CN103124740A - 抗-ssx-2 t细胞受体和相关材料及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离或纯化的T细胞受体(TCR)，所述受体具有针对滑膜肉瘤X断裂点(SSX)-2的抗原特异性。本发明还提供相关的多肽和蛋白，以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群。本发明还提供与本发明的TCR相关的抗体或其抗原结合部分和药物组合物。本发明还提供检测癌症在宿主中存在的方法和治疗或预防宿主的癌症的方法。

Description

抗-SSX-2 T细胞受体和相关材料及使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2010年9月21日提交的美国临时专利申请No.61/384,931的利益，所述申请通过引用结合。
电子递交的结合引用材料
通过引用完整地结合于此的是与此同时递交并且确定为以下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：一个41,480字节的ASCII(文本)文件，文件名：″708841ST25.TXT″，日期：2011年8月22日。
发明背景
过继细胞疗法(ACT)涉及将反应性T细胞转移到患者中，包括将肿瘤反应性T细胞转移到癌症患者中。过继细胞疗法已经成功地导致某些癌症中的肿瘤例如黑色素瘤消退。广泛应用过继细胞疗法的一个障碍是难以产生具有抗肿瘤潜能的人T细胞。成功应用过继细胞疗法的另一障碍在于转移的T细胞对于正常，即，非癌组织也可能是有毒性的。因此，需要改进的免疫学组合物和方法以用于治疗癌症。
发明内容
本发明提供分离或纯化的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体具有针对滑膜肉瘤X断裂点(SSX)-2(SEQ ID NO：1)的抗原特异性。所述TCR可以包含如本文所述的特定氨基酸序列。例如，本发明的TCR可以包含SEQ ID NO：13-18，SEQ ID NO：19和20，SEQ ID NO：23和24，或者SEQ ID NO：25和26中任意一个或多个的氨基酸序列。
本发明还提供相关多肽和蛋白，以及相关核酸，重组表达载体，宿主细胞，和细胞群。本发明还提供与本发明的TCR相关的抗体或者其抗原结合部分以及药物组合物。
本发明还提供检测癌症在宿主中存在的方法和治疗或预防宿主中的癌症的方法。本发明的检测癌症在宿主中存在的方法包括(i)将包含癌症细胞的样品与本文所述的本发明的TCR、多肽、蛋白、核酸，重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群或者抗体或其抗原结合部分接触，由此形成复合物，和(ii)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示宿主中存在癌症。
本发明的治疗或预防宿主的癌症的方法包括以对于治疗或预防宿主的癌症有效的量向宿主施用任何本文所述的TCR、多肽或者蛋白，包含编码任何本文所述的TCR、多肽、蛋白的核苷酸序列的任何核酸或者重组表达载体，或者包含编码任何本文所述的TCR、多肽或者蛋白的重组载体的任何宿主细胞或宿主细胞群。
附图简述
图1A是条线图，其显示在将SSX-2TCR-转导的外周血白细胞(PBL)与来自人供体的T2细胞共培养后测量的干扰素-γ(IFN-γ)水平，其中用不同浓度的SSX-2：41-49(KASEKIFYV)(SEQ ID NO：2)肽对T2细胞进行脉冲。
图1B是条线图，其显示测量的IFN-γ水平，如在图1A中，不同之处在于T2细胞来自不同的人供体。
图2是条线图，其显示当将SSX-2TCR-转导的PBL与表达SSX-2基因的293-A2和COS7-A2细胞以及用SSX-2：41-49肽进行脉冲的T2细胞共培养时测量的IFN-γ水平。
图3是条线图，其显示当将SSX-2TCR-转导的PBL(阴影条)或者未被转导的(UT)PBL(无阴影条)与多种肿瘤细胞系共培养时测量所得的IFN-γ水平。
图4A是条线图，其显示在将来自人供体的PBL(其转导有SSX-2TCR(阴影条)或者是未被转导的(UT)(无阴影条))与多种肿瘤细胞共培养后的IFN-γ水平。
图4B是条线图，其显示IFN-γ水平，如在图4A中，不同之处在于PBL来自不同的人供体。
图5是线图，其显示利用SSX-2TCR转导的PBL和肽脉冲的T2细胞进行的共培养测定的结果。用于脉冲的肽有：SSX-1(KYSEKISYV，SEQ IDNO：32)(-◆-)；SSX-2(KASEKIFYV，SEQ ID NO：2)(■)；SSX-3(KVSEKIVYV，SEQ ID NO：8)(▲)；SSX-4(KSSEKIVYV，SEQ ID NO：9)(X)；SSX-5(KASEKIIYV，SEQ ID NO：10)(*)；SSX-6(KFSEKISCV，SEQ ID NO：33)(●)；SSX-7(KSLEKISYV，SEQ ID NO：34)(|)；SSX-8KYSEKISYV，SEQ ID NO：32)(-)；SSX-9(KSSEKIIYV，SEQ ID NO：11)(-)；和SSX-10(KASEKILYV，SEQ ID NO：12)(--◆--)。
图6A和6B是条线图，其显示来自供体1(A)或者供体2(B)的未被转导的(UT)或者转导有SSX-2TCR(“SSX-WT”)、密码子优化的SSX-2TCR(“SSX-CO op”)或者密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR(“SSX-MCR”)的PBL的增殖(以每分钟[3H]-胸腺嘧啶引入计数(CPM)为单位)。
图7A-D是这样的图，其显示：当以指定的效应物比靶标(E∶T)比率与未被转导的(◆)或者转导有SSX-2TCR(■)、密码子优化的SSX-2TCR(▲)或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR(X)的PBL共培养时，938mel(HLA-A2-/SSX-2+)(A)、COS-A2(B)、938-A2mel(C)、COS-A2-SSX-2(D)的百分比溶胞。
图8A-D是线图，其显示：当以指定的效应物比靶标(E∶T)比率与未被转导的(◆)或者转导有SSX-2TCR(■)、密码子优化的SSX-2TCR(▲)或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR(X)的PBL共培养时，624mel(A)、1300mel(B)、SK mel37(C)或者888mel(D)的百分比溶胞。
图9A-9E是条线图，其显示未被转导的或者转导有SSX-2TCR(“SSX-TCR-WT”)、密码子优化的SSX-2TCR（“SSX-TCR-密码子优化-PBL”)或者密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR(“SSX-2-TCR小鼠恒定区-PBL”)的PBL的增殖(以每分钟[3H]-胸腺嘧啶引入计数(CPM)为单位)。
图10是条线图，其显示在将转导有SSX-2TCR(“SSX2-WT”)(灰条)、密码子优化的SSX-2TCR(“SSX2-Co Op”)(无阴影条)或者密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR(“SSX2-MCR”)(黑条)的PBL与来自人供体的T2细胞共培养后测量的IFN-γ水平，其中用变化浓度的SSX-2：41-49肽对T2细胞进行脉冲。
图11是条线图，其显示在将来自人供体的、转导有SSX-2TCR(无阴影条)或者未被转导的(UT)(阴影条)PBL与多种原发性黑色素瘤细胞共培养后的IFN-γ水平。
图12是条线图，其显示在将来自人供体的、转导有SSX-2TCR的PBL与mel1300细胞在不存在(灰条)或者存在(0.1μM(无阴影条)或者1.0μM(黑条))的去甲基化剂，5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)的情况下共培养后的IFN-γ水平。NM是没有药物的正常培养基对照。
发明详述
本发明提供分离的或者纯化的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体具有针对滑膜肉瘤X断裂点(SSX)-2(也被称为HOM-MEL-40)的抗原特异性。SSX-2是SSX家族的成员，SSX家族具有十个高度同源的核蛋白，还包括SSX-1、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-6、SSX-7、SSX-8、SSX-9和SSX-10。SSX蛋白是癌睾丸抗原(cancer testis antigen，CTA)，其仅表达在肿瘤细胞和睾丸的不表达MHC的生殖细胞中。SSX-2表达于多种人癌症中，包括但不限于：黑色素瘤、头部癌症、颈部癌症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、肝细胞和结肠癌。SSX-2蛋白可以包含SEQ ID NO：1，由SEQ ID NO：1组成，或基本由SEQ ID NO：1组成。
当在本文中使用时，短语″抗原特异性″是指TCR可以以高的亲合力特异性结合并免疫识别SSX-2。例如，如果表达TCR的T细胞在与低浓度的HLA-A2限制性SSX-2(例如，约0.01ng/ml至约1ng/ml，0.01ng/ml、0.1ng/ml或者1ng/ml)共培养后分泌至少约200pg/ml以上(例如，200pg/ml以上，300pg/ml以上，400pg/ml以上，500pg/ml以上，600pg/ml以上，700pg/ml以上)的IFN-γ，则可以认为所述TCR具有针对SSX-2的“抗原特异性”。本发明的TCR也可以在与更高浓度的SSX-2共培养后分泌IFN-γ。
本发明的一个实施方案包括分离或纯化的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体具有针对滑膜肉瘤X断裂点(SSX)-2或者SSX-2和以下任意一个或多个的抗原反应性：SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10。
TCR可以具有针对任何SSX-2蛋白、多肽或者肽的抗原特异性。在本发明的一个实施方案中，TCR具有针对SSX-2蛋白的抗原特异性，所述SSX-2蛋白包含SEQ ID NO：1，由SEQ ID NO：1组成，或基本由SEQID NO：1组成。在本发明的优选实施方案中，TCR具有针对SSX-2肽的抗原特异性，SSX-2肽包含KASEKIFYV(SEQ ID NO：2)，由KASEKIFYV(SEQ ID NO：2)组成，或基本由KASEKIFYV(SEQ ID NO：2)组成。
在本发明的TCR具有针对SSX-2的抗原特异性的同时，本发明的TCR也可以识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个。即，本发明的TCR可以结合并且免疫识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个，但是与针对与SSX-2的结合所观察到的相比亲合力较低，以致TCR与这些蛋白中的一个以更高(相比于用SSX-2引发免疫应答所需的浓度)浓度结合引发免疫应答。例如，如果表达TCR的T细胞在与低浓度的SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个(例如，约0.01ng/ml至约1ng/ml，0.01ng/ml，0.1ng/ml，或者1ng/ml)共培养后不分泌至少约200pg/ml(例如，分泌少于200pg/ml，少于100pg/ml)的IFN-γ，而是在与更高浓度的SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个(例如，约10ng/ml至约100ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，或者100ng/ml)共培养后确实分泌至少约200pg/ml以上(例如，200pg/ml以上，300pg/ml以上，400pg/ml以上，500pg/ml以上，600pg/ml以上，700pg/ml以上)，则可以认为本发明的TCR以低的亲合力识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个。
TCR可以识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和/或SSX-10蛋白、多肽或肽。在本发明的一个实施方案中，TCR识别这样的蛋白，所述蛋白包含以下、由以下组成、或基本由以下组成：SEQ ID NO：3(SSX-3)，SEQ IDNO：4(SSX-4)，SEQ ID NO：5(SSX-5)，SEQ ID NO：6(SSX-9)，和/或SEQID NO：7(SSX-10)。在本发明的优选实施方案中，TCR识别这样的肽，所述肽包含以下、由以下组成、或基本由以下组成：SSX-3肽KVSEKIVYV(SEQ ID NO：8)，SSX-4肽KSSEKIVYV(SEQ ID NO：9)，SSX-5肽KASEKIIYV(SEQ ID NO：10)，SSX-9肽KSSEKIIYV(SEQ IDNO：11)，和/或SSX-10肽KASEKILYV(SEQ ID NO：12)。
本发明的TCR能够以依赖于HLA-A2的方式识别SSX-2、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和/或SSX-10(下文中，“SSX癌症抗原”)。当在本文中使用时，″依赖HLA-A2的方式″是指TCR在存在HLA-A2分子的情况下在与SSX癌症抗原结合后引发免疫应答。
此外，不受任何特定理论的限制，本发明的TCR能够以不依赖CD8-和/或CD4的方式识别SSX癌症抗原。″不依赖CD8-和/或CD4的方式″是指本发明的TCR在不存在表达于表达本发明的TCR的细胞上的CD8或CD4分子或CD8和CD4分子两者，或是在不存在功能性CD8或CD4分子或两者，在与SSX癌症抗原结合后，可以引发免疫应答。与常规TCR不同，本发明的TCR不偏好CD8或者CD4并且可以在CD8或者CD4分子存在下发挥功能。
本发明的TCR提供包括当用于过继细胞转移时的许多优势。例如，不受限于特定理论，据信因为SSX-2、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和/或SSX-10被多种癌症类型的细胞表达，所以本发明的TCR有利地提供摧毁多种类型的癌症细胞并且因此治疗或者预防多种类型的癌症的能力。此外，不受限于特定理论，据信因为SSX蛋白是仅表达在肿瘤细胞和睾丸的不表达MHC的生殖细胞中的癌睾丸抗原，所以本发明的TCR有利地靶向癌症细胞的破坏同时最小化或者排除正常、非癌细胞的破坏，由此减小，例如最小化或者消除毒性。此外，在本发明的TCR具有针对SSX-2的抗原特异性的同时，本发明的TCR还有利地识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个。不受限于特定理论，据信识别多个癌症抗原的能力有利地增加可以被本发明的TCR破坏的癌细胞的数量。此外，即使SSX抗原变成突变的，本发明的TCR仍然可以是可效的，因为它们识别超过一个抗原。
本发明提供TCR，所述TCR包含两个多肽(即，多肽链)，如TCR的α链，TCR的β链，TCR的γ链，TCR的δ链，或它们的组合。这样的TCR的多肽链是本领域中已知的。本发明的TCR的多肽可以包含任何氨基酸序列，条件是TCR具有针对SSX-2的抗原特异性和/或识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个。
在本发明的一个实施方案中，TCR包含两个多肽链，其中每个包含可变区，所述可变区包含TCR的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3。优选地，第一多肽链包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列(α链的CDR1)，所述CDR2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列(α链的CDR2)，和所述CDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列(α链的CDR3)；并且第二多肽链包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列(β链的CDR1)，所述CDR2包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列(β链的CDR2)和所述CDR3包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列(β链的CDR3)。在这点上，本发明的TCR可以包含选自由SEQID NO：13-15、16-18和13-18中的任意一个或多个组成的组的氨基酸序列。优选地，TCR包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。
备选地或者此外，TCR可以包含TCR的可变区的氨基酸序列，其包含如上所述的CDR。在这点上，TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：19(α链的可变区)或20(β链的可变区)，SEQ ID NO：19和20两者，SEQ ID NO：35(α链的可变区的一部分)或36(β链的可变区的一部分)，或SEQ ID NO：35和36两者。优选地，本发明的TCR包含SEQ ID NO：19和20的氨基酸序列。
备选地或者此外，TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的TCR的α链和β链中的每个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，α链包含如上所述的α链的可变区。在这点上，本发明的TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：23。该类型的本发明的TCR可以与任何TCR的β链配对。优选地，本发明的TCR的β链包含如上所述的β链的可变区。在这点上，本发明的TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：24。本发明的TCR，因此，可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：23或者24，或者SEQ ID NO：23和24两者。优选地，本发明的TCR包含氨基酸序列SEQ ID NO：23和24。
在本发明的一个实施方案中，TCR可以包含人/小鼠嵌合TCR。在这点上，TCR可以包含小鼠恒定区，所述小鼠恒定区包含SEQ ID NO：21(小鼠α链的恒定区)，SEQ ID NO：22(小鼠β链的恒定区)，或者SEQ ID NO：21和22两者。优选地，TCR包含SEQ ID NO：21和22两者。
备选地或者此外，本发明的人/小鼠嵌合TCR可以包含如上所述的任何CDR。在这点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR可以包含选自由SEQ ID NO：13-15、16-18和13-18组成的组的氨基酸序列。优选地，人/小鼠嵌合TCR包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。
备选地或者此外，人/小鼠嵌合TCR可以包含如上所述的任何可变区。在这点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：19(α链的可变区)或20(β链的可变区)，SEQ ID NO：19和20两者，SEQ IDNO：35(α链的可变区的一部分)或36(β链的可变区的一部分)，或SEQ IDNO：35和36两者。优选地，本发明的TCR包含SEQ ID NO：19和20的氨基酸序列。
备选地或者此外，人/小鼠嵌合TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的人/小鼠嵌合TCR的α链和β链中的每个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，α链包含如上所述的α链的可变区。在这点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：25。该类型的本发明的人/小鼠嵌合TCR可以与任何TCR的β链配对。优选地，本发明的人/小鼠嵌合TCR的β链包含如上所述的β链的可变区。在这点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：26。本发明的人/小鼠嵌合TCR，因此，可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：25或者26，或SEQ ID NO：25和26两者。优选地，本发明的TCR包含氨基酸序列SEQ ID NO：25和26。
本发明还提供分离或纯化的多肽，所述多肽包含任何本文所述的TCR的功能部分。当在本文中使用时，术语″多肽″包括寡肽并且是指通过一个以上的肽键相连的氨基酸的单链。
关于本发明的多肽，功能部分可以是包含TCR(功能部分是所述TCR的部分)的连续氨基酸的任何部分，条件是功能部分特异性结合SSX-2和/或识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个。当关于TCR使用时，术语″功能部分″是指本发明的TCR的任何部分或片段，所述部分或片段保持TCR(所述部分或片段是所述TCR的部分)(亲本TCR)的生物学活性。功能部分包括，例如，TCR的那些部分，所述那些部分以与亲本TCR相比相似、相同或更高的程度保持特异性结合SSX-2和/或识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个(例如，以依赖HLA-A2的方式)，或者检测、治疗或预防癌症的能力。关于亲本TCR，功能部分可以包含，例如，亲本TCR的约10％，25％，30％，50％，68％，80％，90％，95％以上。
所述功能部分可以包含位于所述部分的氨基或羧基端或者两端的额外的氨基酸，所述额外的氨基酸未在亲本TCR的氨基酸序列中发现。理想地，所述额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，特异性结合SSX-2；识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个；具有检测癌症、治疗或预防癌症等的能力。更理想的是，与亲本TCR的生物学活性相比，所述额外的氨基酸增强生物学活性。
多肽可以包含本发明的TCR的α和β链中任一或两者的功能部分，如包含本发明的TCR的α链和/或β链的可变区的CDR1、CDR2和CDR3中的一个或多个的功能部分。在这点上，多肽可以包含这样的功能部分，所述功能部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：13(α链的CDR1)，14(α链的CDR2)，15(α链的CDR3)，16(β链的CDR1)，17(β链的CDR2)，18(β链的CDR3)，或它们的组合。优选地，本发明的多肽包含这样的功能部分，所述功能部分包含SEQ ID NO：13-15、16-18或所有SEQ ID NO：13-18。更优选地，多肽包含这样的功能部分，所述功能部分包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。
备选地或者此外，本发明的多肽可以包含，例如，包含如上所述的CDR区的组合的本发明的TCR的可变区。在这点上，多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：19(α链的可变区)，20(β链的可变区)，SEQ ID NO：19和20两者，SEQ ID NO：35(α链的可变区的一部分)或36(β链的可变区的一部分)，或SEQ ID NO：35和36两者。优选地，多肽包含氨基酸序列SEQID NO：19、SEQ ID NO：20或氨基酸序列SEQ ID NO：19和20两者。
备选地或者此外，本发明的多肽可以包含本文所述的一个TCR的α或者β链的全长。在这点上，本发明的多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：23、24、25或26。备选地，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR的α和β链。例如，本发明的多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：23和24两者或SEQ ID NO：25和26两者的序列。
本发明还提供分离或纯化的蛋白，所述蛋白包含至少一个本文所述的多肽。″蛋白″是指包含一个以上多肽链的分子。
本发明的蛋白可以包含第一多肽链，所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：19或35；和第二多肽链，所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQID NO：20或36。本发明的蛋白可以，例如，包含第一多肽链，所述第一多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：23或25；和第二多肽链，所述第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO：24或26。在此情况中，本发明的蛋白可以是TCR。备选地，如果，例如，蛋白包含单个多肽链，所述单个多肽链包含SEQ ID NO：23或25和SEQ ID NO：24或26，或者如果蛋白的第一和/或第二多肽链还包含其他氨基酸序列，例如，编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白可以是融合蛋白。在这点上，本发明还提供这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一个本文所述的本发明的多肽以及至少一个其他多肽。其他多肽可以作为融合蛋白的分开的多肽存在，或者可以作为这样的多肽存在，所述多肽与一个本文所述的本发明的多肽一起框内表达(一前一后地)。所述其他多肽可以编码任何肽分子或者蛋白分子，或其部分，包括但不限于免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子，例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等。
融合蛋白可以包含本发明的多肽的一个或多个拷贝和/或其他多肽的一个或多个拷贝。例如，融合蛋白可以包含本发明的多肽的和/或其他多肽的1、2、3、4、5个以上的拷贝。制备融合蛋白的合适方法是本领域中已知的，并且包括例如重组方法。见，例如，Choi等，Mol.Biotechnol.31：193-202(2005)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR、多肽和蛋白可以表达为包含连接α链和β链的接头肽的单个蛋白。在这点上，本发明的TCR、多肽和蛋白还可以包含接头肽，所述接头肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：37。在本发明的一个实施方案中，接头肽可以由包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列编码。接头肽可以有利地促进重组TCR、多肽和/或蛋白在宿主细胞中的表达。在通过宿主细胞表达包含接头肽的构建体后，可以切除接头肽，这导致分开的α和β链。
本发明的蛋白可以是包含至少一个本文所述的本发明的多肽的重组抗体。当在本文中使用时，″重组抗体″是指重组(例如，遗传改造的)蛋白，所述重组蛋白包含至少一个本发明的多肽和抗体或其部分的多肽链。抗体或其部分的多肽可以是抗体的重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区、单链可变片段(scFv)或者Fc、Fab或F(ab)2′片段等。抗体或其部分的多肽链可以作为重组抗体的分开的多肽存在。备选地，抗体或其部分的多肽链可以作为这样的多肽存在，所述多肽与本发明的多肽一起框内表达(一前一后地)。抗体或其部分的多肽可以是任何抗体或任何抗体片段的多肽，所述任何抗体或任何抗体片段包括本文所述的任何抗体和抗体片段。
本发明的范围包括本文所述的本发明的TCR、多肽和蛋白的功能变体。当在本文中使用时，术语″功能变体″是指与亲本TCR、多肽或蛋白具有基本或显著序列同一性或者相似性的TCR、多肽或蛋白，所述功能变体保持所述功能变体作为变体的TCR、多肽或蛋白的生物学活性。功能变体包括，例如，本文所述的TCR、多肽或蛋白(亲本TCR、多肽或蛋白)的那些变体，与亲本TCR、多肽或蛋白相比，所述变体以相似、相同或更高的程度保持特异性结合的SSX-2的能力，所述亲本TCR对SSX-2具有抗原特异性或所述亲本多肽或者蛋白特异性结合SSX-2。备选地或者此外，功能变体也可以包括，例如，本文所述的TCR、多肽或蛋白(亲本TCR、多肽或蛋白)的那些变体，与亲本TCR、多肽或蛋白相比，所述变体以相似、相同或更高的程度保持识别为亲本多肽或者蛋白所识别的SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个的能力。关于亲本TCR、多肽或蛋白，功能变体可以，例如，在氨基酸序列上与亲本TCR、多肽或蛋白具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。
功能变体可以，例如，包括具有至少一个保守氨基酸取代的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中一个具有特定物理和/或化学性质的氨基酸被交换为另一个具有相同化学或物理性质的氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是一个酸性氨基酸被取代为另一个酸性氨基酸(例如，Asp或者Glu)，一个具有非极性侧链的氨基酸被取代为另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，一个碱性氨基酸被取代为另一个碱性氨基酸(Lys、Arg等)，一个具有极性测量的氨基酸被取代为另一个具有极性测量的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。
备选地或者此外，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。在此情况中，对于非保守氨基酸取代优选的是不干扰或者抑制功能变体的生物学活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能变体生物学活性，以致与亲本TCR、多肽或蛋白相比，功能变体的生物学活性提高。
TCR、多肽或蛋白可以基本上由本文所述的一个或多个特定氨基酸序列组成，以致功能变体的其他组分，例如，其他氨基酸，不实质改变功能变体的生物学活性。在这点上，本发明的TCR、多肽或蛋白可以，例如，基本由以下组成：氨基酸序列SEQ ID NO：23、24、25、26、SEQ ID NO：23和24两者，或SEQ ID NO：25和26两者。同样，例如，本发明的TCR、多肽或蛋白可以基本由以下组成：氨基酸序列SEQ ID NO：19、20、21、22、35、36、SEQ ID NO：19和20两者、SEQ ID NO：21和22两者或者SEQ ID NO：35和36两者。此外，本发明的TCR、多肽或蛋白可以基本由以下组成：氨基酸序列SEQ ID NO：13(α链的CDR1)、14(α链的CDR2)、15(α链的CDR3)、16(β链的CDR1)、17(β链的CDR2)、18(β链的CDR3)或者它们的任何组合，例如，SEQ ID NO：13-15、16-18或者13-18。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以具有任何长度，即，可以包含任何数量的氨基酸，条件是TCR、多肽或蛋白(或其功能部分或功能变体)保持其生物学活性，例如，保持以下能力：特异性结合SSX-2；识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个；检测宿主中的癌症；或者治疗或预防宿主的癌症等。例如，多肽的长度可以是50至5000个氨基酸，如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。在这点上，本发明的多肽也包括寡肽。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以包含代替一个或多个天然氨基酸的合成的氨基酸。这样的合成氨基酸在本领域中是已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反-3-和反-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸，和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫键环化，或者转化为酸加成盐和/或任选地二聚或多聚，或者缀合。
当本发明的TCR、多肽和蛋白(包括功能部分和功能变体)以盐的形式时，优选地，多肽以药用盐的形式。合适的药用酸加成盐包括来源于无机酸和有机酸的那些，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，所述有机酸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸例如对甲苯磺酸。
本发明的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域中已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白的合适方法描述于文献中，如Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis(Fmoc固相肽合成)，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2005；Peptide and Protein Drug Analysis(肽和蛋白药物分析)，ed.Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping(表位定位)，ed.Westwood等，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000；和美国专利No.5,449,752。同样，可以使用本文所述的核酸使用标准重组方法重组地生产多肽和蛋白。见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手 册)，3rded.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY2001；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(当前的分子生物学实验 方案)，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons，NY，1994。此外，一些本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以从如以下的来源分离和/或纯化：植物、细菌、昆虫、哺乳动物例如大鼠、人等。分离和纯化的方法是本领域中已知的。备选地，本文所述的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以由公司如Synpep(Dublin，CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg，MD)和Multiple PeptideSystems(San Diego，CA)商业合成。在这点上，本发明的TCR、多肽和蛋白可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
包括在本发明的范围中的是缀合物，例如，生物缀合物，其包含任何本发明的TCR、多肽或蛋白(包括其任何功能部分或变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群或抗体或其抗原结合部分。缀合物，以及通常用于合成缀合物的方法在本领域中是已知的(见，例如，Hudecz，F.，Methods Mol.Biol.298：209-223(2005)和Kirin等，Inorg Chem.44(15)：5405-5415(2005))。
本发明还提供核酸，所述核酸包含编码任何本文所述的TCR、多肽或蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列。
当在本文中使用时，″核酸″包括″多核苷酸″、″寡核苷酸″和″核酸分子″，并且通常表示DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的、合成的或从天然源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸间键合，如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。通常优选的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所述，在一些情况中，对于核酸可能合适的是包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代。
优选地，本发明的核酸是重组体。当在本文中使用时，术语″重组体″是指(i)在活细胞外通过将天然或合成的核酸片段与可以在活细胞中复制的核酸分子连接构建的分子，或者(ii)由以上(i)中所述的那些分子的复制产生的分子。对于本文，复制可以是体外复制或体内复制。
可以基于化学合成和/或酶连反应使用本领域中已知的方法构建核酸。见，例如，Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上。例如，可以使用被设计用来增加分子的生物学稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性的天然核苷酸或不同修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。可以用于生产核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。备选地，本发明的一种或多种核酸可以购买自公司，如Macromolecular Resources(FortCollins，CO)和Synthegen(Houston，TX)。
核酸可以包含编码任何TCR、多肽或蛋白，或其功能部分或者功能变体的任何核苷酸序列。例如，核酸可以包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本由以下组成：SEQ ID NO：27(编码抗-SSX-2TCRα和β链)或者SEQ ID NO：28(编码人/小鼠嵌合抗-SSX-2TCRα和β链)。核苷酸序列备选地可以包含简并为SEQ ID NO：27或者28的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列可以被优化。不受限于特定理论，据信核酸序列的优化增加mRNA转录物的翻译效率。核酸序列的优化可以涉及将天然密码子取代为编码相同氨基酸、但是可以被在细胞内更容易获得的tRNA翻译的另一密码子，因此增加翻译效率。核酸序列的优化也可以减少将干扰翻译的二级mRNA结构，因此增加翻译效率。例如，优化的核酸可以包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本由以下组成：SEQ ID NO：29(编码抗-SSX-2TCRα和β链)或者SEQID NO：30(编码人/小鼠嵌合抗-SSX-2TCRα和β链)。核苷酸序列备选地可以包含简并为SEQ ID NO：29或者30的核苷酸序列。
本发明还提供分离或纯化的核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选地在高度严格条件下杂交。“高度严格条件”是指核苷酸序列以相比于非特异性杂交的可检测地更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性地杂交。高度严格条件包括将区别具有正确互补序列的多核苷酸的条件，或者仅包含少量分散错配的条件，所述错配来自正好具有少量匹配所述核苷酸序列的小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列。这样的互补性小区域比14-17个以上碱基的全长补体更容易解链，并且高度严格杂交使得它们可以容易地区分。相对的高度严格条件包括，例如，低盐和/或高温条件，如由约0.02-0.1M NaCl或等价物，在约50-70℃的温度提供的。这样的高度严格条件几乎不允许(即使有)核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且尤其适于检测任何本发明的TCR的表达。通常被理解的是，可以通过添加增加量的甲酰胺使得条件更严格。
本发明的核酸可以引入到重组表达载体中。在这点上，本发明提供包含本发明的任何核酸的重组表达载体。当用于本文时，术语″重组表达载体″表示遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当所述构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且将载体在足以使mRNA、蛋白、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体允许宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体整体上不是天然存在的。然而，所述载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以包含天然存在、非天然存在或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在、非天然存在的核苷酸间键合，或上述两种类型的键合。优选地，非天然或改变的核苷酸或核苷酸间键合不妨碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括那些载体，所述载体被设计成用于增殖和扩大或表达或两者，如质粒和病毒。载体可以选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences)，pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)，pET系列(Novagen，Madison，WI)，pGEX系列(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10，λGT11，λZapII(Stratagene)，λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01，pBI101.2，pBI101.3，pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl，pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如，反转录病毒载体。
可以使用标准重组DNA技术制备本发明的重组表达载体，所述技术描述于例如，Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上。环形或线形的表达载体的构建体可被制备成包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源自，例如，ColEl、2μ质粒、λ病毒、SV40病毒、牛乳头瘤病毒等。
理想地，重组表达载体包含调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对其中将要引入所述载体的宿主(例如，细菌、真菌、植物或动物)是特异的，适当地并且考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的。
重组表达载体可以包括一种或多种标记物基因，这允许选择转化的或转染的宿主。标记物基因包括杀菌剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的的抗性，在营养缺陷型宿主中的互补以提供原营养，等。适用于本发明的表达载体的标记物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因，潮霉素抗性基因，组胺醇抗性基因，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含天然或者非天然启动子，所述启动子可操作地相连于编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列，或与编码TCR、多肽或蛋白的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。选择例如，强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子属于技术人员的常规技术。类似地，将核苷酸序列与启动子结合也在技术人员的技术内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和发现于鼠干细胞病毒的长末端重复中的启动子。
本发明的重组表达载体可以被设计成用于瞬时表达、稳定表达或两者。同样，重组表达载体可以被制成用于组成型表达或可诱导表达。此外，重组表达载体可以被制成包括自杀基因。
当在本文中使用时，术语″自杀基因″是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是这样的基因，其将对药剂例如药物的敏感性给予表达该基因的细胞，并且当细胞与所述药剂接触或暴露于所述药剂时导致所述细胞死亡。自杀基因是本领域中已知的(见，例如，Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews(自杀基因疗法：方法和综述)，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at theInstitute of Cancer Research，Sutton，Surrey，UK)，Humana Press，2004)，并且包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶激酶(TK)基因，胞嘧啶脱氨酶(daminase)，嘌呤核苷磷酸化酶，和硝基还原酶。
本发明的另一个实施方案还提供包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。当在本文中使用时，术语″宿主细胞″是指可以包含本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接分离自生物例如人的细胞。宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞，即，在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域中已知的并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞，中国仓鼠卵巢细胞，猴VERO细胞，COS细胞，HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞优选是原核细胞，例如，DH5α细胞。为了制备重组TCR、多肽或蛋白，宿主细胞优选是哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞是人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段，但是宿主细胞优选是外周血白细胞(PBL)或者外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞是T细胞。
当用于本文时，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或者来自培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自哺乳动物的T细胞。如果获得自哺乳动物，T细胞可以获得自多个来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。T细胞也可以被浓缩或纯化。优选地，T细胞是人T细胞。更优选地，T细胞是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+双阳性T细胞，CD4+辅助T细胞，例如，Th1和Th2细胞，CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)，肿瘤浸润细胞(TIL)，记忆T细胞，幼稚T细胞等。优选地，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明还提供包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异种群，其包含含有所述任何重组表达载体的宿主细胞，此外还包含至少一种其他细胞，例如，不含有任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或者除T细胞以外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。备选地，细胞群可以是基本同种的群，其中该群主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本尤其组成)。所述群也可以是克隆的细胞群，其中该群的所有细胞都是含有重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以致该群的所有细胞都含有重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是克隆的群，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的重组表达载体。
本发明还提供抗体，或者其抗原结合部分，其特异性结合本文所述的任何TCR的功能部分。优选地，功能部分特异性结合癌症抗原，例如，含有以下氨基酸序列的功能部分：SEQ ID NO：13(α链的CDR1)，14(α链的CDR2)，15(α链的CDR3)，16(β链的CDR1)，17(β链的CDR2)，18(β链的CDR3)，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，或它们的组合，例如，13-15；16-18；13-18；19-20，或35-36。更优选地，功能部分包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。在优选的实施方案中，抗体，或者其抗原结合部分，结合由所有6个CDR(α链的CDR1-3和β链的CDR1-3)形成的表位。抗体可以是本领域中已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任何同种型，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然抗体，例如，分离和/或纯化自哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等的抗体。备选地，抗体可以是遗传改造的抗体，例如，人源化抗体或者嵌合抗体。抗体可以是以单体或多聚体形式。同样，抗体可以具有针对本发明的TCR的功能部分的任何水平的亲和性(affinity)或亲合力(avidity)。理想地，抗体对本发明的TCR的功能部分具有特异性，以致与其他肽或蛋白具有最小的交叉反应。
检测抗体结合本发明的TCR的任何功能部分的能力的方法是本领域中已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，如，例如，放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白印迹法、免疫沉淀和竞争性抑制测定(见，例如，Janeway等，如下，和美国专利申请公布No.2002/0197266A1)。
制备抗体的合适的方法是本领域中已知的。例如，标准杂交瘤方法被描述于，例如，
Figure BDA00002946871600201
和Milstein，Eur.J.Immunol.，5，511-519(1976)，Harlow和Lane(eds.)，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验手册)，CSH Press(1988)，和C.A.Janeway等(eds.)，Immunobiology，5thEd.，GarlandPublishing，New York，NY(2001))。备选地，其他方法，如EBV-杂交瘤法(Haskard和Archer，J.Immunol.Methods，74(2)，361-67(1984)，和Roder等，Methods Enzymol.，121，140-67(1986))，和噬菌体载体表达系统(见，例如，Huse等，Science，246，1275-81(1989))是本领域中已知的。此外，在非人动物中制备抗体的方法被描述于，例如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352，以及美国专利申请公开No.2002/0197266A1)。
此外，噬菌体展示可以用于生产本发明的抗体。在这点上，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术(见，例如，Sambrook等(eds.)，MolecularCloning，Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，3rdEdition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(2001))生产编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于与所需抗原的特异性结合，并且重建包含所选的可变结构域的完全或部分抗体。将编码重建的抗体的核酸序列引入合适的细胞系中，如用于杂交瘤制备的骨髓瘤细胞，以致由所述细胞分泌具有单克隆抗体特性的抗体(见，例如，Janeway等，同上，Huse等，同上，和美国专利6,265,150)。
抗体可以由转有特定的重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备。所述方法是本领域中已知的并且描述于，例如美国专利5,545,806和5,569,825，以及Janeway等，同上。
制备人源化抗体的方法是本领域中已知的，并且详细描述于，例如，Janeway等，同上，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利No.0239400B1，和英国专利No.2188638。也可以使用描述于美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235，959-973(1994)中的抗体表面重建(resurfacing)技术制备人源化抗体。
本发明还提供本文所述任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab、F(ab’)2、dsFv、sFv、双抗体(diabodies)和三抗体(triabodies)。
可以使用常规重组DNA技术(见，例如，Janeway等，同上)制备单链可变区片段(sFv)抗体片段，所述片段由截短的Fab片段组成，其包含经由合成肽与轻抗体链的V结构域相连的抗体重链的可变(V)结构域。类似地，可以通过重组DNA技术(见，例如，Reiter等，Protein Engineering，7，697-704(1994))制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。然而，本发明的抗体片段不限于这些示例类型的抗体片段。
同样，抗体或其抗原结合部分可以被修饰成包含可检测的标记，如，例如，放射性同位素、荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。
本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能部分和功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)，可以是分离的和/或纯化的。当在本文中使用时，术语″分离的″表示已经从其天然环境中移去。当在本文中使用时，术语″纯化的″表示纯度提高，其中″纯度″是相对项，并且没必要解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50％，可以大于60％，70％或80％，90％或者可以是100％。
本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)，所有这些在下文中共同被称作″本发明的TCR材料″，可以被制成组合物，如药物组合物。在这点上，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含任何的TCR、多肽、蛋白、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)和药用载体。包含任何本发明的TCR材料的本发明的药物组合物可以包含超过一种本发明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或者两种以上不同的TCR。备选地，药物组合物可以包含本发明的TCR材料以及其他药物活性试剂或药物，如化疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲胺蝶呤、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。
优选地，载体是药用载体。关于药物组合物，载体可以是任何常规使用的那些载体并且仅受化学-物理考虑，如溶解性和缺少与活性化合物的反应性，和给药路径的限制。本文所述的药用载体，例如，运载体(vehicle)、佐剂、赋形剂和稀释剂对于本领域中的技术人员是已知的，并且公众可以容易地获得。优选地，药用载体是在化学上对活性试剂为惰性的载体和在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分由特定的本发明的TCR材料以及用于给药本发明的TCR材料的特定方法确定。因此，存在多种本发明的药物组合物的合适制剂。以下用于口服给药、气溶胶给药、肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、鞘内给药和腹膜内给药的制剂是示例性的并且决不是限制性的。超过一种路径可以用于给药本发明的TCR材料，并且在某些情况中，特定路径可以提供比另一种路径更快速和更有效的反应。
局部制剂对于本领域技术人员是已知的。在本发明中，这样的制剂尤其适于向皮肤给药。
适于口服给药的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，如溶解在稀释剂如水、盐水或橙汁中的有效量的本发明的TCR材料；(b)胶囊、囊剂、片剂、锭剂(lozenge)和锭剂(troche)，其各自含有预定量的为固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)在合适液体中的混悬剂；和(e)合适的乳状剂。液体制剂可以包括稀释剂，如水和醇，例如，乙醇、苄醇和聚乙烯醇，同时添加或不添加药用表面活性剂。胶囊形式可以是常规的硬壳明胶类型或软壳明胶类型，其含有，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填料，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括以下各项中的一种更多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和其他药用赋形剂。锭剂(lozenge)形式可以包含具有风味的本发明的TCR材料，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶，以及在惰性基质中包含本发明的TCR材料的软锭剂(pastille)，所述惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶，包含除此之外的赋形剂的乳剂，凝胶等，其是本领域中已知的。
本发明的TCR材料，单独地或者与其他合适的组分组合地，可以被制成经由吸入给药的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可以被置于加压可用的推进剂中，所述加压可用的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们也可以被制成用于非加压制剂的药物，如在雾化器或喷雾器中。所述喷雾制剂也可以用于对粘膜进行喷雾。
适用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性的、等渗无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质，以及水性和非水性的无菌混悬剂，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。本发明的TCR材料可以在药物载体中在生理用稀释剂中被施用，所述稀释剂如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液，醇，如乙醇或十六醇，二醇，如丙二醇或聚乙二醇，二甲亚砜，甘油，缩酮如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇，醚，聚(乙二醇)400，油剂，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯(在添加或不添加药用表面活性剂的情况下，所述药用表面活性剂如脂肪酸盐(soap)或去垢剂)，助悬剂，如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，或羧基甲基纤维素，或乳化剂和其他药物佐剂。
可以用于肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、矿脂和矿物油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
适用于肠胃外制剂中的脂肪酸盐(soap)包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，而合适的去垢剂包括(a)阳离子去垢剂如，例如，二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶
Figure BDA00002946871600241
(b)阴离子去垢剂如，例如，烷基，芳基，和烯烃磺酸酯(或盐)，烷基，烯烃，醚，和单甘油酯硫酸酯，和磺基琥珀酸酯(或盐)，(c)非离子去垢剂如，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺，和聚乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去垢剂如，例如，烷基-β-氨基丙酸酯(或盐)，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。
肠胃外制剂将典型地包含约0.5％至约25重量％的溶液中的本发明的TCR材料。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射位点处的刺激，所述组合物可以包含一种或多种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具有约12至约17的亲水亲油平衡(HLB)。表面活性剂在所述制剂中的量典型地为约5％至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯，如单油酸脱水山梨醇酯和环氧乙烷与通过缩合环氧丙烷和丙二醇形成的疏水基质的高分子量加合物。肠胃外制剂可以被提供在单位剂量或多剂量的密封容器如安瓿和小药瓶中，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件中，其仅需要在使用前的即刻添加注射用无菌液体赋形剂，例如，水。临时注射溶液和混悬剂可以制备自之前所述类型的无菌粉剂、粒剂和片剂。
可注射制剂是按照本发明的。对用于可注射组合物的有效药物载体的需要是本领域技术人员已知的(见，例如，Pharmaceutics and PharmacyPractice(药物和药学实践)，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，238-250页(1982)，以及ASHP Handbook onInjectable Drugs(关于可注射药物的ASHP手册)，Toissel，第4版，622-630页(1986))。优选地，当施用细胞例如T细胞时，经由注射施用所述细胞。
本领域技术人员将理解，除了上述药物组合物以外，本发明的TCR材料可以被制成包合络合物(inclusion complex)，如环糊精包合络合物，或脂质体。
为了本发明，施用的本发明的TCR材料的量或剂量应当足以在合理的时间内，在受试者或动物中产生，例如，治疗或预防反应。例如，本发明的TCR材料的剂量应当足以在自给药起的约2小时以上例如12小时至24个小时以上的时间中结合癌症抗原，或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间可以更长。剂量将取决于具体的本发明的TCR材料的效力和动物(例如，人)的状态，以及待治疗的动物(例如，人)的体重。
用于确定给药剂量的许多测定是本领域中已知的。对本发明来说，这样的测定可以用于确定向哺乳动物施用的起始剂量，所述测定包含在各自被给予不同剂量的T细胞的一组哺乳动物间比较在向所述哺乳动物给药给定剂量的所述T细胞后靶细胞被溶解或表达本发明的TCR、多肽或蛋白的T细胞分泌IFN-γ的程度。给药特定剂量后靶细胞溶解或IFN-γ分泌的程度可以通过本领域中已知的方法测定。
本发明的TCR材料的剂量也将取决于可能伴随特定的本发明的TCR材料的给药的任何不良副作用的存在、性质和程度。典型地，主治医生将决定用以治疗每个个体患者的本发明的TCR材料的剂量，考虑多种因素，如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待给药的本发明的TCR材料、给药途径和被治疗的症状的严重性。通过实例并且不意在限制本发明，本发明的TCR材料的剂量可以是约0.001至约1000mg/kg被治疗受试者的体重/天，约0.01至约10mg/kg体重/天，约0.01mg至约1mg/kg体重/天。
本领域技术人员将容易理解本发明的TCR材料可以以任何数量的方式修饰，以致本发明的TCR材料的治疗或预防效力通过所述修饰而增加。例如，本发明的TCR材料可以通过桥直接或间接与寻靶部分缀合。将化合物例如本发明的TCR材料缀合到寻靶部分的实践是本领域中已知的。见，例如，Wadwa等，J.Drug Targeting3：111(1995)和美国专利No.5,087,616。当在本文中使用时，术语″寻靶部分″是指任何这样的分子或试剂，所述分子或试剂特异性识别并结合细胞表面受体，以致寻靶部分指引本发明的TCR材料到其表面表达有受体的细胞群的递送。寻靶部分包括但不限于，抗体或其片段，肽，激素，生长因子，细胞因子，和任何其他天然或非天然配体，其结合细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)，T细胞受体(TCR)，B细胞受体(BCR)，CD28，血小板衍生生长因子受体(PDGF)，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)。当在本文中使用时，术语″桥″是指将本发明的TCR材料与寻靶部分相连的任何试剂或分子。本领域技术人员知道在本发明的TCR材料上的位点(其对于本发明的TCR材料的功能不是必需的)对于连接桥和/或寻靶部分是理想的位点，条件是桥和/或寻靶部分，一旦连接到本发明的TCR材料，不干扰本发明的TCR材料的功能，即，结合SSX-2；识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个；或检测、治疗或预防癌症的能力。
备选地，本发明的TCR材料可以被改变成贮藏物质(depot)形式，以致本发明的TCR材料释放到其被给药于的身体中的方式关于时间和体内的位置被控制(见，例如，美国专利No.4,450,150)。本发明的TCR材料的贮藏物质形式可以是，例如，可植入组合物，所述可植入组合物包含本发明的TCR材料和多孔或非多孔材料，如聚合物，其中本发明的TCR材料被所述材料包封或通过所述材料和/或非多孔材料的分解扩散。然后贮藏物质被植入到所需的体内位置中，并且本发明的TCR材料以预定的速率从所述植入物释放。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物还包含5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)。不受限于特定理论，据信去甲基化剂DAC通过上调SSX-2的表达增强任何本发明的TCR材料对癌症细胞的识别。
考虑本发明的药物组合物、TCR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、抗体、宿主细胞或细胞群可以用于治疗或预防癌症的方法中。不受限于特定理论，据信，本发明的TCR特异性结合SSX-2并且还可以识别SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个，以致TCR(或相关的本发明的多肽或蛋白)当被细胞表达时能够介导针对表达SSX-2的细胞的免疫应答并且还可以介导针对SSX-3、SSX-4、SSX-5、SSX-9和SSX-10中的任意一个或多个的免疫应答。在这点上，本发明提供治疗或预防宿主的癌症的方法，所述方法包括向宿主给药本文所述的任何药物组合物、TCR、多肽或蛋白，包含编码本文所述的任何TCR、多肽，蛋白的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，本文所述的任何抗体，或包含编码本文所述的任何TCR、多肽或蛋白的重组载体的任何宿主细胞或细胞群，以对于治疗或预防宿主的癌症有效的量给药。
在本发明的一个实施方案中，治疗或预防宿主的癌症的方法还包括将DAC给药于宿主。所述方法可以包括在将任何本发明的药物组合物、TCR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群向宿主给药之前、同时或之后给药DAC。不受限于特定理论，据信去甲基化剂DAC通过上调癌症细胞对SSX-2的表达增强任何本发明的TCR材料对癌症细胞的识别。
术语″治疗″和″预防″以及从其衍生的词语，当在本文中使用时，不一定意味100％或完全的治疗或预防。而是，有不同程度的治疗或预防，本领域技术人员承认其具有潜在的有利或治疗效果。在这点上，本发明的方法可以提供任何量的任何水平的对哺乳动物癌症的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病症或症状。同样，当用于本文的目的时，″预防″可以包括延迟疾病或其症状或病症的发作。
还提供检测在宿主中存在癌症的方法。所述方法包括(i)将含有癌细胞的样品与本文所述的任何本发明的TCR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或其抗原结合部分接触，由此形成复合物，并检测所述复合物，其中检测到复合物指示在宿主中存在癌症。
关于本发明的检测宿主中癌症的方法，癌细胞样品可以是含有全细胞，其溶胞产物，或全细胞溶胞产物的级分，例如，细胞核或胞质级分，全细胞蛋白级分，或核酸级分的样品。
对本发明的检测方法来说，接触步骤可以发生在相对于宿主的体外或体内。优选地，接触是在体外。
同样，对复合物的检测可以通过本领域中已知的任何数量的方式发生。例如，本文所述的本发明的TCR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或其抗原结合部分，可以被标记以可检测的标记物如，例如，放射性同位素，荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。
对施用宿主细胞或细胞群的本发明的方法来说，所述细胞可以是对于宿主是异源的或自体的细胞。优选地，所述细胞是宿主自体的。
关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下任何：肉瘤(例如，滑膜肉瘤，骨原性肉瘤(osteogenic sarcoma)，子宫平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma uteri)，和小泡型横纹肌肉瘤(alveolarrhabdomyosarcoma))，淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma))，肝细胞癌，神经胶质瘤(glioma)，头颈癌，急性淋巴细胞癌，急性髓样白血病(acute myeloidleukemia)，骨癌，脑癌，乳腺癌，肛门、肛门管或肛门直肠的癌症，眼睛的癌症，肝内胆管的癌症，关节的癌症，颈、胆囊或胸膜的癌症，鼻子、鼻腔或中耳的癌症，口腔的癌症，外阴的癌症，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)，慢性骨髓癌，结肠癌(例如，结肠癌瘤)，食道癌，宫颈癌，胃肠类癌肿瘤(gastrointestinal carcinoid tumor)，下咽癌，喉癌，肝癌，肺癌，恶性间皮瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)，鼻咽癌，卵巢癌，胰腺癌，腹膜癌，网膜癌，和肠系膜癌，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌，小肠癌，软组织癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，输尿管癌，和膀胱癌。其中，肉瘤(例如，滑膜肉瘤，骨原性肉瘤，子宫平滑肌肉瘤，和小泡型横纹肌肉瘤)，肝细胞癌，神经胶质瘤，肝癌，黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌和前列腺癌是优选治疗的。
本发明的实施方案提供任何TCR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分或药物组合物在治疗或预防宿主中的癌症中的用途。在一个实施方案中，所述用途可以进一步包括使用DAC。
本发明的方法中涉及的宿主可以是任何宿主。优选地，宿主是哺乳动物。当在本文中使用时，术语″哺乳动物″是指任何哺乳动物，包括但不限于，啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，和兔形目(orderLogomorpha)的哺乳动物，如兔子。优选的是，哺乳动物来自食肉目(orderCarnivora)，包括猫科(猫)和犬科(狗)。更优选的是，哺乳动物来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或奇蹄目(orderPerssodactyla)，包括马科(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目(orderPrimates)，Ceboids，或Simoids(猴)，或类人目(order Anthropoids)(人和猿)。尤其优选的哺乳动物是人。
以下实施例进一步说明本发明，但是其绝不应当被视作限制本发明的范围。
实施例1
该实施例例示用于表达SSX-2的反转录病毒载体的构建并示范在特定细胞系中的SSX-2表达。
将SSX-2基因插入表达载体pMSGV1和pRRLSIN.cPPT.PGK中。插入的SSX-2的序列为：
ATGaacggagacgacgcctttgcaaggagacccacggttggtgctcaaataccagagaagatccaaaaggccttcgatgatattgccaaatacttctctaaggaagagtgggaaaagatgaaagcctcggagaaaatcttctatgtgtatatgaagagaaagtatgaggctatgactaaactaggtttcaaggccaccctcccacctttcatgtgtaataaacgggccgaagacttccaggggaatgatttggataatgaccctaaccgtgggaatcaggttgaacgtcctcagatgactttcggcaggctccagggaatctccccgaagatcatgcccaagaagccagcagaggaaggaaatgattcggaggaagtgccagaagcatctggcccacaaaatgatgggaaagagctgtgccccccgggaaaaccaactacctctgagaagattcacgagagatctggaaatagggaggcccaagaaaaggaagagagacgcggaacagctcatcggtggagcagtcagaacacacacaacattggtcgattcagtttgtcaacttctatgggtgcagttcatggtacccccaaaacaattacacacaacagggacccaaaaggggggaacatgcctggacccacagactgcgtgagagaaaacagctggTGA(SEQ ID NO：31)。pRRLSIN载体还插入有WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)。
通过蛋白印迹法观察SSX-2在624.38细胞中以及在转导有以上SSX2载体的COS7-A2细胞中的表达。在H508、Panc2551、A549或OVCAR3细胞或未转导的COS7-A2细胞中没有观察到SSX-2的表达。
同样在938mel、U251、T567A、SKMEL23和SKMEL37细胞中测量SSX-2。相对β肌动蛋白进行归一化的SSX-2的拷贝数显示在表1中。
表1
细胞系 拷贝数SSX-2/106β肌动蛋白
938mel 17194.1
U251 6168.2
T567A 8278.0
SKMEL23 0.2
SKMEL37 26568.9
使用实时PCR进行另外的SSX-2表达研究。结果显示在表2中。
表2
Figure BDA00002946871600301
Figure BDA00002946871600311
实施例2
该实施例示例说明表达SSX-2特异性TCR的反转录病毒载体的构建。
使用5’-RACE，从来自黑色素瘤患者的肿瘤浸润的淋巴结(TILN)分离来自天然T细胞克隆的HLA-A2限制性TCR，所述黑色素瘤患者对SSX-2血清反应阳性并且其肿瘤表达SSX-2。
T细胞克隆显示：TRAV14/DV4*01(阳性细菌克隆数21/23)和TRBV15*02-CB1(阳性细菌克隆数23/23)。
构建反转录病毒载体，其表达引入2a切割肽的TCRα和β链。对α链和β链进行分别的PCR反应。对于α链，正向引物引入ATG的NcoI限制性位点。反向引物在识别序列前具有引入的furin-SGSG-P2a。对于β链，正向引物在识别序列前也引入furin-SGSG-P2a，并且反向引物具有终止密码子和NotI限制性位点。
在完成后，将分开的PCR反应结合，并利用外部引物进行另外的PCR以产生α链(TRAV14)-接头-β链(TRBV15-CB1)构建体。所述构建体包含SEQ ID NO：27，其编码抗-SSX-2TCRα和β链。
将该构建体使用NcoI和NotI限制性位点克隆到pMSGV1反转录病毒载体中。
实施例3
该实施例证明用SSX-2TCR改造的PBL显示SSX-2肽特异反应性和四聚体结合。
用实施例2的SSX-2TCR载体转导来源于人供体的PBL，并对其进行肽反应性和四聚体结合的测试。
在CD4和CD8细胞中观察四聚体结合。
将SSX-2TCR-转导的PBL与来自两个人供体的T2细胞共培养，其中利用不同浓度的SSX-2：41-49(KASEKIFYV)肽对T2细胞进行脉冲。图1A和1B显示测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。这些数据显示SSX-2TCR-转导的PBL识别低至0.01ng/ml以下的SSX-2：41-49肽。图1A和1B间的差异是由供体变异性所致。
还将SSX-2TCR-转导的PBL与来自实施例1的经反转录病毒改造从而表达SSX-2基因的细胞共培养。图2显示当将PBL与表达SSX-2基因的293-A2和COS7-A2细胞以及用SSX-2：41-49肽进行脉冲的T2细胞共培养时测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。未用SSX-2TCR转导的PBL不显示针对这些细胞的反应性。
实施例4
该实施例证明用实施例2的SSX-2TCR改造的PBL显示针对肿瘤细胞系的反应性。
SSX-2TCR-转导的PBL与多种肿瘤细胞系共培养。图3显示测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。这些数据显示，在黑色素瘤(624和1300)和成胶质细胞瘤细胞系(U251)中，SSX-2TCR改造的T细胞识别天然加工和递呈的SSX-2蛋白。未用SSX-2TCR转导的PBL(UT)显示极低的反应性或不显示反应性。
图4A和4B、图11和表3和4显示来自人供体的、用实施例2的SSX-2TCR转导的PBL的另外的结果(当这些PBL与多种肿瘤细胞共培养时)。
表3
Figure BDA00002946871600341
Figure BDA00002946871600351
表4
Figure BDA00002946871600352
Figure BDA00002946871600361
实施例5
该实施例证明用SSX-2TCR改造的PBL显示针对其他SSX蛋白肽的反应性。
用实施例2的转导有SSX-2TCR的PBL和肽脉冲的T2细胞进行共培养测定。
图5显示，相比于其他SSX肽，SSX-2TCR与SSX-2的肽最具反应性，并且也识别SSX-3、-4、-5、-9和-10的肽，虽然在更高的肽浓度见到更好的识别。
实施例6
该实施例证明密码子优化和引入小鼠恒定区提高SSX-2TCR在人PBL中的表达和功能。
不用或用包含以下的载体转导人PBL：SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)，SEQ ID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)，或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)。通过FACS分析测量表达。所测量的用SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)转导的细胞的平均荧光强度为656，用SEQ ID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)转导的细胞的平均荧光强度为910，并且用SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)转导的细胞的平均荧光强度为949。
在另一个实验中，四聚体结合的测量确认密码子优化和引入小鼠恒定区提高SSX-2TCR在人PBL中的表达。
在另一个实验中，FACS分析也揭示，在将用SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)、SEQ ID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)转导的人PBL与COS-A2-SSX2细胞共培养后，活化标记物CD137(4-1BB)被上调。
另一个实验通过在与COS-A2-SSX-2细胞共培养后测量CD107a动员评估SSX-2TCR的功能。在第0天，用OKT3刺激PBL。在第2天，如在此实施例中所述地转导PBL。在第15天，将PBL与COS-A2细胞或COS-A2-SSX-2细胞共培养2小时。在第16天，通过FACS分析测量CD107a动员。结果显示密码子优化和引入小鼠恒定区提高SSX-2TCR的功能，如通过与COS-A2-SSX-2细胞共培养后的CD107a动员所测量的。
还通过与COS-A2-SSX-2细胞或938-A2mel细胞共培养后的IL-2和IFN-γ生产测量SSX-2TCR的功能。用OKT3刺激PBL，并如在该实施例中所述的那样进行转导。在第10天，将PBL与COS-A2细胞、COS-A2-SSX-2细胞、938-A2mel细胞或938mel细胞共培养。在第11天，通过FACS分析测量IL-2和IFN-γ生产。结果显示密码子优化和引入小鼠恒定区提高SSX-2TCR的功能，如通过与COS-A2-SSX-2细胞和938-A2mel细胞共培养后的IL-2和IFN-γ生产所测量的。
实施例7
该实施例证明用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR改造的PBL显示针对肿瘤细胞系的反应性。
将未被转导的PBL(UT)或用包含SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)、SEQID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)的载体转导的PBL与多种肿瘤细胞系共培养。表5和6显示关于来自两个不同供体的PBL测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。这些数据显示转导的T细胞识别多种肿瘤细胞系中的天然加工和递呈的SSX-2蛋白。未用SSX-2TCR转导的PBL(UT)显示极低的反应性或不显示反应性。
表5
Figure BDA00002946871600371
Figure BDA00002946871600381
表6
实施例8
该实施例证明用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR改造的PBL在与SSX2+/HLA-A2+靶细胞共培养后增殖。
将来自供体1或供体2、未被转导的PBL(UT)或用包含SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)、SEQ ID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)的载体转导的PBL与COS-A2-SSX-2细胞共培养。测量以[3H]-胸腺嘧啶引入(CPM)为单位的增殖并将其显示在图6A(供体1)和6B(供体2)中。这些数据显示用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的SSX-2TCR(其包括小鼠恒定区)转导的PBL响应与COS-A2-SSX-2细胞的共培养而增殖。
在另一个实验中，将如在该实施例中所述那样转导的PBL与1300mel细胞、624mel细胞、888mel细胞、SK mel37细胞或COS-A2-SSX-2细胞共培养。测量以[3H]-胸腺嘧啶引入每分钟计数(CPM)为单位的增殖并将其显示在图9A-9E中。这些数据显示用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的SSX-2TCR(其包括小鼠恒定区)转导的PBL响应与SSX2+/HLA-A2+靶细胞的共培养而增殖。
实施例9
该实施例证明用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR改造的PBL显示针对SSX-2+/HLA-A2+靶细胞的特异性溶胞活性。
将未被转导的PBL(UT)或用包含SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)、SEQID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)的载体转导的PBL与靶细胞938mel(HLA-A2-/SSX-2+)、COS-A2、938-A2mel、COS-A2-SSX-2、624mel、1300mel、SK mel37或888mel以图7A-D和8A-D中所示的效应物：靶比率共培养。测量靶细胞的百分比溶胞并将其显示在图7A-D和8A-D中。未被转导的细胞显示低至无的反应性。这些数据显示用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR改造的PBL显示针对SSX-2+/HLA-A2+靶细胞的特异性溶胞活性。
实施例10
该实施例证明用SSX-2TCR、密码子优化的SSX-2TCR或密码子优化的人-小鼠嵌合体SSX-2TCR改造的PBL当与肽脉冲的T2细胞共培养时分泌细胞因子。
将未被转导的PBL(UT)或用包含SEQ ID NO：27(SSX-2TCR)、SEQID NO：29(密码子优化的SSX-2TCR)或SEQ ID NO：30(密码子优化的SSX-2TCR，其包括小鼠恒定区)的载体转导的PBL与T2细胞共培养，所述T2细胞用SSX-2进行脉冲用不同浓度的SSX-2：41-49(KASEKIFYV)(SEQ ID NO：1)肽进行脉冲。图10显示测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。这些数据显示SSX-2TCR-转导的PBL识别SSX-2：41-49肽。
实施例11
该实施例证明去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)增强SSX2-TCR改造的PBL对mel1300细胞的识别。
将来自三个供体的、SSX-2TCR-转导的PBL与mel1300细胞在不存在DAC的情况下或存在0.1μM或1.0μM DAC的情况下共培养。图12显示测量的所得的干扰素-γ水平(pg/ml)。这些数据显示DAC增强SSX2-TCR改造的PBL对mel1300细胞的识别。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)以相同的程度通过引用结合于此如同每个参考文献被单独地且明确地指示为通过引用结合并且完整的于此提出。
除非本文中另有指示或与语境明显矛盾，术语“一个”和“一种”和“所述”及类似指示在描述本发明的语境中(尤其在以下权利要求的语境中)的使用被解释为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被理解为开放式术语(即，是指“包括但不限于”)。除非本文中另有说明。本文中数值范围的列举仅意在充当单独地引用落入所述范围的各个分离的值的速记方法，并且各个分离的值被结合到说明书中如同其单独地在本文中被列举。除非本文中另有指示或与语境明显矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合适的次序进行。使用本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”)仅意在更好地说明本发明并且除非另外声明不限制本发明的范围。在说明书中所有语言都不应当被理解为指示任何未要求保护的元素对实现本发明是必要的。
本文中描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人所知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了上述描述后，对于本领域技术人员，那些优选实施方案的变化可以变得明显。本发明人预期技术人员适当地采用所述变化，并且本发明人意在使本发明以不同于本文中所具体描述的方式被实施。因此，本发明包括如被适用法律所许可的于此所附的权利要求中列举的主题的所有改变和等价物。此外，除非本文中另有指示或与语境明显矛盾，本发明包括在其所有可能的变化中的上述元素的任何组合。
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Claims (37)

1.分离或纯化的T细胞受体(TCR)，所述受体具有针对滑膜肉瘤X断裂点(SSX)-2(SEQ ID NO：1)的抗原特异性。
2.权利要求1的TCR，其中所述TCR还识别SSX-3(SEQ ID NO：3)，SSX-4(SEQ ID NO：4)，SSX-5(SEQ ID NO：5)，SSX-9(SEQ ID NO：6)，和SSX-10(SEQ ID NO：7)中的任何一个或多个。
3.权利要求1或2中任一项的TCR，其中所述TCR具有针对包含KASEKIFYV(SEQ ID NO：2)的SSX-2肽的抗原特异性。
4.权利要求1-3中任一项的TCR，其中所述TCR识别KVSEKIVYV(SEQ ID NO：8)，KSSEKIVYV(SEQ ID NO：9)，KASEKIIYV(SEQ ID NO：10)，KSSEKIIYV(SEQ ID NO：11)，和KASEKILYV(SEQ ID NO：12)中的任何一个或多个。
5.权利要求1-4中任一项的TCR，其中所述TCR包括包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的TCR，其中所述TCR包含SEQ ID NO：19和20。
7.权利要求6的TCR，其中所述TCR还包含SEQ ID NO：21和22。
8.权利要求1-7中任一项的TCR，其中所述TCR包含：
a)SEQ ID NO：23和24或
b)SEQ ID NO：25和26。
9.分离或纯化的多肽，所述多肽包含权利要求1-8中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列。
10.权利要求9的分离或纯化的多肽，其中所述部分包含SEQ ID NO：19和20的氨基酸序列。
11.权利要求10的分离或纯化的多肽，其包含：
a)SEQ ID NO：23和24；或
b)SEQ ID NO：25和26。
12.分离或纯化的蛋白，所述蛋白包含权利要求9-11任一项的多肽中的至少一个。
13.权利要求12的分离或纯化的蛋白，所述蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：19，所述第二多肽链包含SEQID NO：20。
14.权利要求13的分离或纯化的蛋白，其包含
a)包含SEQ ID NO：23的第一多肽链和包含SEQ ID NO：24的第二多肽链；或
b)包含SEQ ID NO：25的第一多肽链和包含SEQ ID NO：26的第二多肽链。
15.权利要求12-14中任一项的分离或纯化的蛋白，其中所述蛋白是融合蛋白。
16.权利要求12-15中任一项的分离或纯化的蛋白，其中所述蛋白是重组抗体。
17.分离或纯化的核酸，所述核酸包含编码权利要求1-8中任一项的TCR、权利要求9-11中任一项的多肽或权利要求12-16中任一项的蛋白的核苷酸序列。
18.权利要求17的核酸，其中所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：27-30中的任何一条。
19.分离或纯化的核酸，所述核酸包含与权利要求17或18的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
20.分离或纯化的核酸，所述核酸包含在严格条件下与权利要求17或18的核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
21.重组表达载体，其包含权利要求17-20中任一项的核酸。
22.权利要求21的重组表达载体，其中所述载体是反转录病毒载体。
23.分离的宿主细胞，其包含权利要求21或22的重组表达载体。
24.权利要求23的分离的宿主细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。
25.权利要求24的分离的宿主细胞，其中所述PBL是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
26.细胞群，其包含至少一种权利要求23-25中任一项的宿主细胞。
27.抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合权利要求1-8中任一项的TCR的功能部分，其中所述功能部分包含氨基酸序列：SEQ ID NO：13-18。
28.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的TCR，权利要求9-11中任一项的多肽，权利要求12-16中任一项的蛋白，权利要求17-20中任一项的核酸，权利要求21或22的重组表达载体，权利要求23-25中任一项的宿主细胞，权利要求26的细胞群，或者权利要求27的抗体或其抗原结合部分，和药用载体。
29.一种检测宿主中癌症存在的方法，所述方法包括：
(a)将含有所述癌症的细胞的样品与权利要求1-8中任一项的TCR，权利要求9-11中任一项的多肽，权利要求12-16中任一项的蛋白，权利要求17-20中任一项的核酸，权利要求21或22的重组表达载体，权利要求23-25中任一项的宿主细胞，权利要求26的细胞群，或者权利要求27的抗体或其抗原结合部分接触，由此形成复合物，和
(b)检测所述复合物，
其中检测到所述复合物指示在所述宿主中癌症的存在。
30.一种治疗或预防宿主癌症的方法，所述方法包括以对于治疗或预防所述宿主的癌症有效的量，向所述宿主给药权利要求1-8中任一项的TCR，权利要求9-11中任一项的多肽，权利要求12-16中任一项的蛋白，权利要求17-20中任一项的核酸，权利要求21或22的重组表达载体，权利要求23-25中任一项的宿主细胞，权利要求26的细胞群，或权利要求27的抗体或其抗原结合部分，或权利要求28的药物组合物。
31.权利要求29或30的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、滑膜肉瘤、骨原性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤和肝细胞癌。
32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述宿主细胞是所述宿主自体的细胞或者所述群的细胞是所述宿主自体的细胞。
33.权利要求30-32中任一项的方法，所述方法还包括向所述宿主给药5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)。
34.权利要求1-8中任一项的TCR、权利要求9-11中任一项的多肽、权利要求12-16中任一项的蛋白、权利要求17-20中任一项的核酸、权利要求21或22的重组表达载体、权利要求23-25中任一项的宿主细胞、权利要求26的细胞群、或权利要求27的抗体或其抗原结合部分、或权利要求28的药物组合物用于治疗或预防宿主的癌症的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、滑膜肉瘤、骨原性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤和肝细胞癌。
36.权利要求34或35的用途，其中所述宿主细胞是所述宿主自体的细胞或者所述群的细胞是所述宿主自体的细胞。
37.权利要求34-36中任一项的用途，所述用途还包括使用DAC。
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