ES2381617T9

ES2381617T9 - Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2381617T9
Application number: ES03788456.6T
Authority: ES
Inventors: Scott Koenig; Maria-Concetta Veri
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2016-03-10
Anticipated expiration: 2023-08-14
Also published as: HK1079979A1; EP1534335B1; EP1534335A4; EP1534335B9; WO2004016750A2; ES2381617T3; DK1534335T4; US20040185045A1; DK1534335T3; EP1534335A2; WO2004016750A3; IL228068A; ES2381617T5; IL228069A0; AU2003262650A1; IL228069A; EP2371389A2; US7425620B2; JP4459810B2; PT1534335E

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos específicos frente a FcγRIIB y sus procedimientos de uso.

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a anticuerpos o sus fragmentos que unen específicamente FcγRIIB, en particular FcγRIIB humano, con una afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos o sus fragmentos unen FcγRIIA, en particular FcγRIIA humano. La divulgación proporciona procedimientos para potenciar el efecto terapéutico de anticuerpos terapéuticos administrando los anticuerpos de la invención para potenciar la función efectora de los anticuerpos terapéuticos. La divulgación también proporciona procedimientos para potenciar la eficacia de una composición de vacuna administrando los anticuerpos de la invención.

Antecedentes

2.1 Receptores de Fc y su papel en el sistema inmunitario

La interacción de complejos anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario da como resultado una amplia variedad de respuestas, que van desde funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de mastocitos y la fagocitosis frente a señales inmunomoduladoras tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie celular especializados sobre células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos y complejos inmunitarios resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores de Fc. Los receptores de Fc comparten dominios de unión de ligando relacionados estructuralmente que presumiblemente median la señalización intracelular.

Los receptores de Fc, miembros de la superfamilia de proteínas de genes de inmunoglobulina, son glucoproteínas de superficie que pueden unir la porción Fc de moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento de la cadena a del receptor de Fc. Los receptores de Fc se definen por su especificidad para los subtipos de inmunoglobulina. Los receptores de Fc para IgG se denominan FcγR, para IgE, FcεR y para IgA FcαR. Diferentes células accesorias portan receptores de Fc para anticuerpos de isotipo diferente y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias participarán en una determinada respuesta (revisado por Ravetch J.V. y col. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. y col. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. y col. 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. y col. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. y col., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores de Fc, las células que los expresan y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptada de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4ª ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York).

Receptores Fcγ

Cada miembro de esta familia es una glucoproteína de membrana integral, que posee dominios extracelulares relacionados con un conjunto C2 de dominios relacionados con inmunoglobulina, un dominio único que se extiende por la membrana y un dominio intracitoplásmico de longitud variable. Existen tres FcγR conocidos, llamados FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) y FcγRIII(CD16). Los tres receptores están codificadas por genes distintos; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgieron de un origen común, quizás por duplicación génica. Esta invención se centra específicamente en los FcγRII(CD32).

FcγRII(CD32)

Las proteínas FcγRII son glucoproteínas de membrana integrales de 40 KDa que sólo unen las IgG complejadas debido a una baja afinidad por Ig monomérica (106 M-1). Este receptor es el FcγR más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcγRII sólo tiene dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y, por tanto, una afinidad mucho menor por IgG que FcγRI. Existen tres genes de FcγRII humano (FcγRII-A, FcγRII-B, FcγRII-C), todos lo cuales unen IgG en agregados o complejos inmunitarios.

Distintas diferencias dentro de los dominios citoplásmicos de FcγRII-A y FcγRII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas frente a la unión al receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como la fagocitosis y el estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, p. ej., inhibiendo la activación de linfocitos B.

Señalización a través de FcγR

Tanto las señales activadoras como las inhibidoras se transducen a través de los FcγR tras la unión. Estas funciones diametralmente opuestas son resultado de las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios diferentes dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor denominados motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) o motivos inhibidores del inmunorreceptor basados en

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tirosina (ITIM) son responsables de las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplásmicas a estas estructuras determina el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcγR. Los complejos de FcγR que contienen ITAM incluyen FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, mientras los complejos que contienen ITIM sólo incluyen FcγRIIB.

5 Los neutrófilos humanos expresan el gen FcγRIIA. La agrupación de FcγRIIA mediante complejos inmunitarios o entrecruzamiento específico de anticuerpos sirve para agregar ITAM junto con cinasas asociadas a receptor, lo que facilita la fosforilación de los ITAM. La fosforilación de los ITAM sirve como un sitio de anclaje para la cinasa Syk, cuya activación da como resultado la activación de sustratos corriente abajo (p. ej., PI3K). La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios.

10 El gen FcγRIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es un 96 % idéntico a FcγRIIA y une complejos de IgG de una manera no distinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplásmico de FcγRIIB define esta subclase inhibidora de FcγR. Recientemente, se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se une con un FcγR activador, el ITIM de FcγRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la fosfatasa de inositoles 5'-polifosfato (SHIP), que hidroliza mensajeros fosfoisonitol liberados como consecuencia de la activación de tirosina cinasas mediada por

15 FcγR que contienen ITAM, impidiendo en consecuencia la entrada de Ca++ intracelular. Así, el entrecruzamiento de FcγRIIB amortigua la respuesta activadora frente a la unión de FcγR e inhibe la capacidad de respuesta celular. Por tanto, se anulan la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B y la secreción de anticuerpos.

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TABLA 1. Receptores para las regiones Fc de isotipos de inmunoglobulina

Receptor: FcγRI(CD64) FcγRII-A(CD32) FcΓRII-B2(CD32) FcγRII-BI(CD32) FcγRIII(CD16) FcεRI FcαRI(CD89)

Unión: IgG110 8 M-1 IgG12 x 106 M-1 IgG12 x 106 M-1 IgG12 x 106 M-1 IgG15 x 105 M-1 IgG110 10 M-1 IgG1, IgA210 7 M-1

Tipo de célula: MacrófagosNeutrófilosEosinófilosCélulas dendríticas MacrófagosNeutrófilosEosinófilosCélulas dendríticasPlaquetasCélulas de Langerhans MacrófagosNeutrófilosEosinófilos Linfocitos BMastocitos Células NKEosinófilosMacrófagosNeutrófilosMastocitos MastocitosEosinófilosBasófilos MacrófagosNeutrófilosEosinófilos

Efecto de la unión: IncorporaciónEstimulaciónActivación del estallido respiratorioInducción dedestrucción IncorporaciónLiberación de gránulos IncorporaciónInhibición de laestimulación No incorporaciónInhibición de laestimulación Inducción dedestrucción Secreción degránulos IncorporaciónInducción dedestrucción

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El diagnóstico de la artritis reumatoide se basa en una combinación de factores, incluyendo: la localización específica y la simetría de las articulaciones dolorosas, la presencia de rigidez articular por la mañana, la presencia de protuberancias y nódulos bajo la piel (nódulos reumatoides), resultados de pruebas de rayos X que sugieren artritis reumatoide y/o resultados positivos de un análisis de sangre denominado factor reumatoide. Muchas personas, aunque no todas, con artritis reumatoide tienen el anticuerpo de factor reumatoide en su sangre. El factor reumatoide puede estar presente en personas que no tienen artritis reumatoide. Otras enfermedades pueden provocar también que se produzca el factor reumatoide en la sangre. Es por eso que el diagnóstico de la artritis reumatoide se basa en una combinación de varios factores y no sólo en la presencia del factor reumatoide en la sangre.

El curso típico de la enfermedad es uno de síntomas articulares persistentes pero fluctuantes y, después de aproximadamente 10 años, el 90 % de los pacientes presentan daño estructural en el hueso y el cartílago. Un pequeño porcentaje tendrá una enfermedad corta que desaparece completamente y otro pequeño porcentaje tendrá una enfermedad muy grave con muchas deformaciones articulares y, ocasionalmente, otras manifestaciones de la enfermedad. El proceso inflamatorio provoca erosión o destrucción de huesos y cartílago en las articulaciones. En la artritis reumatoide, existe un ciclo autoinmunitario de presentación de antígenos persistente, estimulación de linfocitos T, secreción de citocinas, activación de células sinoviales y destrucción articular. La enfermedad tiene un impacto importante tanto en el individuo como en la sociedad, provocando dolor, función deficiente y discapacidad, así como el coste de millones de dólares en gastos de atención sanitaria y pérdidas salariales. (véase, por ejemplo, la página web del NIH y la página web del NIAID).

El tratamiento disponible actualmente para la artritis se centra en reducir la inflamación de las articulaciones con medicaciones antiinflamatorias o inmunosupresoras. La primera línea de tratamiento de cualquier artritis son, generalmente, antiinflamatorios, tales como aspirina, ibuprofeno e inhibidores de Cox-2 tales como celecoxib y rofecoxib. Los "fármacos de segunda línea" incluyen oro, metotrexato y esteroides. Aunque éstos son tratamientos bien establecidos para la artritis, muy pocos pacientes remiten con sólo estas líneas de tratamiento. Los recientes avances en la comprensión de la patogénesis de la artritis reumatoide han conducido al uso de metotrexato en combinación con anticuerpos frente a citocinas o receptores solubles recombinantes. Por ejemplo, se han usado receptores solubles recombinantes para factor de necrosis tumoral (TNF)-α en combinación con metotrexato en el tratamiento de la artritis. No obstante, sólo aproximadamente el 50 % de los pacientes tratados con una combinación de metotrexato y agentes anti-TNF-α tales como receptores solubles recombinantes para TNF-α muestran una mejoría clínicamente significativa. Muchos pacientes siguen siendo resistentes a pesar del tratamiento. Aún quedan asuntos de tratamiento difíciles para pacientes con artritis reumatoide. Muchos tratamientos actuales tienen una alta incidencia de efectos secundarios o no pueden evitar completamente la progresión de la enfermedad. Hasta ahora, no existe un tratamiento ideal y no hay cura. Se necesitan agentes terapéuticos novedosos que traten de manera más eficaz la artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios.

2.2.3 Alergia

Las reacciones alérgicas mediadas por inmunidad (hipersensibilidad) se clasifican en cuatro tipos (I-IV) de acuerdo con los mecanismos subyacentes que conducen a la expresión de los síntomas alérgicos. Las reacciones alérgicas de tipo I se caracterizan por la liberación mediada por IgE de sustancias vasoactivas tales como histamina desde mastocitos y basófilos. La liberación de estas sustancias y la subsiguiente manifestación de síntomas alérgicos se inician por el entrecruzamiento de IgE unidas a alérgeno con su receptor en la superficie de mastocitos y basófilos. En individuos que padecen reacciones alérgicas de tipo I, la exposición a un alérgeno por segunda vez conduce a la producción de niveles altos de anticuerpos de IgE específicos para el alérgeno como resultado de la implicación de linfocitos B y T de memoria en la interacción de 3 células necesaria para la producción de IgE. Los elevados niveles de anticuerpos de IgE producidos provocan un incremento en el entrecruzamiento de los receptores de IgE en mastocitos y basófilos por IgE unidas a alérgeno, que a su vez conduce a la activación de estas células y la liberación de los mediadores farmacológicos que son responsables de las manifestaciones clínicas de las enfermedades alérgicas de tipo I.

Se han identificado y caracterizado dos receptores con afinidades diferentes por IgE. El receptor de alta afinidad (FcεRI) se expresa en la superficie de mastocitos y basófilos. El receptor de baja afinidad (FcεRII/CD23) se expresa en muchos tipos celulares incluyendo linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, eosinófilos y células de Langerhans. El receptor de alta afinidad de IgE consta de tres subunidades (cadenas alfa, beta y gamma). Varios estudios demuestran que únicamente la cadena alfa está implicada en la unión de IgE, mientras que las cadenas beta y gamma (que son proteínas transmembranarias o citoplásmicas) son necesarias para acontecimientos de transducción de señales. La identificación de estructuras de IgE necesarias para que las IgE se unan a los FcεRI en mastocitos y basófilos es de suma importancia en la elaboración de estrategias para tratar o evitar alergias mediadas por IgE. Por ejemplo, la elucidación del sitio de unión al receptor de IgE podría conducir a la identificación de péptidos o moléculas pequeñas que bloquean la unión de IgE a las células que portan los receptores in vivo.

Actualmente, las reacciones alérgicas mediadas por IgE se tratan con fármacos tales como antihistamínicos y corticoesteroides que intentan aliviar los síntomas asociados con reacciones alérgicas contrarrestando los efectos de las sustancias vasoactivas liberadas desde mastocitos y basófilos. Las dosis altas de antihistamínicos y corticoesteroides tienen efectos secundarios perjudiciales (p. ej., alteración del sistema nervioso central, estreñimiento, etc.). Por tanto, son necesarios otros procedimientos para tratar las reacciones alérgicas de tipo I.

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En una realización particular, los anticuerpos anti-FcγRIIB bloquean el sitio de unión de ligando de FcγRIIB. En una realización específica más, la actividad de bloqueo puede bloquear la regulación negativa de la activación desencadenada por complejos inmunitarios y, en consecuencia, potenciar la respuesta inmunitaria. En otra realización específica, la respuesta inmunitaria potenciada es un incremento de la respuesta celular dependiente de anticuerpos. En una realización específica más, los anticuerpos anti-FcγRIIB bloquean el entrecruzamiento de los receptores de FcγRIIB con receptores de linfocitos B y/o de Fc, conduciendo a la activación de linfocitos B, mastocitos, células dendríticas o macrófagos.

La divulgación engloba la producción de anticuerpos monoclonales novedosos con especificidades por FcγRIIB en relación con FcγRIIA. En particular, la divulgación proporciona un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales frente a FcγRIIB que unen específicamente FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, con una afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos monoclonales unen FcγRIIA, en particular FcγRIIA humano, comprendiendo dicho procedimiento: a) inmunizar uno o más ratones transgénicos en FcγRIIA con FcγRIIB purificado o uno de sus fragmentos inmunogénicos; (b) producir líneas celulares de hibridoma a partir de células de bazo de dichos uno o más ratones; (c) rastrear dichas líneas celulares de hibridoma para localizar una o más líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que unen específicamente FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que los anticuerpos unen FcγRIIA. La divulgación engloba cualquier anticuerpo producido por dicho procedimiento. En una realización específica, la divulgación proporciona un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales frente a FcγRIIB que unen específicamente FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, con una afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos monoclonales unen FcγRIIA, particularmente FcγRIIA humano, comprendiendo dicho procedimiento: a) inmunizar uno o más ratones transgénicos en FcγRIIA con FcγRIIB purificado o uno de sus fragmentos inmunogénicos;

(b): reforzar la inmunización de dichos ratones durante un tiempo suficiente para producir una respuesta inmunitaria;

(c): producir líneas celulares de hibridoma a partir de células de bazo de dichos uno o más ratones; (d) rastrear dichas líneas celulares de hibridoma para localizar una o más líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos que unen específicamente FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que los anticuerpos unen FcγRIIA. En una realización preferida, dichos los ratones reciben inmunización de refuerzo al menos cuatro veces durante un periodo de cuatro meses. En una realización, dichos ratones se inmunizan con FcγRIIB purificado, que se ha mezclado con adyuvantes conocidos en la técnica para potenciar la respuesta inmunitaria en dichos ratones. En una realización concreta, dicho fragmento inmunogénico es el dominio extracelular soluble de FcγRIIB. Las líneas celulares de hibridoma se pueden rastrear usando técnicas estándar conocidas en la técnica (p. ej., ELISA).

En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7, con números de acceso de ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. En otra realización, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos que compiten por la unión con el anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7 y unen FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos unen FcγRIIA, y/o se unen al mismo epítopo de FcγRIIB que el anticuerpo monoclonal producido a partir del clon 2B6 o 3H7 y unen FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos unen FcγRIIA. Además, la divulgación proporciona una línea celular de hibridoma 2B6 o 3H7, con números de acceso de ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente.

Los procedimientos divulgados en el presente documento engloban también polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la divulgación. En una realización, la divulgación proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o uno de sus fragmentos que unen específicamente FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos unen FcγRIIA. La divulgación también se refiere a un vector que comprende dicho ácido nucleico. La divulgación proporciona además un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera, siendo dichas cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo o uno de sus fragmentos que unen específicamente FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos unen FcγRIIA. En una realización específica, dicho vector es un vector de expresión. La divulgación proporciona además células huésped que contienen los vectores de o polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención. Preferentemente, la divulgación engloba polinucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos producidos por los clones de hibridoma depositados, con números de acceso de ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente, o partes de de ellas, p. ej., CDR, dominios variables, etc.

La divulgación proporciona además procedimientos para la producción de anticuerpos de la invención o sus fragmentos. Los anticuerpos divulgados en el presente documento o sus fragmentos pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la producción de anticuerpos, en particular, mediante secreción a partir de células de hibridoma cultivadas, síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante conocidas en la técnica. En una realización específica, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir de forma recombinante un anticuerpo específico para FcγRIIB, comprendiendo dicho procedimiento:

(i) cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho anticuerpo en un medio, una célula huésped que contiene una primera molécula de ácido nucleico, unida de manera operable a un promotor heterólogo y un segundo acido nucleico unido de forma operable al mismo o a otro promotor heterólogo, codificando dichos primer y segundo ácidos nucleicos una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo o uno de sus fragmentos que unen específicamente FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos unen FcγRIIA; y

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FIGURA 5: Comparación de la capacidad de unión directa a FcγRIIA y FcγRIIB del anticuerpo purificado a partir del clon 2B6 comparado con otros tres anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles frente a FcγRII.

La unión de anticuerpo de 2B6 a FcγRIIA (panel superior derecho) y FcγRIIB (panel superior izquierdo) se compara con la de otros tres anticuerpos comercialmente disponibles obtenidos frente a FcγRII. El formato de ELISA usado es el mismo descrito en la figura 4.

FIGURA 6: Competición en la unión del anticuerpo producido a partir del clon 2B6 e IgG humana biotinilada agregada a FcγRIIB.

Panel A

La capacidad del anticuerpo presente en el sobrenadante del clon 2B6 para competir por la unión a FcγRIIB con IgG humana biotinilada agregada se midió usando un experimento ELISA de bloqueo.

La capacidad de competición del anticuerpo de 2B6 se comparó con la de un sobrenadante negativo de hibridoma y con la del anticuerpo de 3H7.

Se incubó una placa de ELISA recubierta con FcγRIIB con diferentes diluciones (1:10) de los sobrenadantes. Tras los lavados la placa se incubó con una cantidad fija de IgG humana biotinilada agregada (1 mg/pocillo) y los

agregados unidos se detectaron con conjugado estreptavidina-HRP. La reacción se reveló con TMB y monitorizó la absorbancia a 650 nm.: se

Panel B

El mismo ELISA de bloqueo descrito: en el panel A se realizó con anticuerpo de 2B6 purificado y se

representaron los datos de una concentración de anticuerpo de bloqueo usada (4 mg/pocillo) en un diagrama de barras. La capacidad de 2B6 para bloquear la unión de IgG humana agregada a FcγRIIB se comparó con la de un control de isotipo de IgG1 de ratón.

FIGURA 7: Competición del anticuerpo de 2B6 y la IgG humana biotinilada agregada en la unión a FcγRIIB usando un ensayo de FACS de tinción doble.

Se realizó un ensayo de FACS de tinción doble para caracterizar el anticuerpo de 2B6 usando células CHO-K1 que habían sido transfectadas de forma estable con FcγRIIB de mamífero de longitud completa.

Panel A

Las células transfectantes se tiñeron con control de isotipo de IgG1 de ratón seguido por un anticuerpo conjugado con FITC anti-ratón de cabra y estreptavidina-PE.

Panel B

Las células transfectantes se tiñeron con IgG humana biotinilada agregada después de ser teñidas con control de isotipo de IgG1 de ratón y marcadas con un anticuerpo conjugado con FITC anti-ratón de cabra para detectar el anticuerpo monoclonal unido y con conjugado estreptavidina-PE para detectar los agregados unidos.

Panel C

Las células se tiñeron con anticuerpo de 2B6, el anticuerpo se retiró por lavado y las células se incubaron con IgG humana biotinilada agregada. Las células se lavaron y se marcaron con un anticuerpo conjugado con FITC antiratón de cabra para detectar el anticuerpo monoclonal unido y con conjugado estreptavidina-PE para detectar los agregados unidos.

FIGURA 8: Co-tinción de anticuerpos monoclonales anti-FcγRIIB y CD20 de linfocitos B humanos.

Se tiñeron células de sangre humana ("capa leucocítica") con anticuerpo conjugado con FITC anti-CD20, para seleccionar la población de linfocitos B, así como de 3H7 y 2B6. Los anticuerpos anti-FcγRIIB se detectaron con anticuerpo conjugado con PE anti-ratón de cabra.

A. Las células se co-tiñeron con anticuerpo anti-CD20-FITC y control de isotipo de IgG1 de ratón.

B. Las células se co-tiñeron con anticuerpo anti-CD20-FITC y anticuerpo de 3H7.

C. Las células se co-tiñeron con anticuerpo anti-CD20-FITC y anticuerpo de 2B6.

FIGURA 9: Tinción de células CHO que expresan FcγRIIB.

A. Se tiñeron células CHO/IIB con control de isotipo de IgG1 de ratón (panel izquierdo) y anticuerpo de 3H7

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no humana y regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (en el documento EP 239.400; publicación internacional N.º. WO 91/09967; y en las patentes de EE. UU. N.º 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), barnizado o modificación de la superficie (en los documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498; Studnicka y col., 1994, Protein Engineering 7:805; y Roguska y col., 1994, PNAS 91:969) y reordenamiento de cadenas (en la patente de EE. UU. N.º 5.565.332).

Frecuentemente, los residuos estructurales de las regiones estructurales serán sustituidos por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para modificar, preferentemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, p. ej., realizando un modelo de las interacciones de los residuos estructurales y de las CDR para identificar residuos estructurales importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos estructurales no habituales en posiciones particulares. (Véanse, p. ej., la patente de EE. UU. N.º 5.585.089; y Riechmann y col., 1988, Nature 332:323.)

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o variantes, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región estructural que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos, al menos uno y normalmente dos, los dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferentemente, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse a partir de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Habitualmente, el dominio constante es un dominio constante que fija el complemento cuando se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y la clase es normalmente IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y la selección de dominios constantes concretos para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la técnica. Las regiones estructurales y CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponderse exactamente con las secuencias originales, p. ej., la CDR del donante o la estructura consenso pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo, de forma que el residuo de CDR o estructural en ese sitio no se corresponde con el anticuerpo de consenso o importado. No obstante, tales mutaciones, no serán extensas. Habitualmente, al menos el 75 % de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de la región estructural (FR) y las secuencias CDR originales, más a menudo el 90 % y lo más preferentemente, más del 95 %. Los anticuerpos humanizados pueden prepararse usando un variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, injerto de CDR (en la patente europea N.º EP 239.400; en la publicación internacional N.º WO 91/09967; y en las patentes de EE. UU. N.º 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), barnizado o modificación de la superficie (en las patentes europeas N.º EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka y col., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska y col., 1994, PNAS 91:969-973), reordenamiento de cadenas (en la patente de EE. UU. N.º 5.565.332) y técnicas divulgadas,

p. ej., en las patentes de EE. UU. N.º 6.407.213, 5.766.886, 5.585.089, la publicación internacional N.º WO 9317105, Tan y col., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas y col., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea y col., 2000, Methods 20:267-79, Baca y col., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska y col., 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto y col, 1995, Cancer Res. 55 (23 Sup):5973s.5977s, Couto y col, 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen y col., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones y col., 1986, Nature 321:522-525, Riechmann y col., 1988, Nature 332:323 y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. A menudo, los residuos estructurales de las regiones estructurales serán sustituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para modificar, preferentemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, p. ej., realizando un modelo de las interacciones de los residuos estructurales y de las CDR para identificar residuos estructurales importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos estructurales no habituales en posiciones particulares. (Véanse, p. ej., la patente de EE. UU. N.º 5.585.089; y Riechmann y col., 1988, Nature 332:323).

Además, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos antiidiotípicos usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (véanse, p. ej., Greenspan y Bona, 1989, FASEB J. 7:437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438). La divulgación proporciona procedimientos que emplean el uso de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo divulgado en el presente documento o uno de sus fragmentos.

La divulgación engloba anticuerpos de un sólo dominio, incluyendo anticuerpos camelizados de dominio único (véanse, p. ej., Muildermans y col., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall y col., 2000, Actual. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann y Muildermans, 1999, J. Immunol. Met. 231:25; las publicaciones internacionales N.º WO 94/04678 y WO 94/25591; la patente de EE. UU. N.º 6.005.079). En una realización, la divulgación proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios VH con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio

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único.

Los procedimientos divulgados en el presente documento engloban también el uso de anticuerpos o sus fragmentos que tienen semividas (p. ej., semividas en suero) en un mamífero, preferentemente un ser humano, de más de 15 días, preferentemente de más de 20 días, de más de 25 días, de más de 30 días, de más de 35 días, de más de 40 días, de más de 45 días, de más de 2 meses, de más de 3 meses, de más de 4 meses o de más de 5 meses. Las semividas incrementadas de los anticuerpos o sus fragmentos en un mamífero, preferentemente un ser humano, dan como resultado una mayor valoración en suero de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero y, por tanto, reducen la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reducen la concentración que debe administrarse de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos o sus fragmentos que tienen semividas in vivo incrementadas pueden generarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o sus fragmentos con semividas in vivo incrementadas pueden generarse modificando (p. ej., por sustitución, deleción o adición) residuos de aminoácido identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn. Los anticuerpos pueden manipularse mediante procedimientos descritos en Ward y col. para incrementar sus semividas biológicas (véase el documento US

6.277.375 B1). Por ejemplo, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden manipularse en el dominio Fc-bisagra para que tengan semividas in vivo o en suero incrementadas.

Los anticuerpos o sus fragmentos con semividas in vivo incrementadas pueden generarse uniendo a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo moléculas de polímero, tal como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. El PEG puede unirse a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional, bien mediante conjugación específica de sitio del PEG al extremo N o C de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o mediante grupos épsilon-amino presentes en residuos de lisina. Se usará la derivatización polimérica lineal o ramificada que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se monitorizará estrechamente mediante SD-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados PEGanticuerpo mediante, p. ej., cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento también pueden modificarse mediante los procedimientos y agentes de acoplamiento descritos por Davis y col. (véase el documento US 4.179.337) con el fin de proporcionar composiciones que pueden inyectarse en el aparato circulatorio de mamíferos sustancialmente sin respuesta inmunogénica.

La divulgación también engloba el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento con mutaciones (p. ej., una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones estructurales o variables. Preferentemente, las mutaciones de estos anticuerpos mantienen o potencian la avidez y/o la afinidad de los anticuerpos por el/los antígeno(s) concretos a los que se unen inmunoespecíficamente. Pueden usarse las técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica

(p. ej., inmunoensayos) para ensayar la afinidad de un anticuerpo por un antígeno concreto.

La divulgación engloba anticuerpos que comprenden modificaciones, preferentemente en la región Fc, que modifican la afinidad de unión del anticuerpo a uno o más FcγR. Se conocen en la técnica procedimientos para modificar anticuerpos con unión modificada a uno o más FcγR, véanse, p. ej., las publicaciones PCT N.º WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089 y las patentes de EE. UU. N.º 5.843.597 y 5.642.821. La divulgación engloba cualquiera de las mutaciones divulgadas en las solicitudes de EE. UU. N.º 60/439.498, presentada el 9 de enero de 2003, y 60/456.041, presentada el 19 de marzo de 2003. En algunas realizaciones, la divulgación engloba anticuerpos que tienen modificada su afinidad por un FcγR activador, p. ej., FcγRIIIA. Preferentemente, tales modificaciones tienen también una función efectora mediada por Fc modificada. Las modificaciones que afectan a la función efectora mediada por Fc son bien conocidas en la técnica (véase el documento US 6.194.551). Los aminoácidos que pueden modificarse de acuerdo con el procedimiento divulgado en el presente documento incluyen, pero no se limitan a prolina 329, prolina 331 y lisina 322. Las prolinas 329 y 331 y la lisina 322 se reemplazan preferentemente con alanina, aunque se contempla la sustitución con cualquier otro aminoácido. Véanse la publicación internacional N.º WO 00/42072 y el documento US 6.194.551.

En una realización concreta, la modificación de la región Fc comprende una o más mutaciones en la región Fc. La una o más mutaciones en la región Fc pueden dar como resultado un anticuerpo con una función efectora mediada por anticuerpo modificada, una unión a otros receptores de Fc modificada (p. ej., receptores de Fc activadores), una actividad ADCC modificada, una actividad de unión a C1q modificada o una actividad de citotoxicidad dependiente del complemento modificada o cualquiera de sus combinaciones.

La divulgación también proporciona anticuerpos con contenido en oligosacáridos modificado. Oligosacáridos como se usa en el presente documento se refiere a hidratos de carbono que contienen dos o más monosacáridos y los dos términos pueden utilizarse indistintamente en el presente documento. Los restos de carbohidrato divulgados en el presente documento se describirán con referencia a la nomenclatura usada comúnmente en la técnica. Para una revisión de la química de los hidratos de carbono, véase, p. ej., Hubbard y col., 1981 Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man que representa manosa; GlcNAc que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa; Fuc para fucosa y Glc para glucosa. Los ácidos siálicos se describen mediante la

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notación abreviada NeuNAc para el ácido 5-N-acetilneuramínico y NeuNGc para el ácido 5-glicolilneuramínico.

En general, los anticuerpos contienen restos de carbohidrato en posiciones conservadas de la región constante de la cadena pesada y hasta el 30 % de las IgG humanas tienen una región Fab glucosilada. La IgG tiene una sola estructura de carbohidrato bicatenaria unida a N en Asn 297 que reside en el dominio CH2 (Jefferis y col., 1998, Immunol. Rev.

163: 59-76; Wright y col., 1997, Trends Biotech 15: 26-32). La IgG humana tiene normalmente un carbohidrato con la siguiente estructura: GlcNAc(fucosa)-GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)2. No obstante, entre las IgG se producen variaciones en el contenido en hidratos de carbono, lo que conduce a una función modificada, véanse, p. ej., Jassal y col., 2001 Bichem. Biophys. Res. Commun. 288: 243-9; Groenink y col., 1996 J. Immunol. 26: 1404-7; Boyd y col, 1995 Mol. Immunol. 32: 1311-8; Kumpel y col, 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51. La divulgación engloba anticuerpos que comprenden una variación en el resto carbohidrato que está unido a la Asn 297. En una realización, el resto carbohidrato tiene una galactosa y/o una galactosa-ácido siálico en uno o en ambos de los GlcNAc terminales y/o un tercer brazo GlcNAc (GlcNAc bisector).

En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados en el presente documento están sustancialmente libres de uno

: o más grupos de azúcar seleccionados, p. ej., uno o más residuos de ácido siálico, uno o más residuos de galactosa, uno

: o más residuos de fucosa. Un anticuerpo que está sustancialmente libre de uno o más grupos de azúcar seleccionados puede prepararse usando procedimientos comunes conocidos por el experto en la técnica, incluyendo, por ejemplo, producir por recombinación un anticuerpo en una célula huésped que es defectiva en la adición del/de los grupo(s) de azúcar seleccionado(s) al resto carbohidrato del anticuerpo, de forma que aproximadamente el 90-100 % del anticuerpo de la composición carece del/de los grupo(s) de azúcar unido(s) al resto carbohidrato. Los procedimientos alternativos para la preparación de tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, el cultivo de células bajo condiciones que evitan o reducen la adición de uno o más grupos de azúcar seleccionados o la eliminación postraduccional de uno o más grupos de azúcar seleccionados.

En una realización específica, la divulgación engloba un procedimiento para producir una preparación de anticuerpos sustancialmente homogénea, en la que aproximadamente el 80-100 % del anticuerpo de la composición carece de fucosa en su resto carbohidrato, p. ej., la unión de carbohidrato de la Asn 297. El anticuerpo puede prepararse, por ejemplo, mediante (a) el uso de una célula huésped manipulada que es deficiente en el metabolismo de la fucosa de forma que tiene una capacidad reducida para fucosilar proteínas expresadas en ella; (b) el cultivo de células bajo condiciones que evitan o reducen la fucosilación; (c) la eliminación postraduccional de fucosa, p. ej., con una enzima fucosidasa; o (d) la purificación del anticuerpo con el fin de seleccionar para el producto el que no está fucosilado. Lo más preferentemente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado se expresa en una célula huésped que tiene una capacidad reducida para fucosilar el anticuerpo expresado en ella. Preferentemente, la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en dihidrofolato reductasa, p. ej., una célula CHO Lec 13 (línea celular de CHO resistente a lectina; Ribka y Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12 (1); 51-62; Ripka y col., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 249 (2): 533-45), CHO-K1, DUX-B 11, CHO-DP12 o CHO-DG44, que ha sido modificada de forma que el anticuerpo, sustancialmente, no se fucosila. Por tanto, la célula puede presentar una expresión y/o una actividad modificadas para la enzima fucosiltransferasa u otra enzima o sustrato implicados en la adición de fucosa al oligosacárido unido en N, de forma que la enzima tiene una actividad disminuida y/o un nivel de expresión en la célula reducido. Para procedimientos para preparar anticuerpos con un contenido en fucosa modificado, véanse, p. ej., el documento WO 03/035835 y Shields y col., 2002, J. Biol. Chem. 271 (30): 26733-40.

En algunas realizaciones, las modificaciones de hidratos de carbono modificadas modulan uno o más de los siguientes: solubilización del anticuerpo, facilitación del transporte subcelular y secreción del anticuerpo, promoción del ensamblaje del anticuerpo, integridad conformacional y función efectora mediada por anticuerpos. En una realización específica, las modificaciones de hidratos de carbono modificadas potencian la función efectora mediada por anticuerpos en relación con el anticuerpo que carece de modificación de hidratos de carbono. Las modificaciones de hidratos de carbono que conducen a una modificación de la función efectora mediada por anticuerpos son bien conocidas en la técnica (p. ej., véanse Shields R.L. y col., 2001, J. Biol. Chem. 271 (30): 26733-40; Davies J. y col., 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4): 288-294). En otra realización específica, las modificaciones de hidratos de carbono modificadas potencian la unión anticuerpos de la invención al receptor FcγRIIB. Modificar las modificaciones de carbohidratos de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento incluye, por ejemplo, incrementar el contenido en hidratos de carbono del anticuerpo o reducir el contenido en hidratos de carbono del anticuerpo. Los procedimientos para modificar los contenidos en hidratos de carbono son conocidos por los expertos en la técnica, véanse, p. ej., Wallick y col., 1988, Journal of Exp. Med. 168 (3): 1099-1109; Tao y col., 1989 Journal of Immunology, 143(8): 2595-2601; Routledge y col., 1995 Transplantation, 60(8): 847-53; Elliott y col. 2003; Nature Biotechnology, 21: 414-21; Shields y col. 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(30): 26733-40

En algunas realizaciones, la divulgación engloba anticuerpos que comprenden uno o más sitios de glucosilación, de modo que uno o más restos de carbohidrato se unen covalentemente al anticuerpo. En otras realizaciones, la divulgación engloba anticuerpos que comprenden uno o más sitios de glucosilación y una o más modificaciones en la región Fc, tales como las divulgadas anteriormente y las conocidas por el experto en la técnica. En realizaciones preferidas, las una o más modificaciones en la región Fc potencian la afinidad del anticuerpo por un FcγR activador,

p. ej., FcγRIIIA, en relación con el anticuerpo que comprende las regiones Fc naturales. Los anticuerpos divulgados en el presente documento con uno o más sitios de glucosilación y/o una o más modificaciones en la región Fc tienen una función efectora mediada por anticuerpos potenciada, p. ej., una actividad ADCC potenciada. En algunas

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