação genética in vivo. {Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

Um vector de expressão que compreende a sequência de nucleótidos de um anticorpo pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais (por exemplo, electroporação, transfecção lipossómica e precipitação de fosfato de cálcio) e as células transfectadas são postas em cultura por meio de técnicas convencionais para produzir o anticorpo aqui descrito. Em modalidades específicas, a expressão do anticorpo é regulada por um promotor 128 constitutivo, indutivel ou um promotor de um tecido especifico.

As células hospedeiras usadas para expressar os anticorpos recombinantes aqui descritas podem ser tanto células bacterianas, tal como as de Escherichia coli ou, de preferência, células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula completa de imunoglobulina recombinante. Em particular, as células de mamífero tal como as células de ovário de hamster chinês (OHC), em conjunto com um vector tal como o elemento principal do promotor do gene precoce intermédio para o citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para as imunoglobulinas (Foecking et al., Gene. 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2)

Uma variedade dos sistemas de vectores de expressão de hospedeiros podem ser utilizados para expressar os anticorpos aqui descritos. Esses sistemas de expressão de hospedeiros representam veículos através dos quais as sequências de codificação dos anticorpos podem ser produzidas e, posteriormente, purificados, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleótidos apropriadas, expressam os anticorpos aqui descritos in situ. Estes incluem, mas não se limitam a, microrganismos, tal como bactérias {por exemplo, E. coli e B. subtilis), transformados com ADN recombinante de bacteriófagos, ADN de plasmido ou vectores de expressão de ADN de cosmidos contendo sequências de codificação de imunoglobulinas; levedura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformada com vectores de expressão recombinantes de leveduras contendo sequências de codificação de imunoglobulina; sistemas de células de 129 insectos infectados com vectores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências de codificação da imunoglobulina; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão de vírus recombinante {por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e vírus do mosaico do tabaco (TMV)) ou transformados com vectores de expressão de plasmido recombinante (por exemplo, plasmidos de Ti) contendo sequências de codificação de imunoglobulina; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, COS, OHC, BHK, células 293, 293 T, 3T3, células linfocíticas (ver US 5.807.715), células Per C.6 (as células da retina de ratos desenvolvidas pela Crucell)) comportando estruturas de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, promotor de adenovírus tardio; promotor do vírus vaccínia de 7,5 K) .

Em sistemas de bactérias, pode-se selecionar, com vantagem, um certo número de vectores de expressão segundo o uso pretendido para o anticorpo a ser expresso. Por exemplo, quando se quer produzir uma grande quantidade dessa proteína, para a geração de composições farmacêuticas de um anticorpo, podem ser desejáveis vectores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos proteicos de fusão que são facilmente purificados. Esses vectores incluem, mas não se limitam ao vector de expressão de E. Coli pUR27 8 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), em que a sequência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente ao vector enquadrado pela região de codificação de lac Z de modo a produzir-se a proteína de fusão; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. 130

Chem. 24: 5503-5509); e similares. Os vectores pGEX também podem ser usados para expressar polipéptidos exógenos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST) . Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células submetidas a lise por meio da adsorção e da ligação a pérolas da matriz de glutationa e agarose, seguida da eluição, na presença de glutationa livre. Os vectores de pGEX são concebidos para incluir trombina ou sítios de clivagem da protease do factor Xa de modo que o produto do gene-alvo clonado pode ser libertado da parte de GST.

Num sistema de insecto, utiliza-se o vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como um vector para expressar genes exógenos. O vúrus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob o controlo de um promotor (por exemplo, o promotor de poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, pode-se utilizar um certo número de sistemas de expressão com base virai. Nos casos em que se utiliza um adenovírus como um vector de expressão, a sequência de codificação do anticorpo de interesse, pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução do adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por meio de uma recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, região EI ou E3) irá resultar num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de imunoglobulina em hospedeiros infectados. (Por exemplo, ver Logan & Shenk, 131 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 355-359). Podem também ser necessários sinais de iniciação específicos para a tradução eficiente de sequências de codificação do anticorpo inserido. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e as sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais de controlo exógenos translacionais e os codões de iniciação podem ter uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos melhoradores apropriados da transcrição, terminadores de transcrição, etc. (ver, Bittner et al., 1987, Methods Enzymol. 153:51-544).

Além disso, pode-se escolher uma estirpe de uma célula hospedeira que regula a expressão das sequências inseridas ou modifica e trata o produto do gene de uma maneira específica desejada. Essas modificações (por exemplo, glicosilação) e transformação (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para a transformação post-translacional e a modificação das proteínas e dos produtos do gene. Podem-se escolher linhas de células ou sistemas de hospedeiros apropriados para assegurar a correcta modificação e a transformação da proteína exógena expressa. Com esta finalidade, podem utilizar-se células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para a transformação apropriada do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto do gene. Essas células hospedeiras de mamíferos incluem mas não se limitam a OHC, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 132 293Τ, 3Τ3, WI38, ΒΤ483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção com elevado rendimento e de longo prazo de proteínas recombinantes, prefere-se uma expressão estável. Por exemplo, as linhas de células que expressam de forma estável um anticorpo aqui descrito podem ser tratadas por engenharia genética. Em vez de se utilizar vectores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado pelos elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, promotores, sequências melhoradoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. No seguimento da introdução do ADN exógeno, pode-se deixar crescer as células tratadas por engenharia durante 1-2 dias num meio enriquecido e depois mudam-se para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmido recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem de forma estável o plasmido nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos nas linhas de células. Este processo pode ser usado, com vantagem, para tratar por engenharia genética as linhas de células que expressam os anticorpos aqui descritos. Tais linhas de células tratadas por engenharia genética podem ser particularmente úteis na triagem e na avaliação de compostos que interagem directa ou indirectamente com os anticorpos aqui descritos.

Pode-se utilizar um certo número de sistemas de selecção, incluindo mas não se limitando a timidina quinase do vírus do herpes simples (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 133 48: 202) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) os genes podem ser usados nas células de tk-, hgprt- o aprt- respectivamente. Também se pode usar a resistência a antimetabolitos como base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 357; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072); neo, que confere resistência aos aminoglicosideos G-418 (Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215). Os processos normalmente conhecidos na técnica da tecnologia do ADN recombinante, que pode ser usado, estão descritos em Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1; e higro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

Os níveis de expressão de um anticorpo aqui descrito podem ser aumentados pela amplificação do vector (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel. O uso de vectores com based na amplificação de genes para a expresão de genes clonados em células de mamíferos na clonagem de ADN, vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando se pode amplificar um marcador no sistema de vectores que expressam um anticorpo, o aumento do nível do inibidor presente na 134 cultura das células hospedeiras irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Dado que a região amplificada está associada à sequência de nucleótidos do anticorpo, a produção do anticorpo irá aumentar (Crouse et ai., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257). A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vectores de expressão aqui descritos, codificando o primeiro vector um polipéptido derivado de cadeia pesada e codificando o segundo vector um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que permitem uma expressão igual dos polipéptidos de cadeia pesada e de cadeia leve. Alternativamente, pode-se utilizar um único vector que codifica tanto os polipéptidos de cadeia pesada como os de cadeia leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada isenta de tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 2197) . As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Logo que um anticorpo aqui descrito tenha sido produzido por expressão recombinante, pode ser purificado por qualquer processo conhecido na técnica para a purificação de um anticorpo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de permuta iónica, de afinidade, particularmente por afinidade para o antigénio especifico da proteína A e cromatografia de dimensionamento em coluna) , centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica normalizada para a purificação de proteínas.

5.3 PROCESSOS PROFILÁCTICOS E TERAPÊUTICOS 135 A presente invenção engloba terapias baseadas em anticorpos, que envolvem a administração de um ou mais dos anticorpos aqui descritos a um animal, de preferência a um mamífero e, mais preferivelmente a um ser humano, para prevenir, tratar ou melhorar sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infecção, associados com níveis anormais ou com a actividade de FcyRIIB e/ou tratável alterando a função imunológica associada com a actividade de FcyRIIB ou melhorando a actividade citotóxica de um segundo anticorpo terapêutico ou melhorando a eficácia de uma composição de vacina. Nalgumas modalidades, a terapia por administração de um ou mais dos anticorpos aqui descritos consiste na combinação da administração de uma ou mais terapias, tais como, mas não se limitando a quimioterapias, terapias de radiação, terapias hormonais e/ou terapias biológicas/imunoterapias.

Os compostos profilácticos e terapêuticos aqui descritos incluem, mas não se limitam a moléculas proteicas, incluindo, mas não se limitando a péptidos, polipéptidos, proteínas, incluindo proteínas modificadas pós-traducionalmente, anticorpos, etc.; moléculas pequenas (menos de 1000 dalton), compostos inorgânicos ou orgânicos; moléculas de ácidos nucleicos, incluindo, mas não se limitando a ADN de hélice dupla ou de hélice simples, ARN de hélice dupla ou de hélice simples, bem como moléculas de ácido nucleico de hélice tripla. Os compostos profilácticos e terapêuticos podem ser provenientes de qualquer organismo conhecido (incluindo, mas não se limitando a animais, plantas, bactérias, fungos e protistas ou vírus) ou de uma biblioteca de moléculas sintéticas. 136

Os anticorpos podem ser fornecidas em composições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tal como é conhecido na técnica ou tal como aqui descrito. Conforme detalhado a seguir, os anticorpos aqui descritos podem ser usados em processos de tratamento de cancro (particularmente para aumentar a imunoterapia passiva ou a eficácia de uma vacina contra o cancro), doenças auto-imunes, doenças inflamatórias ou alergias (por exemplo, para aumentar a eficácia de uma vacina para o tratamento de alergia).

Os anticorpos, aqui descritos, que funcionam como um agente profiláctico e/ou terapêutico de uma doença, distúrbio ou infecção podem ser administrados a um animal, de preferência a um mamífero e mais preferivelmente a um ser humano para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas associados à doença, distúrbio ou infecção. Os anticorpos aqui descritos pode ser administrados numa combinação com um ou mais de outros agentes profilácticos e/ou terapêuticos, úteis no tratamento, prevenção ou gestão de uma doença, distúrbio ou infecção associados com níveis anormais ou actividade de FcyRIIB e/ou tratáveis, alterando a função imunológica associada à actividade de FcyRIIB. Em certas modalidades, administra-se um ou mais dos anticorpos aqui descritos a um mamífero, de preferência a um ser humano, concomitantemente com um ou mais de outros agentes terapêuticos úteis para o tratamento do cancro. 0 termo "concomitantemente" não se limita à administração de agentes profilácticos ou terapêuticos exactamente ao mesmo tempo, mas significa que os anticorpos da presente invenção e o outro agente são administrados a um indivíduo numa sequência e dentro de um intervalo de tempo tal que os agentes aqui descritos podem actuar em conjunto com o outro agente para providenciar um benefício maior do que se 137 fossem administrados de outra forma. Por exemplo, cada agente profiláctico ou terapêutico pode ser administrado ao mesmo tempo ou sequencialmente, em qualquer ordem, em diferentes momentos; no entanto, se não forem administrados ao mesmo tempo, devem ser administrados num espaço de tempo suficientemente próximo de modo a proporcionar o desejado efeito terapêutico ou profiláctico. Cada agente terapêutico pode ser administrado separadamente, por qualquer forma adequada e por qualquer via adequada.

Em modalidades diferentes, os agentes profilácticos ou terapêuticos são administrados a menos de uma hora um do outro, a cerca de uma hora um do outro, a cerca de uma hora a cerca de 2 horas de intervalo, a cerca de 2 horas até cerca de 3 horas de intervalo, a cerca de 3 horas até cerca de 4 horas de intervalo, a cerca de 4 horas até cerca de 5 horas de intervalo, a cerca de 5 horas até cerca de 6 horas de intervalo, acerca de 6 horas até cerca de 7 horas de intervalo, a cerca de 7 horas até cerca de 8 horas de intervalo, a cerca de 8 horas até cerca de 9 horas de intervalo, a cerca de 9 horas até cerca de 10 horas de intervalo, a cerca de 10 horas até a cerca de 11 horas de intervalo, a cerca de 11 horas até cerca de 12 horas de intervalo ou não mais que 24 horas de intervalo ou no máximo 48 horas de intervalo. Em modalidades preferidas, administram-se dois ou mais componentes na mesma visita do doente.

As quantidades das doses e as frequências de administração dadas neste documento estão englobadas nos termos eficaz sob o ponto de vista terapêutico e eficaz sob o ponto de vista profiláctico. A dose e a frequência normalmente variam de acordo com factores específicos para cada doente consoante os agentes terapêuticos ou 138 profilácticos específicos administrados, a gravidade e o tipo de cancro, a via de administração, bem como a idade, o peso corporal, a resposta e a história clínica anterior do doente. Os regimes apropriados podem ser seleccionados por um técnico da matéria tendo em conta esses factores e seguindo, por exemplo, as doses referidas na literatura e recomendadas no Physician's Desk Reference (56a ed., 2002).

Os anticorpos aqui descritos também podem ser vantajosamente utilizados em combinação com outros anticorpos monoclonais ou quiméricos ou com factores de crescimento das linfocinas ou hematopoiéticos (tais como, por exemplo, IL-2, IL -3 e IL-7), que, por exemplo, servem para aumentar o número ou a actividade das células efectoras que interagem com os anticorpos e, aumentar a resposta imunitária. Os anticorpos aqui descritos também pode ser utilizados, vantajosamente, em combinação com um ou mais fármacos usados para tratar uma doença, um distúrbio ou uma infecção, tal como, por exemplo, agentes anti-cancerígenos, agentes anti-inflamatórios ou agentes anti-virais e, por exemplo, conforme detalhado nas seções 5.4. 6 e 5.4.5 a seguir.

5.3.1 CANCROS

Os anticorpos aqui descritos podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros anticorpos terapêuticos conhecidos na técnica para prevenir, inibir ou reduzir o crescimento de tumores primário ou de metástase de células cancerosas. Numa modalidade, os anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com anticorpos utilizados na imunoterapia do cancro. A presente invenção abrange o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com outro anticorpo terapêutico para melhorar a eficácia dessa 139 imunoterapia por meio do aumento da potência da função efectora do anticorpo terapêutico, por exemplo, CCDA, CDC, fagocitose, opsonização, etc. Apesar de não ser intenção estar vinculado a um mecanismo especifico de acção, os anticorpos aqui descritos bloqueiam ícyRIIB, preferencialmente em monócitos e macrófagos e aumentam assim os benefícios terapêuticos, a eficácia clínica de anticorpos específicos de tumores, por exemplo, aumentando a eliminação dos tumores mediada pela activação de fcyRs. De acordo com isto, a presente invenção providencia processos de prevenção ou de tratamento de cancro caracterizados por um antigénio de cancro que, quando administrado em combinação com outro anticorpo que se liga especificamente ao antigénio do cancro, é citotóxico. Os anticorpos aqui descritos são úteis para a prevenção ou o tratamento de cancro, particularmente potenciando a actividade citotóxica dos anticorpos terapêuticos específicos do antigénio do cancro com actividade citotóxica para aumentar a morte de células tumorais pelos anticorpos da presente invenção e/ou aumentar, por exemplo, a actividade CCDA ou a actividade CDC dos anticorpos terapêuticos. Numa modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, quando administrado isoladamente ou em combinação com um anticorpo citotóxico terapêutico inibe ou reduz o crescimento do tumor primário ou das metástases de células cancerígenas em pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, pelo menos 20 % ou pelo menos 10% em relação ao crescimento do tumor primário ou das metástases, na ausência do referido anticorpo. Numa modalidade preferida, os anticorpos aqui descritos, em combinação com um anticorpo citotóxico terapêutico inibem ou reduzem o 140 crescimento do tumor primário ou das metástases do cancro em pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, pelo menos 20 % ou pelo menos 1 % em relação ao crescimento do tumor primário ou das metástases, na ausência dos referidos anticorpos. A transição de um estado normal para um estado maligno é um processo em várias etapas que envolve alterações genéticas e epigenéticas. Na verdade, ocorrem inúmeras alterações nos circuitos reguladores celulares que facilitam esta progressão que permite que as células tumorais escapem do compromisso com a diferenciação terminal e a inactivação que normalmente regula a homeostase do tecido. Alguns genes têm sido implicados na invasão e no potencial metastásico das células cancerosas, tais como FEC-1 (factor 1 estimulador de colónias ou factor estimulador de colónias de macrófagos). Embora não seja intenção estar ligado a um mecanismo de acção particular, considera-se que FEC-1 pode mediar a progressão do tumor e das metástases por recrutamento de macrófagos para o local do tumor, onde promove a progressão do tumor. Acredita-se que os macrófagos têm um papel trófico na mediação da progressão tumoral e das metástases, talvez pela secreção de factores angiogénicos, por exemplo, timidina fosforilase, factor de crescimento endotelial vascular; secreção de factores de crescimento tais como factor de crescimento epidérmico, que poderia actuar como um factor parécrino nas células tumorais, promovendo assim a migração das células do tumor e a invasão dos vasos sanguíneos. {Ver, por exemplo, Lin et al., 2001, J. Exp. Med. 193 (6): 727-739; Lin et al., 2002, Journal of Mammary Gland Biology 141 and Neoplasam 7 (2) : 147-162; Scholl et al., 1993, Molecular Carcinogenesis, 7: 207-11; Clynes et al., 2000, Nature Medicine, 6 (4): 443-446; Fidler et al., 1985, Câncer Research, 45: 4714-26) . A presente invenção abrange a utilização dos anticorpos aqui descritos para bloquear a progressão e as metástases das células do tumor mediadas por macrófagos. Os anticorpos são particularmente úteis no tratamento de tumores sólidos, onde ocorre a infiltração de macrófagos. Os anticorpos antagonistas são particularmente úteis para controlar, por exemplo, a redução ou a eliminação, as metástases das células tumorais, por meio da redução ou da eliminação da população de macrófagos que está localizada no local do tumor. Nalgumas modalidades, os anticorpos são usados isoladamente para controlar as metástases das células tumorais. Apesar de não ser a intenção estar vinculado a um mecanismo particular de acção, considera-se que os anticorpos antagonistas, quando administrado isoladamente, ligam-se à FcyRIIB inibidora nos macrófagos e reduzem eficazmente a população de macrófagos e, portanto, restringem a progressão das células tumorais. Os anticorpos antagonistas reduzem ou, preferencialmente eliminam os macrófagos que estão localizados no local do tumor. Nalgumas modalidades, os anticorpos são usados no tratamento de cancros que são caracterizados pela super-expressão de FEC-1, incluindo, mas não se limitando aos cancros da mama, do útero e dos ovários. A presente invenção ainda engloba anticorpos que destroem ou eliminam eficazmente células efectoras imunitárias para além dos macrófagos que expressam FcyRIIB, por exemplo, células dendriticas. A destruição ou a eliminação eficaz das células efectoras imunitárias, usando 142 os anticorpos pode variar desde uma redução na população de células efectoras em 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, de preferência de 90 % e, mais preferencialmente, 99 %. Assim, os anticorpos têm uma maior eficácia terapêutica seja isolados ou em combinação com um segundo anticorpo, por exemplo, um anticorpo terapêutico, tal como anticorpos anti-tumor, anticorpos anti-virais e anticorpos anti-microbianos. Nalgumas modalidades, os anticorpos terapêuticos têm especificidade para uma célula de cancro ou uma célula inflamatória. Noutras modalidades, o segundo anticorpo liga-se uma célula normal. Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo especifico de acção, quando os anticorpos aqui descritos são usados isoladamente para destruir as células efectoras que expressam FcyRIIB, a via de sinalização mediada pelos receptores de activação de Fc é efectivamente reforçada. Quando utilizados em combinação com um segundo anticorpo, por exemplo, um anticorpo terapêutico, a eficácia do segundo anticorpo é reforçada pelo aumento da função efectora mediada pela Fc do anticorpo.

Os cancros e os distúrbios relacionados que podem ser tratados ou prevenidos por meio dos processos e composições da presente invenção incluem, mas não se limitam ao seguinte: leucemias, incluindo mas não se limitando a leucemia aguda, leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocitica aguda, tal como leucemias mieloblástica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica, eritroleucemia e sindrome mielodisplásica, leucemias crónicas, tais como, mas não se limitando a leucemia mielocitica (granulocitica) crónica, leucemia linfocitica crónica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas, tais como, mas não se limitando a doença de Hodgkin, doença não Hodgkin; mielomas múltiplos, tais como, mas não se limitando a mieloma 143 múltiplo latente, mieloma não secretório, mieloma osteo-esclerótico, leucemia das células plasmáticas, plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; macroglobulinémia de Waldenstrõm; gamopatia monoclonal de significado indeterminado; gamopatia monoclonal benigna; doença da cadeia pesada; sarcomas dos ossos e do tecido conjuntivo, tais como, mas não se limitando a sarcoma ósseo, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor de células gigantes malignas, fibrossarcoma dos ossos, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, neurilemoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrais, incluindo mas não se limitando a glioma, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglioma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primário; cancro da mama, incluindo, mas não se limitando a adenocarcinoma, carcinoma lobular (pequenas células), carcinoma intraductal, cancro da mama medular, cancro da mama mucinoso, cancro da mama tubular, cancro de mama papilar, doença de Paget e cancro da mama inflamatório; cancro das supra-renais, incluindo mas não se limitando a feocromocitoma e carcinoma adreno-cortical; cancro de tiróide, tal como, mas não se limitando a cancro de tiróide papilar ou folicular, cancro da tiróide medular e cancro de tiróide anaplásico; cancro pancreático, incluindo mas não se limitando a insulinoma, gastrinoma, glicagonoma, vipoma, tumor que segrega somatostatina e tumor de células carcinóides ou de ilhotas; cancros da pituitária, incluindo mas não se limitando a doença de Cushing, tumor que segrega prolactina, acromegalia e diabetes insipius; cancros oculares, incluindo mas não se limitando a melanoma ocular tal como melanoma da iris, 144 melanoma coróidal, e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; cancros vaginais, incluindo, mas não se limitando a carcinoma das células escamosas, adenocarcinoma e melanoma; cancro vulvar, incluindo mas não se limitando a carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma das células basais, sarcoma e doença de Paget; cancros cervicais incluindo, mas não se limitando a carcinoma das células escamosas e adenocarcinoma; cancros uterinos incluindo, mas não se limitando a carcinoma endometrial e sarcoma uterino; cancros do ovário incluindo, mas não se limitando a carcinoma epitelial do ovário, tumor de contornos incertos, tumor das células germinativas e tumor do estroma; cancros esofágicos incluindo, mas não se limitando a cancro escamoso, adenocarcinoma, carcinoma citico dos adenoides, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso e de células de aveia (células pequenas) carcinoma; cancros de estômago incluindo mas não se limitando a adenocarcinoma, tumor ulceroso (polipóide), ulceração, tumores que se espalham superficialmente, tumores que se espalham difusamente, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma e carcinossarcoma; cancros do cólon; cancros rectais; cancros do fígado incluindo mas não se limitando a carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma, cancros da vesícula biliar incluindo, mas não se limitando a adenocarcinoma; colangiocarcinomas incluindo mas não se limitando a cancros papilares, nodulares e difusos; cancros do pulmão incluindo mas não se limitando a cancro de pulmão de células não pequenas, carcinoma das células escamosas (carcinoma epidermóide), adenocarcinoma, carcinoma do pulmão de células grandes e de células pequenas; cancros testiculares incluindo mas não se limitando a tumor embrionário, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, não seminoma, carcinoma embrionário, 145 carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor do saco embrionário), cancros de próstata incluindo mas não se limitando a adenocarcinoma leiomiossarcoma e rabdomio-sarcoma; cancros penianos; cancros orais incluindo, mas não se limitando a carcinoma de células escamosas; cancros basais; cancros das glândulas salivares incluindo, mas não se limitando a adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermóide e carcinoma adenoidecítico; cancro da faringe incluindo, mas não se limitando a cancro das células escamosas e verrucosos; cancros da pele incluindo, mas não se limitando a carcinoma das células basais, carcinoma e melanoma espinocelulares, melanoma de difusão superficial, melanoma nodular, melanoma de sardas malignas, melanoma acral das sardas; cancros do rim incluindo, mas não se limitando a cancro das células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, cancro das células transicionais (pelve renal e/ou ureter); tumor de Wilms; cancros da bexiga incluindo, mas não se limitando a carcinoma das células transicionais, cancro das células escamosas, adenocarcinoma carcinossarcoma. Além disso, os cancros incluem mixossarcoma, sasrcoma osteogénico, endoteliossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais distúrbios, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2a Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia e Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Câncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., Estados Unidos da América).

De acordo com isto, os processos e as composições aqui descritos também são úteis no tratamento ou na prevenção de uma variedade de cancros ou de outras doenças 146 proliferativas anormais incluindo (mas não se limitando a) o seguinte: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, colo do útero, tiróide e pele; incluindo carcinoma de células escamosas, tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide incluindo leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfoma das células T, linfoma de Berketts; tumores hematopoiéticos das linhas mielóides incluindo leucemias mielóides agudas e crónicas e leucemia promielocítica; tumores mesenquimais incluindo fibrossarcoma e rabdomiosscarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, tratocarcinoma, neuroblastoma e glioma, tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrosafcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xenoderma pegmentosum, queratoactantoma, seminoma, cancro folicular da tiróide e teratocarcinoma. Também se considera que os cancros causados por aberrações na apoptose também seriam tratados pelos processos e composições aqui descritos. Tais cancros podem incluir, mas não se limitam a linfomas foliculares, carcinomas com mutações de p53, tumores dependentes de hormonas da mama, próstata e ovário e lesões pré-cancerosas tais como a polipose adenomatosa familiar e síndromes mielodisplásicas. Em modalidades especificas, as alterações malignas ou disproliferativas (tais como metaplasia e displasias) ou desordens hiperproliferativas, são tratadas ou prevenidas pelos processos e composições aqui descritos no ovário, bexiga, mama, cólon, pulmão, pele, pâncreas ou útero. Noutras modalidades específicas, o sarcoma, o melanoma ou a leucemia são tratados ou prevenidos através dos processos e composições da presente invenção. 147

Os cancros associados com os antigénios de cancro podem ser tratados ou prevenidos pela administração dos anticorpos aqui descritos em combinação com um anticorpo que se liga ao antigénio do cancro e que seja citotóxico. Numa modalidade particular, os anticorpos aqui descritos aumentam o efeito citotóxico dos anticorpos mediado pelo anticorpo dirigido ao antigénio particular do cancro. A titulo de exemplo, mas não a titulo de limitação, os cancros associados com o antigénio dos cancros que se seguem podem ser tratadas ou prevenidas por processos e composições da presente invenção. Antigénio KS 1/4 de pan-carcinoma (Perez e Walker, 1990, J. Immunol. 142: 32-37;

Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4): 407-415), antigénio (CA125) de carcinoma do ovário (Yu et al., 1991, Câncer Res. 51 (2): 48-475), fosfato ácido prostático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1) : 4928), antigénio especifico da próstata (Henttu eVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10 (2) : 903-910; Israeli et al., 1993, Câncer Res. 53:227-230), antigénio p97 associado a melanoma (Estin et al., 1989, J. Natl. Câncer Instit. 81 (6): 445-44), antigénio gp75 do melanoma (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171 (4) : 1375-1380), antigénio do melanoma de elevado peso molecular (AMA-EPM, em inglês HMW-MAA) (Natali et al., 1987, Câncer 59: 55-3; Mittelman et al., 1990, J.

Clin. Invest. 86: 2136-2144)), antigénio da membrana especifico da próstata, antigénio carcinoembrionário (ACE, em inglês CEA) (Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin.

Oncol. 13: 294), antigénio polimórfico de mucina epitelial, antigénio dos glóbulos da gordura de leite humano, antigénios associados ao tumor colorectal, tais como: CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992, Câncer Res. 52: 3402-3408), C017-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Câncer 53:751- 758); GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1 e LEA, antigénio 38.13 do linfoma de Burkitt, 148 CD19 (Ghetie et al. , 1994, Blood 83: 1329-1336), human B- lymphoma antigen-CD20 (Reff et al., 1994, Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), antigénios específicos de melanoma tais como o GD2 de gangliósido (Saleh et al., 1993, J.Immunol., 151, 3390- 3398), GD3 de gangliósido (Shitara et al., 1993, Câncer Immunol. Immunother. 36: 373-380), GM2 de gangliósido (Livingston et al. , 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044), GM3 de gangliósido (Hoon et al., 1993, Câncer Res. 53: 5244-5250), antigénio de superfície das células do tipo de transplante específico do tumor (ATET, em inglês TSTA), tais como antigénios tumorais induzidos por meio de vírus incluindo os vírus de ADN do antigénio T de tumor e antigénios do envelope de vírus de ARN do tumor, antigénio-alfa-fetoproteína oncofetal, tal como CEA do cólon, antigénio oncofetal do tumor da bexiga (Hellstrom et al., 1985, Câncer. Res. 45: 2210-2188), antigénio de diferenciação, tal como antigénio L6, L20 do carcinoma de pulmão humano (Hellstrom et al., 1986, Câncer Res. 46: 3917-3923), antigénios de fibrossarcoma, antigénio-Gp37 de células T de leucemia humana (Bhattacharya-Chattetjee et al. , 1988, J. of Immun. 141:1 398-1403), neoglicoproteina,

esf ingolipidos, antigénio do cancro de mama como o RFCE (receptor do factor de crescimento epidérmico, em inglês EGFR) , antigénio HER2 (pl85HER2) , mucina epitelial polimórfica (MEP, em inglês PEM) (Hilkens et al., 1992,

Trends in Bio. Chem. Sei. 17: 359), antigénio de APO-1 de linfócitos humanos malignos (Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304), antigénio de diferenciação (Feizi, 1985,

Nature 314: 53-57) tal como o antigénio I encontrado nos eritrócitos fetais e no endoderma primário, I (Ma) encontrado nos adencarcinomas gástricos, M18 e M39 encontrados no epitélio da mama, SSEA-1 encontrado nas células mielóides, VEP8, VEP9, Mil, VIM-D5 e Di56-22 149 encontrados no cancro colorectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H) , C14 encontrado no adenocarcinoma colónico, F3 encontrado no adenocarcinoma do pulmão, AH6 encontrado no cancro gástrico, Y hapteno, LeY encontrado nas células de carcinoma embrionário, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor do FCE encontrado em células A431, séries Ei (grupo sanguíneo B) encontrado no cancro pancreático, FC10.2 encontrado nas células de carcinoma embrionário, adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado no adenocarcinoma, NS-10 encontrado em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb) , G49, receptor de FCE, (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado no adenocarcinoma colónico, 19.9 encontrado no cancro do cólon, mucinas do cancro gástrico, T5A7 encontrado em células mielóides, R24 encontrado no melanoma, 4.2, GD3, Dl.l, OFA-1, Gm2/ OFA-2, GD2^ Ml :22:25:8 encontrado em células de carcinoma embrionário e SSEA-3, SSEA-4 encontrado em embriões do estádio celular 4-8. Noutra modalidade, o antigénio é um péptido derivado do receptor de células T de um linfoma cutâneo de células T (ver Edelson, 1998, The Câncer Journal 4: 62).

Os anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com quaisquer anticorpos da terapêutica do cancro conhecidos na técnica para melhorar a eficácia do tratamento. Por exemplo, os anticorpos aqui descritos podem ser usados com qualquer um dos anticorpos do quadro 3, que têm demonstrado uma utilidade terapêutica no tratamento do cancro. Os anticorpos aqui descritos melhoram a eficácia do tratamento com anticorpos terapêuticos para o cancro, melhorando pelo menos uma função efectora mediada por anticorpos dos referidos anticorpos terapêuticos do cancro. Numa modalidade particular, os anticorpos melhoram a eficácia do tratamento através do reforço da cascata dependente do complemento dos referidos anticorpos 150 terapêuticos para o cancro. Noutra modalidade da presente invenção, os anticorpos aqui descritos potenciam a eficácia do tratamento por aumento da fagocitose e opsonização das células tumorais alvo. Ainda noutra modalidade aqui descrita, os anticorpos potenciam a eficácia do tratamento pelo aumento da citotoxicidade mediada por células dependentes dos anticorpos ("CCDA") na destruição das células-alvo tumorais.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com produtos à base de dinucleótidos de citosina-guanina ("CpG") que tenham sido desenvolvidos (Coley Pharmaceuticals) ou estão a ser desenvolvidos actualmente como activadores de respostas imunitárias inatas e adquiridas. Por exemplo, a presente invenção abrange o uso de CpG 7909, 8916 CpG, CpG 8954 (Coley

Pharmaceuticals) nos processos e composições aqui descritos para o tratamento e/ou a prevenção de cancro [ver também Warren et al. , 2002, Semin Oncol., 29 (1 supl 2) : 93-7; Warren et al., 2000, Clin Lymphoma, 1 (1): 57-61).

Os anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com um anticorpo terapêutico que não medeia o seu efeito terapêutico através da morte das células para potenciar a actividade terapêutica dos anticorpos. Numa modalidade especifica, a presente invenção abrange o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com um anticorpo terapêutico que induz a apoptose com a actividade agonísitca, por exemplo, um anticorpo anti-Fas. Os anticorpos anti-Fas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, Jo2 (Ogasawara et al., 1993, Nature 364: 806) e HFE7 (Ichikawa et al., 2000, Int. Immunol. 12: 555). Embora não seja intenção estar ligado a um mecanismo de acção particular, considera-se que FcyRIIB tem sido 151 implicado na promoção da apoptose mediada por anti-Fas, ver, por exemplo, Xu et ai., 2003, Journal of Immunology, 171: 562-568. Na verdade, o domínio extracelular da FcyRIIB pode servir como um agente de reticulação para os receptores de Fas, levando a um complexo funcional e promovendo a apoptose dependente de Fas. Nalgumas modalidades, os anticorpos aqui descritos bloqueiam a interacção dos anticorpos anti-Fas e FcyRIIB, levando a uma redução na actividade apoptótica mediada por Fas. Os anticorpos aqui descritos, que resultam numa redução da actividade apoptótica mediada por Fas, são particularmente úteis em combinação com anticorpos anti-Fas que têm efeitos colaterais indesejáveis, por exemplo, hépatotoxicidade. Noutras modalidades, os anticorpos aumentam a interacção dos anticorpos anti-Fas e FcyRIIB, levando a um aumento da actividade apoptótica mediada por Fas. A combinação dos anticorpos aqui descritos com anticorpos terapêuticos que induzem a apoptose, com actividade agonísitca, tem uma maior eficácia terapêutica.

Os anticorpos terapêuticos que induzem a apoptose, usados nos processos aqui descritos, podem ser específicos para qualquer receptor de morte conhecido na técnica para a regulação da via de apoptose, por exemplo, a família de receptores RFNT. A presente invenção tem por objecto um processo de tratamento de doenças com sinalização mediada por uma apoptose deficiente, por exemplo, cancro e doenças auto-imunes. Numa modalidade específica, a presente invenção engloba um processo para tratar uma doença com apoptose deficiente mediada por Fas, compreende a administração de um anticorpo aqui descrito em combinação com um anticorpo anti-Fas. 152

Nalgumas modalidades, os anticorpos agonistas aqui descritos são particularmente úteis para o tratamento de tumores de origem não hematopoiética, incluindo tumores de células de melanoma. Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo de acção especifico, a eficácia dos anticorpos agonistas é devida, em parte, à activação da via inibidora de FcyRIIH, como tumores de origem não hematopoiética, incluindo tumores de células de melanoma que expressam FcyRIIB. Experiências recentes têm mostrado que, na verdade, a expressão de FcyRIIB em células de melanoma regula o crescimento do tumor por interacção directa com anticorpos anti-tumor (por exemplo, ligando a região Fc dos anticorpos anti-tumor) numa forma dependente do intracitoplasma (Cassard et al., 2002, Journal of Clinicai Investigation, 110 (10): 1549-1557).

Nalgumas modalidades, a presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com anticorpos terapêuticos que se ligam imunoespecificamente aos antigénios de tumor que não são expressos nas próprias células do tumor, mas antes na envolvente reactiva que apoia o tumor, células não malignas compreendendo estroma tumoral. O estroma do tumor é composto por células endoteliais formando novos vasos sanguíneos e fibroblastos do estroma em torno da vascularização do tumor. Numa modalidade específica, um dos anticorpos aqui descritos é usado em combinação com um anticorpo que se liga immunoespecificamente a um antigénio do tumor numa célula endotelial. Numa modalidade preferida, utiliza-se um anticorpo aqui descrito em combinação com um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a um antigénio do tumor numa célula de fibroblastos, por exemplo, a proteína de activação dos fibroblastos (PAF). FAP é uma glicoproteína 153 homodimérica do tipo II de 95 KDa que é altamente expressa em fibroblastos do estroma de muitos tumores sólidos, incluindo, mas não se limitando a carcinomas do pulmão, da mama e colorrectal. {Ver, por exemplo, Scanlan et al., 1994; Proc. Natl. Acad. USA, 91: 5657-61; Park et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 36505-12; Rettig et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 3110-3114; Garin-Chesea et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 7235-7239). Os anticorpos que se ligam imunoespecificamente a FAP são conhecidos na técnica e estão abrangidos pela presente invenção, ver, por exemplo, Wuest et al., 2001, Journal of Biotechnology, 159-168; Mersmann et al., 2001, Int. J. Câncer, 92: 240-248; patente norte-americana n°. 6.455.677.

Recentemente as IgE têm sido implicadas como mediadores do crescimento do tumor e, de facto, têm sido propostas as reacções de hipersensibilidade imediata e de inflamação alérgica dirigida a IgE como possíveis mecanismos naturais envolvidos nas respostas anti-tumor (para uma revisão ver, por exemplo, Mills et al., 1992, Am. Journal of Epidemiol. 122: 66-74; Eriksson et al., 1995, Allergy 50: 718-722). Na verdade, um estudo recente demonstrou que a carga de células tumorais com IgE reduz o crescimento do tumor, levando, nalguns casos, à rejeição do tumor. Segundo o estudo, as células tumorais carregadas com IgE não só possuem um potencial terapêutico, mas também conferem uma imunidade antitumor de longo prazo, incluindo a activação do mecanismo de imunidade inata do efector e a resposta imunitária adaptativa mediada pelas células T, ver Reali et al., 2001, Câncer Res. 61: 5516-22; que é aqui incorporada, na sua totalidade, como referência. Os anticorpos antagonistas aqui descritos podem ser usados no tratamento e/ou na prevenção de cancro em combinação com a administração de IgE, a fim de reforçar a eficácia da 154 terapia do cancro mediada por IgE. Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo de acção especifico, os anticorpos aumentam a eficácia terapêutica do tratamento de tumores com IgE, bloqueando a via inibidora. Os anticorpos antagonistas podem aumentar a eficácia terapêutica da terapia do cancro mediada por IgE por meio de (i) aumento do retardamento do crescimento do tumor, (ii) aumento da diminuição da taxa de progressão do tumor; (iii) aumento da rejeição do tumor; ou (iv) aumento da imunidade protectora em relação ao tratamento de cancro apenas com IgE.

As terapias contra o cancro e as suas dosagens, as vias de administração e as utilizações recomendadas são conhecidas na técnica e têm sido descritas na literatura, ver, por exemplo Physician's Desk Reference (56a ed., 2002).

5.3.2 MALIGNIDADES DAS CÉLULAS B

Os anticorpos agonistas aqui descritos são úteis para o tratamento ou a prevenção de qualquer malignidade de células B, principalmente linfoma não Hodgkin ou leucemia linfocítica crónica. FcyRIIB é um alvo para a desregulação por meio de translocação cromossómica de linfoma maligno, particularmente no linfoma não Hodgkin de células B (Ver Callanan M.B. et al., 2000 Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 97 (1) : 309-314) . Assim, os anticorpos aqui descritos são úteis para o tratamento ou a prevenção de qualquer leucemia linfocítica crónica das linhas de células B. A leucemia linfocítica crónica das linhas de células B está revista por Freedman (Ver revisão feita por Freedman, 1990, Hemtaol. Oncol. Clin. North Am. 4: 405). Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo de acção 155 específico, os anticorpos agonistas aqui descritos inibem ou previnem doenças malignas das células B inibindo a proliferação e/ou activação das células B. A presente invenção também engloba a utilização dos anticorpos agonistas em combinação com outras terapias conhecidas (por exemplo, quimioterapia e radioterapia) na técnica para a prevenção e/ou o tratamento de neoplasias malignas das células B. A presente invenção também engloba a utilização dos anticorpos agonistas em combinação com outras anticorpos conhecidos na técnica para a prevenção e/ou o tratamento de neoplasias malignas das células B. Por exemplo, os anticorpos agonistas da presente invenção podem ser usados em combinação com os anticorpos anti-C22 ou anti-CD19 divulgados por Goldenberg et al. (U.S. 6.306.393).

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com Oncoscint (alvo: ACE), Verluma (alvo: GP4 0), Prostascint (alvo: PSMA) , ACE-SCAN (alvo: ACE), rituxina (alvo: CD20), herceptina (alvo: HER-2), campath (alvo: CD52), Mylotarge (alvo: CD33) e zevalina (alvo: CD2 0) .

5.3.3 DOENÇAS AUTOIMUNES E DOENÇAS INFLAMATÓRIAS

Os anticorpos agonistas aqui descritos podem ser usados para tratar ou prevenir doenças auto-imunes ou doenças inflamatórias. A presente invenção providencia processos de prevenção, tratamento ou gestão de um ou mais sintomas associados com um distúrbio auto-imune ou inflamatório num indivíduo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade, eficaz sob o ponto de vista terapêutico, de anticorpos ou fragmentos dos mesmos aqui descritos. 156 A presente invenção também providencia processos para a prevenção, tratamento ou gestão de um ou mais sintomas associados com um distúrbio inflamatório num indivíduo, compreendendo ainda a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade, eficaz sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais agentes anti-inflamatórios. A presente invenção também providencia processos para a prevenção, tratamento ou gestão de um ou mais sintomas associados a uma doença auto-imune, compreendendo ainda a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade, eficaz sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais agentes imuno-reguladores. A secção 5.4.5 dá exemplos não limitativos de agentes anti-inflamatórios e agentes imunoreguladores.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com qualquer um dos anticorpos conhecidos na técnica para o tratamento e/ou a prevenção de doenças auto-imunes ou de doenças inflamatórias. Um exemplo não limitativo dos anticorpos que são usados no tratamento ou na prevenção de distúrbios inflamatórios está ilustrado no quadro 6A e um exemplo não limitativo dos anticorpos que são usados para o tratamento ou a prevenção de distúrbios auto-imunes está ilustrado no quadro 6B. Os anticorpos aqui descritos podem, por exemplo, aumentar a eficácia do tratamento dos anticorpos terapêuticos que se apresentam nos quadros 6A e 6B. Por exemplo, mas não a título limitativo, os anticorpos aqui descritos podem aumentar a resposta imunitária no indivíduo que está a ser tratado com qualquer um dos anticorpos dos quadros 6A ou 6B.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com Orthoclone 0KT3, ReoPro, Zenapex, Simulec, Synagis e Remicade. 157

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com produtos à base de dinucleótidos de citosina-guanina ("CpG") que tenham sido desenvolvidos (Coley Pharmaceuticals) ou estão a ser desenvolvidos actualmente como activadores de respostas imunitáriasinatas e adquiridas. Por exemplo, a presente invenção abrange o uso de CpG 7909, CpG 8916, CpG 8954 (Coley Pharmaceuticals) nos processos e composições aqui descritos para o tratamento e/ou a prevenção de doenças auto-imunes ou inflamatórias (Weeratna et al., 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32 (1): 65-71).

Exemplos de doenças auto-imunes que podem ser tratadas pela administração dos anticorpos aqui descritos incluem, mas não se limitam a alop'wcia areata, espondilite anquilosante, sindrome antifosfolipidica, doença de Addison auto-imune, doenças auto-imunes da glândula supra-renal, anemia hemolitica auto-imune, hepatite auto-imune, ooforite e orquite auto-imune, trombocitopénia auto-imune, doença de Behcet, penfigóide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite da psilose celíaca, sindrome da disfunção imunológica da fadiga crónica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, sindrome de Churg-Strauss, penfigóide cicatrical, sindrome de CREST, doença da aglutinina do frio, doença de Crohn, lúpus discóide, crioglobulinémia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomérulo-nefrite, doença de Graves, sindrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura da trombocitopénia idiopática (PTI), neuropatia da IgA, artrite juvenil, líquen plano, lupus eritematoso, doença de Ménière, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus do tipo 1 ou imunomediada, miastenia gravis, penfigo vulgar, anemia 158 perniciosa, politartrite nodosa, policrondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinémia primária, cirrose biliar primária, psoriase, artrite psoriática, fenómeno de Raynauld, sindrome de Reiter, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, sindrome de Sjõgren, sindrome do homem rijo, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso, artrite de Takayasu, artrite temporal/artrite de células gigantes, colite ulcerosa, uveite, vasculites tais como vasculite herpetiforme vasculite da dermatite, vitiligo e granulomatose de Wegener. Exemplos de doenças inflamatórias incluem, mas não se limita a, asma, encefalitr, doença inflamatória intestinal, doença pulmonar obstrutiva crónica, (DPOC), doenças alérgicas, choque séptico, fibrose pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória e inflamação crónica resultante de infecções virais ou bacterianas crónicas. Tal como descrito aqui na secção 2.2.2, alguns distúrbios autoimmunes estão associados com um estado clinico inflamatório. Assim, há uma sobreposição entre o que se considera um distúrbio autoimmune e um distúrbio inflamatório. Por isso, alguns distúrbios autoimmunes também podem ser caracterizados como distúrbios inflamatórios. Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser prevenidas ou tratadas de acordo com os processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a asma, encefalite, doença inflamatória intestinal, doença pulmonar obstrutiva crónica, (DPOC), doenças alérgicas, choque séptico, fibrose pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória e inflamação crónica resultante de infecções virais ou bacterianas crónicas. 159

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados para reduzir inflamações verificadas em animais, particularmente em mamíferos, com distúrbios inflamatórios. Numa modalidade específica, um anticorpo reduz a inflamação em um animal de pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, em pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, em pelo menos 20 % ou pelo menos 10 % em relação à inflamação num animal a que não se administraram os referidos anticorpos. Numa outra modalidade, uma combinação de anticorpos reduz a inflamação num animal de pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, em pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, em pelo menos 20 % ou pelo menos 10 % em relação à inflamação num animal a que não se administraram os referidos anticorpos.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados para prevenir a rejeição de transplantes.

QUADRO 6A: ANTICORPOS PARA DOENÇAS INFLAMATÓRIAS E DOENÇAS AUTOIMUNES QUE PODEM SER USADOS EM CONJUNTO COM OS ANTICORPOS DA PRESENTE INVENÇÃO. Designação do Antigénio Tipo de Isotipo Patrocinadores Indicação anticorpo alvo produto 5G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm Artrite (C 5) Inc reumatóide 5G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm LES (C5) Inc 3G1.1 Complemento Humanizado IgG Alexion Pharm Nefrite (C5) Inc 160

SG1.1-SC 5G1.1-SC 5G1.1-SC ABX-CBL ABX-CBL ABX-IL8 Antegren Anti-CDlla Anti-CD18 Anti-LFAl Antova Antova BTI-322 CDP571 CDP571 CDP850 Corsevin M D2E7 Hu23F2C

Complemento Humaizado ScFv (C5) Complemento Humanizado ScFv (C5)

Alexion Inc cardiopulmonar Alexion Pharm Enfarte do Inc miocárdio

Pharm Bypass

Complemento (C5) CBL CD1 47 IL-8 VLA-4 CDlla CD18 CD18

Humanizado

Humano

De murino

Humano

Humanizado

De murino

ScFv

IgG

IgG2

IgG

IgGl

Fab * 2

Fab' 2 CD40L CD40L CD2 FNT-alfa FNT-alfa

Humanizado IgG

Rato IgG

Humanizado IgG4

Humanizado IgG4 E-selectina Humanized

Fact VII Quimérico FNT-alfa Humano CD11/18 Humanizado

Alexion Pharm Inc Abgenix Inc Abgenix Inc Abgenix Inc Athene/Elan Genentech Inc/Xoma Genent ech Inc Pasteur- Merieux/Immunote c h Biogen Biogen Medimmune Inc Celltech

Angioplastia GvHD Rejeição de aloenxerto Psoriase Esclerose múltipla Psoriase Enfarte do miocárdio Rejeição de aloenxerto Rejeição de aloenxerto LES GvHD, Psoriase Doença de Crohn

Celltech Artrite reumatóide Celltech Psoriase

Centocor

CAT/BASF

Anticoagulante

Rheumatoid Arthritis ICOS Pharm Inc Esclerose múltipla 161

Hu23F2G CD11/18 Humanizado IgG ICOS Pharm Inc Acidente vascular cerebral IC14 CD 14 ? ICOS Pharm Inc Choque tóxico ICM3 ICAM-3 Humanizado ICOS Pharm Inc Psoriase IDEC—114< td>CD80 Primatised IDEC Pharn/Mitsu bishi Psoriase IDEC- 131 CD40L Humanizado IDEC Pharm/Eisai LES IDEC—131 CD40L Humanizado IDEC Pharm/Eisai Esclerose múltipla IDEC—151 CD4 Primatizado IgGl IDEC Pharm/GlaxoSmith Kline Artrite reumatóide IDEC—152 CD23 Primatizado IDEC Pharm Asma / Al e r g i a Infliximab FNT-alfa Quimérico IgGl Centocor Artrite reumatóide Infliximab TNF-alp ha CQuimérico IgGl Centocor Doença de Crohn LDP-01 Beta2- integrina Humanizado IgG Millennium Inc Ataque cardíaco (LeukoSite Inc.) LDP-01 Beta-integ rin Humanizado IgG Millennium Inc Rejeição de aloenxerto (LeukoSite Inc.) LDP-02 alpha4beta 7 Humanizado Millenium Inc Colite ulcerosa (LeukoSite Inc.) MAK-195F TNF alpha De murino Fab' 2 Knoll Pharm, BASF Choque tóxico MDX-33 CD64 (FcR) Humano Medarex/Centoon Distúrbios autoimmunes hematológicos 162 MDX-CD4 CD4

Humano IgG

Medarex/Eisai/Ge Artrite nmab reumatóide MEDI-507 MEDI-507< td>CD2 CD2 Humanizado Medimmune Inc Psoriase Humanizado Medimmune GvHD Inc

OKT4A CD4

Humanizado IgG

Ortho Biotech

Rejeição de aloenxerto

OrthoClone CD4 Humanizado IgG Ortho Biotech Doença autoimune 0KT4A

Orthoclone/an CD3 ti-CD3 0KT3

De murino mlgG2a 0 rtho Biotech

Rejeição de aloenxerto

RepPro/Abcixi g pllbllla Quimérico Fab mab

Centocor/Lilly Complicações de angioplastia coronária

rhuMab-E2 5 IgE

Humanized IgGl SB-240 563 IL5 SB-240683 IL-4 SCH55700 IL-5 Simulect CD25

Humanizado

Genentech/Novart Asma/Alergia is/Tan ox Biosystems GlaxoSmit hKline Asma/Alergia GlaxoSmithKl ine Asma/Alergia Celltech/Scherin Asma/Alergia g

Quimérico IgGl

Novartis Pharm

Rejeição de aloenxerto

SMART CD3

Humanizado

Protein Design Doença autoimune Lab a-CD3 SMART a-CD3 CD3

Humanizado

Protein Design Rejeição de Lab aloenxerto SMART a-CD3 CD3

Humanizado IgG

Protein Design Psoriase Lab

Zenapax CD25

Humanizado IgGl Protein Design Rejeição de Lab/Hoffman-La aloenxerto Roche 163

Quadro 6B: Anticorpos para distúrbios autoimunes

Anticorpo ABX-RB2

ILl-ras FNT-RI

Indicação Antigénio-alvo anticorpo para o antigénio CBL em células T, células B e anticorpo totalmente humano de células AN a partir de rato com xenoenxerto

Artrite Receptor do tipo I de factor alfa de necrose do reumatóide tumor solúvel em proteína anti-inflamatória

crónica Artrite recombinante reumatóidede Bloqueia a acção do FNT doença inflamatória 5c8 (Anticorpo do ligando anti-CD-40)

Os ensaios da fase II para ram em Out. 99 e CD-40 IDEC 131IDEC 151IDEC 152 IDEC 114 MEDI-507 examinaram "eventos adversos" Lúpus eritematoso sistémico (LES) Artrite reumatóide Asma Psoríase Artrite reumatóide; esclerose múltipla; doença de Crohn; psoríase anti CD40 humanizado primatizado; anti-CD4 primatizado; anti-CD23 Primatizado anti-CD80 anti-CD2 LDP-02 (anti-Acm Doença b7) inflamatória do intestino; doença de Chron; colite ulcerosaSMART Anticorpo Distúrbios anti-interferão autoimmunes gamaVerteportin Artrite reumatóideThalomid lepra - (talidomida) aprovado para o mercado doença de Crohn; Artrite

Receptor de integrina a4b7 em glóbulos brancos do sangue (leucócitos)

Anti-interferão gama inibidor do factor de necrose do tumor alfa (FNT alfa) 164

Anticorpo

Indicação reumatoide

Antigénio-alvo

FselC (fármacos selectivos inibidores decitocina) FIM (fármacos Distúrbiosimunomoduladores) autoimmunes generalizados MDX-33 Distúrbios no sangue causados por reacçoes autoimunes Púrpura da trombocitopénia idiopática

Inibidores altamente específicos da enzima fosfodiesterase do tipo 4 (FDE-4) aumentam os níveis de cAMP (monofosfato de edenosina cílcico) activa a proteína cinase A (PKA), bloqueia a transcrição do factor NK-kB, previne a transcrição de um gene de FNT-a e diminui aprodução de FNT-a Análofos estruturais da talidomida inibem FNT-a

Anticorpo monoclonal contra os receptores de FcRI (PTI) anemia MDX-CD4 VX-497 VX-740 hemolítica autoimune trata artrite reumatoide e outras autoimunidades Distúrbios autoimunes esclerose múltipla artrite reumatoide doença inflamatória do intestino psoríase artrite reumatoide

Anticorpo monoclonal contra a molécula receptora de CD4 inibidor de monofosfato de inosina desidrogenase (enzima necessária para preparar novos ARN e ADN usados na produção de nucleótidos necessários para a proliferação dos linfócitos) VX-745

Específica da inflamação envolvida na sinalização química do início da resposta imunitária e a progressão da inflamação

inibidor de interleucina-1 beta de ICE (a conversão da enzima controla as vias que levam a uma resposta imunitária agressiva que regulas as citocinas) inibidor da proteína cinase activada pelo mitogene da cinase P38MAP

Enbrel(etanercepto) IL- ACM completamente humano do FNT (factor de necrose de tumor) alvo contra IL-8 (interleucina 8) 165

Anticorpo 8

Indicação

Antigénio-alvo (bloqueio da resposta inflamatória dos blocos de IL- 8) 5G1.1 Artrite Um inibidor do complemento de C5 reumatóide penfigóide (vermelhidão perigosa da pele) psoriase lúpus

Apogen MP4 0 antigénio recombinante destrói selectivamente doenças associadas à apoptose induzida pelas células

T

Células T eliminadas pela morte programada das células não ataca ma is as próprias células do corpo especificas dos apogenes alvos específicos das células T

Classificação das Produto Estádio de desenvolvimento empresas Immunex Enbrel No mercado Amgen ILl-ras FNT-RI Fase II/III Abgenix AGX-RB2, IL-8 Fase I, pré-clinica Alexion 5G1.1, Apogen Fase II, pré-clinica MP4 Biogen 5c8 Fase II (parado) IDEC 131, 151, 152, Fase I ed II 114 Medlmmune MEDI507 Fase I/II Millennium LDP-02, Fase II Protein Design Anti-Interferão Pré-clinica Labs gama Medarex MDX-33, MDX-CD4 Fase II, Fase I QLT Verteportin Fase I PhotoTherapeutics Celegene Talidomida, No mercado, pré-clinico FSelC, IMiDs Vertex VX-497, VX-740, Fase II, Fase II, Fase II VX-745

5.3.4 ALERGIA 166 A presente invenção tem por objecto processos para tratar ou prevenir uma doença alérgica mediada por IgE e/ou mediada FcsRI num doente gue disso necessite, em que o referido processo compreende a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um ou mais anticorpos agonistas ou dos seus fragmentos aqui descritos. Apesar de não ser intenção estar ligado a um mecanismo de acção específico, considera-se que os anticorpos aqui descritos são úteis na inibição da activação de mastócitos induzida por FcsRI, o que contribui para as respostas alérgicas da fase aguda e tardia (Metcalfe D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77: 1033) . De preferência, os anticorpos agonistas têm melhorado a eficácia terapêutica e/ou reduzido os efeitos em comparação com os processos convencionais utilizados na técnica para o tratamento e/ou a prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgB. Os processos convencionais para o tratamento e/ou a prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE incluem, mas não se limitam a fármacos anti-inflamatórios (por exemplo, corticóides orais e inalados para a asma), anti-histamínicos (por exemplo, para rinite alérgica e dermatite atópica), cisteinil-leucotrienos (por exemplo, para o tratamento da asma); anticorpos anti-IgE; e imunoterapia ou dessensibilização específicas.

Exemplos de reacções alérgicas mediada por IgE incluem, mas não se limitam a asma, rinite alérgica, alergias gastrointestinais, eosinofilia, conjuntivite, dermatite atópica, urticária, anafilaxia ou nefrite golmerular. A presente invenção engloba moléculas, por exemplo, imunoglobulinas, tratadas por engenharia genética para 167 formar complexos com FcsRIe e FcyRIIH humanas, isto é, ligam-se especificamente a FcsRI e a FcyRIIB humana. De preferência, essass moléculas têm eficácia terapêutica nos didtúrbios mediados por IgE e FcsRI. Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo de acção especifico, a eficácia terapêutica destas moléculas tratadas por engenharia genética é, em parte, devida à sua capacidade para inibir a função de mastócitos e basófilos.

Numa modalidade especifica, as moléculas que se ligam especificamente a FcsRI e a FcyRIIB humanas são proteínas de fusão quiméricas compreendendo um sítio de ligação para FcsRI e um sítio de ligação para FcyRIIB. Tais moléculas podem ser concebidas por engenharia genética de acordo com metodologias-padrão de ADN recombinante, conhecidas pelos especialistas na matéria. Numa modalidade preferida especifica, uma proteína de fusão quimérica para uso nos processos aqui descritos compreende uma cadeia simples de F(ab') de um anticorpo monoclonal anti-FcYRIIB aqui descrito, fundido com uma região usada como uma ponte para ligar Fcshu à região de terminal C da cadeia simples de F(ab') do anticorpo monoclonal FcyRIIB. Um exemplo de uma proteína de fusão quimérica para uso nos processos aqui descritos compreende o seguinte: VL/CP (FcyRIIB)-charneira-VH/CP (FcyRIIB)-LIGANTE-CPsZ-CPs3-CPs4. 0 ligante para as moléculas quiméricas pode ter cinco, dez, de preferência quinze aminoácidos de comprimento. 0 comprimento do ligante pode variar para proporcionar uma ligação óptima da molécula a ambas as FcyRIIB e FcsRI. Numa modalidade específica, o ligante é um ligante de 15 aminoácidos, que consiste na sequência: (GlÍ4Ser)3. Apesar de não ter a intenção de estar ligado a um mecanismo de acção específico, considera-se que o ligante de péptido flexível facilita o emparelhamento da cadeia e minimiza a 168 possível redobragem e também permite que a molécula quimérica alcance os dois receptores, ou seja, FcyRIIB e FcsRI nas células e as reticule. De preferência, a molécula quimérica é clonada num vector de expressão de mamífero, por exemplo, pCI-neo, com um promotor compatível, por exemplo, promotor de citomegalovírus. As proteínas de fusão preparadas de acordo com os processos aqui descritos conterão o local de ligação para FcsRI (ΟΗε2ΟΗε3) e para FcyRIIB (VL/CL, -charneira-VH/CP). 0 ácido nucleico que codifica a proteína de fusão preparada de acordo com os processos aqui descritos é preferivelmente transfectado em células 293 e a proteína segregada é purificada utilizando processos comuns conhecidos na técnica. A ligação das moléculas quiméricas tanto a FcsRI como a FcyRIIB humanas pode ser avaliada utilizando processos comuns conhecidos dos especialistas na matéria para determinar a ligação a uma FcyR. De preferência, as moléculas quiméricas aqui descritas têm eficácia terapêutica no tratamento de distúrbios mediados por IgE, por exemplo, pela inibição da desgranulação orientada pelo antigénio e a inibição da activação das células. A eficácia das moléculas quiméricas aqui descritas bloqueiam a desgranulação de mastócitos mediada por driven FcsRI, impulsionado por IgE pode ser determinada em ratos transgénicos, que foram tratados por engenharia genética para expressar a FcsRoí humana e a FcyRIIB humana, antes da sua utilização em seres humanos. A presente invenção providencia o uso de anticorpos duplamente específicos para o tratamento e/ou a prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE e/ou mediadas por FcsRI. Um anticorpo biespecífico (AcBe) liga-se a dois epítopos diferentes geralmente em antigénios distintos. Os 169

AcBe têm uma utilidade clinica potencial e têm sido usados para atingie vírus, células infectadas por vírus e agentes patogénicos bacterianos, bem como para libertar agentes trombolíticos em coágulos sanguíneos (Cao Y., 1998 Bioconj. Chem 9: 635-644; Koelemij et al., 1999, J. Immunother., 22, 514-524; Segai et al., Curr. Opin. Immunol., 11, 558-562). A tecnologia para a produção de IgG Be e outras moléculas biespecíficas relacionadas está disponível (ver, por exemplo, Cárter et al., 2001 J. of Immunol. Methods, 248, 7-15; Segai et al., 2001, J. of Immunol. Methods, 248, 7-15) . A presente invenção tem por objecto anticorpos biespecíficos contendo um F(ab') do anticorpo anti-FcYRIIB e um F(ab') de um anticorpo monoclonal anti-IgE humana disponível que agrega dois receptores, FcyRIIB ed FcsRI, na superfície da mesma célula. Qualquer metodologia conhecida na técnica e divulgada aqui pode ser utilizada para gerar anticorpos biespecíficos para uso nos processos aqui descritos. Numa modalidade específica, os AcBe serão produzidos por fragmentos F(ab') de um anticorpo anti-FcyRIIB e um anticorpo anti-IgE humana quimicamente reticulados, tal como descrito anteriormente, ver, por exemplo, Glennie et al., 1995, Tumor Immunobiology, Oxford University press, Oxford, p. 225). Os fragmentos F(ab') podem ser produzidos por proteólise limitada com pepsina e reduzido com mercaptoetanol-amina para providenciar fragments Fab' com grupos sulfidrilo (SH) da região charneira livre. O grupo SH num dos fragmentos Fab' de (SH) podem ser alquilados com um excesso de O-fenileno-dimaleimida (O-PDM) para providenciar um grupo maleimida (mal) livre. As duas preparações de Fab' (mal) e Fab' (SH) podem ser combinadas numa proporção adequada, de preferência a 1:1 para gerar estruturas heterodiméricas. Os 170

AcBe podem ser purificados por cromatografia de exclusão por dimensão e caracterizados por CLAR usando processos conhecidos dos especialistas na técnica.

Em particular, a presente invenção inclui anticorpos biespecificos compreendendo um primeiro par de cadeia pesada - cadeia leve que se liga a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido par de cadeia pesada - cadeia leve se liga a FcyRIIA e um segundo par de cadeia pesada -cadeia leve que se liga a um receptor de IgE, com a condição que o referido primeiro par de cadeia pesada -cadeia leve se ligue primeiro a FcyRIIB. Os anticorpos biespecificos podem ser tratados por engenharia genética usando técnicas padrão conhecidas na técnica para garantir que a ligação a FcyRIIB precede a ligação ao receptor de IgE. Será compreendido pelos especialistas nesta técnica como tratar por engenharia genética os anticorpos biespecificos, por exemplo, de tal forma que os referidos anticorpos biespecificos se liguem a FcyRIIB com maior afinidade do que os referidos anticorpos se ligam aos receptores de IgE. Além disso, os anticorpos biespecificos podem ser tratados por engenharia genética por meio de técnicas conhecidas na técnica, de modo que o tamanho da charneira do anticorpo pode ser aumentado no seu comprimento, por exemplo, pela adição de ligantes, para providenciar os anticorpos biespecificos com flexibilidade para se ligarem ao receptor de IgE e ao receptor de FcyRIIB na mesma célula.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser usados em combinação com outros anticorpos terapêuticos ou fármacos conhecidas na técnica para o tratamento ou a prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados em combinação com 171 qualquer um dos seguintes: azelastina, Astelina, inalador de dipropionato de beclometasona, Vancerilo, inalador nasal/pulverizador de dipropionato de beclometasona, Vancenase, Beconase, inalador nasal/pulverizador de budesonide, Rhinocort cetirizina, Zyrtec, clorfeniramina, pseudoefedrina, Deconamina, Sudafed, cromoline, Nasalcrom, Intal, Opticrom, desloratadina, Clarinex, fexofenadina e pseudoefedrina, Allegra-D, fexofenadina, pulverizador nasal de flunisolida Allegra, inalador nasal/pulverizador de propionato de fluticasona Nasalide, inalador nasal de propionato de fluticasona Flonase, Flovent, hidroxizina, Vistaril, Ataraxloratadina, pseudoefedrina, Claritina-D, Ioratadina, Claritina, prednisolona, Prednisolona, liquido oral Pediapred, prednisona Medrol, Deltasona, Predsalmeterol liquido, inalador de triamcinolona-acetonida Serevent, inalador nasal/pulverizador de triamcinolona-acetonida Azmacort, Nasacort ou NasacortAQ. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados em combinação com produtos à base de dinucleótidos de citosina-guanina ("CpG") que tenham sido desenvolvidos (Coley Pharmaceuticals) ou estão a ser desenvolvidos actualmente como activadores de respostas imunitárias inatas e adquiridas. Por exemplo, a presente invenção abrange o uso de CpG 7909, CpG 8916, CpG 8954 (Coley Pharmaceuticals) nos processos e composições aqui descritos para o tratamento e/ou a prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE (ver, também Weeratna et al., 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32 (1): 65-71). A presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos, em combinação com quaisquer anticorpos terapêuticos conhecidos na técnica, para o tratamento de distúrbios alérgicos, por exemplo, Xolair™ (Omalizumab; Genentech); rhuMAB-E25 (BioWorld Today, Nov. 10, 1998, p. 172 1; Genentech); CGP-51901 (anticorpo humanizado anti-IgE), etc.

Além disso, a presente invenção abrange o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com outras composições conhecidas na técnica para o tratamento de distúrbios alérgicos. Em particular processos e composições divulgadas em Carson et al. (US 6.426.336; US 2002/0035109 Al; US 2002/0010343).

5.3.5 AGENTES IMUNOREGUIADORES E AGENTES ΑΝΤΙ-INFLAMATÓRIOS O processo da presente invenção tem por objecto processos de tratamento de doenças auto-imunes e doenças inflamatórias que compreendem a administração dos anticorpos aqui descritos em conjunto com outros agentes de tratamento. Exemplos de agentes imunomreguladores incluem, mas não se limitam a metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A e antibióticos macrólios (por exemplo, FK506 (tacrolimus)), metil-prednisolona (MP), corticosteróides, esteróides, mico-fenolato de mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, deoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindas {por exemplo, leflunamida), reguladores de receptores das células T e reguladores dos receptores de citocinas.

Agentes anti-inflamatórios têm demonstrado sucesso no tratamento de doenças inflamatórias e auto-imunes e são agora um tratamento comum e um padrão de tratamento para tais distúrbios. Qualquer agente anti-inflamatório bem conhecido de um de especialista nesta técnica pode ser usado nos presentes processos. Exemplos não limitativos de agentes anti-inflamatórios incluem fármacos anti-inf lamatórios não esteróides (FAINE), fármacos anti- 173 inflamatórios esteróides, beta-agonistas, agentes anti-colinérgicos e metil-xantinas. Exemplos de FAINE incluem, mas não se limitam a aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenac (VOLTAREN™), etodolac (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), cetoralac (TORADOL™), oxaprozin (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindac (CLINORIL™), tolmentina (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™), cetoprofeno (ACTRON™) e nabumetona (RELAFEN™). Esses FAINE funcionam por inibição de uma enzima de ciclo-oxigenase (por exemplo, COX-1 e/ou COX-2). Exemplos de fármacos anti-inflamatórios esteróides incluem, mas não se limitam a glicocorticóides, dexametasona (DECADRON™) , cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triancinolona, azul-fidina e eicosanóides, tais como prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos.

5.3.6 AGENTES ΑΝΤΙ-CANCRO E ANTICORPOS TERAPÊUTICOS

Numa modalidade especifica, os processos da presente invenção compreendem a administração de um ou mais inibidores da angiogénese, tais como, mas não se limitando a: angiostatina (fragmento de plasminogénio)/ antitrombina III antiangiogénica; Angiozima; ABT-627; Bay 12-9566/ Benefina; Bevacizumab; BMS-275291; inibidor derivado de cartilagem (IDC, em inglês CDI); CAI; fragmento do complemento de CD59; CEP-7055; Col 3/ Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento de colage XVIII); fragmento de fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinases; fragmento de hexassacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (GCh, em inglês hCG); IM-862; interferão alfa/beta/gama; proteína indutivel por um interferão (IP-10); interleucina-12; Kringle 5 (fragmento de plasminogénio); Marimastat; inbidores de matelo- 174 proteinase (TIMP); 2-metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A) / MoAb IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; inibidor de ribonuclease da placenta, inibidor do activador de plasminogénio, factor-4 de plaquetas (PF4); Prinomastat; fragmento de prolactina de 16 kD; proteína relacionada com proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; retinóides; Solimastar; esqualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; tetra-hidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondina-1 (TSP-1); TNP-470; factor-beta de transformação do crescimento (FTC-b); vasculostatina; vasostatina (fragmeno de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inibidores de farnesilo transferase (IFTI); e bis-fosfonatos.

Agentes anti-cancerígenos que podem ser usados em combinação com anticorpos aqui descritos nas várias modalidades da presente invenção, incluindo composições farmacêuticas e formas farmacêuticas e kits da presente invenção, incluem, mas não se limitam a: acivicina; aclarubicina; cloridrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; cloridrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer, carboplatina; carmustina; cloridrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; cloridrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; cloridrato de 175 doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; cloridrato de epirubicina; erbulozol; cloridrato de esorubicina; estramustina; fosfato de estramustina e sódio; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; cloridrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemeitabina; cloridrato de gemeitabina; hydroxiureia; cloridrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluindo interleucina II recombinante ou IL2r), interferão alfa-2a; interferão alfa-2b; interferão alfa-nl; interferão alfa-n3; interferão beta-I a; interferão gama-I b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreótido; letrozol; acetato de leuprolide; cloridrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; cloridrato de mecloretamina; acetato de megestrole; acetato de melengestrol; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisurano; paclitaxel; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromao; piposulfano; cloridrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer sódico; porfiromicina; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; cloridrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimide; safingol; cloridrato de safingol; semustina; simtrazeno; sparfosato sódico; esparsomicina; cloridrato de espirogermânio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozoeina; sulofenur; 176 talisomicina; tecogalano sódico; tegafur; cloridrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glicuronato de trimetrexato; triptorelin; cloridrato de tubulozol; mustarda de uracilo; uredepa; vapreotide; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorubicina. Outros fármacos anti-cancro incluem, mas não se limitam a: 20-epi-l,25 di-hidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulinico; anrubicina; amsacrina; anagrelide; anastrozol; andrografolide; inibidores de angiogénese; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteina-1 morfogrnética anti-dorsalizante; antiandrogéneo do carcinoma prostático; antiestrogéneo; antineoplastona; oligonucleótidos anti-paralelos; glicinato de afidicolina; moduladores do gene da apoptose; reguladores da apoptose; ácido apurinico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina-desaminase; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulinico; inibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafide; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionino-sulfoximina; calcipotriol; calfostina 177 C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamido-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inibidor derivado de cartilagem; carzelesina; inibidores de caseína cinase (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalino-sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; desidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexi-fosfamida; dexrazoxana; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; di-hidro-5-azacitidina; di-hidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil-espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristeride; análogo de estramustina; agonistas de estrogeno; antagonistas de estrogeno; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; cloridrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolínio-texafirina; nitrato de gálio; galocitabina; ganirelix; inibidores de gelatinase; gemcitabina; inibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametileno-bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos imunoestimulantes; inibidor do recptor do factor de crescimento 1 semelhante a insulina; agonistas de interferão; interferões; interleucinas; iobenguano; 178 iododoxorubicina; ipomeanol, 4-/ iroplact; irsogladina; isobengazol; isso-homo-halicondrina B; itasetron; jasplacinolido; ca-halalido F; triacetato de lamelarina-N; lanreotide; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolestatina; letrozol; factor de inibição da leucemia; interferão alfa de leucócitos; leuprolide + estrógeno + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo linear de poliamina; péptido dissacaridico lipofílico; compostos lipofilicos de platina; lissoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina; loso-xantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecano; luteceio-texafirina; lisofillina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inibidores de matrilisina; inibidores da matriz de metaloproteinase; menogarilo; merbarona; meterelina; metioninase; metoclopramida; inibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de hélice dupla desemparelhadas; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafide; mitotoxina, factor de crescimento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticorpo monoclonal, gonadotrofina coriónica humana; sk da parede celular do lipido A+miobactério monofosforilado; mopidamol; inibidor de genes resistentes a múltiplos fármacos; terapia à base do supressor 1 de tumores múltiplos; agente anticancro de mustarda; micaperóxido B; extracto de parede celular micobacteriana; miriaporone; N-acetildinalina; benzamidas substituídas em N; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidase neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de ácido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; 06-benzilguanina; octreotido; oquicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetron; ondansetrona; oracina; indutor oral de citocina; ormaplatina; osaterona; 179 oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoil-rizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargase; peldesina; poli-sulfato de pentosano sódico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; álcool perililo; fenazinomicina; fenilacetato; inibidores de fosfatase; picibanilo; cloridrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inibidor do activador de plasminogénio; complexo de platina; compostos de platina; complexo de platina-triamina; porfimer sódico; porfiromicina; prednisona; propil-bis-acridone; prosta-glandina J2; inibidores de proteasoma; modulador imunitário à base de proteína A; inibidor de proteína-cinase C; microalgal; inibidores de proteína tirosine-fosfatase; inibidores de fosforilase de nucleósidos de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de hemoglobina piridoxilada e polioxietileno; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrona; inibidores de ras farnesil-proteína-transferase; inibidores de ras; inibidores de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de rénio Re 186; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitucina; romurtide; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inibidor 1 derivado de senescência; oligonucleótidos paralelos; inibidores de transdução do sinal; moduladores de transdução do sinal; proteína de ligação ao antigénio de cadeia simples; sizofirano; sobuzoxano; borocaptato de sódio; fenilacetato de sódio; solverol; proteína de ligação à somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espi-romustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inibidores de células estaminais; inibidores da divisão de células estaminais; estipiamida; inibidores de estro- 180 melisina; sulfinosina; antagonista superactivo do péptido intestinal vasoactiva; suradista; suramina; svainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; metiodeto de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalano sódico; tegafur; telurapirilo; inibidores de telomerase; temo-porfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoietina; trombopoietina mimética; timalfasina; agonista receptor de timopoietina; timotrinano; hormona estimuladora da tiróide; etil-etiopurpurina de estanho; tirapazamina; bicloreto de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor totipotente das células estaminais; inibidores de tradução; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosteride; inibidores de tirosina-cinase; tirfostinas; inibidores de UBC; ubenimex; factor de crescimento derivado do seno urogenital; antagonistas do receptor de urocinase; vapreotide; variolina B; sistema de vectores, terapia dos genes e eritrócitos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatina; zilascorb; e stimalamero de zinostatina. Outros fármacos anti-cancro preferidos são 5-fluorouracilo e leucovorina.

Exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser usadas nos processos aqui descritos incluem, mas não se limitam a HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que é um anticorpo anti-HER2 monoclonal humanizado para o tratamento de doentes com cancro de mama metastático, REOPRO® (abciximab) (Centocor) que é um anti-receptor da glicoproteina Ilb/IIa nas plaquetas para a prevenção da formação de coágulos; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suíça) que é um imunossupressor, o anticorpo anti-CD25 monoclonal humanizado para a prevenção da rejeição aguda do aloenxerto renal; PANOREX™ que é um anticorpo IgG2a do antigénio da superfície cellular anti- 181 ΙΑ-17 de murino (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que é um anticorpo IgG (epitopo de GD3) anti-idiotipo de murino (ImClone System); IMC-C225 que é um anticorpo IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System); VITAXIN™ que é um anticorpo humanizado anti-aV^3 integrina (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Campath 1H/LDP-03 que é um anticorpo IgGl humanizado anti-CD52 (Leukosite); Smart M195 que é um anticorpo IgG humanizado anti-CD33 (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que é um anticorpo IgGl quimérico anti-CD20 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™ que é um anticorpo IgG humanizado anti-CD22 IgG (Immunomedics); ICM3 é um anticorpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo de primata anti-CD80 (IDEC PharmlMitsubishi) ; ZEVALIN™ é um anticorpo anti-CD20 de murino radiomarcado (IDEC/Schering AG) ; IDEC-131 é um anticorpo humanizado anti-CD40L (EDEC/Eisai); IDEC-151 é um anticorpo de primata anti-CD4 (IDEC); IDEC-é um anticorpo de primata anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMART é um anticorpo IgG humanizado anti-CD3 (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo humanizado do factor 5 (C5) anti-complemento (Alexion Pharm); D2E7 é um anticorpo humanizado anti-FNT-a (CAT/BASF); CDP870 é um fragmento Fab humanizado anti-FNT-a (Celltech); IDEC-151 é um anticorpo IgGl de primata anti-CD4 (IDEC Pharm/SmithKline Beecharn); MDX-CD4 é um anticorpo IgG humano anti-CD4 (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 é um anticorpo IgG4 anti-FNT-α (Celltech); LDP-02 é um anticorpo humanizado 3η^-α4β7 (LeukoSite/Genentech) ; OrthoClone 0KT4A é um anticorpo IgG humanizado anti-CD4 (Ortho Biotech); ANTOVA™ é um anticorpo IgG humanizado anti-CD40L (Biogen); ANTEGREN™ é um anticorpo IgG humanizado anti-VLA-4 (Elan); e CAT-152 é um anticorpo humano anti-TGP-p2 (Cambridge Ab Tech). 182

Outros exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser usados em combinação com os anticorpos aqui descritos estão apresentados no quadro 7.

QUADRO 7: ANTICORPOS MONOCLONAIS OU TERAPIA DO CANCRO QUE PODEM SER USADOS EM COMBINAÇÃO COM OS ANTICORPOS AQUI

DESCRITOS

Empresa Produto Doença Alvo Abgenix ABX-FCE Cancro receptor de FCE AltaRex OvaRex Cancro do ovário Antigénio de tumor CAI25 BravaRex Cancros com metástases Antigénio de tumor MUCI Antisoma Theragyn (perm- turmorrabítrio- 90) Cancro do ovário Antigénio PEM Therex Cancro da mama Antigénio PEM Boehringer Ingelheim Bivatuzumab Cancro da cabeça e do pescoço CD44 Centeror/J&J Panorex Cancro colorectal 17 —Ia ReoPro PTCA gp IlIb/IIIa ReoPro EM agudo gp IlIb/IIIa ReoPro AVC isquémico gp IlIb/IIIa Corixa Bexocar NHL CD2 0 CRC Acm, idiotipico Vacina para o cancro gp72 Technology 105AD7 colorectal Crucell Anti-EpCAM Cancro Ep-CAM Cytoclonal Acm, cancro do pulmão Células não pequenas do pulmão Cancro NA Genentech Herceptina Cancro da mama com metástases HER-2 Herceptina Cancro da mama em estado inicial HER-2 Rituxano Baixa CD2 0 reincidência/refractário NHL crescido ou 183

Empresa Produto Doença Alvo folicular NHL Rituxano intermédio < e elevado CD2 0 NHL crescido Acm-FCEV NSCLC, metastático FCEV Acm-FCEV Cancro colorectal FCEV metastases AMD Fab Degeneração macular CD18 relacionada com a idade E-26 (2* gen. Asma alérgica e rinite IgE IgE) IDEC Zevalina Grau baixo de folicular, CD2 0 (Rituxano + incidência OU ítrio-90) refractário , positivo para CD20, Bell NHL e refractário a rituximab- refractário a NHL ImClone Cetuximab + carcinoma colorectal receptor de FCE inotecano refractário Cetuximab + Cancro da cabeça e receptor de FCE cisplatina e pescoço recentemente radiação diagnosticado ou recorrente Cetuximab + carcinoma pancreático receptor de FCE gencitabina metastático resentemente diagnosticado Cetuximab + Cancro da cabeça e do receptor de FCE cisplatina + pescoço recorrente ou 5FU ou Taxol metastático Cetuximab + carcinoma do pulmão de receptor de FCE carboplatina + células pequenas paclitaxel recentemente diagnosticado Cetuximab + Cancro da cabeça e do receptor de FCE cisplatina pescoço (doença local- regional extensiva e incurável metasteses distantes) Cetuximab + Cancro da cabeça e do receptor de FCE radiação pescoço localmente avançado 184

Empresa

Produto

Doença

Alvo BEC2 + Bacilo carcinoma do pulmão de Calmette Guerin células pequenas BEC2 + Bacilo Melanoma Calmette Guerin IMC-IC11

ImmonoGen

nuC242-DM I

ImmunoMedi c s

LymphoCide LymphoCide Y-90 CEA-Cide CEA-Cide Y-90 CEA-Scan (arcitumomab marcado com Tc-

Cancro colorectal câncer com metástases do fígado Cancro colorectal, gástrico e pancreático Linfoma não Hodgkins Linfoma não Hodgkins tumores sólidos metastásicos tumores sólidos metastásicos Cancro colorectal (radioimagiologia) imita gangliósido GD3 imita gangliósido GD3 receptor de FCEV nuC242

CD22 CD22 CEA CEA CEA 99m)

CEA-Scan Cancro da mama CEA (arcitumomab (radioimagiologia) marcado com Tc-99m)

CEA-Scan Cancro do pulmão CEA (arcitumomab (radioimagiologia) marcado com Tc-99m) CEA-Scan (arcitumomab marcado com Tc- tumores intraoperativos CEA (radioimagiologia) 99m)

LeukoScan (sulesomab marcado com 99m) LeukoScan (marcado Tc-99m) AFP-Scan (marcado Tc-99m)

Infecção dos tecidos CEA moles (radioimagiologia) limfomas CD22 com (radioimagiologia)

Cancros das células gem AFP com 7 do fígado (radioimagiologia) 185

Empresa Produto Doença Alvo Intracel HumaRAD-HN (+ Cancro da cabeça e do NA ítrio-90) pescoço HumaSPECT Visualização colorectal NA Medarex MDX-101 (CTLA- Cancros da próstata e CTLA-4 4) outros MDX-210 (her-2 Cancro da próstata HER-2 sobre- expressão) MDX-210/MAK Cancro HER-2 Medlmmune Vitaxina Cancro ανβ3 Merck KGaA Acm 425 Vários cancros receptor de FCE IS-IL-2 Vários cancros Ep-CAM Millennium Campath Leucemia linfocitica CD52 (alemtuzumab) crónica NeoRx CD20- Linfoma não Hodgkins CD2 0 estreptavidina (+ biotina- ítrio 90) Avidicina Cancros com metástases NA (albumina + NRLU13) Oncolim ( + Linfoma não Hodgkins HLA-DR 10 beta iodo-131) Cotara (+ iodo- Glioma maligno não Proteínas 131) ressecável associadas ao

Peregrine

ADN

Pharmacia Corporation

Protein Design Labs

C215 (+ Cancro pancreático NA enterotoxina estafilocóxica)

Acm, cancro do Cancro do pulmão e rim NA pulmão/rim

nacolomab Cancro do cólon e NA tafenatox (C242 pancreático + enterotoxina estafilocóxica)

Nuvion Malignidades das células CD3

T SMART Ml95 AML CD33 SMART ID10 NHL Antigénio HLA-

DR 186

Empresa Produto Doença Alvo Titan CEAVac Cancro colorectal CEA avançado TriGem melanoma metastásico e GD2-gangliósido cancro do pulmão células pequenas de TriAb Cancro da mama com MUC-1 metástases Trilex CEAVac Cancro colorectal CEA avançado TriGem melanoma metastásico e GD2-gangliósido cancro do pulmão de células pequenas TriAb Cancro da mama com MUC-1 metástases Viventia NovoAcm-G2 Linfoma não Hodgkins NA Biotech radiornarcado Monofarm C Carcinoma colorectal e Antigénio SK-1 pancreático GlioAcm-H ( + glioma, melanoma e NA toxina de neuroblastoma gelonina) Xoma Rituxano NHL com baixo grau de CD20 reincidência/refractário ou folicular

Rituxano NHL de grau intermédio e CD20 elevado

ING-1 Adenocarcinoma Ep-CAM

5.3.7 TERAPIA COM VACINAS A presente invenção tem por objecto um processo para aumentar uma resposta imunológica a uma composição de vacina num indivíduo, em que o referido processo compreendendo a administração, ao referido indivíduo, de anticorpos ou de um seu fragmento, que se liga especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA e uma composição de uma vacina, em que o referido anticorpo 187 ou um seu fragmento melhora a resposta imunológica à referida composição da vacina. Numa modalidade particular, o referido anticorpo ou um seu fragmento aumenta a resposta imunitária à referida composição de vacina aumentando a presença do antigénio e/ou o tratamenteo antigénio, antigénio esse ao qual se dirige a vacina. Qualquer composição de vacina conhecida na técnica é útil em combinação com os anticorpos ou fragmentos de anticorpos aqui descritos.

Numa modalidade, a presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com qualquer vacina contra o cancro conhecida na técnica, por exemplo, CanvaxinTM (Câncer Vax, Corporation, melanoma e cancro do cólon); Oncophage (HSPPC-96; Antigenics; melanoma metastático); vacina do cancro de HER-2/neu, etc. As vacinas contra o cancro usadas nos processos e composições aqui descritos podem ser, por exemplo, vacinas especificas do antigénio, vacinas anti-idiotipicas, vacinas de células dendriticas ou vacinas de ADN. A presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos com vacinas á base de células, tal como descrito por Segai et al. (US 6.403.080). As vacinas à base de células usadas em combinação com os anticorpos aqui descritos podem ser autólogas ou alogénicas. Em resumo, as vacinas contra o cancro, tal como descrito por Segai et al, baseiam-se no produto Opsonokine (TM) da Genitrix, LLC. As Opsonokines(TM) são citocinas geneticamente modificadas que, quando misturadas com células tumorais, ligam-se automaticamente à superfície das células. Quando as células "decoradas" são administradas como uma vacina, a citocina nas células activa o antigénio crítico presente nas células no recipiente, ao mesmo tempo permitindo que as células que apresentam o antigénio ingiram as células do tumor. As células que apresentam 188 antigénios são então capazes de instruir as células T "assassinas" para encontrar e destruir as células tumorais semelhantes ao longo de todo o corpo. Assim, o produto Opsonokine (TM) converte as células do tumor num potente agente imunoterapêutico anti-tumor.

Numa modalidade, a presente invenção abrange o uso dos anticorpos aqui descritos em combinação com qualquer vacina contra alergias conhecida na técnica. Os anticorpos podem ser usados, por exemplo, em combinação com moléculas híbridas recombinantes que codificam para os principais alergenos de pólen de gramíneas usadas para a vacinação contra a alergia do pólen das gramíneas, tal como descrito por Linhart et al. (2000, FASEB Journal, 16 (10): 1301-3). Além disso, os anticorpos podem ser usados em combinação com vacinas, à base de ADN, descritas por Horner et al. (2002, Allergy, 57 Supl, 72: 24-9). Os anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com o Bacilo de vacinação de Clamett-Guerin ("BCG"), como descrito por Choi et al. (2002, Ann. Allergy Asthma Immunology, 88 (6) : 584-91) e Barlan et al. (2002, Journal Asthma, 9 (3): 239-46) para desregular de forma decrescente a secreção de IgE. Os anticorpos aqui descritos são úteis no tratamento de alergias alimentares. Em particular, os anticorpos podem ser usados em combinação com vacinas ou outras imunoterapias conhecidas na técnica (ver Hourihane et al., 2002, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2 (3): 227-31) para o tratamento da alergia ao amendoim.

Os processos e composições aqui descritos podem ser usados em combinação com vacinas, em que se deseja a imunidade para os antigénios. Esses antigénios podem ser qualquer antigénio conhecido na técnica. Os anticorpos podem ser usados para aumentar uma resposta imunitária, por 189 células doentes ou exemplo, a agentes infecciosos, anormais, tais como, mas não se limitando a bactérias {por exemplo, bactérias gram-positivas, bactérias gram- negativas, bactérias aeróbicas, espiroquetas, mico- bactérias, riquetsias, Chlamydias, etc.), parasitas, fungos {por exemplo, Candida albicans, Aspergillus, etc.), virus (por exemplo, virus de ADN, virus de ARN, etc.) ou tumores. As infecções virais incluem, mas não se limitam a virus da imunodeficiência humana (VIH); virus da hepatite A, virus da hepatite B, virus da hepatite C, virus da hepatite D ou outros virus de hepatite; citomegalovirus; virus do herpes simples 1 (2, 3, 4. 5, 6), virus do papeiloma humano; virus sincicial respiratório (VSR) , virus da para-gripe (VPG) , virus de Epstein Barr ou outras infecções virais. A presente invenção engloba o uso dos anticorpos aqui descritos para aumentar uma resposta humoral e/ou mediada por células contra o antigénio(s) da composição da vacina. A presente invenção ainda inclui o uso dos anticorpos, aqui descritos, quer para prevenir ou para tratar um distúrbio particular, em que uma resposta imunitária aumentada contra um antigénio ou antigénios em particular é eficaz para tratar ou para prevenir a doença ou distúrbio. Tais doenças e distúrbios incluem, mas não se limitam a infecções virais, tais como VIH, CMV, hepatite, virus do herpes, sarampo, etc., infecções bacterianas, infecções fúngicas e parasitárias, cancro e qualquer outra doença ou distúrbio passíveis de tratamento ou prevenção, reforçando uma resposta imunológica contra um antigénio ou antigénios específicos.

5.4 COMPOSIÇÕES E PROCESSOS DE ADMINISTRAÇÃO 190 A presente invenção providencia processos e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos aqui descritos. A presente invenção também tem por objecto processos de tratamento, profilaxia e melhoria de um ou mais sintomas associados com uma doença, anomalia ou infecção através da administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão ou de uma molécula conjugada aqui descrita ou uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão oumoléculas conjugadas aqui descritas. Num aspecto preferido, um anticorpo ou uma proteína de fusão ou uma molécula conjugada, está praticamente purificado (isto é, praticamente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejáveis). Numa modalidade específica, o indivíduo é um animal, de preferência um mamífero, tal como não primatas (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) e um primata (por exemplo, macacos, tais como, um macaco caranguejeiro e um ser humano). Numa modalidade preferida, o indivíduo é um ser humano. Vários sistemas de libertação são conhecidos e podem ser usados para administrar uma composição que compreende anticorpos aqui descritos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células re-combinantes capazes de expressarem o anticorpo ou proteína de fusão, endocitose mediada por receptores (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), preparação de um ácido nucleico como parte de um vector retroviral ou outro, etc.

Nalgumas modalidades, os anticorpos aqui descritos são formulados em lipossomas para uma administração dirigida dos anticorpos. Os lipossomas são vesículas compostas por bicamadas de fosfolípidos ordenadas concentricamente que 191 encapsulam uma fase aquosa. Os lipossomas normalmente compreendem vários tipos de lipidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos. Os componentes dos lipossomas estão dispostos numa configuração em camada dupla, similar ao arranjo lipidico das membranas biológicas. Os lipossomas são veículos de administração particularmente preferidos, devido, em parte, à sua biocompatibilidade, baixa imunogenicidade e baixa toxicidade. Os processos para a preparação de lipossomas são conhecidos na técnica e estão abrangidos pela presente invenção, ver, por exemplo, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 82: 3688/ Hwang et al., 1980 Proc. Natl. Acad Sei. USA, 77: 4030-4/ patentes norte-americanas n°. 4.485.045 e 4.544.545. A presente invenção também aengloba processos de preparação de lipossomas com um semi-período de vida prolongado no soro, isto é, que aumenta o tempo de circulação, tal como os que são divulgados na patente norte-americana No. 5.013.556. Os lipossomas preferidos usados nos processos aqui descritos não são rapidamente eliminados da circulação, ou seja, não são levados para o sistema de fagócitos mononucleares (SEM). A presente invenção engloba os lipossomas estericamente estabilizados que são preparados usando processos comuns para os especialistas na matéria. Não pretendendo estar ligado a nenhum mecanismo de acção em particular, os lipossomas estericamente estabilizados contêm componentes lipídicos com partes volumosas hidrofílicas e altamente flexíveis, o que reduz a reação indesejada de lipossomas com proteínas do soro, reduz a oposonização com componentes do soro e reduz o reconhecimento pelo SEM. Os lipossomas estericamente estabilizados são preferencialmente preparados com polietileno-glicol. Para a preparação de lipossomas e lipossomas estericamente estabilizados ver, 192 por exemplo, Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15 (4): 215-224/ Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6/ et al., 1990 FEBS Lett. 268: 235-7/ Blum et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7/ Torchilin et al., 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116/ Litzinger et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta., 1190: 99-107/ Maruyama et al., 1991, Chem. Pharm. Buli., 39: 1620-2/ Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062/ 142-8/ Allen et al., 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309. A presente invenção também engloba lipossomas que estão adaptados para atingir órgãos específicos, ver, por exemplo, a patente norte-americana No. 4.544.545. Lipossomas particularmente úteis para uso nas composições e processos aqui descritos podem ser gerados pelo processo de evaporação de fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizado de PEG (PEG-FE). Os lipossomas são extrudidas através de filtros com um tamanho de poros definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Nalgumas modalidades, um fragmento de um anticorpo aqui descrito, por exemplo, F(ab'), pode ser conjugado com os lipossomas usando os processos descritos anteriormente, ver, por exemplo, Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288.

Os anticorpos aqui descritos podem também ser formulados como imunolipossomas. Imunolipossomas referem-se a uma composição de lipossoma em que um anticorpo aqui descrito ou um seu fragmento está ligado covalentemente ou não covalentemente à superfície do lipossoma. A química da ligação de um anticorpo à superfície do lipossoma é conhecida na técnica e está englobada na presente invenção, ver, por exemplo, Allen et al., 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44/ Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 133-44. 193

Na maioria das modalidades preferidas, os imunolipossornas para uso nos processos e composições aqui descritos são ainda estericamente estabilizados. De preferência, os anticorpos aqui descritos ligam-se covalentemente ou não covalentemente a uma âncora hidrofóbica, que está estavelmente enraizada na bicamada lipidica do lipossoma. Exemplos de âncoras hidrofóbicas incluem mas não seo limitam a fosfolipidos, por exemplo, fosoatidiletanolamina (FE), fosfatidilinositol (FI). Para conseguir uma ligação covalente entre um anticorpo e uma âncora hidrofóbica, qualquer uma das estratégias bioquímicas conhecidas na técnica pode ser utilizada, ver, por exemplo, J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p. 399-435. Por exemplo, um grupo funcional de uma molécula de anticorpo que pode reagir com um grupo activo numa âncora hidrofóbica associada a lipossomas, por exemplo, um grupo amino de uma cadeia lateral de lisina num anticorpo pode ser acoplado ao lipossoma associado a N-glutaril-fosfatidiletanolamina associada a lipossomas activados com carbodi-imida solúvel em água; ou um grupo tiol de um anticorpo reduzido pode ser acoplado a lipossomas através de âncoras de tiol reactivas tais como piridiltiopropionil-fosfatidiletanolamina. Ver, por exemplo, Dietrich et al., 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105; Loughrey et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta., 901: 157-160; Martin et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 286-288; Martin et al., 1981, Biochemistry, 20: 4429-38.

Embora não pretendendo estar ligado a um mecanismo de acção particular, considera-se que as formulações imunolipossómicas compreendendo um anticorpo aqui descrito são particularmente eficazes como agentes terapêuticos, já 194 que libertam o anticorpo para o citoplasma da célula-alvo, isto é, a célula que compreende o receptorde FcyRIIB ao qual se liga o anticorpo. Os imunolipossornas, de preferência, têm um semi-periodo de vida aumentado no sangue, especificamente nas células-alvo e podem ser internalizados no citoplasma das células-alvo evitando assim a perda do agente terapêutico ou a degradação pela via endolisossómica. A presente invenção engloba os imunolipossornas que compreendem um anticorpo aqui descrito ou um seu fragmento. Nalgumas modalidades, os imunolipossornas ainda compreendem um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como os descritos aqui.

As composições imunolipossómicas aqui descritas compreendem um ou mais lípidos formando vesículas, um anticorpo aqui descrito ou um seu fragmento ou um seu derivado e, eventualmente, um polímero hidrofilico. Um lípido formando uma vesícula é, de preferência, um lípido com duas cadeias de hidrocarboneto, tal como cadeias de acilo e um grupo polar de topo. Exemplos de lípidos formando vesículas incluem fosfolípidos, por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, esfingomielina e glicolípidos, por exemplo, cerebrósidos e gangliósidos. Outros lípidos, úteis nas formulações aqui descritas, são conhecidos dos técnicos na matéria e estão abrangidos pela presente invenção. Nalgumas modalidades, as composições imunolipossómicas ainda compreender um polímero hidrofilico, por exemplo, polietileno-glicol e gnagliósido GM1, que aumenta o semi-periodo de vida do lipossoma no soro. Os processos de conjugação de polímeros hidrofílicos com lipossomas são bem conhecidos na técnica e estão englobados pela presente 195 invenção. Para uma revisão dos imunolipossomas e dos processos para a sua preparação, ver, por exemplo, a publicação internacional PCT No. WO 97/38731, Vingerhoeads et al., 1994, Immunomethods, 4: 259-72; Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Buli. 23 (7) : 791-799; Abra et al., 2002, Journal of Liposome Research, 12 (1 &2) : 1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22 (2): 267-281; Bendas et al., 2001 BioDrugs, 14 (4): 215-224, J. Thomas August, ed, 1997, Gene

Therapy: Advances in Pharmacology, volume 40, Academic

Press, San Diego, CA., p. 399-435.

Os processos de administração de um anticorpo aqui descrito incluem, mas não se limitam à administração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e através das mucosas (por exemplo, vias intranasal e oral). Numa modalidade especifica, os anticorpos aqui descritores são administrados por via intramuscular, intravenosa ou subcutânea. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injecção de bólus, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, rectal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados com outros agentes activos sob o ponto de vista biológico. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, também se pode utilizar a administração pulmonar, por exemplo por meio da utilização de um inalador ou de um nebulizador e uma formulação com um agente de aerossolização. Ver, por exemplo, as patentes norte-americanas n°. 6.019.968; 5.985. 320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; e 4.880.078; e publicações das PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; and WO 99166903. 196 A presente invenção também tem por objecto os anticorpos aqui descritos embalados numa embalagem hermeticamente selada, tal como uma ampola ou uma saqueta indicando a quantidade de anticorpo. Numa modalidade, fornecem-se os anticorpos sob a forma de um pó anidro liofilizado e esterilizado ou um concentrado isento de água, numa embalagem hermeticamente selada, que pode ser reconstituída, por exemplo, com água ou uma solução salina, para a concentração apropriada para administração a um indivíduo. De preferência, os anticorpos são fornecidos como um pó estéril liofilizado e seco numa embalagem hermeticamente fechada, com uma dose unitária de pelo menos 5 mg, mais preferencialmente pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg ou pelo menos 75 mg. Os anticorpos liofilizados devem ser armazenados a entre 2 e 8 °C na sua embalagem original e os anticorpos devem ser administrado no prazo de 12 horas, de preferência dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas ou dentro de 1 hora depois de serem reconstituídos. Numa modalidade alternativa, os anticorpos são fornecidos sob a forma líquida numa embalagem hermeticamente selada, indicando a quantidade e a concentração do anticorpo, da proteína de fusão ou na molécula conjugada. De preferência, a forma líquida dos anticorpos é fornecida numa embalagem hermeticamente fechada, a pelo menos 1 mg/ml, mais preferencialmente pelo menos 2,5 mg/ml, pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 8 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 100 mg/ml, pelo menos 150 mg/ml, pelo menos 200 mg/ml de anticorpos. A quantidade de composição aqui descrita que será eficaz no tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais 197 sintomas associados com um distúrbio pode ser determinada por técnicas clinicas normalizadas. A dose precisa a seu utilizada na formulação dependerá também da via de administração e da severidade do estado clinico e deve ser decidida de acordo com a decisão do médico e com as circunstâncias de cada doente. Podem-se extrapolar doses eficazes a partir das curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de ensaio de modelos in vitro ou em animais.

Para anticorpos englobados aqui, a dose administrada a um doente é normalmente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do doente. De preferência, a dose administrada a um doente está entre 0, 0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0, 0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0, 0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg do peso corporal do doente. Geralmente, os anticorpos humanos têm um semi-periodo de vida no corpo humano mais longo do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imunitária aos polipéptidos exógenos. Assim, são possíveis doses mais baixas dos anticorpos humanos e uma administração menos frequente. Além disso, a dose e a frequência de administração dos anticorpos aqui descritos ou os seus fragmentos podem ser reduzidas aumentando a ingestão e a penetração nos tecidos dos anticorpos, por meio de modificações tais como, por exemplo, lipidação.

Numa modalidade, a dosagem dos anticorpos aqui descritos, administrada a um doente é de 0,01 mg para 1000 mg/dia, quando usada como terapia de agente único. Numa outra modalidade, os anticorpos aqui descritos são usados em combinação com outras composições terapêuticas e a 198 dosagem administrada a um doente é menor do que quando os referidos anticorpos são usados como terapia de agente único.

Numa modalidade especifica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas aqui descritas, localmente, na área que precisa de tratamento, o que pode ser conseguido, por exemplo e não a titulo limitativo, por infusão local, por injecção ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas ou fibras. Preferencialmente, quando se administra um anticorpo aqui descrito, é preciso ter cuidado para utilizar materiais que o anticorpo ou a proteína de fusão não absorvam.

Noutra modalidade, as composições podem ser administradas numa vesícula, em particular um lipossoma {Ver Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3-327; ver, em geral ibid.).

Ainda numa outra modalidade, as composições podem ser libertadas num sistema de libertação controlada ou de libertação sustentada. Qualquer técnica conhecida de um especialista na matéria pode ser usada para produzir formulações de libertação sustentada compreendendo um ou mais anticorpos aqui descritos. Ver, por exemplo a patente norte-americana U.S. No. 4.526.938; a publicação da PCT WO 91/05548; a publicação da PCT WO 96/20698; Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Câncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," 199

Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24: 853-854; e Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24: 759-760.

Numa modalidade, pode-se utilizar uma bomba num sistema de libertação controlada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; e Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574) . Noutra modalidade, podem ser utilizados materiais poliméricos para se conseguir a libertação controlada dos anticorpos (ver, por exemplo, Medicai Application of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Bali (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7:1 105); patentes de invenção norte-americanas U.S. No. 5.679.377; U.S. No. 5.916.597; U.S. No. 5.912.015; U.S. No. 5.989.463; U.S. No. 5.128.326; publicação PCT No. WO 99/15154; e publicação PCT No. WO 99/20253). Exemplos de polímeros utilizados nas formulações de libertação sustentada incluem, mas não se limitam a poli(metacrilato de 2-hidroxi-etilo), poli(metacrilato de metilo), poli-(ácido acrílico), poli (acetato de etileno-co-vinilo), poli-(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianidridos, 200 poli(N-vinil-pirrolidona), poli(álcool de vinilo), poli-acrilamida, poli(etileno-glicol), poliláctidos (PLA), poli(lactido-co-glicólidos) (PLGA) e poliortoésteres. Ainda noutra modalidade, pode-se colocar um sistema de libertação controlada na proximidade do alvo terapêutico {por exemplo, os pulmões), exigindo assim apenas uma fracção da dose sistémica (ver, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) ) . Noutra modalidade, as composições poliméricas úteis como implantes de libertação controlada são utilizadas de acordo com Dunn et al. (ver U.S. 5.945.155). Este processo particular é baseado no efeito terapêutico da libertação controlada in situ do material bioactivo a partir do sistema de polímero. A implantação pode ocorrer, geralmente, em qualquer lugar dentro do corpo do doente com necessidade do tratamento terapêutico. Noutra modalidade, utiliza-se um sistema de libertação sustentada não polimérico, pelo qual se utiliza um implante não polimérico no corpo do indivíduo como um sistema de administração de fármacos. Após a implantação no corpo, o dissolvente orgânico do implante irá dissipar, dispersar ou lixiviar a partir da composição no fluido em torno do tecido e o material não polimérico vai gradualmente coagular ou precipitar para formar uma matriz sólida, microporosa (ver U.S. 5.888.533) .

Os sistemas de libertação controlada estão discutidos na revisão de Langer (1990, Science 249: 1527-1533) . Qualquer técnica conhecida de um especialista na matéria pode ser usada para produzir formulações de libertação sustentada compreendendo um ou mais agentes terapêuticos aqui descritos. Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. No. 4.526.938; as publicações internacionais n° . WO 91/05548 e WO 96/20698; Ning et al. , 1996, Radiotherapy & 201

Oncology 39: 179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24: 853-854; e Lam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24: 759-760.

Numa modalidade especifica, em que a composição aqui descrita é um ácido nucleico codificando um anticorpo, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de seu anticorpo codificado, construindo-o como parte de um vector de expressão de ácido nucleico apropriado e administrá-lo de modo que se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vector retroviral (ver a patente U.S. No. 4.980.286) ou por injecção directa ou por uso de bombardeamento de microparticulas (por exemplo, uma arma genética; Biolistic, Dupont) ou revestimento com lipidos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção ou pela sua administração em articulação com um péptido semelhante a uma "homeobox" que é conhecida por entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, pode-se introduzir um ácido nucleico intracelularmente e incorporá-lo no ADN da célula hospedeira para expressão por recombinação homóloga.

Para os anticorpos, a dose terapeuticamente ou profilacticamente eficaz administrada a um indivíduo é geralmente de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg de peso corporal do indivíduo. De preferência, a dose administrada a um indivíduo está entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal do indivíduo e, mais preferivelmente, a dose administrada a um indivíduo está entre 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. A dose e a frequência de administração dos anticorpos aqui descritos ou os seus fragmentos podem ser 202 reduzidas também aumentando a ingestão e a penetração nos tecidos (por exemplo, no pulmão) dos anticorpos ou proteínas de fusão, por meio de modificações tais como, por exemplo, lipidação. 0 tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz dos anticorpos aqui descritos pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos. Num exemplo preferido, trata-se um indivíduo com anticorpos no intervalo entre cerca de 0,1 a 30 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana, durante cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre 2 a 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 semanas e ainda mais preferencialmente durante cerca de 4, 5 ou 6 semanas. Noutras modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas são administradas uma vez por dia, duas vezes por dia ou três vezes por dia. Noutras modalidades, as composições farmacêuticas são administradas uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez em a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez de seis em seis semanas, uma vez em a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano. Também será reconhecido que a dose eficaz dos anticorpos utilizados para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um tratamento particular.

5.4.1 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições aqui descritas incluem composições de fármacos a granel úteis no fabrico de composições farmacêuticas (por exemplo, composições impuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (isto é, composições que são adequados para administração a um indivíduo ou doente), que podem ser usadas na preparação de formas 203 farmacêuticas unitárias. Essas composições compreendem uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista profiláctico ou terapêutico de um agente profiláctico e/ou terapêutico aqui descrito ou uma combinação desses agentes e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. De preferência, as composições aqui descritas compreendem uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista profiláctico ou terapêutico, dos anticorpos aqui descritos e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Numa modalidade particular, a composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico de um anticorpo ou de um seu fragmento que se liga a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA e um anticorpo citotóxico que se liga especificamente a um antigénio do cancro e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Noutra modalidade, a referida composição farmacêutica compreende ainda um ou mais agentes anti-cancro.

Num enquadramento especifico, a expressão "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico", significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou de um governo estadual ou inscrito na Farmacopeia dos EUA ou noutras farmacopeias geralmente reconhecidas, para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. 0 termo "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjucante de Freund (completo e incompleto) , excipiente ou veiculo com o qual se administra o veículo terapêutico. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos esterilizados, tal como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tal como o óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água é um veículo preferido quando 204 a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Também se podem utilizar, como veículos líquidos, soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol, particularmente para soluções injectáveis. Os excipientes farmacêuticos apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, gesso, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado, glicerol, propileno-glicol, água, etanol e similares. A composição, se se desejar, também podem conter quantidades mínimas de agentes de molhagem, emulsionantes ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e similares.

Geralmente, os ingredientes das composições aqui descritas são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado anidro ou um concentrado isento de água num recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou uma saqueta indicando a quantidade de agente activo. Quando a composição farmacêutica é para ser administrada por infusão, pode ser libertada com um frasco de infusão contendo água ou uma solução salina esterilizada, de grau farmacêutico. Quando a composição é administrada por injecção, pode-se fornecer uma ampola de água esterilizada para injecção ou uma solução salina para que os ingredientes se possam misturar antes da administração.

As composições aqui descritas podem ser formuladas sob formas neutras ou de sais. Sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem, mas não se limitam aos sais formados com aniões, tais como os derivados dos ácidos 205 clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. e os formados com catiões, tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropil-amina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

5.4.2 TERAPIA GENÉTICA

Numa modalidade específica, os ácidos nucleicos compreendem sequências que codificam anticorpos ou proteínas de fusão, que são administrados para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infecção, por meio da terapia de genes. A terapia genética refere-se à terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou que pode expressar. Nesta modalidade, os ácidos nucleicos produzem os seus anticorpos codificados ou proteínas de fusão que medeiam um efeito terapêutico ou profiláctico.

Qualquer um dos processos para a terapia genética disponível na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Estes processos estão descritos a seguir.

Para revisões gerais dos processos de terapia genética ver, Goldspiel et al., 1993, Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, Science 260; 926-932 (1993); e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Maio de 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215. Os processos normalmente conhecidos na técnica da tecnologia de ADN recombinante, que pode ser usados estão descritos em Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols 206 in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) .

Num aspecto preferido, uma composição aqui descrita compreende ácidos nucleicos codificando um anticorpo, em que os referidos ácidos nucleicos são uma parte de um vector de expressão que expressa o anticorpo num hospedeiro adequado. Em particular, esses ácidos nucleicos têm promotores, de preferência promotores heterólogos, operacionalmente ligados à região de codificação de anticorpos, sendo o referido promotor indutivel ou constitutivo e, eventualmente, especifico do tecido. Noutra modalidade particular, utilizam-se moléculas de ácido nucleico nas quais as sequências de codificação do anticorpo e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando assim a expressão intracromossómica dos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

Noutro aspecto preferido, uma composição aqui descrita compreende ácidos nucleicos codificando uma proteína de fusão, em que os referidos ácidos nucleicos são uma parte de um vector de expressão que expressa a proteína de fusão num hospedeiro adequado. Em particular, esses ácidos nucleicos têm promotores, de preferência promotores heterólogos, operacionalmente ligados à região de codificação de uma proteína de fusão, sendo o referido promotor indutivel ou constitutivo e, eventualmente, específico do tecido. Numa outra modalidade particular, utilizam-se as moléculas de ácido nucleico nas quais a 207 sequência de codificação da proteína de fusão e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando assim a expressão intracromossómica da proteína de fusão que codifica os ácidos nucleicos. A administração dos ácidos nucleicos a um indivíduo pode ser directa, caso em que o indivíduo está directamente exposto ao ácido nucleico ou a vectores que comportam os ácidos nucleicos ou indirectamente, caso em que as células são primeiro transformadas com os ácidos nucleicos in vitro e depois transplantadas para o indivíduo. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia genética in vivo ou ex vivo.

Numa modalidade específica, as sequências de ácidos nucleicos são directamente administradas in vivo, onde são expressas para produzir o produto codificado. Isso pode ser feito por qualquer um dos vários processos conhecidos na técnica, por exemplo, construindo-os como parte de um vector de expressão de ácido nucleico apropriado e administrando-o para que se tornem intracelulares, por exemplo, por infecção utilizando vectores defeituosos ou retrovirais atenuados ou outros vectores virais (ver patente U.S. No. 4.980.286) ou por injecção directa de ADN nu ou pelo uso de bombardeamento com micropartículas {por exemplo, uma arma genética; Biolistic, Dupont) ou revestimento com lípidos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, encapsulamento em lipossomas, micropartículas ou microcápsulas ou administrando-os em ligação a um péptido que é conhecido por entrar no núcleo, administrando-o em ligação com um ligando submetido a endocitose mediada pelo receptor [ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol Chem 262: 4429-4432) 208 (que pode ser usado para atingir tipos de células expressando especificamente os receptores), etc. Noutra modalidade, podem formar-se complexos de ácido nucleico -ligando em que o ligando compreende um péptido virai fusogénico para romper endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossómica. Ainda noutra modalidade, o ácido nucleico pode ser dirigido in vivo para a absorção especifica de células e a expressão, visando um receptor especifico {ver, por exemplo, publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido no meio intracelular e incorporado no ADN da célula hospedeira para a expressão por recombinação homóloga (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932-8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

Numa modalidade especifica, utilizam-se os vectores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo ou uma proteína de fusão. Por exemplo, pode-se utilizar um vector retroviral (ver Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estes vectores retrovirais contêm os componentes necessários para o acondicionamento correcto do genoma virai e a integração no ADN da célula hospedeira. As sequências de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo ou uma proteína de fusão que se utilizam na terapia genética são clonadas num ou mais vectores, o que facilita a administração da sequência de nucleótidos a um indivíduo. Mais detalhes sobre vectores retrovirais podem ser encontrados em Boesen et al, (1994, Biotherapy 6: 291-302), que descreve o uso de um vector retroviral para administrar o gene mdr 1 às células estaminais hematopoiéticas, a fim de tornar as células estaminais mais resistentes à quimioterapia. Outras 209 referências que ilustram o uso de vectores retrovirais na terapia genética são: Clowes et ai., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Klein et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons e Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; e Grossman e Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3: 110-114.

Os adenovirus são outros vectores virais que podem ser usados na terapia genética. Os adenovirus são veículos especialmente atractivos para a administração de genes do epitélio respiratório. Os adenovirus infectam naturalmente o epitélio respiratório, onde causam uma doença ligeira. Outros alvos para os sistemas de libertação à base de adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais e o músculo. Os adenovirus têm a vantagem de serem capazes de infectar células que não se dividem. Kozarsky e Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503, 1993, apresentam uma revisão de terapia genética à base de adenovirus. Bout et al., (Human Gene Therapy, 5: 3-10, 1994) demonstraram o uso de vectores de adenovirus para transferir genes para o epitélio respiratório de macacos rhesus. Outros exemplos do uso de adenovirus na terapia genética podem ser encontrados em Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234; publicação PCT W094/12649; e Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783. Numa modalidade preferida, usam-se vectores de adenovirus.

Os vírus adeno-associados (VAA) também têm sido propostos para serem utilizados na terapia genética {ver, por exemplo, Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 204: 289-300 e patente No. 5.436.146). 210

Outra abordagem para a terapia genética consiste na transferência de um gene para células em cultura de tecidos por processos como a electroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção virai. Normalmente, o processo de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são então colocadas sob seleção para isolar as células que assumiram e estão a expressar o gene transferido. Essas células são então administradas a um indivíduo.

Nesta modalidade, o ácido nucleico é introduzido numa célula, antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Essa introdução pode ser efectuada por qualquer processo conhecido na técnica, incluindo mas não se limitando a transfecção, electroporação, microinjecção, infecção com um vector virai ou bacteriófago contendo as sequências de ácidos nucleicos, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomas, transferência de genes mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Numerosas técnicas são conhecidas na técnica para a introdução de genes exógenos em células {ver, por exemplo Loeffler e Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618, Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; e Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92, 1985) e podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, desde que as funções necessárias, de desenvolvimento e fisiológicas, das células destinatárias não sejam perturbadas. A técnica deverá providenciar a transferência estável do ácido nucleico para a célula, de modo que o ácido nucleico é expresso pela célula e, de preferência, herdado e podendo ser expresso pela sua descendência celular. 211

As células recombinantes resultantes podem ser administradas a um indivíduo por vários processos conhecidos na técnica. Os glóbulos de sangue recombinantes {por exemplo, células estaminais hematopoiéticas ou células progenitoras) são administrados, de preferência, por via intravenosa. A quantidade prevista de células a utilizar depende do efeito desejado, do estado do doente, etc. e pode ser determinada por um especialista na matéria.

As células em que se pode introduzir um ácido nucleico, para fins de terapia genética, abrangem qualquer tipo de célula desejado disponível e incluem, mas não se limitam a células epiteliais, queratinócitos, fibroblastos, células dos músculos, hepatócitos; células do sangue tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em especial células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, como as obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.

Numa modalidade preferida, a célula utilizada para a terapia genética é autóloga em relação ao indivíduo.

Numa modalidade em que as células recombinantes são usados na terapia genética, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo ou uma proteína de fusão são introduzidas nas células de modo que possam ser expressas pelas células ou a sua progenia e as células recombinantes são então administradas in vivo para efeitos terapêuticos. Numa modalidade específica, utilizam-se as células estaminais ou progenitoras. Quaisquer células estaminais e/ou células progenitoras, que podem ser isoladas e mantidas in vitro, podem ser potencialmente 212 utilizadas de acordo com esta modalidade da presente invenção {ver, por exemplo, a publicação PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, 1992, Cell 7 1: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229; e Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771).

Numa modalidade especifica, o ácido nucleico a ser introduzido para fins de terapia genética compreende um promotor indutivel operacionalmente ligado à região de codificação, tal como a expressão do ácido nucleico é controlável por meio do controlo da presença ou da ausência do indutor apropriado de transcrição.

5.4.3 KITS A presente invenção tem por objecto um pacote ou um kit de produtos farmacêuticos composto por um ou mais recipientes cheios com os anticorpos aqui descritos. Além disso, o pacote ou o kit de produtos farmacêuticos pode também incluir um ou mais de outros agentes profilácticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma doença. A presente invenção também providencia um pacote ou um kit de produtos farmacêuticos composto por um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da presente invenção. Opcionalmente associado com esses recipientes pode estar um aviso sob a forma prescrita por uma agência governamental que regula o fabrico, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso esse que reflecte a aprovação pela agência do fabrico, utilização ou venda para a administração humana. A presente invenção providencia kits que podem ser usados nos processos anteriores. Numa modalidade, um kit 213 compreende um ou mais dos anticorpos aqui descritos. Noutra modalidade, um kit inclui ainda um ou mais de outros agentes profilácticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de cancro, em um ou mais recipientes. Noutra modalidade, um kit inclui ainda um ou mais anticorpos citotóxicos que se ligam a um ou mais antigénios de cancro associados ao cancro. Em certas modalidades, o outro agente profiláctico ou terapêutico é um produto quimioterapêutico. Noutras modalidades, o agente profiláctico ou terapêutico é um agente terapêutico biológico ou hormonal.

5.5 CARACTERIZAÇÃO E DEMONSTRAÇÃO DA UTILIDADE TERAPÊUTICA Vários aspectos das composições farmacêuticas ou dos agentes profilácticos ou terapêuticos aqui descritos são ensaiados, preferencialmente, in vitro, por exemplo, num sistema de cultura de células e depois in vivo, por exemplo, num organismo de um modelo de animal, tal como um sistema de um modelo de um animal roedor, para a actividade terapêutica desejada antes do uso em seres humanos. Por exemplo, os ensaios que podem ser usados para determinar se a administração de uma composição farmacêutica especifica é indicada, incluem ensaios de cultura de células em que se faz crescer numa cultura uma amostra de tecido do doente e se expõe ou de alguma forma se faz contactar com uma composição farmacêutica e observa-se o efeito de tal composição na amostra de tecido, por exemplo, a inibição ou a diminuição do crescimento e/ou a formação de colónias em ágar mole ou formação de uma rede tubular numa membrana basal a três dimensões ou a preparação de uma matriz extracelular. A amostra de tecido pode ser obtida por biópsia do doente. Este ensaio permite a identificação das moléculas profilácticas ou terapêuticas mais eficazes sob o ponto de vista terapêutico, para cada doente individual. 214

Alternativamente, em vez da cultura de células de um doente, os agentes terapêuticos e os processos podem ser rastreados, utilizando células de uma linha de células tumorais ou malignas. Em várias modalidades especificas, podem fazer-se ensaios in vitro com células representativas dos tipos de células envolvidas num distúrbio auto-imune ou inflamatório (por exemplo células T) , para determinar se uma composição farmacêutico aqui descrita tem o efeito desejado sobre esses tipos de células. Muitos ensaios-padrão desta técnica podem ser usados para avaliar essa sobrevivência e/ou crescimento, por exemplo, a proliferação celular pode ser analisada através da medição da incorporação de 3H-timidina, pela contagem directa das células, através da detecção de alterações na actividade transcricional de genes conhecidos tais como proto-oncogenes (por exemplo fos, myc) ou marcadores do ciclo celular; a viabilidade celular pode ser avaliada pela coloração azul de tripano, a diferenciação pode ser avaliada visualmente com base em alterações da morfologia, diminuição do crescimento e/ou formação de colónias em ágar mole ou a formação de uma rede tubular, a três dimensões, da membrana basal ou preparação da matriz extracelular, etc.

Podem analisar-se combinações de agentes profiláticos e/ou terapêuticos em sistemas adequados de modelos de animais antes do uso em seres humanos. Esses sistemas de modelo de animais incluem, mas não de limitam a ratos, murganhos, galinhas, vacas, macacos, porcos, cães, coelhos, etc. Pode-se utilizar qualquer sistema de animais, bem conhecido na técnica. Numa modalidade especifica, as combinações de agentes profilácticos e/ou terapêuticos são ensaiadas num sistema de modelo de murganho. Esses sistemas de modelos são amplamente utilizados e bem conhecidos pelos 215 especialistas na matéria. Os agentes profilácticos e terapêuticos podem ser administrados repetidamente. Vários aspectos do procedimento podem variar, tal como o regime temporal de administração dos agentes profilácticos e/ou terapêuticos e se tais agentes forem administrados separadamente ou como uma mistura.

Modelos de animais preferidos para se utilizarem nos processos aqui descritos são, por exemplo, ratos transgénicos que expressam FcyR em células efectoras de murganho, por exemplo, qualquer modelo de murganho descrito na patente U.S. n° 5.877.396.

Os ratos transgénicos que se utilizam nos processos aqui descritos incluem, mas não se limitam a ratos portadores de FcyRIIIA humana, ratos portadores de FcyRIIA humanas, ratos portadores de FcyRIIB humanas e FcyRIII humanas, ratos portadores de FcyRIIB humanas e FcyRIIA humanas.

Uma vez que os agentes profilácticos e/ou agentes terapêuticos aqui descritos são ensaiados num modelo de animal, também podem ser ensaiados em ensaios clínicos para estabelecer a sua eficácia. 0 estabelecimento de ensaios clínicos será feito de acordo com metodologias comuns conhecidos dos especialistas na matéria e as doses óptimas e as vias de administração, bem como os perfis de toxicidade das composições aqui descritas podem ser estabelecidos usando experimentação de rotina. A actividade anti-inflamatória das terapias de combinação aqui descritas pode ser determinada utilizando vários modelos experimentais de animais de artrite inflamatória conhecidos na técnica e descritos em Crofford 216 L.J. e Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animais", em Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), capitulo 30 (Lee e Febiger, 1993). Modelos experimentais e espontâneos de artrite inflamatória e doenças reumáticas auto-imunes em animais também podem ser usados para avaliar a actividade anti-inflamatória das terapias de combinação aqui descritas. A seguir dão-se alguns ensaios a titulo de exemplos e não como limitação. O principio dos modelos de artrite ou doença inflamatória em animais conhecidos na técnica e amplamente utilizados incluem: modelos de artrite induzida por adjuvante em ratos, modelos de artrite induzida por colagénio em ratos e murganhos e modelos de artrite induzida por antigénios em ratos, coelhos e hamsteres, todos descritos em Crofford L.J. e Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animais", em Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), capitulo 30 (Lee e Febiger, 1993). A actividade anti-inflamatória das terapias de combinação aqui descritas pode ser avaliada utilizando um modelo de artrite induzida por carragenina em ratos. A artrite induzida por carragenina também tem sido usada em coelhos, cães e porcos em estudos de artrite crónica ou de inflamação. A análise histomorfométrica quantitativa é usada para determinar a eficácia terapêutica. Os processos para usar esse modelo de artrite induzida por carragenina estão descritos em Hansra P. et al "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat" Inflammation, 24 (2): 141-155, (2000). Também se usam vulgarmente modelos de inflamação induzida por zimosano em animais, como é conhecido e está descrito na técnica. 217 A actividade anti-inflamatória das terapias de combinação aqui descritas também pode ser avaliada medindo a inibição do edema da pata de ratos induzido por carragenina, usando uma modificação do processo descrito em Winter C. A. et al., "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for And-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 44-547, (1962). Este ensaio tem sido usado como um rastreio primário in vivo para a actividade anti-inflamatória da maior parte dos FAINE e é considerado preditivo de eficácia em seres humanos. A actividade anti-inflamatória dos agentes profilácticos ou terapêuticos do ensaio é expressa como a percentagem de inibição do aumento no peso da pata posterior do grupo de ensaio em relação ao grupo de controlo doseado com veiculo.

Além disso, os modelos para doenças inflamatórias intestinais em animais também podem ser usados para avaliar a eficácia das terapias de combinação aqui descritas (Kim et al., 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27: 529-537; Strober, 1985, Dig. Dis. Sei. 30 (12 supl) : 3S-10S) . A colite ulcerosa e a doença de Crohn são doenças inflamatórias do intestino humano que podem ser induzidas em animais. Os polissacáridos sulfatados, incluindo, mas não se limitando a amilopectina, carragenina, sulfato de amilopectina e sulfato de dextrano ou irritantes químicos, incluindo, mas não se limitando a ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) e ácido acético podem ser administrados por via oral aos animais para induzir doenças inflamatórias intestinais.

Os modelos para a asma em animais também podem ser usados para avaliar a eficácia das terapias de combinação aqui descritas. Um exemplo de um tal modelo é o modelo de transferência adoptiva de murino em que a provocação do aeroalergeno de ratos destinatário de TH1 ou TH2 resulta na 218 migração de células efectoras TH para as vias aéreas e está associada a uma intensa resposta inflamatória neutrofilica (TH1) e eosinofilica (TH2) da mucosa do pulmão (Cohn et al., 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747).

Os modelos para distúrbios autoimunes em animais também podem ser usados para avaliar a eficácia das terapias de combinação aqui descritas. Têm sido desenvolvidos modelos para doenças auto-imunes em animais, tal como diabetes do tipo 1, autoimunidade da tiróide, lúpus eritematoso sistémico e glomerulonefrite (Flanders et al., 1999, Autoimmunity 29: 235-246; Krogh et al., 1999, Biochimie 81: 511-515; Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19: 12-24) .

Além disso, qualquer ensaio conhecido pelos especialistas na técnica pode ser usado para avaliar a utilidade profiláctica e/ou terapêutica das terapias de combinação aqui descritas para doenças auto-imunes e/ou inflamatórias. A toxicidade e a eficácia dos protocolos profilácticos e/ou terapêuticos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos normalizados em culturas de células ou em animais experimentais, por exemplo, para a determinação da DL50 (a dose letal para 50 % da população) e a DE50 (a dose terapêutica efectiva em 50 % da população) . A proporção da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão DL50/DE50. Os agentes profiláticos e/ou terapêuticos que apresentam grandes índices terapêuticos são os preferidos. Embora se possam utilizar agentes profilácticos e/ou terapêuticos que exibem efeitos colaterais tóxicos, deve-se tomar cuidado para projectar um sistema de libertação que direcione esses agentes para o 219 local do tecido afectado, a fim de minimizar os danos potenciais para as células não infectadas e assim reduzir os efeitos colaterais.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e de estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem dos agentes profilácticos e/ou terapêuticos para serem utilizados em seres humanos. A dosagem para os seres humanos encontra-se, de preferência, numa gama de concentrações em circulação que incluem a DE5o com pouca ou nenhuma toxicidade. A dose pode variar dentro deste intervalo consoante a forma farmacêutica utilizada e a via de administração utilizada. Para qualquer agente utilizado no processo aqui descrito, a dose eficaz sob o ponto de vista terapêutico pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. A dose pode ser formulada em modelos de animais para alcançar um intervalo de concentrações em circulação no plasma que inclui a CI50 (isto é, a concentração do composto do ensaio que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas), conforme determinado na cultura de células. Essa informação pode ser utilizada para determinar, com mais precisão, doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta resolução. A actividade anti-cancro das terapias utilizadas de acordo com a presente invenção também pode ser determinada usando vários modelos experimentais de animais para o estudo de cancro, como o modelo de rato SCID ou ratos transgénicos ou ratos nus com xenotransplantes humanos, modelos animais, tais como hamsters, coelhos, etc. conhecidos na técnica e descritos em Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The 220

Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd); e Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher) .

Os protocolos e as composições aqui descritos são ensaiados, de preferência, in vitro e depois in vivo, quanto à actividade terapêutica ou profiláctica desejada, antes do uso em seres humanos. Os agentes terapêuticos e os processos podem ser rastreados, utilizando células de uma linha de células tumorais malignas. Muitos ensaios-padrão desta técnica podem ser usados para avaliar essa sobrevivência e/ou crescimento; por exemplo, a proliferação celular pode ser analisada através da medição da incorporação de 3H-timidina, pela contagem directa das células, através da detecção das alterações na actividade transcricional de genes conhecidos tais como proto-oncogenes (por exemplo fos, myc) ou marcadores do ciclo celular; a viabilidade celular pode ser avaliada pela coloração azul de tripano, a diferenciação pode ser avaliada visualmente com base em alterações da morfologia, diminuição do crescimento e/ou formação de colónias em ágar mole ou a formação de uma rede tubular a três dimensões da membrana basal ou preparação da matriz extracelular, etc.

Os compostos utilizados na terapia podem ser ensaiados em sistemas adequados de modelos de animais antes dos testes em seres humanos, incluindo, mas não se limitando a ratos, murganhos, galinhas, vacas, macacos, coelhos, hamsters, etc., por exemplo, os modelos de animais descritos antes. Os compostos podem ser utilizados nos ensaios clínicos apropriados.

Além disso, qualquer ensaio conhecido pelos especialistas nesta técnica pode ser usado para avaliar a 221 utilidade profiláctica e/ou terapêutica das terapias de combinação aqui descritas para o tratamento ou a prevenção de cancro, doenças auto-imunes ou inflamatórias.

5.6 PROCESSOS DE DIAGNÓSTICO

Os anticorpos marcados aqui descritos podem ser usados para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorizar doenças, distúrbios ou infecções. A presente invenção providencia a detecção ou o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou infecção, em particular uma doença auto-imune que compreende: (a) a avaliação da expressão de FcyRIIB em células ou numa amostra de tecido de um indivíduo usando um ou mais anticorpos que se ligam imunoespecificamente a FcyRIIB; e (b) a comparação do nível do antigénio com um nível de controlo, por exemplo, os níveis em amostras de tecido normal, em que um aumento do nível de antigénio analisado com o nível de controlo do antigénio é indicativo da doença, distúrbio ou infecção.

Os anticorpos aqui descritos podem ser usados para ensaiar os níveis de FcyRIIB numa amostra biológica usando os processos clássicos de imuno-histoquímica, tal como aqui descrito ou como é conhecido pelos especialistas nesta técnica (por exemplo, ver Jalkanen et al., 1985, J. Cell Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al • r 1987, J. Cell. Biol 105: 3087-3096) . Outros processos à base de anticorpos úteis para a detecção da expressão de genes da proteína, incluem imuno-ensaios, tal como o ensaio de imuno-absorção ligada a enzimas (ELISA) e o radio-imunoensaio (RIA) . São conhecidos, na técnica, marcadores de ensaios de anticorpos apropriados que incluem marcadores de enzimas, tal como fosfatase alcalina, glicose-oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 131I), carbono (14C) , enxofre (35S) , trítio 222 (3Η) , índio (111Ιη) e tecnécio (99mTc) ; marcadores luminescentes, tais como luminol; e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina.

Um aspecto da presente invenção é a detecção e o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou infecção num ser humano. Numa modalidade, o diagnóstico compreende: a) a administração (por exemplo, parentérica, subcutânea ou intraperitoneal), a um indivíduo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo marcado que se liga imunoespecificamente a FcyRIIB; b) a espera, durante um certo intervalo de tempo, após a administração, para permitir que o anticorpo marcado se concentre preferencialmente em locais do indivíduo onde FcyRIIB é expressa (e para que as molécula marcados não ligadas sejam eliminadas até ao nível inicial); c) a determinação do nível de referência; e d) a detecção de anticorpos marcados no indivíduo, de tal que a detecção de anticorpos marcados, acima do nível de referência, indicam que o indivíduo tem a doença, o distúrbio ou a infecção. De acordo com esta modalidade, o anticorpo é marcado com uma parte visualizável que é detectável utilizando um sistema de visualização conhecido pelos especialistas na matéria. Pode-se determinar o nível de referência por vários processos incluindo a comparação da quantidade de molécula marcada detectada em relação a um valor padrão previamente determinado para um sistema particular.

Será entendido na técnica que o tamanho do indivíduo e o sistema de visualização de imagens utilizado irá determinar a quantidade da parte de visualização necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma parte de radioisótopo, para um ser humano, a quantidade de radioactividade injectada normalmente irá variar entre cerca de 5 e 20 milicuries de 99mTc. O anticorpo marcado irá 223 acumular-se então preferencialmente na localização das células que contêm a proteína específica. A visualização das imagens do tumor in vivo está descrita em S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies anda Ter Fragmentes", (capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Câncer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).

Consoante as várias variáveis, incluindo o tipo de marcador utilizado e o modo de administração, o intervalo de tempo que se segue à administração, para permitir que a molécula marcada se concentre preferencialmente em sítios no indivíduo e para a molécula marcada não ligada voltar para o nível de referência, pode ser de 6 a 48 horas ou de 6 a 24 horas ou de 6 a 12 horas. Noutra modalidade, o intervalo de tempo que se segue à administração é de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.

Numa modalidade, a monitorização de uma doença, distúrbio ou infecção é realizada por repetição do processo para diagnosticar a doença, o distúrbio ou a infecção, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial, etc. A presença da molécula marcada pode ser detectada num indivíduo utilizando processos conhecidos na técnica para o rastreio in vivo. Estes processos dependem do tipo de marcador utilizado. Técnicos da matéria serão capazes de determinar o processo apropriado para a detecção de um marcador particular. Os processos e dispositivos que podem ser utilizados nos processos de diagnóstico da presente invenção incluem, mas não se limitam a tomografia computorizada (TC) , rastreio de todo o corpo tal como por 224 tomografia de emissão de positrões (PET), imagem por ressonância magnética (IRM) e sonografia.

Numa modalidade especifica, a molécula é marcada com um radioisótopo e detecta-se no indivíduo utilizando um instrumento cirúrgico que responde à radiação (Thurston et al., patente U.S. No. 5.441.050). Noutra modalidade, a molécula é marcada com um composto fluorescente e é detectada num doente utilizando um instrumento de rastreio que responde à fluorescência. Noutra modalidade, a molécula é marcada com um metal emissor de positrões e é detectada no doente utilizando uma tomografia de emissão de positrões. Ainda noutra modalidade, a molécula é marcada com um marcador paramagnético e é detectada no doente utilizando imagiologia de ressonância magnética (IRM).

6. EXEMPLOS

6.1 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

Produziu-se um anticorpo monoclonal a partir dos clones 3H7 ou 2B6 com os números de acesso, na ATCC PTA-4591 e PTA-4592, respectivamente. Gerou-se um anticorpo monoclonal de murganho que se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade maior do que o referido anticorpo monoclonal se liga a FcyRIIA. Imunizaram-se ratos transgénicos comportando FcyRIIA (gerados no laboratório do Dr. Ravetch, Rockefeller University) com FcyRIIB purificado a partir de sobrenadante de células 293 que tinha sido transfectadas com ADNc que codifica o domínio extracelular 225 do receptor de FcyRIIB humano, os resíduos 1-180. As linhas de células de hibridoma de células do baço desses ratos foram produzidas e ensaiadas em relação aos anticorpos que se ligam especificamente a FcyRIIB com maior afinidade do que os anticorpos se ligam a FcyRIIA.

6.2 DESPISTAGEM E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MATERIAIS E PROCESSOS.

Os sobrenadantes das culturas de hibridomas são despistados quanto à imunorreactividade contra FcyRIIA ou FcyRIIB utilizando ensaios por ELISA. Em cada caso, a placa é revestida com 100 ng/poço de FcyRIIA ou FcyRIIB. A ligação do anticorpo ao receptor específico é detectada com o anticorpo de cabra anti-rato conjugado com PRD através da monitorização da densidade óptica a 650 nm.

Na experiência de bloqueio por meio de ELISA, monitoriza-se a capacidade do anticorpo do sobrenadante do hibridoma para bloquear a ligação de IgG agregada a FcyRIIB. A placa é bloqueada com o "agente bloqueador" apropriado, lavada três vezes (200 μΐ/poço) com o tampão de lavagem (STF mais Tween a 0,1 %) . A placa é pré-incubada com sobrenadante de hibridoma durante 1 hora, a 37 °C. Após o bloqueio, adiciona-se aos poços uma quantidade fixa de agregado de IgG humana biotinilada (1 pg/poço) para permitir que o agregado se ligue ao receptor de FcyRIIB. Esta reação realiza-se durante duas horas, a 37 °C. A detecção é, então, monitorizada, após uma lavagem adicional, com um conjugado de estreptavidina e peroxidase de rábano-silvestre, que detecta a IgG ligada ao agregado. A densidade óptica, a 650 nm é proporcional à IgG agregada ligada. 226

Num ensaio de libertação de β-hexoaminidase monitoriza-se a capacidade de um anticorpo do sobrenadante do hibridoma para inibir a libertação de β-hexoaminidase induzida por Fcs. As células RBL-2H3 são transfectadas com FcyRIIB humana; as células são estimuladas com várias concentrações do fragmento F(ab)2 de cabra, anti-murganho, variando de 0,03 pg/mL a 30 pg/mL; e são sensibilizadas quer apenas com IgE de murganho (a 0,01 pg/mL), quer com um anticorpo anti-FcYRIIB. Após uma hora de incubação, as células são centrifugadas; recolhe-se o sobrenadante; e faz-se a lise das células. A actividade da β-hexoaminidase libertada no sobrenadante é determinada num ensaio colorimétrico utilizando p-nitrofenil-N-acetil-β-Ό-glucoasminida. A actividade de libertação de β-hexosaminidase é expressa em percentagem da actividade libertada em relação à actividade total. ANALISE POR SCAF (separação de células activada por fluorescência)

Coram-se células de OHC, que expressam FcyRIIB, com vários anticorpos e analisaram-se por SCAF. Numa série de experiência, as células são marcadas directamente para determinar se os anticorpos monoclonais reconhecem o receptor.

Na experiência de bloqueio por meio de SCAF, monitoriza-se a capacidade do anticorpo do sobrenadante do hibridoma para bloquear a ligação de IgG agregada a FcyRIIB. Faz-se a incubação de cerca de 1 milhão de células (células OHC que expressam FcyRIIB) para cada amostra, em gelo, durante 30 minutos com 2 pg do isotipo de controlo 227 (IgGl de murganho) ou com o anticorpo 2B6 ou 3H7. Lavam-se as células, uma vez, com STF + ASB a 1% e faz-se a sua incubação com 1 pg de IgG humana agregada, biotinilada, durante 30 minutos, em gelo. As células são lavadas e adicionam-se os anticorpos secundários, FITC de cabra anti-rato para detectar o anticorpo ligado e o conjugado de estreptavidina-PE para detectar a IgG humana agregada, biotinilada, ligada e faz-se a incubação em gelo durante 30 minutos. As células são lavadas e analisadas por SCAF.

Os linfócitos B são corados para detectar a presença de FcyRIIB e CD20. Faz-se a incubação de 200 μΐ de "uma camada de células brancas (buffy coat)" para cada amostra, em gelo, com 2 ug de controlo de isotipo ou os anticorpos monoclonais, 2B6 ou 3H7. Lavam-se então as células, uma vez, com STF + ASB a 1 % e faz-se a sua incubação com 1 μΐ de anticorpo de cabra anti rato-PE, durante 30 minutos, em gelo. Lavam-se as células uma vez e adiciona-se o anticorpo CD20-FITC anticorpo (2 pg) às amostras e faz-se a sua incubação, no gelo, durante 30 minutos. Todas as amostras são lavadas com STF + ASB a 1 %, uma vez e analisam-se as células por SCAF. ENSAIO DE CCDA:

Marcam-se 4-5xl06 células-alvo que expressam o antigénio de Her2/neu (células IGROV-1 ou SKBR-3) com 2,2':6',2"-terpiridino-t-6"-dicarboxilato de bis(acetoxi-metilo) (reagente DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac). Adiciona-se o reagente BATDA às células e faz-se a incubação da mistura, a 37 °C, preferencialmente em atmosfera de CO2 a 5 %, durante pelo menos 30 minutos. As células são então lavadas com um tampão fisiológico, por exemplo, com STF com sulfinpirazol 0,125 mM e meio contendo 228 sulfinpirazol. Ο, 125 mM. Adicionam-se as células-alvo marcadas às células efectoras, por exemplo, CMSP, para produzir proporções de efectoras : alvo de aproximadamente 50:1, 75:1 ou 100:1. As CMSP são isoladas por camadas de sangue completo em Ficoll-Hypaque (Sigma) e centrifugadas, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, a 500 g. Colhe-se a camada de leucócitos como efectores para os ensaios de CCDA à base de európio. Os monócitos depurados, congelados ou isolados recentemente (Advanced Biotechnologies, MD) são usados como efectores com as linhas de células-alvo de tumor em diferentes proporções de efectores para o alvo de 100:1 a 10:1 e titula-se a concentração dos anticorpos a partir de 1-15 pg/ml. Os monócitos obtidos, como concentrados congelados, estimulados com citocina, são usado como células efectoras nos ensaios de CCDA. Se os monócitos congelados se comportarem de forma óptima, serão utilizados por rotina, a menos que se utilizem células frescas. MDM será preparado pelo tratamento com as citocinas FEC-GM ou FEC-M que são conhecidas por melhorarem a viabilidade e a diferenciação dos monócitos em cultura. MDM serão estimulados com citocinas e a expressão dos diversos FcyRs (I, IIA, IIB e IIIA) será determinado pela análise por SCAF.

As células efectoras e as células-alvo são incubadas durante por pelo menos duas horas e até 16 horas, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %, na presença de um anticorpo anti-tumor, especifico para um antigénio expresso nas células-alvo, HER2/neu e na presença ou na ausência de um anticorpo anti-FcYRIIB. Um anticorpo quimérico 4D5 que tenha sido tratado por engenharia genética para conter a mutação N297A, que é usado como um controlo negativo dado que este anticorpo se liga a células-alvo do tumor através da sua região variável. A perda de glicosilação neste sitio 229 vai abolir a ligação da região Fc do anticorpo a FcyR. A IgGl/k, disponível comercialmente, serve como um controlo de isotipo para o anticorpo anti-FcYRIIB. Colhem-se as células sobrenadantes e adicionam-se a uma solução ácida de európio (por exemplo, a solução de európio DELFIA, Perkin Elmer/Wallac). A fluorescência dos quelatos de európio-TDA formados é quantificada num fluorómetro resolvido em função do tempo (por exemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac). A libertação máxima (LM) e a libertação espontânea (LE) são determinadas por incubação das células-alvo com TX-100 a 1 % e apenas meio, respectivamente. A citotoxicidade celular independente do anticorpo (CCIA) é medida pela incubação de células-alvo e células efectoras na ausência de anticorpos. Cada ensaio realiza-se, de preferência, em triplicado. A percentagem média da lise específica é calculada como: Libertação experimental (CDAC) - (CCIA)/(LM-LE) x 100.

CARAC TE RI ZAÇAO DO ANTICORPO MONOCLONAL PRODUZIDO A PARTIR DO CLONE 3H7

Ligação dlrecta dos diferentes lotes de culturas de hibridomas

As ligações directas dos diferentes lotes de culturas de hibridoma com FcyRIIA e FcyRIIB foram comparadas utilizando um ensaio de ELISA (figura IA). Os sobrenadantes, numerados com 1, 4, 7, 9 e 3 foram analisados quanto à ligação específica e a sua ligação foi comparada com um anticorpo disponível comercialmente, FL18.26. Conforme se mostra na figura IA (painel esquerdo), o sobrenadante do clone 7 tem a ligação máxima a FcyRIIB, 230 que é cerca de quatro vezes maior em condições de saturação do que a liqação do anticorpo comercialmente disponível a FcyRIIB. No entanto, o sobrenadante do clone 7 não tem quase nenhuma afinidade para FcyRIIA, como pode ser visto no painel à direita, enquanto o anticorpo disponível comercialmente liga-se a FcyRIIA, de uma forma pelo menos 4 vezes melhor.

Ligação directa do anticorpo, produzido a partir do clone 3H7, a FcyRIIA e FcyRIIB

Mediu-se a ligação do sobrenadante de 3H7 impuro e do sobrenadante de 3H7 purificado (figura 1B). Em cada caso, o sobrenadante foi fornecido numa concentração de 70 pg/ml e foi diluído até 6 vezes. Como se mostra na figura 1, em condições de saturação, o sobrenadante de 3H7 liga-se a FcyRIIB quatro vezes melhor do que se liga a FcyRIIA. Após purificação com uma coluna de proteína G, a ligação absoluta do sobrenadante de 3H7, para cada imunogénio, melhora.

Bloqueio da ligação de IgG humana agregada a FcyRIIB por meio do anticorpo produzido a partir do clone 3H7.

Se o anticorpo presente no sobrenadante do hibridoma se liga a FcyRIIB no local de ligação de IgG e bloqueia a ligação de IgG, então a IgG agregada não se pode ligar ao receptor e, portanto, não se pode detectar a densidade óptica a 650. O anticorpo é, na verdade, um "agente de bloqueio" que bloqueia o sítio de ligação de IgG na FcyRIIB. Como controlo, o ensaio por ELISA foi realizado sem bloqueio, com um sobrenadante de controlo e com um sobrenadante do clone 3H7. Conforme se mostra na figura 2, o sobrenadante de 3H7 bloqueia completamente a ligação de 231

IgG, uma vez que a IgG agregada não se pode ligar ao receptor, como é evidente a partir da falta de absorvência a 650 nm. O sobrenadante de controlo, no entanto, não consegue bloquear a ligação de IgG; a IgG agregada liga-se ao receptor, como é evidente pela leitura a 650 nm. O sobrenadante de controlo comporta-se de forma semelhante à condição em que não há nenhum bloqueio.

Comparação da ligação directa do anticorpo produzido a partir do clone 3H7 a FcyRIIB bacteriano e de mamíferos

Conforme se mostra na figura 3, o sobrenadante do clone 3H7, liga-se, em níveis comparáveis, à FcyRIIB bacteriana e de mamíferos. Em condições de saturação, o sobrenadante de 3H7 liga-se à FcyRIIB bacteriana e de mamíferos cerca de três vezes melhor do que se liga a FcyRIIA. O anticorpo monoclonal do clone 3H7 é, portanto, capaz de se ligar especificamente à FcyRIIB de mamíferos que tenha sido modificada pós-translacionalmente (por exemplo, por glicosilação).

Ligação directa do anticorpo, produzido a partir do clone 3H7, a FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIIA.

Compararam-se as ligações directas do sobrenadante das culturas de hibridoma a partir da linha de células de 3H7 a FcyRIIA, FcyRIIIA e FcyRIIB utilizando um ensaio de ELISA (figura 4). O anticorpo produzido a partir do clone 3H7 não tem afinidade para FcyRIIIA e liga-se a FcyRIIB com uma afinidade cerca de 4 vezes maior do que a que se liga a FcyRIIA. 232

CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONALPRODUZIDO A PARTIR DO CLONE 2B6

Comparação da ligação directa do anticorpo produzido a partir de clone 2B6 com outros três anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente contra FcyRII

Compara-se a ligação do anticorpo, produzido a partir de clone 2B6, a FcyRIIA e FcyRIIB com a de outros três anticorpos comercialmente disponíveis, AT10, FL18.26 e IV.3, em função de FcyRII, num ensaio de ELISA. Como se vê na figura 5, painel A, o anticorpo produzido a partir de clone 2B6 liga-se a FcyRIIB até 4,5 vezes melhor do que os outros anticorpos disponíveis comercialmente. Além disso, o anticorpo produzido a partir de clone 2Β6 tem uma afinidade mínima para FcyRIIA, enquanto os outros três anticorpos comercialmente disponíveis se ligam a FcyRIIA de uma forma saturável e duas vezes mais forte do que o anticorpo do clone 2B6 se liga a FcyRIIA (figura 5, painel B).

Bloqueio da IgG humana agregada a FcyRIIB pelo anticorpo produzido a partir de clone 2B6. A capacidade do anticorpo produzido a partir de clone 2B6 bloqueia a ligação da IgG agregada a FcyRIIB foi investigada por meio de um ensaio de bloqueio por ELISA e foi comparada com a do anticorpo produzido pelo clone 3H7. Conforme se mostra na figura 6A, o sobrenadante de controlo não se liga a FcyRIIB no sítio de ligação de IgG e a IgG agregada pode ligar-se ao receptor e, portanto, a absorvência a 650 nm é máxima. O clone 3H7, no entanto, bloqueia a ligação de IgG até 75 %. O clone 2B6 bloqueia completamente a ligação do sítio de ligação de IgG e não permite que a IgG agregada se ligue ao receptor e até mesmo 233 em diluições muito elevadas não se detecta a absorvência a 650 nm. A figura 6B representa os dados num diagrama de barras.

Comparação do anticorpo 2B6 e da IgG agregada na ligação a FcyRIIB usando ensaios de coloração dupla por SCAF

Utilizou-se um ensaio de dupla coloração por SCAF para caracterizar o anticorpo produzido a partir do clone 2B6 em células de OHC que tinham sido transfectadas com FcyIIB de mamífero de comprimento completo.

Conforme se mostra na figura 7, no painel C, o anticorpo produzido a partir de clone 2B6 bloqueia efectivamente a ligação de IgG agregada ao receptor de FcyRIIB em células OHC uma vez que não se observa coloração para a IgG biotinilada agregada depois de as células terem sido pré-incubadas com o anticorpo monoclonal. As células estão coradas apenas no painel inferior direito, indicando que a maioria das células estava ligada ao anticorpo monoclonal do clone 2B6. Nas experiências de controlo, utilizando IgGl como o controle do isotipo, painel A, quando as células estão coradas com a IgG marcada do isotipo, não se observou nenhuma coloração dado que a IgG monomérica não se liga a FcyRIIB com qualquer afinidade detectável, enquanto no painel B, cerca de 60 % das células estão coradas com a IgG agregada, que é capaz de se ligar a FcyRIIB.

Anticorpos monoclonais anti-FcylIB e CD20 co-corados com linfócitos B humanos

Utilizou-se um ensaio de dupla coloração SCAF para caracterizar o anticorpo produzido a partir dos clones 2B6 234 e 3H7 em linfócitos B humanos. As células foram coradas com o anticorpo anti-CD20 que foi conjugado com FITC, para selecionar a população de linfócitos B, assim como os anticorpos produzidos a partir dos clones 3H7 e 2B6, marcados com peroxidase de cabra anti-rato. 0 eixo horizontal representa a intensidade da fluorescência do anticorpo anti-CD20 e o eixo vertical representa a intensidade da fluorescência do anticorpo monoclonal. Conforme se mostra na figura 8, painéis B e C, as células são duplamente coradas com o anticorpo anti-CD20, assim como os anticorpos produzidos a partir dos clones 2B6 e 3H7, no entanto, o anticorpo produzido a partir do clone 2B6 mostra uma coloração mais intensa que a produzida a partir de clone 3H7. 0 painel A mostra a coloração do controlo do isotipo, IgGl de murganho.

Coloração de células de OHC expressando FcylIB

As células OHC, que expressam estavelmente FcyRIIB foram coradas com o controlo do isotipo de IgGl (figura 9A; painel da esquerda) ou com o sobrenadante do hibridoma de 3H7 (figura 9B; painel direito). Utilizou-se o anticorpo de cabra anti-murganho conjugado com peroxidase como um anticorpo secundário. As células foram então analisadas por SCAF; as células que estão coradas com o sobrenadante do hibridoma de 3H7 mostram um forte sinal de fluorescência e um deslocamento do pico para a direita; indicando a detecção de FcyRIIB nas células OHC do sobrenadante produzido a partir da hibridoma de 3H7. As células coradas com o sobrenadante do hibridoma 2B6, também mostram uma fluorescência significativa, quando comparadas com as células coradas com IgGl e uma deslocação do pico para a 235 direita, indicando a detecção de FcyRIIB nas células de OHC pelo sobrenadante produzido a partir da hibridoma de 2B6.

Inibição da libertação de B-hexosaminidase por 2B6

Os transfectantes que expressam FcyIIB humana foram sensibilizados com IgE de ratos e receberam um reforço com fragmentos de F(ab')2 de uma IgG policlonal de cabra anti-rato para agregar FcsRI. A reticulação ocorre porque a capacidade do anticorpo policlonal para reconhecer a cadeia leve do anticorpo de IgE de murino ligado a FcsRI. Esta experiência está esquematicamente ilustrada na figura 10A. Os transfectantes sensibilizados com IgE de murino e pré-incubados com anticorpo 2Β6 também foram reforçados com fragmentos de F(ab')2 de uma IgG policlonal de cabra anti-rato para reticular FcsRI para FcyIIB. Como se mostra na Figura 10B, observou-se β-hexoaminidase, libertada em menor quantidade, quando as células que foram pré-incubadas com o anticorpo 2B6 e IgE foram imunizadas com F(ab')2 de cabra anti-murganho. Como se vê na figura 10B, o anticorpo 2B6 não bloqueia a actividade inibidora dos receptores. Em vez disso, a reticulação com FcsRI activa a via inibidora e resulta numa diminuição significativa da libertação de β-hexosaminidase. Estes dados também mostram que o receptor inibidor de FcyRIIB humana pode efetivamente assinalar basófilos de ratos.

ENSAIOS IN VITRO DA CCDA A fim de determinar se as células IGROV-1, OVCAR-8 e SKBR-3 células expressam o antigénio Her2neu, coraram-se as células quer com o anticorpo 4D5 purificado ou ch4D5 em gelo; o anticorpo não ligado foi lavado com tampão de STF/ASB contendo azida sódica e a ligação de 4D5 ou de 236 ch4D5 foi detectada pelo anticorpo de cabra anti-rato ou de cabra anti-humano conjugado com PE (Jackson Laboratories), respectivamente. Um anticorpo IgGl irrelevante (Becton Dickinson) serviu como o controlo para a ligação não especifica. Conforme se mostra na figura 11, as linhas de células de tumor do ovário expressam menos antigénios HER2/neu do que a linha de células do carcinoma mamário e a avaliação destas linhas de células, em paralelo, irá determinar o rigor da eliminação do tumor por meio de um anticorpo anti-FcYRIIB aqui descrito.

Os monócitos humanos são a população efectora envolvida na CCDA que expressa os receptores tanto de activação como de inibição. A expressão de FcyRs foi avaliada por uma análise de SCAF utilizando vários lotes de monócitos congelados dado que estas células serão transferidas adoptivamente como efectoras para investigar o papel de ch2B6 na eliminação do tumor. Obtiveram-se comercialmente monócitos purificados congelados que foram descongelados em meio básico contendo soro humano AB a 10 % e em meio básico com soro humano e 25-50 ng/ml de FEC-GM. As células ou foram coradas directamente ou deixou-se maturarem até macrófagos durante 7-8 dias (MDM), descoloram-se do plástico e em seguida foram coradas com IV.3-FITC (FcyRIIA anti-humana), 32.2-FITC (anti-FcYRI), CD16-PE (Pharmingen) ou 3G8 (anti-FcYRIII) de cabra anti-murganho-PE, 3H7 (anti-FcYRIIB) e marcador de CD14 para os monócitos (Pharmingen), juntamente com controlos isotípicos relevantes. Um perfil representativo feito por SCAF de MDM de dois dadores, descrevendo a expressão de FcyR em monócitos recentemente descongelados e monócitos de cultura, está ilustrado na figura 12. Estes resultados indicam que FcyRIIB é modestamente expressa em monócitos (5-30 %, dependendo do dador) . No entanto, esta expressão 237 aumenta à medida que maturam em macrófagos. Os dados preliminares mostram que os macrófagos que se infiltram no tumor em amostras tumorais humanas são corados positivamente para FcyRIIB (dados não mostrados). Verificou-se que o padrão de FcyRs e a capacidade para se diferenciar morfologicamente em macrófagos era reprodutível em vários lotes de monócitos congelados. Estes dados indicam que esta fonte de células é adequada para experiências de transferência adoptiva.

Ch4D5 medeia a CCDA eficaz com linhas de células de cancro do ovário e da mama usando CMSP A actividade de CCDA de anticorpos anti-Her2/neu foi ensaiada num ensaio à base de európio. A linha celular de ovário, IGROV-1 e a linha de células de cancro da mama, SKBR-3, foram usadas como alvos marcados num ensaio de 4 h com o PBL humano como células efectoras. A figura 13 indica que ch4D5 é funcionalmente activo na mediação da lise dos alvos que expressam Her2neu. Em seguida mede-se o efeito de um anticorpo da presente invenção sobre a actividade de CCDA do anticorpo anti-Her2/neu.

ACTIVIDADE IN VIVO DOS ANTICORPOS DE FcyRIIB EM MODELOS DE MURINOS XENOENXERTADOS USANDO LINHAS CELULARES TUMORAIS HUMANAS

Utilizam-se ratos fêmeas Balb/c peladas com seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME; Taconic) para estabelecer os modelos de carcinoma xenoenxertado do ovário e da mama. Mantêm-se os ratos em BIOCON, Inc. Rockville, Maryland (ver o protocolo em anexo). Os ratos são alojados em unidades Biosafety Level-2 para o modelo de xenoenxerto utilizando, como fontes de 238 tumores, as células de ovário derivadas de ascites e células de cancro de mama derivadas de derrame pleural. Os ratos são colocados em grupos de 4 para estas experiências e monitorizados três vezes por semana. 0 peso dos ratos e o tempo de sobrevivência são registados e os critérios para tumores em crescimento são a distensão abdominal e tumores palpáveis. Os ratos que mostram sinais de desconforto visíveis ou cujos tumores atingem 5 gramas de peso são sacrificados com dióxido de carbono e autopsiados. Os animais tratados com anticorpos serão colocados sob observação durante mais dois meses, segundo o grupo de controlo.

Estabelecimento do modelo de tumor xenoenxertado com linhas de células tumorais A fim de estabelecer o modelo de tumor xenoenxertado, injectam-se, s.c., 5 x 106 células viáveis de IGROV-1 ou de SKBR-3 em ratos fêmeas atímicos, pelados com três anos e pesos equivalentes, com Matrigel (Becton Dickinson). 0 peso estimado do tumor pode ser calculado pela fórmula: comprimento x (largura)2/2 não deve exceder 3 gramas. Para uma sub-cultura de células in vivo para expansão, isola-se o tumor dependente da ancoragem e as células são dissociadas pela adição de 1 pg de colagenase (Sigma) por grama de tumor, a 37 °C, durante a noite. A injecção s.c. de células IGROV-1 dá origem a tumores de crescimento rápido, enquanto a via i.p. induz uma carcinomatose peritoneal que mata os ratos em 2 meses. Dado que as células IGROV-1 formam tumores no prazo de 5 semanas, no Io dia após a injecção das células tumorais, injectam-se, i.p., os monócitos, como efectores, juntamente com anticorpos terapêuticos ch4D5 e ch2B6 a 4 pg cada um, 239 por grama de peso corporal de rato (per) (quadro 8) . A injecção inicial será seguida de injecções semanais de anticorpos durante 4-6 semanas depois. As células efectoras humanas são reabastecidas uma vez em cada duas semanas. Um grupo de ratos não receberá nenhum anticorpo terapêutico, mas vai ser injectado com ch4D5 N297A e IgGl como anticorpos de controlo do isotipo para os anticorpos anti-tumor e ch2B6, respectivamente. QUADRO 8: Resumo dos estudos de eliminação do tumor com anticorpos anti-Her2neu, ch4D5 e ch2B6, anticorpo anti-FcyRIIB em modelo de tumor xenoenxertado em ratos pelados com monócitos humanos transferidos adoptivamente como efectores de CCDA. per (peso corporal do rato). 8 ratos/ grupo Célula de tumor s. c dia 0 Monócitos i.p no dia 1 ch4D5 a 4 μg/g de per dia 1 i.p. ch4D5 N297Aa 4 pg/g de per dia 1 i.p. ch2B6 N297A a 4 μg/g de per dia 1 i.p. IgGl humano a 4 μ g/g de per dia 1 i.p. A + - - - - - B + + - - - - C + + + - - - D + + + - + - E + + - - + - F + + - + - -

Como se mostra no quadro 8 são necessários 6 grupos de 48 ratos cada, para testar o papel de um anticorpo anti- 240

FcyRIIB na eliminação do tumor com uma combinação alvo e uma efectora, com duas combinações diferentes das concentrações de anticorpos. Estes grupos são A) células de tumor, B) células tumorais e monócitos, C) células tumorais, monócitos, anticorpo anti-tumor, ch4D5, D) células tumorais, monócitos, anticorpos anti-tumor ch4D5 e um anticorpo anti-FcYRIIB, por exemplo, ch2B6, E) células tumorais, monócitos e um anticorpo anti-FcYRIIB, por exemplo, ch2B6 e F) células tumorais, ch4D5 N297A e IgGl humana. Várias combinações da concentração de anticorpos podem ser analisadas em esquemas semelhantes.

Realizam-se estudos utilizando linhas de células de cancro da mama, SKBR-3, em paralelo com o modelo de IGROV-1 como células SKBR-3 que sobre-expressam Her2neu. Isto vai aumentar o rigor da avaliação do papel do anticorpo anti-FcyRIIB na eliminação do tumor. Com base no resultado dos estudos de eliminação do tumor com as células IGROV-1, fazem-se modificações na concepção experimental de futuras experiências com outros alvos. 0 ponto final do modelo de tumor xenoenxertado é determinado com base no tamanho dos tumores (peso dos ratos), o tempo de sobrevivência e o relatório da histologia para cada grupo no quadro XX. Os ratos são monitorizados três vezes por semana; os critérios para o crescimento dos tumores são a distensão abdominal e a presença de massas palpáveis na cavidade peritoneal. Calcula-se o peso estimado do tumor versus dias após a inoculação. Com base nestes três critérios dos ratos do grupo D, no quadro 8, versus os outros grupos de ratos, ir-se-á definir o papel dos anticorpos anti-FcyRIIB no aumento da eliminação do tumor. Os ratos que mostram sinais visíveis de dor ou cujos tumores atingem 5 gramas de peso 241 são sacrificados com dióxido de carbono e autopsiados. Os animais tratados com anticorpos são seguidos durante dois meses após este momento no tempo.

ACTIVIDADE IN VIVO DE ANTICORPOS DE FcyRIIB EM MODELOS DE MURINOS XENOENXERTADOS COM CÉLULAS DERIVADAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS HUMANOS DO OVÁRIO E DA MAMA

Os tumores primários são estabelecidos a partir de cancros primários do ovário e da mama através da transferência de células de tumores isoladas de exsudados de doentes com carcinomatose. A fim de traduzir estes estudos para a clínica, o modelo de xenoenxerto é avaliado com células derivadas de ascites e derrames pleurais de dois doentes com carcinoma do ovário e dois doentes com carcinoma da mama, respectivamente. Utilizou-se o derrame pleural, como fonte de células de cancro da mama e implantação de tecido mamário maligno para estabelecer com êxito modelos de xenoenxerto de murinos, ver, por exemplo, Sakakibara et al., 1996, Câncer J. Sei. Am. 2: 291. Estes estudos vão determinar a aplicação de largo espectro do anticorpo anti-FcYRIIB na eliminação de células de tumor primário. A eliminação do tumor é avaliada usando os anticorpos anti-tumor, ch4D5 e anticorpos anti-FcYRIIB, por exemplo, ch2B6, num modelo de rato pelado Balb/c, com monócitos humanos transferidos adoptivamente. Células tumorals primárias derivadas de ascites e derrames pleurais humanos

As ascites de doentes com cancro de ovário e os derrames pleurais de doentes com cancro da mama foram fornecidos pelo St. Agnes Câncer Center, Baltimore, Maryland. As ascitese e os derrames pleurais de doentes 242 podem conter 40-50 % de células tumorais e podem usar-se amostras com uma elevada expressão de células tumorais Her2neu+ para estabelecer os modelos de xenotransplante.

As amostras de ascites e de derrame pleural são analisadas para avaliar a expressão de HER2/neu nas células neoplásicas antes do estabelecimento do modelo de tumor xenoenxertado. Determina-se a percentagem de células neoplásicas versus outros subconjuntos celulares que podem influenciar o estabelecimento do modelo de tumor. As ascites e o derrame pleural de doentes com cancro do ovário e da mama, respectivamente, são analisados por rotina para determinar o nível de expressão de HER2/neu+ nas células neoplásicas. A análise por SCAF é usada para determinar a percentagem de células neoplásicas de HER2/neu+ nas amostras clínicas. As amostras com elevada percentagem de células neoplásicas de Her2/neu+ são seleccionadas para a iniciação de tumores em ratos Balb/c.

Histoquímica e imuno-química

Realiza-se a histoquímica e a imuno-histoquímica em ascites e derrame pleural de doentes com carcinoma do ovário para analisar as características estruturais da neoplasia. Os marcadores que podem ser monitorizados são citoqueratina (para identificar células mesoteliais neoplásicas do ovário das células inflamatórias e mesenquimais); calretinina (para separar as células mesoteliais das células neoplásicas positivas para Her2/neu); e CD45 (para separar as células inflamatórias do resto da população de células nas amostras) . Os marcadores adicionais que se seguem podem incluir CD3 (células T) , CD20 (células B), CD56 (células AN) e CD 14 (monócitos). 243

Para a coloração imuno-histoquímica, preparam-se secções congeladas e tecidos parafinados por técnicas convencionais. As secções congeladas, bem como as seções desparafinadas são coradas num protocolo de coloração similar. A peroxidase endógena dos tecidos anula-se, imergindo as lâminas em peróxido de hidrogénio a 3 % e lavando com STF durante 5 minutos. As seções são bloqueadas e adiciona-se o anticorpo primário ch4D5 no soro de bloqueio durante 30 minutos seguido da lavagem das amostras com STF, três vezes. Adiciona-se o anticorpo anti-humano secundário conjugado com biotina durante 30 minutos e lavam-se as lâminas com STF durante 5 minutos. Adiciona-se o complexo de peroxidase e avidina-biotina (Vector Labs), durante 30 minutos, seguido de lavagem. A cor é desenvolvida pela incubação das lâminas em solução recente do substrato DAB e para-se a reacção pela lavagem com água da torneira. Para a coloração Η & E, desparaf inam-se as lâminas e depois hidratam-se com diferentes concentrações de álcool. Lavam-se as lâminas com água da torneira e colocam-se em hematoxilina durante 5 minutos. O excesso de corante é eliminado com álcool-ácido, seguido de amónia e água. Colocam-se as lâminas em eosina e em seguida lavam-se com 90 a 100 % de álcool para a desidratação. Finalmente colocam-se as lâminas em xileno e montam-se com fixador para uma armazenagem de longo prazo. Em todos os casos, a percentagem de células tumorais é determinada pela coloração de Papanicolaou.

Coloração hlstoquímica

Coraram-se as ascites de dois doentes diferentes com carcinoma do ovário por meio de hematoxilina e eosina (H & E) e Giemsa para analisar a presença de células tumorais e 244 outros tipos de células. 0 resultado da coloração histoquimica está ilustrado na figura 14.

Modelos de murinos

Estas amostras de doentes com carcinoma do ovário são tratadas por centrifugação das ascites a 6.370 g, durante 20 minutos, a 4 °C; fazendo-se a lise dos glóbulos vermelhos seguida de lavagem das células com STF. Com base na percentagem de células tumorais de Her2neu+ em cada amostra, seleccionam-se duas amostras, seleciona-se um expressor mediano e um elevado para a inoculação s.c. para estabelecer o modelo de xenoenxerto para avaliar o papel do anticorpo anti-FcYRIIB, na depuração dos tumores. Tem sido relatado que as células tumorais constituem 40-50% do subconjunto celular das ascites não transformadas e, depois da purificação, obtiveram-se ~10-50 x 106 células tumorais a partir de 2 litros de ascites (Barker et al., 2001, Gynecol. Oncol. 82: 57-63). As células isoladas de ascites são injetados i.p. em ratos para expandir as células. Aproximadamente 10 ratos podem ser injectados i.p. e, as ascites de cada rato vão ainda passar por dois ratos para se obter ascites de um total de 20 ratos, que podem ser usadas para injectar um grupo de 80 ratos. O derrame pleural é tratado de forma semelhante às ascites e injectam-se células tumorais de Her2neu+ na parte superior direita e esquerda do epitélio mamário em matrigel. Após a inoculação s.c. de células tumorais, os ratos são seguidos no que respeita às alterações clinicas e anatómicas. Quando necessário, os ratos podem ser necropsiados para correlacionar a carga tumoral total com a localização de órgãos específicos.

LISTA DE SEQUÊNCIAS 245 <110> Koenig, Scott Veri, Maria Concetta <120> Anticorpos monoclonais anti-FcgRIIB e a sua utilização na melhoria da resposta imunitária <130> 11183-003 <140> <141> <150> 60/403.266 <151> 2002-08-14 <160> 4 <170> Patentin versão 3.2 <210> 1 <211> 363

<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 ctggtgaggc egggggcttc agtgafcgttg 60 aactactgga tacactgggt aaagcagagg 120 attgatcctt ctgatactta tccaaactac 180 actgt&gtcg tatcctccag cacagcctac 240 tetgeggtcfc attacfcgtgc aagaaacggt 300 tggggtcaag ga&ectcagt caccgtctcc 360 363 caggtecast tgcagcagcc fcgfcgactgag fceeegcaagg cccctgacta cccettcacc cccggacaag gcctggagfcg gatcggagfcg aataaaaagt tcaagggcaa ggccacattg afcgeagctca gcagcctgac at.ctgacgat gattccgatt attactctgg tatggactac tca <210> 2 <211> 121 246

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Gin Val Gin teu õln Gin Pro Vai Thr Glu leu Vai Arg pto Giy Ala 15 10 15

Ser val «et Lea Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Pro Phe Thr ftan Tyr 20 25 30

Trp He His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Val He Asp Pro Ser Asp Thr Tyr Pro Aan Tyr Asn Lys Lys Phe 50 55 60

Lye Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val val Val Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 50 95

Ala Arg Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 uo

Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 321

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 247 gacatettgc tgactcagfcc tccagccatc ctgtctgCgs gtccaggaga gagagtcagfc £0 ttttcctgca ggaccagtca gageattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttttc caaggettct cataaagaat gttcctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttattctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattatta ttgtcaacaa agtaatacct ggccgttcae gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Asp Xle i>eu Leu Thr Gin Ser pro Ala Xle Leu ser Vai Ser Pro Gly 1 S 10 IS

Glu Arg Vai Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Gin Ser Xle Gly Thr Asn 20 25 30

Xle His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Phe Pro Arg Leu Leu He 2S 4Q 45

Lye Aen vai Ser Glu Ser Xle Ser Gly lie pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 ss 60

Ser 65

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Xle Leu Ser Xle Asn Ser Vai Glu Ser TO 75 80

Glu Asp He Ala Asp Tyr Tyr Cys gin 01» Ser Ae» Thr Trp Pro Pbe 85 50 OS

Thr Phe Gly Gly Gly Thr bye Leu Glu Xle Lye 100 105

Lisboa, 15 de Fevereiro de 2012. 248

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo IgG isolado ou um seu fragmento caracterizado pelo facto de se ligar especificamente ao domínio extracelular de FcyRIIB humana expressa endogenamente nas células humanas com uma afinidade pelo menos 10 vezes maior do que a que o referido anticorpo ou fragmento se liga a FcyRIIA expressa endogenamente numa célula humana, em que a referida ligação é feita por via do domínio variável.
2. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida região variável dos referido anticorpo bloquear a ligação de uma Ig-Fc a FcyRIIB.
3. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de aumentar a activação das células B, a proliferação das células B, o influxo intracelular de cálcio, a actividade de uma molécula de sinalização a jusante na via de transdução do sinal de FcyRIIB ou aumentar uma resposta celular dependente do anticorpo.
4. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo activar a sinalização mediada pelo receptor de células B ou inibir a activação de mastócitos induzida por FcsRl.
5. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo competir para a ligação a FcyRIIB com o anticorpo produzido pela linha de células 1 de hibridoma 2B6, com o número de acesso na ATCC PTA-4591 ou com o anticorpo produzido pela linha de células de hibridoma 3H7, com o número de acesso na ATCC PTA- 4592.
6. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-5, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, ou um anticorpo humano.
7. Fragmento de anticorpo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-6, caracterizado pelo facto de o referido fragmento ser um fragmento F(ab')2 ou um fragmento F(ab).
8. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-7, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ou fragmento se ligar a um domínio extracelular de FcyRIIB com uma afinidade pelo menos 100 vezes maior do que a que o referido domínio variável se liga a FcyRIIA.
9. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-8, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ou fragmento ser um anticorpo ou fragmento bi-específico compreendendo um primeiro par de cadeia pesada - cadeia leve que se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade maior do que a que o referido par de cadeia pesada - cadeia leve se liga a FcyRIIA e um segundo par de cadeia pesada -cadeia leve que se liga a um antigénio de tumor.
10. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com uma 2 qualquer das reivindicações 1-9, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ou um seu fragmento estar ligado operacionalmente a um agente terapêutico, uma citotoxina ou um polipéptido heterólogo, em que o referido polipéptido heterólogo é um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um receptor da superfície da célula.
11. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o referido receptor da superfície das células ser um antigénio do tumor.
12 . Anticorpo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-6 e 8-11 caracterizado pelo facto de compreender uma região Fc, compreendendo ainda pelo menos uma modificação na região Fc que altera a afinidade da referida região Fc do anticorpo para uma FcyR.
13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a referida região Fc se ligar a FcyRIIIA com uma afinidade maior do que a de um anticorpo comparável compreendendo uma região Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIIA.
14. Utilização de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, do anticorpo ou de um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de um medicamento para o tratamento de cancro num doente.
15. Anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se 3 utilizar no tratamento de cancro.
16. Utilização, de acordo com a reivindicação 14 ou anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 15, para se utilizar no tratamento de cancro, de acordo com a reivindicação 15, em que o referido medicamento ou tratamento se utiliza em combinação com um segundo anticorpo que se liga especificamente a um antigénio de cancro e é citotóxico, em que o referido cancro é caracterizado pelo referido antigénio de cancro.
17. Utilização, de acordo com a reivindicação 16 ou anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 16, para se utilizar no tratamento de cancro, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o referido antigénio de cancro ser ΜΆΘΕΙ, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglicosaminil-transferase, pl5, beta-catenina, ΜΌΜ-1, CDK4, HER-2/neu, virus do papiloma humano E6, vírus do papiloma humano E7 ou MUC-1.
18. Utilização, de acordo com a reivindicação 14 ou anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 15, para se utilizar no tratamento de cancro, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido medicamento ou tratamento se utilizarem em combinação com um segundo anticorpo que não medeia o seu efeito terapêutico pela morte das células.
19. Utilização, de acordo com a reivindicação 18, anticorpo ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 18, para se utilizar no tratamento de cancro, de acordo com 4 a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o referido segundo anticorpo ser um anticorpo anti-Fas.
20. Utilização do anticorpo ou de um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1 e uma composição de vacina, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ou fragmento estar numa quantidade eficaz para aumentar a resposta imunitária de um indivíduo à referida composição de vacina, na preparação de uma composição farmacêutica para aumentar a resposta imunitária à referida composição de vacina no referido indivíduo.
21. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar para aumentar a resposta a uma composição de vacina, em que a referida utilização se faz em combinação com a referida composição de vacina.
22. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de incluir: (i) uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um anticorpo ou de um fragmento de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-13; e (ii) um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo facto de o referido anticorpo ou fragmento aumentar a activação das células B, a proliferação das células B, o influxo intracelular de cálcio, a actividade de uma molécula de sinalização a jusante na via de transdução do sinal de FcyRIIB ou 5 uma resposta celular dependente do anticorpo e em que a referida composição compreende, adicionalmente, um anticorpo citotóxico que se liga especificamente a um antigénio de cancro. Lisboa, 15 de Fevereiro de 2012. 6