ES2371468T3

ES2371468T3 - SUSTANCIA QUE SE UNE AL RECEPTOR HUMANO llb MEDIANTE Fc DE IgG (Fc? Rllb).

Info

Publication number: ES2371468T3
Application number: ES04798098T
Authority: ES
Inventors: Robert Huber; Peter Sondermann; Uwe Jacob; Kerstin Wendt; Cabrele Chiara; Luis Moroder
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2012-01-03
Anticipated expiration: 2024-11-26
Also published as: ATE519784T1; AU2004293184B2; US20120269837A1; EP1709073B1; PL1709073T3; JP2008502312A; US20080014141A1; WO2005051999A3; CA2547126A1; JP5652987B2; EP1709073A2; PT1709073E; CA2547126C; WO2005051999A2; NZ547629A; US8853363B2; AU2004293184A1

Abstract

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a FcγRIIb humano en el entorno natural del receptor de Fc a través de su región variable, y que se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que comprende un epítopo conformacionalmente discriminador (CDE) que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcγRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos.

Description

Sustancia que se une al receptor humano IIb mediante Fc de IgG (FcyRIIb)

La invención se refiere a nuevos inmunógenos que poseen epítopos conformacionalmente discriminadores (CDEs), y a métodos de inmunización para producir anticuerpos que reconocen específicamente proteínas con homólogos muy estrechamente relacionados. En particular, la invención se refiere a anticuerpos que son específicos para FcyRIIb y que son útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, infecciones, tumores y otras afecciones en las que está implicado el sistema inmunitario.

Los receptores de Fc (FcRs) desempeñan un papel clave a la hora de defender al organismo humano frente a infecciones. Después de que los patógenos tienen acceso a la circulación sanguínea, son opsonizados por los anticuerpos (inmunoglobulinas, Igs). Esto conduce a la formación de complejos inmunitarios. Las porciones Fc de los anticuerpos se pueden unir a receptores de Fc que están presentes en virtualmente todas las células del sistema inmunitario. Existen FcRs específicos para todas las clases de Ig. La letra griega indica la clase de Ig a la que se une, es decir, los receptores de Fcy reconocen IgG, etc.

Desde hace años se conoce que los receptores de Fc para IgG (FcyR) desempeñan un papel importante a la hora de accionar respuestas efectoras (Metzger, 1992A). Estas incluyen, dependiendo del FcyR expresado y del tipo celular, endo-y fagocitosis que dan como resultado la neutralización de los patógenos y la presentación de antígenos, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), activación de neutrófilos, regulación de la producción de anticuerpos, o la secreción de mediadores inflamatorios (Fridman et al., 1992; van de Winker y Capel, 1993; Ravetch y Bolland, 2001).

En contraste con el papel beneficioso que los FcRs desempeñan en el individuo sano, también transmiten la estimulación del sistema inmunitario en alergias (por ejemplo, mediadas por FcsR1a) o enfermedades autoinmunitarias. Además, algunos virus emplean los FcyRs para tener acceso a las células, como el VIH (Homsy et al., 1989) y el Dengue (Littaua et al., 1990), o ralentizan la respuesta inmunitaria bloqueando los FcyRs, como en el caso del Ébola (Yang et al., 1998) y del sarampión (Ravanel et al., 1997).

Los receptores de Fc para IgG (FcyR) son los más ampliamente extendidos de la familia de receptores de Fc, y se expresan en un patrón definido en todas las células activas inmunológicas. FcyRI se expresa constitutivamente en monocitos y macrófagos, y puede ser inducido en neutrófilos y eosinófilos. El papel fisiológico de FcyRI todavía es desconocido, ya que la expresión en monocitos no es vital (Ceuppens et al., 1988). La forma anclada a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de FcyRIII (FcyRIIIb) se expresa exclusivamente en granulocitos. Debido a su parte citoplásmica faltante, la transducción de señales en la célula se produce solamente vía otras proteínas transmembránicas, como el receptor del complemento tipo 3 (CR3), que se pueden asociar al menos con FcyRIIIb (Zhou et al., 1993; Poo et al., 1995). FcyRIIIa se expresa principalmente en monocitos y macrófagos, pero sólo junto con una proteína asociada denominada cadena y. FcyRIIa es el receptor con la distribución más amplia en las células inmunocompetentes, y está implicado principalmente en la endocitosis de complejos inmunitarios. FcyRIIb se expresa en células B, en las que es el único receptor de IgG, y en células efectoras tales como macrófagos, neutrófilos y mastocitos, pero no en células NK ni en células T.

Estructuralmente, la parte extracelular de los FcyRs consiste en tres (FcyRI, CD64) o dos (FcsRI, FcyRII, CD32 y FcyRIII, CD16) dominios similares a Ig (aprox. 10 kDa/dominio), y por lo tanto pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. Además de los dominios extracelulares, los FcRs tienen un dominio transmembránico, y un dominio intracelular, con la excepción del FcyRIIIb anclado a GPI. Los receptores son homólogos entre sí, y la identidad global en la secuencia de aminoácidos entre los FcyRs y el FcsRIa supera el 40% en sus regiones extracelulares. FcyRIIa y FcyRIIb difieren en su región extracelular en sólo 6% de los restos de aminoácidos. No obstante, ambas formas se pueden distinguir por sus características de unión a las subclases de IgG humana y de ratón (van de Winkel y Capel, 1993) y su distinta afinidad hacia IgGs humanas (Sondermann et al., 1999A).

Los FcRs están muy glucosilados. La secuencia de ADNc de muchos receptores de Fc es conocida, y se han generado algunos FcR recombinantes solubles. Los receptores de Fc recombinantes solubles, que se caracterizan por la ausencia de dominios transmembránicos, péptido señal y glucosilación, se describen en el documento WO 00/32767.

El documento WO 00/32767 describe polipéptidos de FcyRIIb solubles que comprenden el motivo de aminoácido RGTH, que corresponde a los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb según la presente invención.

El documento WO 00/32767 describe además el uso del polipéptido de FcyRIIb soluble para la identificación de sustancias que son capaces de actuar como inhibidores del reconocimiento y unión de anticuerpos a los receptores celulares respectivos.

Los FcyRs aparecen en diversas isoformas (FcyRIa, b1, b2, c; FcyRIIa1-2, b1-3, c) y alelos (FcyRIIa1-HR, -LR; FcyRIIIb-NA1, -NA2) (van de Winkel y Capel, 1993). En contraste con las partes extracelulares homólogas globales, los dominios transmembránicos y citoplásmicos de hasta 8 kDa difieren enormemente.

Los FcyRs se pueden dividir en dos clases generales según su función, que puede ser activadora o inhibidora. Los receptores activadores están asociados con un motivo de activación a base de tirosina del inmunorreceptor (ITAM) de 16 aminoácidos que tiene la secuencia de consenso Y-X2-L/I-X8-Y-X2-L/I (Isakov, 1997). Este motivo se puede encontrar, por ejemplo, en FcyRIIa. La otra clase de FcRs son los receptores inhibidores, que tienen un motivo inhibidor (ITIM) citoplásmico de 6 aminoácidos que tiene la secuencia de consenso V/I-X-Y-X2-V/L (Isakov, 1997). Un ejemplo de tal FcR inhibidor es FcyRIIb.

La activación e inhibición vía los motivos ITAM e ITIM se efectúan mediante fosforilación de la tirosina. Dependiendo del tipo celular particular, activadas por el receptor de Fc, diferentes tirosina cinasas están implicadas en estas rutas de señalización (Amigorena et al., 1992). Tanto los FcyRs activadores como inhibidores se pueden expresar en la misma célula, lo que permite el funcionamiento de los receptores activadores e inhibidores en concierto para un ajuste fino de la respuesta inmunitaria.

FcyRIIb tiene dos actividades inhibidoras. Una de estas depende del motivo ITIM, y se produce cuando FcyRIIb se liga a un receptor que tiene ITAM (por ejemplo FcyRIIa), dando como resultado la inhibición de la movilización del calcio accionada por ITAM y la proliferación celular. Esto significa que los procesos dependientes del calcio, tales como desgranulación, fagocitosis, ADCC, liberación de citocinas, y activación proinflamatoria, y también la proliferación de células B son bloqueados por FcyRIIb. La segunda actividad inhibidora de FcyRIIb implica la homoagregación del receptor (agrupamiento de FcyRIIb), que envía una señal proapoptótica al citoplasma. La señal proapoptótica sólo se ha dado a conocer en células B, y se puede bloquear por ligación de FcyRIIb al receptor de células B (BCR). Estudios in vivo sugieren que FcyRIIb desempeña un papel en la tolerancia periférica, debido a que los ratones a los que se les ha desactivado FcyRIIb desarrollan espontáneamente enfermedades autoinmunitarias. Por otro lado, también se ha dado a conocer que FcyRIIb disminuye la citotoxicidad frente a tumores (Clynes et al., 2000). Los ratones deficientes en FcyRIIb y tratados con un anticuerpo antitumoral mostraron ADCC aumentada, dando como resultado la reducción de la metástasis tumoral, mientras que los ratones deficientes en receptores de Fc activadores fueron incapaces de detener el crecimiento tumoral, cuando se trataron con el mismo anticuerpo.

La generación de anticuerpos inmunizando animales con proteínas o péptidos como inmunógenos es conocida en la técnica. Los protocolos de inmunización convencionales usan péptidos lineales como inmunógenos, que derivan de antígenos de interés. La desventaja de tales métodos es que, debido a que la estructura tridimensional de los epítopos se pierde completamente a menudo, los anticuerpos resultantes no son muy específicos, o comprenden una gran fracción de anticuerpos dirigidos a epítopos distintos de aquél de interés.

Durante la última década, los protocolos de inmunización que usan células que expresan receptores de Fc, o que usan receptores de Fc desnaturalizados, sólo han dado como resultado anticuerpos que fueron capaces de detectar específicamente receptores de Fc desnaturalizados (transferencia Western), o no fueron capaces de discriminar entre el FcyRIIa y FcyRIIb relacionados en estirpes celulares (por ejemplo U-937, Raji) o células sanguíneas. Hasta la fecha, no hay anticuerpos u otras sustancias de unión que se unan selectiva y específicamente a FcyRIIb en su conformación nativa y/o su entorno natural.

Los protocolos de inmunización convencionales, que implican péptidos o proteínas recombinantes como antígenos, no son muy adecuados para producir anticuerpos específicos frente a proteínas para las cuales existen homólogos con una identidad de secuencia muy elevada. En general, los anticuerpos se producen usando como inmunógenos pequeños péptidos lineales. Tales péptidos no representan la conformación nativa del epítopo en la proteína de la que derivan. Además, la gran mayoría de los anticuerpos producidos por el animal inmunizado se dirigen contra epítopos de la proteína portadora a la que está conjugado el antígeno, o contra epítopos en el antígeno recombinante que son comunes a los homólogos. En consecuencia, los anticuerpos producidos no son específicos, y/o fallan a la hora de detectar el antígeno en su conformación nativa. Adicionalmente, se pueden localizar sitios de glucosilación en los epítopos de interés, y enmascarar estos sitios. Los protocolos de inmunización convencionales que usan estos epítopos sin la glucosilación nativa respectiva encontrada en la molécula diana dan como resultado anticuerpos que fallan a la hora de reconocer el antígeno en su conformación nativa.

Un aspecto de la presente invención es proporcionar péptidos o polipéptidos recombinantes que se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos capaces de discriminar entre un antígeno de interés y antígenos estrechamente relacionados, y un método para generar tales péptidos y los anticuerpos correspondientes y otras sustancias que tienen especificidad inmunológica.

Es un aspecto adicional de la presente invención, proporcionar sustancias que se pueden unir selectivamente a y discriminar entre subtipos de receptores de Fc, actuando de ese modo como una sustancia de unión de receptores Fc útil para el tratamiento y diagnóstico de trastornos inmunitarios, en particular enfermedades autoinmunitarias, y como agentes antitumorales que potencian la eficiencia de tales terapias promoviendo la ADCC frente a células tumorales.

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Es un aspecto adicional de la presente invención proporcionar un protocolo de inmunización que permitirá la generación de tales sustancias de unión a FcyRIIb, en particular anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales con la especificidad mencionada anteriormente.

Los inventores de la presente invención han encontrado un enfoque para desarrollar sustancias, en particular anticuerpos, que son capaces de discriminar entre proteínas muy estrechamente relacionadas y/o proteínas y antígenos con homología elevada.

Sorprendentemente, se encontró que es posible producir anticuerpos específicos frente a proteínas de interés cuando se usan como antígeno frente a los cuales se producen los anticuerpos los denominados epítopos conformacionalmente discriminadores (CDEs).

La presente invención se refiere por lo tanto a un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a FcyRIIb humano en el entorno natural del receptor de Fc, y que se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que comprende un epítopo conformacionalmente discriminador (CDE) que comprende los aminoácidos 2730 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos.

Para los fines de la presente invención, un péptido o polipéptido artificial es aquel que es producido por cualquier procedimiento técnico, tal como técnicas recombinantes, o preferiblemente mediante síntesis peptídica.

Un CDE es un epítopo en una proteína que tiene una conformación específica en la proteína. Los anticuerpos que son específicos para tal epítopo pueden discriminar entre una proteína y homólogos muy estrechamente relacionados. El CDE comprende al menos un aminoácido que difiere entre la proteína en la que está presente y los homólogos de esa proteína (resto único). Los restos únicos no necesitan estar en estrecha proximidad en la secuencia lineal de la proteína a fin de ser parte del mismo epítopo. La ventaja es que los péptidos de la invención no tienen sólo la secuencia lineal de esos epítopos, sino que también imitan su estructura. El CDE contiene al menos uno de tales restos únicos, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente más de dos de tales restos únicos. El CDE representa el sitio de unión para un anticuerpo.

Los péptidos tienen una longitud de 5, preferiblemente de alrededor de 8, más preferiblemente de alrededor de 10 a 30, más preferiblemente hasta alrededor de 20, más preferiblemente hasta alrededor de 18, más preferiblemente hasta alrededor de 15 aminoácidos.

La estabilización estructural en este contexto significa que el péptido se estabiliza de manera que el CDE está presente en su conformación tridimensional nativa en la proteína original tan próxima como sea posible. La estabilización estructural se puede lograr por un número de medios. En particular, el péptido se circulariza de manera que forma una estructura tridimensional estable, tal como un bucle. La estabilización del péptido se puede lograr mediante acoplamiento N- a C-terminal, la formación de puentes de cisteína, o formando puentes entre cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden formar pseudopéptidos.

Preferiblemente, el péptido o polipéptido también posee restos de glucosilación. El péptido se genera preferiblemente de manera que los aminoácidos glucosilados se incorporan en los mismos sitios que están glucosilados en la proteína nativa de la que deriva el CDE. Preferiblemente, los aminoácidos glucosilados se seleccionan de N-acetil-glucosamina, fucosa, xilosa, manosa, y conjugados de galactosa, pero esta lista no es exhaustiva. Si el epítopo discriminador contiene un sitio de N-glucosilación, se puede incorporar en el péptido un conjugado artificial de un resto de asparagina con una N-acetil-glucosamina, para potenciar la probabilidad de que el sustrato nativamente glucosilado sea reconocido por los anticuerpos resultantes después de la inmunización exitosa. En consecuencia, para sitios de O-glucosilación, se puede conjugar un resto de serina o treonina se puede conjugar con un resto de manosa, fucosa, xilosa, galactosa o N-acetil-galactosamina, respectivamente.

Los péptidos y polipéptidos se pueden acoplar adicionalmente a una molécula portadora. Tales moléculas portadoras se seleccionan preferiblemente de haptenos, péptidos, polipéptidos y otros inmunógenos. Los péptidos se pueden injertar en otros péptidos y proteínas, incluso en la misma proteína o sus partes de la que se derivó el CDE.

Según la invención, un anticuerpo o su fragmento se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que posee un CDE de un receptor de FcyRIIb que comprende los aminoácidos 27-30 de SEC ID NO: 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos. Sorprendentemente se ha encontrado que hay epítopos específicos en la porción extracelular de FcyRIIb que permiten la generación de anticuerpos que se unen específicamente a FcyRIIb. Esto es particularmente útil debido a que la familia de receptores de Fc comprende inusualmente homólogos estrechamente relacionados que son difíciles de distinguir usando anticuerpos convencionales. En particular, la presente invención hace posible generar sustancias que se unen a FcyRIIb pero no a FcyRIIa, y viceversa.

Los péptidos o polipéptidos comprenden un epítopo que comprende al menos los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb humano según la Figura 1 y SEC ID NO: 2: Gln12, Arg27, Thr29, His30, Val104, Lys127, Ser132, Asn135, Tyr160, y Ala171. Estos péptidos pueden representar epítopos conformacionalmente discriminadores (CDEs) específicos de FcyRIIb, cuando se estabilizan estructuralmente mediante circularización, de una manera adecuada como se ejemplifica en la Figura 2.

Estos péptidos artificiales se pueden usar entonces directamente para la inmunización de animales, o se pueden acoplar a una proteína portadora, tal como haptenos o péptidos o polipéptidos, o idealmente a la propia proteína diana. En una realización preferida, un CDE de FcyRIIb, o un péptido que posee tal CDE, se conjuga a FcyRIIb o a FcyRIIa.

Los péptidos y polipéptidos se usan preferiblemente como inmunógenos para inmunizar animales a fin de generar anticuerpos específicos y, con la ayuda de la secuencia de esos anticuerpos específicos, otras sustancias inmunológicamente específicas. Los CDEs y los péptidos que los poseen se pueden usar para la generación de sustancias inmunomoduladoras que reconocen específicamente el CDE. Esto es particularmente preferido cuando se escogen CDEs de receptores de Fc, debido a que permiten la generación de anticuerpos específicos para miembros individuales de la familia de homólogos. En particular, se pueden generar anticuerpos u otra sustancia inmunomoduladora que reconoce FcyRIIb o FcyRIIa, pero no ambos al mismo tiempo. La presente invención permite la generación de anticuerpos que son capaces no sólo de reconocer específicamente FcyRIIb y discriminar entre los dos receptores de Fc, sino también de hacerlo cuando los receptores de Fc están en su entorno natural, por ejemplo en cultivo celular o in vivo, por ejemplo en el torrente sanguíneo.

Acoplando el CDE a la proteína de la que derivó, se reduce la reacción inmunitaria de fondo frente a la proteína portadora. La modificación artificial por el CDE acoplado covalentemente da como resultado una respuesta inmunitaria incrementada. Esto es especialmente importante si el animal inmunizado expresa proteínas similares que serían toleradas por su sistema inmunitario. De este modo, si el péptido de la invención posee un CDE de FcyRIIb, está preferiblemente acoplado al propio receptor de Fc respectivo. Esto incrementa la antigenicidad. El acoplamiento se puede producir mediante enlace químico u otro medio adecuado.

Este método produce preferiblemente un inmunógeno con una densidad elevada de CDEs, presentándolos de ese modo en un entorno diferente y de este modo inmunógeno. La respuesta inmunitaria inicial está dirigida contra la región seleccionada como diana (CDE) que produce anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con la estructura nativa a la que se acoplan. Estos anticuerpos que reaccionan de forma cruzada maduran hacia una mayor afinidad, reconociendo también el CDE en su entorno natural.

Los péptidos y los CDEs también se pueden usar en la identificación de librerías moleculares para moléculas de unión (por ejemplo péptidos, moléculas orgánicas, peptidomiméticos, etc.) o librerías codificadas genéticamente (por ejemplo presentación de fagos de dominios variables de anticuerpos u otros marcos como lipocalinas), para encontrar sustancias que se unen específicamente a FcyRIIb. Los péptidos se pueden usar para identificar librerías de moléculas que se unen específicamente a FcyRIIb en células humanas.

El péptido se estabiliza estructuralmente mediante circularización, preferiblemente mediante acoplamiento N a Cterminal, la formación de puentes de cisteína, y/o el establecimiento de puentes entre cadenas laterales de aminoácidos formando un pseudopéptido. Como se señala anteriormente, el péptido se genera preferiblemente usando aminoácidos que poseen restos de glucosilación que están presentes en la proteína de interés. El método comprende preferiblemente la etapa adicional de conjugar el péptido a una molécula portadora, que se puede seleccionar de cualquiera de las moléculas mencionadas anteriormente.

A fin de elevar significativamente la fracción de anticuerpos que se unen específicamente, la invención proporciona el siguiente método para generar anticuerpos específicos o sus fragmentos capaces de discriminar entre FcyRIIb y FcyRIIa, en el que el método comprende inmunizar animales o animales transgénicos con un péptido o polipéptido artificial en su conformación nativa, en el que el péptido o polipéptido comprende un CDE de FcyRIIb, comprendiendo el CDR al menos un resto que es único para FcyRIIb, y en el que el CDE se estandariza estructuralmente por circularización.

Para producir anticuerpos que discriminan entre un antígeno A y un antígeno B con elevada identidad de secuencia con A, los aminoácidos que difieren se cartografían a la estructura de A o un modelo de estructura respectivo de A. Los aminoácidos que difieren, que están separados por varios aminoácidos en la secuencia primaria, pueden estar en proximidad espacial. En caso de que estos aminoácidos que difieren sean accesibles desde el disolvente en la estructura nativa, estas regiones superficiales se pueden considerar como epítopos conformacionalmente discriminadores (CDE). Tales epítopos se pueden construir artificialmente mediante péptidos cíclicos o análogos peptídicos, y son especialmente útiles para la generación de anticuerpos que pueden discriminar entre antígenos fuertemente relacionados.

En una variación de este método, se usan animales transgénicos para la inmunización, que son manipulados mediante ingeniería genética para expresar el homólogo u homólogos próximos, y más tarde se inmunizan con el antígeno diana. Los animales que expresan el FcyRIIb humano se inmunizan con FcyRIIa humano o viceversa.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a FcyRIIb humano en el entorno natural del receptor de Fc, y que se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que comprende un epítopo conformacionalmente discriminador (CDE) que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos. Tales fragmentos de anticuerpos o derivados pueden discriminar entre los homólogos estrechamente relacionados de FcyRIIb y FcyRIIa en un entorno natural, por ejemplo en cultivo celular o in vivo.

En una realización preferida, el anticuerpo o su fragmento que se une a FcyRIIb no solamente se une específicamente a FcyRIIb, sino también evita que se unan las parejas de unión naturales de FcyRIIb, es decir, anticuerpos IgG.

En otra realización preferida de la presente invención, los anticuerpos específicos anti-FcyRIIb son no bloqueantes, y reconocen un epítopo distinto del sitio de interacción del receptor de Fc/fragmento de Fc (por ejemplo un epítopo del dominio N-terminal alrededor de los aminoácidos 28-31). En contraste con los anticuerpos bloqueantes, estos anticuerpos tienen la ventaja de que la unión del receptor a los complejos inmunitarios no está dañada. El resultado es que la activación de los receptores por los complejos inmunitarios sigue estando intacta, y se pueden reclutar receptores adicionales para potenciar la activación. De este modo, es posible modular las funciones naturales de estos receptores de Fc independientes de la unión de IgG. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo se puede escoger para ser capaces de reticular el receptor de Fc. De ese modo, se puede activar el receptor. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo de la invención no interfiere con la unión del complejo inmunitario a FcyRIIb o FcyRIIa.

Por otro lado, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo se puede escoger de manera que inhiba la función fisiológica de FcyRIIb humano.

El anticuerpo o derivado o fragmento de la invención se une preferiblemente con una afinidad por FcyRIIb mayor que por FcyRIIa. El anticuerpo o fragmento o derivado del mismo se une a FcyRIIb con una afinidad de al menos 5 veces, preferiblemente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100 veces, más preferiblemente al menos 1.000 veces, más preferiblemente al menos 10.000 veces, más preferiblemente al menos 100.000 veces, más preferiblemente al menos 106 veces, más preferiblemente al menos 107 veces, más preferiblemente al menos 108 veces, más preferiblemente al menos 109 veces, más preferiblemente 1010 veces, más preferiblemente 1011 veces, más preferiblemente 1012 veces mayor que FcyRIIa.

El anticuerpo o su fragmento puede aparecer en un estado monómero o multímero.

En anticuerpo o su fragmento puede ser capaz de unirse a moléculas de receptores de Fc reticulándolas o no sobre la superficie celular. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento o su derivado es multímero a fin de reticular FcyRIIa

o FcyRIIb. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo es monómero, y es capaz de bloquear la unión de IgG a FcyRIIb humano, pero preferiblemente no es capaz de reticular FcyRIIb.

El anticuerpo o su fragmento de la invención también se puede modificar en el fragmento de Fc mediante la modificación de la glucosilación y/o mutagénesis para potenciar la unión hacia subconjuntos de los receptores de Fc.

El anticuerpo o su fragmento de la invención es capaz preferiblemente de unirse a un péptido o polipéptido artificial como se describe anteriormente, que comprende los aminoácidos 27 a 30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb (Figura 1, SEC ID NO: 2.

El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser cualquier sustancia natural, artificial, o producida recombinantemente, que posee una región que se puede unir a los epítopos mencionados anteriormente de FcyRIIb. Preferiblemente, esta región contiene las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo que se une específicamente a FcyRIIb. Más preferiblemente, las CDRs comprenden las secuencias como se representan en las Figuras 5 y 6.

Las CDRs descritas pueden ser la base para variaciones para mejorar adicionalmente su especificidad o diseñar nuevos anticuerpos específicos o pananticuerpos (o moléculas de unión) para otros receptores de Fc seleccionados

o grupos de receptores. Se conocen métodos que incluyen mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, identificación en busca de secuencias relacionadas, y diseño en base al conocimiento o a la estructura.

Preferiblemente, el anticuerpo o su fragmento comprende una o ambas de las regiones ligera y variable y pesada variable según las SEC ID Nos: 5 y 7, y/o las regiones ligera variable y pesada variable según las SEC ID Nos: 9 y

11. Lo más preferible, el anticuerpo es CE5 o GB3.

Se prefieren anticuerpos monoclonales. Preferiblemente, es un anticuerpo o fragmento derivado del mismo que tiene un isotipo IgG, IgE, IgM o IgA. Preferiblemente, el anticuerpo es humano o humanizado, pero también puede ser de otro origen, tal como origen animal, en particular origen de ratón o de camello. El anticuerpo puede estar en diversas formas, tal como un anticuerpo monocatenario, anticuerpo bi- o trifuncional o multifuncional, fragmento Fab o Fab2, o

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como un anticuerpo completo en el que el fragmento Fc tiene una afinidad modificada hacia receptores de Fc o complemento. También puede ser un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, o un fragmento Fv, o un fragmento scv.

El anticuerpo o su fragmento también puede ser un polipéptido o análogo polipeptídico producido recombinantemente que tiene una región de unión específica que comprende la secuencia de los CDRs o una secuencia similar relacionada más de 50%, preferiblemente más de 70%, preferiblemente más de 90%, preferiblemente más de 95% con las secuencias proporcionadas. Estas secuencias también pueden ser el punto de partida para el diseño de inhibidores de receptores de Fc. Por lo tanto, también los peptidomiméticos son parte de la invención que usan o imitan motivos de secuencias de las CDRs proporcionadas.

En otra realización preferida, el anticuerpo o su fragmento es una anticalina o variante de lipocalina u otro sustituto de anticuerpo.

El anticuerpo o su fragmento obtenido se puede acoplar a una molécula efectora tal como un antígeno de interés, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas marcadoras, sustancias citotóxicas, sustancias bloqueantes estéricamente voluminosas, y moléculas ligadoras y sustancias ligadoras.

Otro aspecto de la invención son ácidos nucleicos, vectores y células hospedantes que contienen ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o sus fragmentos de la presente invención como se describe anteriormente.

A partir del anticuerpo o su fragmento según la invención, se puede derivar una secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína. Preferiblemente, esa secuencia codifica las regiones variables, preferiblemente las CDRs que se unen a los epítopos mencionados anteriormente de FcyRIIb. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico codifica las CDRs según una o más de las secuencias de acuerdo con las Figuras 5 y 6. Preferiblemente, el ácido nucleico codifica la secuencia de anticuerpos monoclonales CE5 o GB3.

La secuencia de ácido nucleico se puede insertar en un vector para la expresión de la proteína según las Figuras 5 y 6, vector el cual también es un aspecto de la presente invención. El vector comprende preferiblemente un promotor bajo cuyo control se colocan las secuencias de ácido nucleico anteriores. El vector puede ser procariota o un vector de expresión eucariota, en el que el ácido nucleico recombinante se expresa solo o en fusión con otros péptidos o proteínas, o un vector adecuado para la vacunación de ADN.

La invención también proporciona una célula hospedante transfectada con el vector mencionado anteriormente. La célula hospedante puede ser cualquier célula, una célula procariota o una célula eucariota.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades asociadas con la señalización mediada por receptores de Fc, que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o su fragmento según la invención, y sustancias portadoras farmacéuticamente aceptables.

La presente invención proporciona además un kit de diagnóstico para la detección de enfermedades autoinmunitarias y/o cáncer, que comprende un anticuerpo o su fragmento según la invención y/o el péptido o polipéptido recombinante según la invención que comprende o representa uno de los epítopos como se describe aquí, y opcionalmente reactivos marcadores, reactivos portadores y/o receptáculos adecuados.

La inmunización con los receptores de Fc no glucosilados y correctamente plegados, por ejemplo derivados de E. coli, y decorados con los epítopos descritos, conducen sorprendentemente a anticuerpos que reconocen específicamente receptores de Fc naturales expresados en células sanguíneas y en cultivo celular (Figura 3 y Figura 4).

El anticuerpo o su fragmento según la presente invención es útil para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o diagnóstico de afecciones que implican al sistema inmunitario. Preferiblemente, estas afecciones son enfermedades autoinmunitarias o cáncer.

Las enfermedades que se pueden tratar con un medicamento de la invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, síndrome de Rieter, psoriasis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso.

Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden diagnosticar o tratar usando las sustancias de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, púrpura trombocitopénica idiopática, y enfermedad del hospedante frente a injerto.

Sorprendentemente, se ha encontrado que es posible potenciar ciertos procesos inmunológicos usando in vivo los anticuerpos o sus fragmentos que se unen a FcyRIIb. En particular, es posible usar aquellas sustancias de la invención para bloquear específicamente la señalización de FcyRIIb en células, e incrementar de ese modo la respuesta inmunitaria del individuo. Esto se puede usar para incrementar la ADCC frente a células tumorales. En la práctica, la sustancia que se une a FcyRIIb se da como adyuvante con un anticuerpo terapéutico. La señal inhibidora transmitida por antígenos (por ejemplo células tumorales) opsonizados con el anticuerpo terapéutico a macrófagos activados o células B se bloquea, y el sistema inmunitario del hospedante será más efectivo combatiendo el antígeno seleccionado como diana. Esto puede ser en una manera directa marcando células tumorales que expresan FcyRIIb (por ejemplo linfoma de células B), o usando esa sustancia de unión a FcyRIIb como adyuvante en todos los enfoques que usan anticuerpos terapéuticos conocidos, y por lo tanto dependen de la ADCC del hospedante.

Los anticuerpos terapéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, Herceptin®, Rituxan®, IC14, PANOREX™, IMC-225, VITAXIN™, Campath 1 H/LDP-03, LYMPHOCIDE™ y ZEVLIN™. También incluyen anticuerpos que se unen a los siguientes antígenos de cáncer: MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, Nacetilglucosaminiltransferasa, p15, beta-catenina, MUM-1, CDK-4, HER- 2/neu, papilomavirus E6 humano, papilomavirus E7 humano y MUC-1.

En ciertos linfomas, las células B o los mastocitos se transforman. El anticuerpo o su fragmento es capaz de reticular FcyRIIb sobre la superficie de estas células, lo que marca a estas células para la eliminación, pero adicionalmente se transmite a estas células una señal inhibidora y proapoptótica. Este efecto es una mejora de los enfoques previos con anticuerpos terapéuticos, que dependen completamente de la ADCC del hospedante (por ejemplo Rituxan).

El mismo anticuerpo que reticula o bloquea los receptores de Fc se puede usar para el tratamiento de la enfermedad del hospedante frente a injerto o enfermedades asociadas con amiloides.

Para inhibir mastocitos para el tratamiento de alergias, se pueden usar los mismos constructos que bloquean y/o reticulan FcyRIIb.

El anticuerpo o su fragmento se puede acoplar a IgE (por ejemplo transfiriendo las CDRs mostradas en la Figura 5 ó 6 a una molécula de IgE). En este caso, la IgE está unida por el FcsRI expresado por mastocitos, y los CDRs específicos de FcyRIIb reticulan el ITAM de FcsRI con el ITIM del FcyRIIb. Nuevamente, se transmite a los mastocitos una señal inhibidora y/o apoptótica, lo que es útil en la terapia de alergias.

El anticuerpo o su fragmento (por ejemplo derivados de las secuencias representadas en las figuras 5 y 6) se pueden usar para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Tales sustancias inhiben células B, células dendríticas y granulocitos activados (por ejemplo macrófagos), lo que conduce a una producción reducida de mediadores estimulantes inmunitarios, y a una reducción en la producción de anticuerpos así como la presentación de antígenos (por ejemplo, en células dendríticas y en macrófagos, conduciendo a una disminución en el reclutamiento de células T). Tomado en conjunto, se inhibe el bucle de retroalimentación de la producción de anticuerpos y reestimulación del sistema inmunitario.

Preferiblemente, el anti-FcyRIIb no interfiere con la unión del fragmento Fc del receptor. De esta manera, la función normal del receptor Fc, en contraste con los anticuerpos bloqueantes, se mantiene y potencia la activación de la célula mediante el reclutamiento adicional de otros receptores.

Por otro lado, los anticuerpos anti-FcyRIIa específicos, o sus fragmentos, se pueden usar en dianticuerpos para dirigir un antígeno hacia su receptor, o los fragmentos de estos anticuerpos se pueden usar para inhibir la captación de complejos inmunitarios, por ejemplo para el tratamiento de ITP.

Los anticuerpos o sus fragmentos se pueden usar solos o en combinación, para la producción de inhibidores específicos de la interacción FcyRIIa/IgG o la interacción FcyRII/IgG.

A su vez, los inhibidores se pueden usar para generar estructuras cristalinas, o para el diseño a base de estructuras,

o como sujeto para métodos evolutivos. Un uso adicional es la generación de secuencias modificadas a partir de aquella representada en las figuras 5 ó 6 mediante métodos evolutivos (por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida al sitio, o diseño basado en la estructura).

En particular, los inhibidores de los receptores de Fc se pueden usar para reducir o potenciar la especificidad de los anteriores para los receptores de Fc seleccionados. Para este fin, se pueden llevar a cabo modificaciones en las CDRs de los anticuerpos específicos, en particular de GB3 y CE5, a fin de potenciar o reducir su especificidad por FcyRIIb.

El anticuerpo o su fragmento es útil para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o diagnóstico de afecciones que implican al sistema inmunitario, en particular enfermedades autoinmunitarias, preferiblemente aquellas seleccionadas de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, púrpura trombocitopénica inmunitaria, o esclerosis múltiple. Otros usos de los anticuerpos o sus fragmentos de la invención son en el diagnóstico y/o tratamiento de cáncer y/o alergias. Los mAbs CE5 o GB3, o sus fragmentos, son particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica idiopática, artritis reumatoide, y cáncer, en particular linfomas o leucemias.

Los mAbs CE5 o GB3, o sus fragmentos, también se pueden usar para el tratamiento de cáncer en combinación con otros compuestos terapéuticos, preferiblemente compuestos bioterapéuticos (por ejemplo anticuerpos).

El anticuerpo o sus fragmentos generados según la presente invención se pueden usar para el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer, preferiblemente en combinación con otros compuestos terapéuticos, preferiblemente compuestos bioterapéuticos (por ejemplo otros anticuerpos). El anticuerpo o su fragmento se usa entonces como un adyuvante.

Otros usos del anticuerpo o su fragmento de la invención incluyen el uso para la producción de composiciones farmacéuticas y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedad de hospedante frente a injerto, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con amiloides, o para incrementar el efecto de la vacunación o para el tratamiento de enfermedades asociadas con células dendríticas y/o macrófagos activados.

También es posible usar un anticuerpo o su fragmento, que comprenden fragmentos anti-FcyRIIa específicos, en anticuerpos biespecíficos para dirigir antígenos hacia el transporte mediante trombocitos y/o la captación por el sistema de fagocitosis del hígado y del bazo.

Descripción de las figuras y listado de secuencias

Figura 1:

Alineamiento de secuencias de los dominios extracelulares de FcyRIIb y FcyRIIa humanos. Los aminoácidos que difieren están encerrados en cajas.

Figura 2:

Estructura de FcyRIIb en una representación de cinta. Los restos únicos se muestran en bola y palo, y los sitios de glucosilación potencial se indican como esferas más grandes. Las flechas apuntan a subestructuras extraíbles posibles (epítopos 1 y 2) que se pueden generar artificialmente para la mejora de los protocolos de inmunización frente a antisueros de FcyRIIb específicos, y subsiguientemente para la producción de anticuerpos monoclonales específicos de isoformas.

Figura 3:

Diagrama izquierdo: Histograma de una medida mediante FACS de células Raji (positivas a FcyRIIb y negativas a FcyRIIa) usando el suero preinmune del ratón (menos), el antisuero obtenido después del procedimiento de inmunización (antisuero) y el pan-FcyRII-mAb AT10 (Greenman et al., 1991). Diagrama derecho: Marcador de fluorescencia en células U-937 (positivas a FcyRIIa y negativas a FcyRIIb). El antisuero reacciona sólo marginalmente con las células, indicando la presencia de anticuerpos específicos.

Figura 4:

Análisis mediante FACS de sangre humana incubada con suero normal (control negativo), antisuero de un ratón inmunizado con FcyRIIb-CDE[126-137], mAb AT10 o el anticuerpo monoclonal específico GB3 generado usando esta invención. a): Análisis de transferencia de punto de la muestra de sangre en términos de tamaño celular (FSC-H) y granularidad (SSC-H). Las regiones observadas R1, R2, R3 contienen linfocitos (células B y T), monocitos y granulocitos, respectivamente. b) Intensidad de la fluorescencia de las células encontradas en la región R1 que representa linfocitos. El pan-FcyRIIb-mAb AT10, el mAb GB3 y el antisuero tiñen las células B positivas a FcyRIIb, mientras que las células T negativas a FcyRII no son reconocidas. c) Intensidad de la fluorescencia de las células encontradas en la región R2 que representa monocitos/macrófagos. En contraste con los controles positivos, mAb AT10 y el antisuero, el mAb GB3 no reconoce los monocitos positivos a FcyRIIa. d) Intensidad de la fluorescencia de las células encontradas en la región R3 que representa granulocitos. En contraste con los controles positivos, mAb AT10 y el antisuero, el mAb GB3 no reconoce los granulocitos positivos a FcyRIIa.

Figura 5:

Las regiones variables del anticuerpo GB3 clonado. Las regiones enmarcadas en cajas representan las CDRs, mientras que los términos subrayados pueden variar debido a artefactos de clonación introducidos por el cebador. a) Región variable de la cadena ligera; b) región variable de la cadena pesada.

Figura 6:

Las regiones variables del anticuerpo CE5 clonado. Las regiones enmarcadas en cajas representan las CDRs, mientras que los términos subrayados pueden variar debido a artefactos de clonación introducidos por el cebador. a) Región variable de la cadena ligera; b) región variable de la cadena pesada.

Figura 7:

El glucopéptido CDE[126-137] usado para inmunización y generación de anticuerpos específicos de FcyRIIb.

Figura 8:

Inmunización de ratones SJL con un anticuerpo específico anti-FcyRII de ratón. Se inmunizaron SJLj con 200 !g de MOG en el día 0. El tratamiento con anticuerpo anti-FcyRII (dosis de 50 !g/semana) comenzó en el día

5. La puntuación clínica se monitorizó diariamente, y se da como la media de los 8 ratones por grupo.

5 SEC ID NO: 1 secuencia de aminoácidos de FcyRIIa (como en la Fig. 1)

SEC ID NO: 2 secuencia de aminoácidos de FcyRIIb (como en la Fig. 1)

SEC ID NO: 3 secuencia del glucopéptido CDE [126-137]

SEC ID NO: 4 secuencia de ácido nucleico de la región ligera variable de mAb GB3

SEC ID NO: 5 secuencia de aminoácidos correspondiente de la región ligera variable de mAb GB3

10 SEC ID NO: 6 secuencia de ácido nucleico de la región pesada variable de mAb GB3

SEC ID NO: 7 secuencia de aminoácidos correspondiente de la región pesada variable de mAb GB3

SEC ID NO: 8 secuencia de ácido nucleico de la región ligera variable de mAb CE5

SEC ID NO: 9 secuencia de aminoácidos correspondiente de la región ligera variable de mAb CE5

SEC ID NO: 10 secuencia de ácido nucleico de la región pesada variable de mAb CE5

15 SEC ID NO: 11 secuencia de aminoácidos correspondiente de la región pesada variable de mAb CE5

Todos los ejemplos sólo son para fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de Ciclo-[N- -(2-acetilamino-desoxi-2-1-glucopiranosil)-Asn138, Gly141]-(129-141)-FcyRIIb2, CDE[12620 137]

Los derivados de aminoácidos estándar procedieron de Alexis (Läufelfingen, Suiza), el derivado fluorenilmetoxicarbonílico (Fmoc) de Asn(N-1-3,4,6-tri-O-acetil-2-acetilamino-desoxi-2-1-glucopiranosil)-OH procedió de Merck-Novabiochem (Darmstadt, Alemania), y la resina clorotritílica previamente cargada procedió de Pepchem (Tübingen, Alemania). Los reactivos y disolventes fueron de la mayor calidad comercialmente disponible, y se 25 usaron sin purificación adicional. La HPLC analítica de fase inversa se llevó a cabo en un equipo Waters (Eschborn, Alemania) con una columna Symmetry C18 (5 !m, 3,9 x 150 mm, Waters) mediante elución con gradiente lineal: (1) 0-100% de A en 15 min., o (2) 0-30% de A en 20 min., hasta 50% de A en 5 min., y hasta 100% de A en otros 5 min. (caudal de 1,5 ml/min., y detección de UV a 210 nm). El sistema de elución binario fue (A) acetonitrilo/2% de H3PO4

(90:10) y (B) acetonitrilo/2% de H3PO4 (5:95). La HPLC preparativa de fase inversa se llevó a cabo en un equipo

30 Abimed (Langenfeld, Alemania) usando Nucleosil C18 PPN (5 !m, 100 Å, 10 x 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y un gradiente de 0,08% de ácido trifluoroacético (TFA) en acetonitrilo (A) y 0,1% de TFA en agua (B) a un caudal de 10 ml/min.: 2% de A durante 7 min., hasta 40% de A en 50 min., y hasta 70% de A en otros 5 min. Los espectros de ESI-MS se registraron en un espectrómetro de cuadrupolo triple Perkin-Elmer SCIEX API 165. La LC-MS se llevó a cabo con una columna Nucleosil C18 (5 !m, 100 Å, 1 x 250 mm, Macherey-Nagel) usando gradientes

35 lineales de 0,1% de TFA en agua y 0,08% de TFA en acetonitrilo (caudal: 30 !l/min.; detección a 210 nm).

a) Síntesis peptídica en fase sólida

El precursor peptídico lineal se sintetizó manualmente en resina de Fmoc-Gly-clorotritilo (232 mg, 0,13 mmoles) siguiendo procedimientos estándar de química Fmoc/terc-butilo (tBu). El grupo Fmoc se escindió en cada etapa con dos tratamientos sucesivos (3 y 20 min.) con 20% de piperidina en N-metilpirrolidona (NMP). Para Fmoc-Ser(tBu)40 OH y Fmoc-Phe-OH, se aplicaron acoplamientos dobles (2 x 1 h) con Fmoc-aminoácido/hexafluorofosfato de 2-(1Hbenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU)/N-hidroxibenzotriazol (HOBt)/N,N-diisopropiletilamina (DIEA)

(4:4:4:8 eq.) en NMP, mientras que el derivado de Asn glucosilado se introdujo mediante acoplamiento único usando Fmoc-aminoácido/hexafluorofosfato de (1H-benzotriazol-1-iloxi)-tripirrolidinofosfonio (PyBOP)/HOBt/DIEA (2:2:2:5 eq.) en NMP. La reacción se terminó después de 5 h, como se confirmó mediante el ensayo de Kaiser. Se llevó a

45 cabo una etapa de protección de los extremos de la cadena con anhídrido acético/DIEA (1:1, 3 eq.) durante 10 min. antes del alargamiento de la cadena. Para la acilación con los derivados de aminoácidos que quedan (Arg se introdujo como el derivado Arg-2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonílico [Pbf]), se usaron nuevamente acoplamientos dobles (2 x 1,5 h) con Fmoc-aminoácido/HBTU/HOBt/DIEA (6:6:6:12 eq.) en NMP.

ES 2 371 468 T3

b) Escisión del péptido con cadena lateral protegida.

El péptido lineal con cadena lateral protegida se escindió de la resina tratando el péptido-resina con 5 ml de 1% de TFA en diclorometano (DCM) durante 3 min. El filtrado se analizó mediante cromatografía de capa fina (TLC) (CH3Cl/MeOH/H2O, 8:3:1) antes de la adición de 1 ml de piridina al 10% en metanol. El tratamiento con TFA se repitió hasta que el control de TLC en el filtrado fue negativo (cuatro tratamientos globales). Finalmente, la resina se lavó con DCM y trifluoroetanol para mejorar la recuperación del péptido. Los filtrados que contienen el péptido y los lavados finales se combinaron y se concentraron hasta un pequeño volumen. El residuo se diluyó con MeOH, y el producto se precipitó con agua enfriada con hielo. El producto bruto se recogió mediante filtración (270 mg, 80% de rendimiento) y se caracterizó mediante HPLC analítica (gradiente 1) y ESI-MS. Se encontró un pico principal (tR 9,5 min.; ESI-MS: m/z = 2520 [M+H]+; Mr = 2519,0 calc. para C120H188N20O36S) y un pico secundario (tR 9,3 min.; ESI-MS: m/z = 2478 [M-42+H]+) en la relación de 75:20 que corresponden al producto esperado y al producto secundario, respectivamente. La diferencia de masas se atribuyó a la pérdida de un grupo protector acetílico de Asn (Ac3AcNH-1-Glc).

c) Ciclación.

La ciclación de la cadena principal se logró a una concentración peptídica de 0,9 mM en N,N-dimetilformamida (DMF), en presencia de PyBOP/HOBt/DIEA (1,5:1,5:3,5 eq.). La base se añadió en porciones durante 1 h. La conversión del péptido lineal en la forma cíclica se monitorizó mediante HPLC analítica, y se terminó después de 2,5

h. La mezcla de reacción se llevó a sequedad, y el residuo se trituró y se lavó con éter dietílico enfriado en hielo, para eliminar trazas de DMF antes de la escisión de TFA.

d) Escisión de los grupos protectores de la cadena lateral.

Los grupos protectores de la cadena lateral lábiles a ácidos se eliminaron disolviendo el péptido cíclico en 10 ml de TFA/triisopropilsilano (TISH)/H2O (90:5:5) enfriado en hielo. Después de agitar 2 h, el TFA se eliminó a presión reducida, el residuo oleoso se diluyó con una pequeña cantidad de MeOH, y el producto bruto precipitó con éter dietílico enfriado en hielo. El precipitado se recogió mediante centrifugación, se lavó varias veces con éter enfriado en hielo, y finalmente se liofilizó en agua. El glucopéptido bruto, que, además de la forma triacetilada, según LC-MS estaba contaminado con los derivados di-y monoacetilo, se suspendió en MeOH y se trató en porciones con NaOMe durante 30 min. hasta que se alcanzó un pH aparente de > 10. La reacción se monitorizó mediante HPLC, y después de 3,5 h se paralizó por adición de ácido acético glacial hasta pH < 5. La mezcla se llevó a sequedad, y el sólido se suspendió en MeOH y se volvió a precipitar con éter dietílico enfriado con hielo. El precipitado se recogió por filtración y se liofilizó en agua. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa, y el glucopéptido cíclico se aisló como material liofilizado; rendimiento: 20% de rendimiento (basado en la carga de resina de partida de 0,13 mmoles); HPLC: > 95 % (tR 7,37 min. con gradiente 2); ESI-MS: m/z = 1642,8 [M+H]+; M = 1641,8 Da calculado para C71H108N20O25.

Acoplamiento del CDE[126-137] a Fc RIIb para producir FcyRIIb-CDE[126-137].

Se añadieron 100 !l de FcyRIIb soluble humano (10,6 mg/ml) a 1490 !l de borato 50 mM pH 10 y 410 !l del glucopéptido CDE[126-137] (2 mg/ml), y se agitó suavemente a temperatura ambiente. Se añadieron lentamente 100 !l de una disolución de glutaraldehído al 0,3%, y toda la mezcla se agitó durante otras dos horas a RT antes de añadir 100 !l de glicina 1 M. El FcyRIIb-CDE[126-137] resultante se agitó durante otros 30 min., y después se dializó frente a PBS, y se concentró.

Ejemplo 2

Inmunización con FcyIIb-CDE[126-137]

Un ratón C57B1/6 hembra de seis semanas se inmunizó intraperitonealmente cada dos semanas con una emulsión de 50 !g de FcyRIIb-CDE[126-137] en 100 !l de adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma/Deisenhofen, Alemania) durante tres veces. Tres semanas después de la última inmunización, el ratón se revacunó con 50 !g del FcyRIIb-CDE[126-137]. Tres días más tarde, se retiró el bazo del animal y se llevó a cabo la infusión de las células extraídas con células de mieloma según Bazin y Lemieux, 1989.

Ejemplo 3

Identificación del hibridoma para la especificidad por FcyRIIb-CDE[126-137]

Se aislaron los clones que fueron capaces de crecer en presencia de hipoxantina, aminopterina, y timidina, y su sobrenadante se ensayó en ensayos de ELISA, en los que FcyRIIb-CDE[126-137] se revistió previamente en la placa de microtitulación con 120 ng de sFcyRIIa/b por pocillo (en 100 !l de PBS, 20ºC, 12 h). La placa se lavó y se incubó con PBS/T (PBS/0,2% de Tween 20, 30 min.). A cada pocillo se añadieron 100 !l del hibridoma respectivo (100 !l, 90 min.). La placa se lavó tres veces con tampón de bloqueo antes de que se añadiesen 100 !l de un anticuerpo de cabra anti-IgG + IgM de ratón marcado con peroxidasa (Dianova, Hamburgo, Alemania), diluido en PBS/T. Después de incubar durante 90 min. y lavar posteriormente con PBS/T, se aplicaron a los pocillos 100 !l de tampón de sustrato (tampón de citrato/fosfato 0,2 M pH 5,2, 4 mg/ml de o-fenilendiamina, 0,024% (v/v) de peróxido de hidrógeno. La reacción se detuvo añadiendo 50 !l de ácido sulfúrico 8 N, y la absorbancia se midió a 490 nm en un lector de ELISA.

Los clones que fueron positivos en este ensayo se ensayaron mediante citometría de flujo (FACTS) usando 105 células Raji por muestra (ATCC CCL-86), que expresan enormemente FcyRIIb humano. Tras incubar con 100 !l de sobrenadante de hibridoma durante 30 min. en hielo, las células se lavaron con 1 ml de RPMI/10% de FCS, y se precipitaron mediante centrifugación (400 x g, 4ºC, 5 min.). SE añadieron 100 !l de anticuerpo anti-humano de cabra marcado con FITC (Dianova, Hamburgo/Alemania). Tras incubar durante 30 min. en hielo, las células se lavaron (RPMI/10% de FCS) y se sometieron a citometría de flujo (FACSort, Becton Dickinson, Heidelberg/Alemania). Para cada muestra, se determinó el valor de la mediana de la fluorescencia para 5.000 células contadas. Los sobrenadantes de hibridoma que fueron positivos en este ensayo se sometieron a un ensayo similar usando células U-937 (ATCC CRL-1593.2), que expresan enormemente FcyRIIa, para determinar la especificidad del hibridoma por FcyRIIb. Como control positivo para ambas estirpes celulares, se usó el pan-FcyRII-mAb AT10 (Greenman et al., 1991).

Ejemplo 4

Inmunización de ratones SJL con un anticuerpo anti-Fc RII de ratón específico

Se inmunizaron ratones SJL con 200 !g de MOG para inducir encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en un modelo de animal establecido de esclerosis múltiple. El tratamiento profiláctico así como terapéutico (datos no mostrados) de 8 ratones por grupo con un anticuerpo específico anti-FcyRII de ratón (50 !g/semana) reduce significativamente los síntomas (puntuación clínica) de la enfermedad (0 = sano, 1 = ligera parálisis, 2 = parálisis media, 3 = fuerte parálisis, 4 = parálisis completa, 5 = muerte). Los resultados se muestran en la Figura 8.

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Sondermann P, Huber R, Oosthuizén V, Jacob U. (2000), The 3.2A crystal structure of the hurnan IgG1 Fc fragment-FcyRlll complex. Nature 406, 267-273.

Sondermann P, Kaiser J, Jacob U. (2001), Molecular basis for immune complex recognition: a comparison of 15 Fc-receptor structures. J Mol Biol. 309, 737-749.

van de Winkel, J.G.J. y Capet, P.J.A. (1993), Human IgG Fe receptor heterogeneity: Molecular aspects and clinicat implications, Immunol. Today 14, 215-221.

Yang, Z., Delgado, R., Xu, L., Todd, R.F., Nabel, E.G., Sanchez, A., Nabel, G.J. (1998), Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycol)" roteins, Science 279, 983-984.

20 Zhou, M.-J., Todd, R.F., van de Winkel, J.G.J., Petty, H.R. (1993), Cocapping of the leukoadhesin molecules complement receptor type 3 and lymphocyte function-associated antigen-1 with FcyRIII on human neutrophils. Possible rote of lectin-like interactions, J. Immunol. 150, 3030-3041.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Max Planck Gesellschaft zur.Fôrderung der Wissensc

<120> Sustancia que se une al receptor humano IIb mediante Fc de IgG

<130> 30287P-EP 5 <140>

<141>

<160> 11

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 10 <211> 172

<212> PRT

<213> Humano

<400> 1

15 <210> 2

<211> 172

<212> PRT

<213> Humano

<400> 2

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Humano

<400> 3

10 <210> 4

<211> 312

<212> ADN

<213> hibridoma

<220> 15 <221> CDS

<222> (1)..(312)

<400> 4

<210> 5

<211> 104

<212> PRT

<213> hibridoma

<400> 5

<210>: 6 10 <211> 312

<212> ADN

<213> hibridoma

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(312)

<400> 6

<210>: 7 10 <211> 104

<212> PRT

<213> hibridoma

<400> 7

<210> 8

<211> 331

<212> ADN

<213> hibridoma

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(330)

<400>

<210> 9

<211> 110

<212> PRT

<213> hibridoma

<400> 9

<210> 10

<211> 343

<212> ADN <213>.hibridoma

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(342)

<400> 10

<212> PRT

<213> hibridoma

<400> 11

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a FcyRIIb humano en el entorno natural del receptor de Fc a través de su región variable, y que se une específicamente a un péptido o polipéptido artificial que comprende un epítopo conformacionalmente discriminador (CDE) que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos.
2.

El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que se une con una afinidad al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 100 veces, más preferiblemente al menos 1.000 veces, más preferiblemente al menos
10.000 veces, más preferiblemente al menos 100.000 veces, más preferiblemente al menos 1.000.000 veces mayor por FcyRIIb que por FcyRIIa.
3.

El anticuerpo o fragmento del mismo de las reivindicaciones 1 ó 2, que no interfiere con la unión del complejo inmunitario a FcyRIIb.
4.

El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es capaz de activar la función fisiológica de FcyRIIb humano.
5.

El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es capaz de reticular específicamente FcyRIIb humano.
6.

El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que aparece en un estado monómero o multímero.
7.

El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es de la clase IgG, IgE, IgM o IgA.
8.

El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se selecciona de anticuerpos monocatenarios, anticuerpos bifuncionales y anticuerpos trifuncionales, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, fragmentos Fv y fragmentos scv.
9.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10.

Un vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9.
11.

Una célula hospedante transfectada con un vector según la reivindicación 10.
12.

Uso de un péptido que comprende un CDE de FcyRIIb, que contiene los aminoácidos 27 a 30 de FcyRIIb según SEC ID NO. 2, y que tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos, para identificar librerías moleculares para moléculas de unión o librerías genéticamente codificadas para encontrar sustancias que se unen específicamente a FcyRIIb.
13.

Uso según la reivindicación 12, en el que las librerías comprenden péptidos, moléculas orgánicas, peptidomiméticos, o dominios variables de anticuerpos.
14.

Uso según la reivindicación 12, para identificar librerías de moléculas que se unen específicamente a FcyRIIb en células humanas.
15.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido se estabiliza estructuralmente mediante circularización.
16.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido comprende aminoácidos artificiales o/y glucosilados.
17.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el péptido está conjugado a una molécula portadora.
18.

Un método para producir un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende inmunizar animales o animales transgénicos con un péptido o polipéptido artificial en su conformación nativa, en el que el péptido o polipéptido comprende un CDE que comprende los aminoácidos 27-30 de la secuencia de aminoácidos de FcyRIIb según SEC ID NO. 2, en el que el péptido o polipéptido artificial tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos, y en el que el CDE está estandarizado estructuralmente mediante circularización.
19.

El método según la reivindicación 18, en el que el péptido o polipéptido comprende aminoácidos artificiales o/y glucosilados.
20.

El método según la reivindicación 18 ó 19, en el que el péptido o polipéptido está conjugado a una molécula portadora.
21.

Una composición farmacéutica y/o de diagnóstico útil para el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades asociadas con la señalización mediada por el receptor de Fc, en particular artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, psoriasis o lupus eritematoso, que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y sustancias portadoras farmacéuticamente aceptables.
22.

Un kit de diagnóstico para la detección de enfermedades autoinmunitarias y/o cáncer, que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
23.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de inhibidores o activadores de la interacción FcyRIIb/IgG.
24.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, púrpura trombocitopénica inmunitaria, o esclerosis múltiple.
25.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de cáncer, en particular linfomas o leucemias.
26.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de un adyuvante con otros compuestos bioterapéuticos para el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer.
27.

Uso de la reivindicación 26, en el que los otros compuestos terapéuticos se seleccionan del grupo que comprende los anticuerpos Herceptin®, Rituxan®, IC14, PANOREX™, IMC-225, VITAXIN™, Campath 1H/LDP-03, LYMPHOCIDE™ y ZEVLIN™, y anticuerpos que se unen a los siguientes antígenos de cáncer: MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa, p15, beta-catenina, MUM-1, CDK-4, HER- 2/neu, papilomavirus E6 humano, papilomavirus E7 humano y MUC-1.
28.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias.
29.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades asociadas con células dendríticas y/o macrófagos activados.
30.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedad de hospedante frente a injerto.
31.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades relacionadas con amiloides.
32.

Uso del anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de una composición farmacéutica para incrementar el efecto de la vacunación.
33.

Anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se modifica en el fragmento de Fc mediante la modificación de la glucosilación y/o mutagénesis para potenciar la unión hacia subconjuntos de los receptores de Fc.