WO2010123080A1

WO2010123080A1 - 可溶化ｓｒ-ａ蛋白質の製造方法及びそれを用いた評価方法

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Publication number: WO2010123080A1
Application number: PCT/JP2010/057179
Authority: WO
Inventors: 浩司湯浅; 千鶴宮田; あきば濱本; 泰治松川; 雄毅松居; 泰正山田; 一郎山田
Original assignee: ユーハ味覚糖株式会社
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2010-10-28
Also published as: JP2012139106A

Abstract

　多量体のコンフォメーションを形成する可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質を得るための手段を開発し、該蛋白質のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに極めて有用な、変性ＬＤＬ等のリガンドに対する評価系の構築を提供する。さらには動脈硬化抑制剤となるワクチン製剤や抗体製剤を提供する。ＳＲ-Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ-Ａ遺伝子を導入した動物培養細胞を、無血清培地で培養して可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質を産生させ、可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質を含む培養液又はその培養処理液を精製して可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質を回収することで、リガンド結合能を有する可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質の製造が可能になった。可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質は、多量体のコンフォメーションを持つことにより、ワクチン製剤、中和抗体作製用抗原として利用することが可能である。

Description

可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の製造方法及びそれを用いた評価方法

　本発明は、可溶化クラスＡスカベンジャー受容体（可溶化ＳＲ－Ａ）蛋白質の製造方法及び評価方法に関する。さらには、本発明は、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質、該可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いるワクチン製剤、あるいは抗血清又は抗体に関する。

　膜蛋白質、特に膜受容体は、細胞表面でリガンドと結合することにより、細胞内への様々な物質の取り込みや情報伝達のカスケードを作動させる重要な働きを担っている。膜受容体のアゴニスト（作動薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）は医薬品候補となるために、膜受容体の効率的な生産技術及びこれを用いた評価方法を開発することは創薬研究において非常に重要である。

　また、膜受容体に対する抗体医薬市場は年々伸びているが、実用化されている抗体医薬のターゲットとなる膜受容体の種類は限られている。抗膜受容体抗体の開発には、免疫原となる膜受容体及び免疫応答によって生産された抗体の評価の双方に組換え膜受容体を必要とする。例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のような７回膜貫通型膜受容体はその効率的生産技術が開発されていないため、これらをターゲットとする抗体をはじめとする医薬品の開発は遅れている。

　従来は一般的に、創薬のターゲットとなる哺乳動物由来の膜受容体は、ＣＨＯ細胞のような動物細胞、ｓｆ９のような昆虫細胞を用いた細胞膜での発現が試みられていた（特許文献１、２、３）。しかしながら、細胞膜画分への膜受容体の発現効率は低く、また細胞膜に発現しても細胞膜上に存在する多種類の他の膜蛋白質の存在が精製上で問題となっていた。さらに膜画分からの膜受容体の精製においては、イオン強度、ｐＨ、界面活性剤の種類や濃度等の複雑に係わる因子の影響を考慮しながら、目的の膜受容体本来の活性を保持した状態での可溶化は非常に困難である。また、簡便な方法としてはバクテリアを宿主として用いる方法がある（特許文献４）が、バクテリアでは哺乳動物由来の膜受容体を発現させることが難しく、発現しても不溶性画分に回収されたり翻訳後修飾が無いために目的の活性を保持しない等の問題点が多くあった。

　ところで、膜受容体の一つであるスカベンジャー受容体（ＳＲ）は、酸化・アセチル化等の修飾を受け変性した低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）等のリガンドと結合し、マクロファージの泡沫化や血管内皮細胞の障害等に深く関わる因子群であることが知られている。例えば、スカベンジャー受容体は、炎症、血液凝固、動脈硬化等の発症に関係していると考えられている。その中でＳＲ－Ａ蛋白質はマクロファージ・血管内皮細胞・平滑筋細胞に存在するスカベンジャー受容体であり、スカベンジャー受容体の中でも主用な機能を担っていることが知られている（非特許文献１）。

　ＳＲ－Ａ蛋白質については、生体内での機能ユニットは３量体であることが確認されているが、３量体を超える多量体を形成したＳＲ－Ａ蛋白質の特性・特徴や、多量体と３量体との比較検討等は未だ報告されていない。その原因の一つとして、リガンド結合能を有した状態の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が未だ作製できていないことにある。

　また、上述のようにＳＲ－Ａ蛋白質に関しては可溶化蛋白質が作製されていなかったために、生体内での重要な膜受容体であるにも関わらず、その測定方法も確立されていない。
　ただし、細胞膜上にＳＲ－Ａ蛋白質を発現しているマクロファージ細胞の細胞溶解液を用いたＳＲ－Ａ蛋白質の評価方法などは知られている（非特許文献２）。さらに当業者であれば、遺伝子組換えを行いＳＲ－Ａ蛋白質を発現させた株化細胞を用いての評価方法も検討されるであろう。しかしながら、これらの前記細胞溶解液や前記ＳＲ－Ａ発現細胞株を用いた評価方法では、細胞全体に含まれる受容体や蛋白質などＳＲ－Ａ蛋白質以外の因子とも評価対象物質が相互作用することになり、結合特性を解析する上で必要となる他因子を排除した条件下でのＳＲ－Ａ蛋白質とリガンドのみでの結合評価を行うことが不可能である。

　一方、近年、抗体医薬の研究・開発は活発なものがあり、日本において２０１０年には１７００億円の市場になるとの試算もある。例えば、関節リウマチ、乳がん、血液がん等での治療が改善され、大きな効果が得られるようになり、臨床現場において抗体医薬品の評価が確立することで利用が広まっている。

　ところが、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する抗体作製については、
（１）げっ歯類からヒトまでの哺乳類の間において、ＳＲ－Ａ蛋白質のアミノ酸配列の相同性が高いこと、
（２）ＳＲ－Ａ蛋白質が血中細胞の細胞膜表面に露出していること、
等の理由から、非常に抗体ができにくいとされている（非特許文献３）。Ｔｏｍｏｋｉｙｏらはこれらの技術的問題点を克服するために、ＳＲ－Ａ蛋白質の発現を遺伝学的にノックアウトしたマウスを用い、大腸菌で発現させたヒト由来ＳＲ－Ａ蛋白質の部分アミノ酸配列を持つ蛋白質を抗原とすることで、抗ＳＲ－Ａ抗体の作製に成功している（非特許文献３）。しかしながら、正常な動物やヒトにおいてはＳＲ－Ａ蛋白質をコードする遺伝子をノックアウトすることができないので、ネイティブなＳＲ－Ａ蛋白質を抗原として用いることは非常に困難であり、これに代わる高い力価を有する抗原の開発が必要である。

　また、抗原となりやすい蛋白質は、抗体作製のための抗原としてのみでなく、ワクチン製剤（特にコンポーネントワクチン）としての可能性があり、液性・細胞性等を含めた免疫活性を刺激することが可能であると言われている。例えば、ＳＲ－Ａ蛋白質が関与すると考えられる動脈硬化においても、その治療方法の一つとしてリポプロテイン、コレステロール、コレステロール代謝関連物質、熱ショック蛋白質、インターロイキン－１２等を免疫原としたワクチン療法に関する研究が行われている（非特許文献４）。

　しかしながら、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドの一つである酸化ＬＤＬは、同じ酸化ＬＤＬであってもエピトープは多種多様であることから、免疫原となる酸化ＬＤＬと免疫される側の生体内酸化ＬＤＬのエピトープが異なる可能性も否定できない。

　さらに用いる免疫原の組合せによっては、動脈硬化等を促進する（つまりアゴニストとして作用してしまう）ことも報告されており（特許文献５）、リガンドを免疫原として利用することに対してはリスクを伴う可能性がある。

　一方で、細胞膜表面に局在する蛋白質である受容体を何らかの方法で可溶化し、免疫原として利用することも考えられる。
　ところが、ＳＲ－Ａ蛋白質は、上述のように非常に抗原となりにくい理由から、ワクチン製剤としての利用の可能性は全く言及されていない。さらにはＳＲ－Ａ蛋白質以外のスカベンジャー受容体に関して、可溶化スカベンジャー受容体をワクチンとして利用する方法についての報告は現在のところ、存在しない。

特表２００３－５１６１０９号公報特表２００５－５０７２４５号公報特表２００２－５２５０９５号公報特表２００７－５３１５０２号公報特表２００４－５２９１４３号公報

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｖｏｌ．４６，２００５，ｐｐ．１１－２０Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｖｏｌ．３２９，２００８，ｐｐ．１６７－７５Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ｖｏｌ．１６１，２００２，ｐｐ．１２３－３２ＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｖｉｅｗＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　２００９

　本発明の目的は、ＳＲ－Ａ蛋白質と同等のリガンド結合能を有する可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質及びその製造方法を提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、ＳＲ－Ａ蛋白質のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに極めて有用な、変性ＬＤＬ等のリガンドに対する評価方法を提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、ＳＲ－Ａ蛋白質を特異的に認識できる抗血清及び抗体、さらには動物種を免疫可能なワクチン製剤を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｎ末端から膜貫通ドメインを変異あるいは欠失したＳＲ－Ａ蛋白質をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ-Ａ遺伝子を導入した動物細胞を無血清培地で培養することにより、ＳＲ－Ａ蛋白質と同じ公知のリガンドに対して結合能を有する、可溶化型のＳＲ－Ａ蛋白質を製造することに初めて成功した。そして、このようにして得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いることにより、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する結合能が不明な被検物質について、前記結合能を評価する方法、あるいはＳＲ－Ａ蛋白質と公知のリガンドとの結合を阻害したり、促進したりする作用の有無を評価する方法を構築することに初めて成功した。

　すなわち、本発明は以下の（１）～（９）の係るものである。
（１）以下のａ工程及びｂ工程を含むことを特徴とする、可溶化クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ－Ａ）蛋白質の製造方法。
ａ工程：ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ－Ａ遺伝子を導入した動物培養細胞を、無血清培地で培養して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を産生させる工程。
ｂ工程：可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含む培養液又はその培養処理液を精製して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を回収する工程。
（２）前記組換えＳＲ－Ａ遺伝子として、分泌シグナルの下流にＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させたＳＲ－Ａ遺伝子と、タグ配列とを含むＤＮＡ構造物を用いる前記（１）に記載の製造方法。
（３）前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が多量体を形成している前記（１）又は（２）記載の製造方法。
（４）前記（１）～（３）いずれか記載の製造方法で製造された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質。
（５）前記（４）記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含むワクチン製剤。
（６）前記（４）記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に、被検物質を作用させる工程を有することを特徴とするＳＲ－Ａ蛋白質に対する被検物質の親和性の評価方法。
（７）前記（４）記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に、被検物質とリガンドとを作用させる工程を有することを特徴とする、ＳＲ-Ａ蛋白質とリガンドの結合に対する被検物質の作用の評価方法。
（８）前記（４）記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いて、動物種を免疫することにより作製された抗血清又は抗体。
（９）生体内でＳＲ－Ａ蛋白質とそのリガンドとの結合を抑制するような中和作用を持つ前記（８）記載の抗血清又は抗体。

　本発明で得られる可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、不溶性膜蛋白質であるＳＲ－Ａ蛋白質の可溶化型の組換え蛋白質であって、しかも３量体を形成したＳＲ－Ａ蛋白質よりもより多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質はリガンドに結合しやすいという特性を有している。このことから、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ＳＲ－Ａ蛋白質の可溶化蛋白質として使用することができる。
　本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いることで、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する結合能が未知である被検物質の親和性の評価が可能となる。この評価方法を用いることで、ＳＲ－Ａ蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能になる。
　また、本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いることで、ＳＲ－Ａ蛋白質とリガンドの結合に対する被検物質の作用の評価が可能となる。
　特に、本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、３量体を超える多量体を形成しているため、生体内で抗原となりやすく、抗血清や抗体の作製を容易にし、且つワクチン製剤としての利用も可能な蛋白質である。
　したがって、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質はこれまでは抗原として抗体誘導能が低いとされていたが、本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質をＳＲ－Ａ蛋白質の代わりにワクチン製剤として用いることにより、動物種を免疫して、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質を特異的に認識できる抗血清や抗体を動物種に産生させることが可能になる。
　よって、本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ＳＲ－Ａ蛋白質が関連するといわれている医療分野として、例えば、動脈硬化症、炎症、感染症、アルツハイマー症等の疾患の研究や、これらに疾患に対する創薬の分野に広く貢献することができる。

　つまり、本発明は、従来の当該分野での課題であった、
（１）リガンド結合能を有した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の作製、
（２）個別のエピトープにしか対応できない、酸化ＬＤＬに対する抗体を用いた生体内酸化ＬＤＬ測定法からの脱却、
（３）高い相同性や血中細胞膜表面受容体であるため抗ＳＲ－Ａ抗体が非常に得られにくいという、ＳＲ－Ａ蛋白質に特有の事実の克服、
（４）脂質低下剤や血圧降下剤ではなく、直接動脈硬化を抑制するための「ワクチン」開発、
を見事に解決できるものである。

図１は、実施例１の方法により得られた培養処理液中に産生された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を、抗ヒスチジンタグ抗体により検出した結果を示す図である。図中、左から培地のみ、培養処理液、培養処理液を精製したものの結果を示す。図２は、実施例１の方法により得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、可溶化ＳＲ－Ａ）の非変性状態での分子量を、ゲル濾過カラムにより検証した結果を示すグラフである。マーカー蛋白質４種類（４３，１５８，４４０，６６０ｋＤ）を用いて検量線の作製を行った。図３は、実施例１で精製した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質から、単量体、３量体、多量体のそれぞれのコンフォメーションを持つ蛋白質をゲル濾過カラムにより再精製し、各分子量の蛋白質ごとに同濃度となるように酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）用プレートに固相化し、実施例２の方法に従いアセチル化ＬＤＬ（図中、ＡｃＬＤＬ）に対する結合特性を解析したグラフである。縦軸は波長４５０ｎｍの吸光度を示しており、数値が高いほどアセチル化ＬＤＬとの親和性が高いことを示している。図４は、実施例１の方法により得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用い、実施例２の方法によりネイティブＬＤＬ（図中、ＬＤＬ）とアセチル化ＬＤＬ（図中、ＡｃＬＤＬ）に対する結合特性をＥＬＩＳＡで評価した結果を示すグラフである。図３と同様に縦軸は波長４５０ｎｍの吸光度を示しており、数値が高いほどネイティブＬＤＬ又はアセチル化ＬＤＬとの親和性が高いことを示している。図５は、実施例３において、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドであるフコイダンに対する、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、ｓＳＲＡ）の結合特性を濃度依存的に検証したグラフである。なお、コントロールとしてＢＳＡを用いた結果も示している。図６は、実施例１の方法により得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用い、実施例２の方法に準じて複数のエキスによるアセチル化ＬＤＬとの結合阻害反応をＥＬＩＳＡで評価した実施例４の結果を示すグラフである。図中、予め別のＳＲ－Ａ蛋白質を安定的に発現したＳＲ－Ａ安定発現細胞株を用いたアセチル化ＬＤＬの取り込み抑制試験で、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する親和性のなかったエキスを「ネガ」、親和性のあったエキスを「ポジ」として示している。図７は、実施例５において、実施例３の方法により作製された免疫前（図中、Ｐｒｅ-ｉｍｍｕｎ）及び免疫後（図中、Ｐｏｓｔ-ｉｍｍｕｎ）の各ウサギ抗血清、及び抗ヒスチジンタグ抗体（図中、Ａｎｔｉ-Ｈｉｓ）を用いて、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、可溶化ＳＲ－Ａ）に対する抗原－抗体反応をウェスタン解析した図である。図８は、実施例３の方法により作製されたウサギ抗血清から精製したＩｇＧ画分（図中、抗可溶化ＳＲ－Ａ抗体）と、市販されている唯一の中和抗体である抗ＳＲ－Ａモノクローナル抗体（図中、市販抗体）との中和活性を比較したグラフである。図９は、実施例６において、実施例３の方法により作製し、精製されたＩｇＧ画分を用いて、実施例４の方法によりマクロファージ分化細胞中への蛍光標識したアセチル化ＬＤＬの取り込みに対する抑制効果を、ネガティブコントロールであるコントロールウサギＩｇＧと比較した図である。　図中、「＋ＩｇＧ」は、イムノグロブリンＧでマクロファージを前処理した結果を示し、「＋Ａｎｔｉ-ｓＳＲＡ」は抗可溶化ＳＲ－Ａ抗体でマクロファージを前処理した結果を示す。図１０は、実施例７において、実施例５の方法により自然発症脳卒中モデルラットであるＳＨＲ－ＳＰラットに、抗動脈硬化用のコンポーネントワクチン製剤として可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を静脈注射した後に、腸間膜動脈に蓄積した脂質沈着数を動脈硬化の指標としてグラフ化した図である。図中、「可溶化ＳＲ-Ａ」は前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を静脈注射した結果、「ＢＳＡ　ｃｏｎｔｒｏｌ」はＢＳＡを静脈注射した結果を示す。図１１は、実施例４の方法により免疫されたラットより採血した血清を用い、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を投与したラットで、抗可溶化ＳＲ－Ａ抗体が誘導・産生されているか否かをウェスタン解析した図である。図中、「Ａｎｔｉ-Ｈｉｓ　ｔａｇ」は抗ヒスチジンタグ抗体により検出された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、可溶化ＳＲ-Ａ）を示し、「ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｓｅｒｕｍ」は可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を免疫したラットより採血した血清を１次抗体として用いた場合の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の検出結果を示し、「ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｅｒｕｍ」はＢＳＡを免疫したラットより採血した血清を１次抗体として用いた場合の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の検出結果を示す。

　本発明の製造方法は、以下のａ工程及びｂ工程、
ａ工程：ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ－Ａ遺伝子を導入した動物培養細胞を、無血清培地で培養して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を産生させる工程
ｂ工程：可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含む培養液又はその培養処理液を精製して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を回収する工程
を含むことを特徴とする。

　（ａ工程）
　ａ工程で標的とするスカベンジャー受容体であるＳＲ－Ａ蛋白質は、マクロファージで主に発現されており、糖鎖付加されたII型膜貫通型の蛋白質であり、修飾ＬＤＬ、β－アミロイド、終末糖化産物等と結合することが知られている。修飾ＬＤＬとしては、アセチル化ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ等が挙げられる。本発明で使用するリガンドとは、前記のようにＳＲ－Ａ蛋白質と結合することが知られているリガンドを意味する。

　ＳＲ－Ａ蛋白質の種類としては、１型（ＳＲ－Ａ１）、２型（ＳＲ－Ａ２）、３型（ＳＲ－Ａ３）及びＭＡＲＣＯ（コラーゲン様構造を伴うマクロファージ受容体：macrophage receptor with collagenous structure）が挙げられる。以下、これらをまとめてＳＲ－Ａファミリーともいう。
　いずれのＳＲ－Ａ蛋白質も、Ｎ末端側から、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、スペーサードメイン、及びコラーゲン様ドメインで構成されているアミノ酸配列からなる。なお、ＳＲ－Ａ１は、コラーゲン様ドメインのＣ末端側にさらにシステインリッチ領域を有している。
　なお、前記のアミノ酸配列からなるＳＲ－Ａ蛋白質は、いずれも細胞膜において３量体を形成している。

　前記ＳＲ－Ａ蛋白質の由来としては、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、ラット、ブタ等の哺乳動物が挙げられる。

　本発明でいう「可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質」とは、前記ＳＲ－Ａ蛋白質のうち、Ｎ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列が変異又は欠失された蛋白質であって、３量体を形成しているネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質とは異なった、３量体を超える多量体のコンフォメーションを形成している蛋白質をいう。

　前記変異又は欠失の程度としては、Ｎ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよく、Ｎ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列が全て欠失されたものでもよい。
　また、前記変異又は欠失の手法としては、例えば、前記ＳＲ－Ａ蛋白質の前記Ｎ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードするＳＲ－Ａ遺伝子の塩基配列において、一般的な遺伝子工学手法により、欠失、置換又は挿入等の１個以上の変異を導入するような公知の手法であればよい。また、後述のように前記Ｎ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を全て欠失するような変異を行ってもよい。

　また、本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質においては、多量体を形成できるのであれば、前記スペーサードメイン、及びコラーゲン様ドメイン等の細胞外ドメインの１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。ただし、前記細胞外ドメインのアミノ酸配列はリガンドとの結合特性が損なわれない範囲内での改変であることが好ましい。

　なお、前記ＳＲ－Ａ遺伝子とは、前記ＳＲ－Ａ蛋白質をコードする遺伝子であり、ＳＲ－Ａ遺伝子の塩基配列は、例えば、米国国立生物工学情報センター（Ｎational Center for Biotechnology Information）が提供している塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋや日本ＤＮＡデータバンク（DNA Data Bank of Japan）に登録されて、公開されている。また、これらの機関に登録されている塩基配列からＳＲ－Ａ蛋白質のアミノ酸配列は容易に決定できる。

　本発明において、前記のようなＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列を変異又は欠失させたＳＲ－Ａ蛋白質をコードする組換えＳＲ－Ａ遺伝子は、各種のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、プライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことで得えられる。あるいは、組換えＳＲ－Ａ遺伝子は、ゲノム配列よりイントロンを含む形で直接得てもよい。

　前記ｃＤＮＡライブラリーとしては、ＳＲ－Ａファミリーを発現、あるいは発現誘導させた細胞に関連するものであればよく、市販品を用いてもよいし、公知の遺伝子工学手法に基づいて種々の動物細胞から作製することもできる。

　前記プライマーセットとは、ＰＣＲの際に同時に用いられるプライマーの組み合わせをいう。本発明で使用するプライマーセットについて、一方のプライマーは、前記ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端側の膜貫通ドメインをコードする塩基配列前後に結合可能なものとし、もう一方のプライマーはコラーゲン様ドメインよりもＣ末端側のアミノ酸配列をコードする塩基配列に結合可能なものを選べばよい。
　また、ＰＣＲは複数回に分けて行ってもよい。例えば、膜貫通ドメインからＣ末端側までを含むＳＲ－Ａ蛋白質をコードする塩基配列を増幅できるプライマーセットで１次ＰＣＲを行い、次いで１次ＰＣＲ産物を用いて、膜貫通ドメインのみを欠失させるプライマーセットで２次ＰＣＲを行ってもよい。

　また、前記プライマーとしては、適切な制限酵素サイトを付加したプライマーセットを用いればよい。また、ＴＡクローニングによりｐＣＲ　８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）や適切なクローニングベクターに前記１次又は２次ＰＣＲ産物を挿入することで、簡易にプラスミドベクターを構築できる。該プラスミドベクターは、公知の手法により、鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに使用することで、一次又は２次ＰＣＲ産物を大量に得ることができる。

　前記ＰＣＲの条件は、使用するＰＣＲ装置に添付のマニュアルに準じて適宜調整すればよい。

　本発明では、前記のようにして得られるＰＣＲ産物等を所定のベクターに挿入し、得られた組換えベクターを各種の動物培養細胞に導入する。
　本発明では、動物培養細胞を用いる点に一つの特徴がある。すなわち、後述の実施例に記載のように、前記組換えＳＲ－Ａ遺伝子を大腸菌や酵母に導入し発現させて得られる蛋白質は、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドへの結合能を備えていないものとなる。これに対して、動物培養細胞を用いた場合には、ＳＲ－Ａ蛋白質とはアミノ酸配列やコンフォメーションが相違しているにも関わらず、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドと結合できるという驚くべき特性を有する。

　前記所定のベクターとしては、分泌シグナルが入っている発現ベクターであればよい。本発明において、分泌シグナルとは、ベクターから翻訳された所望の蛋白質を宿主である動物培養細胞の外へ分泌させることを可能とするシグナルペプチドをコードする塩基配列をいう。分泌シグナルの種類は、動物培養細胞の種類に応じて適宜決定すればよい。また、分泌シグナルは、公知の遺伝子工学的な手段によって目的のプラスミドベクターに導入すればよいが、簡便性の観点から、分泌シグナルが入ったプラスミドベクターを用いることが好ましい。例えば、プラスミドベクターとしては、ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏベクター（インビトロジェン社製）が挙げられるが、これらに限定されない。また、分泌シグナルが入っているベクターとして、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等を用いてもよい。

　前記ベクターへのＰＣＲ産物の挿入は、例えば、予め制限酵素を用いて切断したＰＣＲ産物と、切断後配列が相補する制限酵素を用いて切断したベクターとを混合することで行うことができる。ここで、制限酵素としては、発現される可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が多量体のコンフォメーションを形成できるように、前記ＰＣＲ産物の内部配列を切断せず、前記ベクターの分泌シグナルの下流にあるクローニングサイトに存在するものであればよい。また、ＰＣＲ産物とベクターとのライゲーションの条件としては、市販のライゲーションキットを用いる場合には、キットに添付のマニュアルに従って適宜調整すればよい。

　前記のようにして得られる組換えベクターは、組換えＳＲ－Ａ遺伝子として、分泌シグナルの下流に、ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させたＳＲ－Ａ遺伝子を含むＤＮＡ構造物である。また、該ＤＮＡ構築物は、必要に応じてさらにタグ配列を含むことで、発現された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を効率よく精製することができる。タグ配列は、好ましくは前記ＳＲ－Ａ遺伝子の下流側あるいは上流側に配置されていればよい。タグ配列の種類としては特に限定はない。

　前記動物培養細胞としては、前記組換えベクターを導入して、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を産生することができ、かつ前記組換えベクターから発現される分泌シグナルペプチドに対応したものであればよい。中でも、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を細胞外に分泌することができる動物培養細胞としては、高密度培養が可能な細胞が好ましく、例えば、フリースタイル２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）が挙げられる。また、一過性発現でもよいし、安定発現株をセレクションにより得てもよい。

　前記動物培養細胞への組換えベクターの導入には、公知のトランスフェクション技術、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いたり、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポフェクション法等を用いればよい。このような方法により、前記動物培養細胞を形質転換することができる。

　本発明では、前記組換えベクターを導入した動物培養細胞を無血清培地で培養することで、前記動物培養細胞から前記無血清培地中に多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を産生させることができる。

　本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、前記のように細胞内ドメインから膜貫通ドメインが変異又は欠失されているため、前記動物培養細胞内で発現されても細胞膜にとどまることはなく、また、分泌シグナルペプチドにより動物培養細胞外に分泌される。したがって、本発明では、発現させたＳＲ－Ａ蛋白質を細胞膜中に存在させるような従来の製造方法に比べると、細胞膜の表面積等の物理的な制限がないため、連続的に大量に可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を製造することができる。また培養液の上清を動物培養細胞から分離するだけで可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質をきわめて容易に回収できる。なお、上清の分離手段としては、フィルターでのろ過、遠心分離等が挙げられる。

　前記無血清培地には、無蛋白質培地、化学合成培地も含まれる。また、無血清培地の組成、前記動物培養細胞の培養条件については、細胞の種類に応じて適切な条件を適宜選択すればよい。

　なお、ａ工程において、組換えＳＲ－Ａ遺伝子の変異・欠失の程度、動物培養細胞の種類によっては、発現される可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が多量体ではなく、単量体や３量体の割合が多い場合がある。この場合には、公知の手段、例えば、タグ配列を利用したクロスリンク技術などによって、単量体、３量体を材料として、多量体化にする処理を行ってもよい。

（ｂ工程）
　本発明では、次いでｂ工程として、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含む培養液又はその培養処理液を精製して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を回収する。
　具体的には、前記無血清培地から回収した培養液又はその培養処理液については、カラムクロマトグラフィー、有機溶媒分画、塩による分画、等電点分画、密度勾配遠心法、結晶化法等の手法を用いることで精製して、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を回収することができる。
　なお、培養処理液とは、培養液をフィルターでろ過したり遠心処理して不溶成分を取り除いた液を意味する。
　また、前記組換えベクターとしてタグ配列を含むベクターを使用した場合には、そのタグ配列に対して親和性のある担体を用いることで、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を容易に精製することができる。前記担体としては、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースカラム（インビトロジェン社製）等が挙げられるが、特に限定はされない。この場合の精製は製品に添付のマニュアルに準じて行えばよい。

　前記のようにして得られる可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条件下での分子量が約４０～７０ｋＤａとなり、かつ非変性条件下での分子量が６６０ｋＤａ以上となることから、３量体を超える、多量体のコンフォメーションを形成している蛋白質である。したがって、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、３量体を形成しているネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質とは異なった構造を有しているといえる。また、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、後述の実施例で確認されているように、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドと結合する特性を有するものである。

　以上の特性を有する本発明の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ＳＲ－Ａ蛋白質の代替物となるものであり、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いることで、従来は困難であった、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する評価系の構築が可能になる。

　前記評価系としては、例えば、ＳＲ－Ａ蛋白質へ結合することが未知である被検物質の親和性の評価方法が挙げられる。前記親和性を評価する方法としては、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に被検物質を混合して作用させることが挙げられる。かかる評価方法を用いることで、被検物質について、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質と結合するリガンド（修飾ＬＤＬ、β－アミロイド、終末糖化産物等）との親和性の違い評価できるだけでなく、前記被検物質がアゴニストまたはアンタゴニストであることをスクリーニングすることもできる。

　また、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質についてはリガンドへの結合力が高いことから、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に、被検物質と前記リガンドとを混合して作用させることで、ＳＲ－Ａ蛋白質と前記リガンドとの結合に対する被検物質の作用を評価することができる。かかる評価方法を用いることで、被検物質が、前記リガンドとＳＲ－Ａ蛋白質との結合を阻害したり、促進したりする物質であるかどうかをスクリーニングすることもできる。

　なお、前記２つの評価方法での作用は、被検物質、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質、リガンドなどが変性・変質したりしない溶媒中で行えばよい。また、被検物質の作用の程度については、後述の実施例に記載のような検査キットを用いて確認することができる。

　また、本発明では、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を、動物種を免疫するためのワクチン製剤とすることができる。

　本発明のワクチン製剤は、他の既知のワクチン製剤等と同様に、所定量の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を動物種に投与することによって該動物種を免疫することができ、他の既知のワクチン製剤等と同様にしてワクチン製剤の力価を評価することができる。本発明のワクチン製剤の投与経路は皮下注射が一般的であるが、この投与経路に限定されることはなく、例えば、静脈内又は筋肉内のような非経口投与や経口投与も採用し得る。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ程度の量を目安とし、投与は１～４回行うのが適当である。
　なお、本発明のワクチン製剤の製剤化の際には、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質とともに、担体及び希釈剤を、採用される投与経路にしたがって適宜使用することができる。

　また、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いて動物種を免疫することにより、動物種の免疫系で作製された抗血清又は抗体を得ることもできる。この抗血清及び抗体は、ＳＲ－Ａ蛋白質を選択的に認識できるものであり、従来の方法では困難であった、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する抗血清及び抗体となり得る。

　前記抗血清又は抗体の作製方法としては、抗血清、抗体を得るのに一般的に使用されている哺乳動物、例えば、ウサギ、マウス、ヒツジ、ヤギ、サル等に、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を所望のアジュバンド存在下あるいは非存在下で、投与して免疫したのち、前記動物種の血液等から抗血清や抗体を公知の手法により回収すればよい。抗血清を精製することでポリクローナル抗体を得てもよいし、ミエローマ細胞との細胞融合によりモノクローナル抗体を得てもよい。

　このようにして得られた抗血清や抗体は、静脈注射等の一般的な処置により、哺乳動物に投与することで、動物種内で細胞膜上に発現しているＳＲ－Ａ蛋白質に結合して、ＳＲ－Ａ蛋白質とリガンドとの結合を抑制する中和作用を持つものとなる。

　前記ワクチン製剤あるいは抗血清又は抗体のどちらを動物種に投与した場合においても、ＳＲ－Ａ蛋白質とリガンドとの結合は抑制されるため、ＳＲ－Ａ蛋白質が生体内リガンドと相互作用することで発症すると考えられる疾病、例えば、動脈硬化、炎症、凝固促進あるいはアルツハイマー等の予防及び治療に有効であると予想される。さらに、今後発見される可能性のあるＳＲ－Ａ蛋白質が関与している疾病の予防又は治療に対しても有効であると予想される。

　次に、本発明をその実施例によって具体的に説明する。
（実施例１）
　ヒトの脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、次のようなプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
　プライマー１：５´－tccttcaaagctgcactg－３´（配列番号１）
　プライマー２：５´－agagggccctgccctaatatg－３´（配列番号２）

伸長時間は１分間、アニーリング温度は５４℃とし、サイクル数は３０サイクルとした。このＰＣＲにより、膜貫通ドメインからＣ末端までのＳＲ－Ａ２蛋白質をコードする塩基配列を増幅させることができた。

　得られた１次ＰＣＲ産物の塩基配列を常法に基づいて調べたところ、ＳＲ－Ａ蛋白質（ＳＲ－Ａ２）をコードする１０７４個の塩基配列のうち、１４２～１０７４番目の塩基配列を含むものであった。
　次に、ＴＡクローニングによりｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に前記１次ＰＣＲ産物を挿入した。正しく１次ＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドベクターを回収し、このプラスミドベクターを以降の鋳型ＤＮＡとした。

　次にこの鋳型ＤＮＡを用い、次のようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
　プライマー３：５´－aaccaagcttctgaagtgggaaacg－３´（配列番号３）
　プライマー４：５´－ataagaatgcggccgcagagggccctgccctaatatg－３´（配列番号４）
　伸長時間は１分間、アニーリング温度は６３℃とし、サイクル数は３０サイクルとした。
　このＰＣＲにより、膜貫通ドメインを除く、スペーサードメインからＣ末端までのＳＲ－Ａ２蛋白質をコードする塩基配列（２２６～１０７４番目）を増幅させることができた。

　得られた２次ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩの各制限酵素で処理し、同制限酵素で予め処理したｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏベクター（インビトロジェン社製）のマルチクローニングサイトにフレームが合うように２次ＰＣＲ産物を挿入した。このようにして得られたＤＮＡ構造物は、分泌シグナルの下流に前記２次ＰＣＲ産物、その下流にタグ配列を含むものであった。正しくインサートが挿入されたプラスミドベクターをシーケンスにより確認した後に回収した。このプラスミドベクターをフリースタイル２９３－Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に形質転換し、前記細胞を培養して一過性発現を行った。なお、前記プラスミドベクターへの２次ＰＣＲ産物の挿入、形質転換及び一過性発現の条件は、インビトロジェン社が発行する製品マニュアルに準じた。

　培養４日後に培地を遠心分離して培養液を回収し、さらに０．４５μｍのフィルターを通すことにより細胞等の沈殿画分を除去して培養処理液を得た。培養処理液の一部をサンプリングした後に、予めリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した２ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社製）に負荷した。負荷後のカラムをＰＢＳで洗浄後し、さらに２５０ｍＭのイミダゾールを含む水溶液で溶出した。溶出画分は、さらにＰＢＳで透析処理し、これを可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質として以下の実験に用いた。

　得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質のアミノ酸配列について、常法（ＤＮＡシーケンス）を用いて確認したところ、ネイティブのＳＲ－Ａ２蛋白質と比較すると、Ｎ末端から膜貫通ドメインまでが欠失しており、細胞外ドメインであるスペーサードメイン、α－へリックスコイルドコイルドメイン、コラーゲン様ドメインを全て含んでいた。なお、Ｃ末端側には、タグ配列由来のアミノ酸も付加されていた。可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を表１に示す（配列番号５）。

　サンプリングした培養処理液及び最終標品である可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いて、常法に従いＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行った。さらに電気泳動後に常法に従いＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に転写し、１次抗体として抗ヒスチジンタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用い、２次抗体として西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）を用いて検出した。これらの結果を図１に示す。

　図１のように培養上清に分泌された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、抗ヒスチジンタグ抗体により転写膜上で発現が確認され、さらにＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムにより培養培地中から可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を精製濃縮することができた。このように、発現したＳＲ－Ａ蛋白質は抗ヒスチジンタグ抗体により検出されることからも、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が確かに発現・精製されていることが確認できる。
　可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質のアミノ酸配列から予想される単量体の分子量は約３５ｋＤであったが、図１に示されるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上では糖鎖付加等のために約４０～７０ｋＤの分子量として確認された。

　また、実施例１の方法により得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の非変性状態での分子量を、ゲル濾過カラムにより検証した。マーカー蛋白質４種類を用いて検量線の作成を行った結果を、図２に示す。図１、２の結果より、得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、可溶化ＳＲ－Ａ）は６６０ｋＤを超える分子量を有しており、単量体の分子量から換算して、３量体を超える多量体のコンフォメーションを持つことが確認できた。

　また、ゲル濾過カラムより算出された非変性状態での可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の分子量を精査したところ、得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、そのほとんどが多量体を形成した蛋白質であったが、抗ヒスチジンタグ抗体で認識される少量の単量体あるいは３量体を示す蛋白質群も含まれていた。単量体、３量体、多量体の各コンフォメーションの分画においては、得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質をさらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ＨＲゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社製）による分画を行った。
　次いで、以下の実施例２記載の方法でアセチル化ＬＤＬに対する各コンフォメーション構造を有する可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の親和性を測定したところ、図３のように多量体を形成した可溶化ＳＲ-Ａ蛋白質がアセチル化ＬＤＬに対して顕著に高い親和性を持つことも明らかとなった。また、図３の結果より、アセチル化ＬＤＬに対する結合は、多量体であるほど親和性が高いことが確認できる。

　以上のように、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質が結合しうるリガンドとの親和性については、多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が高かった。さらに発現した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質については、この多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が単量体や３量体に比べて、存在比率として主要な部分を占めていたことから、以降の実施例に使用する可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、単量体、３量体を除去するような更なる精製は行わなかった。

（試験例）
　実施例１で得られた２次ＰＣＲ産物を常法に従って大腸菌で発現させたところ、インクルージョンボディーを形成した不溶性画分となり、不活性な蛋白質が得られた。また、実施例１で得られた２次ＰＣＲ産物を常法に従って酵母において発現させたところ、分泌型の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が得られたものの、大腸菌同様に不活性な蛋白質であった。しかしながら、実施例１で示すように動物培養細胞を用いた場合には、可溶化蛋白質であるだけでなく、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドへ結合することができる活性型蛋白質として回収することができた。これらの結果を表２にまとめる。

　表２の結果から、動物培養細胞を用いることで初めて活性を有する可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を作製することができることがわかる。
　なお、大腸菌及び酵母細胞を用いて発現させた蛋白質が、ＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドとの結合能を喪失している原因の詳細は不明であるが、以下のように考えられる。大腸菌を用いた場合では、同じアミノ酸配列を有していても、正しい蛋白質のコンフォメーション（折りたたみ構造）を取れないために不溶性画分として回収され、アグリゲートを起こしているためであると考えられる。また、ＳＲ－Ａ蛋白質は動物細胞では糖鎖付加されるが、大腸菌では糖鎖付加が起こらないために、この糖鎖付加が活性蛋白質として必須の要素である可能性も十分に考えられる。また、酵母細胞は大腸菌と異なり蛋白質の翻訳語修飾が起こることは知られているが、ヒトなどの高等動物種とは異なった糖鎖付加修飾が起こることも知られている。よって、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質と同じアミノ酸配列を有していても、ヒトなど本来の糖鎖付加構造とは異なった糖鎖修飾等が生じたため、リガンドとの結合能が喪失していると考えられる。

（実施例２）
　実施例１により取得した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に対する評価系の構築は以下のように行った。ただし本実施例は評価系のなかの１例であり、特に限定されるものではない。
　マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ社製）をＥＬＩＳＡ用プレートとして用いた。上記のように精製した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳバッファーで調製し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むＰＢＳバッファー３００μｌを各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、５μｇ／ｍｌとなるように１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファー（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で調製したネイティブＬＤＬあるいはアセチル化ＬＤＬ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ社製）を、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファーで１０００倍希釈し、１００μｌずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×５回で洗浄し、３，３´，５，５´－テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）－ペルオキシダーゼ－酵素免疫測定（ＥＩＡ）－基質－キット試薬（バイオラッド社製）を１００μｌずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２Ｍ　Ｈ₂ＳＯ₄を５０μｌずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に波長４５０ｎｍの吸光度を測定して検出を行い、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する親和性をネイティブＬＤＬ又はアセチル化ＬＤＬの結合量として定量した。

　図４に示すように、得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ネイティブＬＤＬ（図中、ＬＤＬ）とは反応せず、アセチル化ＬＤＬ（図中、「ＡｃＬＤＬ」）に対して特異的、かつ濃度依存的に結合することが確認された。このように、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質と同じリガンド選択性を有していることが分かる。
　なお、図４中の概略図で示すように、固相化された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中「ｓＳＲＡ」）にアセチル化ＬＤＬ（図中「ＡｃＬＤＬ」）が結合し、このアセチル化ＬＤＬに対してアセチル化ＬＤＬに含まれるＡｐｏ－Ｂ１００を認識する西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（図中、「ａｎｔｉ-ＡｐｏＢ（ＨＲＰ）」）が結合することで、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に結合したアセチル化ＬＤＬの結合量を定量できる。一方、ＬＤＬは可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質と結合できないため、抗アポリポプロテイン抗体で検出されないことがわかる。また、図には示していないが、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の変わりにネガティブコントロールとして固相化したＢＳＡに対してはこれらのアセチル化ＬＤＬの結合は確認されなかった。

（実施例３）
　また、ネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質のリガンドとして知られるフコイダンを用い、フコイダンと可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質との結合を調べる実験を行った。この実験では、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を固相化するのではなく、フコイダンあるいはネガティブコントロールであるＢＳＡをプレートに固相化し、次いで可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を添加後に、定法に基づいて、１次抗体として抗ヒスチジンタグ抗体、及び２次抗体としてのＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ)をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。これらの実験操作方法以外の部分については、基本的に実施例２と同様に行った。結果を図５に示す。この場合において、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質はフコイダンに対して濃度依存的な結合特性を示したことからも、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質はネイティブなＳＲ－Ａ蛋白質が持つリガンドとの結合特性を有していることが確認された。
　なお、図５中の概略図で示すように、固定されたフコイダン（図中、Ｆｕ）には可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質（図中、ｓＳＲＡ）が結合するため、次いで可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に抗ヒスチジンタグ抗体（ａｎｔｉ-Ｈｉｓ）が結合し、さらに抗ヒスチジンタグ抗体に２次抗体であるＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ)をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（図示せず）を結合させることで、フコイダンに可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が結合していることが分かる。一方、ＢＳＡには可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は結合しないため、検出されないことがわかる。

（実施例４）
　実施例１の方法により得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用い、実施例２の方法において、ブロックエースを各ウェルにアプライして４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製した複数のエキスを１００μｌずつ各ウェルにアプライした。以降は、実施例２の方法と同様にネイティブＬＤＬ又はアセチル化ＬＤＬをアプライし、キット試薬を用いて、複数のエキスによるアセチル化ＬＤＬとの結合阻害反応をＥＬＩＳＡで評価した。結果を図６に示す。

　なお、前記エキスは、以下のように、ＳＲ－Ａ蛋白質を発現した細胞を用いた予備試験により、エキスのＳＲ－Ａ蛋白質に対する親和性を評価することで選択した。
　ＳＲ－Ａ蛋白質の全長を安定的に発現しているＣＨＯ細胞（以下、安定発現株）を用いて、植物あるいは食品に由来するエキス約５００種類についての予備試験を行った。２４ウェルプレート（ファルコン社製）に５．０×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに０．５ｍＬずつ１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨａｍＦ１２培地のもとで細胞のまき込みを行い、３７℃、５％のＣＯ₂濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清０．２５ｍＬを除去し、各エキスを適当な希釈倍率で含む０．２５ｍＬの新しい培養液を添加した。エキスを含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、ＳＲ－Ａ蛋白質へのエキスの結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である１，１´－ジオクタデシル－３，３，３´，３´－テトラメチルインドカルボシアニン　パーコレート（ＤｉＩ）で標識したアセチル化ＬＤＬを５μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加し、同条件で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水で３回ウェルを洗浄し、最終的に１２５μｌの０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で細胞を溶解した。溶解液の蛍光波長は、励起光５３０ｎｍ、蛍光５９０ｎｍで測定し、同溶解液の蛋白質量で除した値を細胞あたりのＤｉＩ－アセチル化ＬＤＬの取り込み量とした。
　その結果、ＳＲ－Ａ蛋白質に対して親和性を有するエキスが複数見つかったので、２種類のエキスをエキスポジ１、２として採用した。一方、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する親和性のないエキスのうち適当に３種類を選択し、これをエキスネガ１～３として採用した。

　図６に示すように、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いることにより、ＳＲ－Ａ蛋白質とアセチル化ＬＤＬとの結合を阻害あるいは促進する物質等を多検体でスクリーニングすることが可能となった。また、これらの結果より、ＳＲ－Ａ蛋白質と親和性のないエキス（エキスネガ１～３）に対してはアセチル化ＬＤＬの結合は阻害されず、ＳＲ－Ａ蛋白質と親和性のあるエキス（エキスポジ１、２）に対してのみアセチル化ＬＤＬの結合が特異的に阻害されていた。このことから、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いた評価系の結果は、細胞上のネイティブなＳＲ－Ａ蛋白質を利用した予備試験を用いた結果と、相関性があることも確認された。これらの結果から、ネイティブなＳＲ－Ａ蛋白質を持つ細胞を用いた評価系に比べて、よりシンプルである可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いた評価系では、他因子に影響されない条件下で、ＳＲ－Ａ蛋白質と評価対象物質のみで構成される直接的な結合特性を解析することが可能となった。

（実施例５）
　実施例１で得られた多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を抗原とし、ウサギ（体重２．５ｋｇ、雌）を免疫動物としてポリクローナル抗体の作製を行った。ウサギ２羽に対し、１回の免疫量を０．２ｍｇとなるように実施例１で得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質でウサギのフットパッドに２回免疫した。免疫日は０、４週目の２回免疫とし、０、５週間目に各々１ｍｌの採血を行い、測定用の血清として用いた。また、免疫期間は計６週間で行った。６週間後に全採血を行い、ウサギ１羽より約５５ｍｌの血清を得ることができた。

　得られた血清を同量のプロテインＡ結合用バッファー（１．５Ｍ　グリシン、３Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）と混合し、０．４５μｍのフィルター濾過後にプロテインＡアフィニティーカラム（バイオラッド社製）に負荷した。プロテインＡアフィニティーカラムに３回負荷した後に、２０カラムボリュームのプロテインＡ結合用バッファーで非特異的に結合した蛋白質群を除去した。その後、３カラムボリュームを１溶出画分として、１０溶出画分を溶出バッファー（５０ｍＭ　グリシン、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ２．８）により溶出し、分画した。なお、各溶出チューブには予め１／１０容量となるように１．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加しておき、溶出し分画と同時に中和した。ＩｇＧが含まれていた溶出画分は、さらに限外ろ過膜を用いて遠心分離して濃縮し、最終的に０．４５μｍのフィルター濾過により無菌サンプルとした。また、得られた各溶出画分のＩｇＧ濃度は波長２８０ｎｍの吸光度を測定することにより濃度換算を行った。

　可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に対する血清中の抗体量を定性的に判断するために、ウェスタン解析を行った。５００ｎｇ／レーンで可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を電気泳動し、電気泳動後のゲルから定法により転写膜に転写した。５％スキムミルクを含むブロッキング溶液でブロッキングした後に、ＰＢＳバッファーなどで１０００倍希釈した血清、あるいは抗ヒスチジンタグ抗体を1次抗体として反応させた。前記血清又は抗体をＰＢＳバッファーで洗浄後に、血清は抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、抗ヒスチジンタグ抗体については抗マウスＩｇＧ抗体を各々２次抗体として用い、定法に従って検出を行った。結果を図７に示す。
　図７で見られるように、免疫前の血清（図中、Ｐｒｅ－ｉｍｍｕｎ）と比較して免疫後の血清（図中、Ｐｏｓｔ－ｉｍｍｕｎ）には可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を認識する抗体ができていることが確認された。この結果から、免疫後の血清において可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に対する抗体（抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体）が多量に含まれているため、抗血清が得られていることが分かる。

　次に、上記のようにプロテインＡアフィニティーカラム（バイオラッド社製）で製品に添付のマニュアルに従い精製された抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体（イムノグロブリンＧ画分）を用いて、実施例２に準じて、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質とアセチル化ＬＤＬとの結合阻害能をＥＬＩＳＡで調べた。具体的には、実施例２に記載の方法において、ブロックエースを各ウェルにアプライして４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μｌ×２回で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製した抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体を１００μｌずつ各ウェルにアプライした。以降は、実施例２の方法と同様にネイティブＬＤＬ又はアセチル化ＬＤＬをアプライし、キット試薬を用いて、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体によるアセチル化ＬＤＬとの結合阻害反応をＥＬＩＳＡで評価した。
　その結果、図８に示すように、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体は、ＳＲ－Ａ蛋白質とアセチル化ＬＤＬとの反応を濃度依存的に抑制することが可能な中和抗体であることが、ＥＬＩＳＡでの結果より確認された。
　このことから実施例１で得られた多量体を形成した可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は抗原として使用でき、得られた抗体は中和抗体として利用可能なことも確認された。また、図８の結果から、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体の力価を、市販されている唯一の中和抗体である抗ＳＲ－Ａモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓ　Ｇｅｎｉｃ　Ｉｎｃ．より入手）と比較したところ、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体の力価が顕著に高いことが分かった。

（実施例６）
　ヒト単球様細胞株であるＴＨＰ－１細胞は、ＰＭＡ（ホルボール－１２‐ミリスタート－１３－アセタート）処理することにより、マクロファージに分化することが知られており、さらにこの分化したマクロファージには、ＳＲ－ＡやＣＤ３６等のスカベンジャー受容体が発現することも知られている。そこで、２４ウェルプレート（ＢＤファルコン社製）に５×１０⁵個／ｍｌとなるようにＴＨＰ－１細胞（独立行政法人理化学研究所より入手）のまき込みを行い、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１００ｎＭ　ＰＭＡを添加することでマクロファージへの分化誘導を行った。３７℃、５％のＣＯ₂条件下で３日間培養を行い、接着細胞へと変化した細胞をマクロファージとして使用した。３日間の培養後、新しい培地と交換した。新しい培地への交換後に、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体又はウサギＩｇＧ（市販品）等の抗体を適切な濃度となるように添加し、同条件で３０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、カルボシアニン蛍光色素である１，１´－ジオクタデシル－３，３，３´，３´－テトラメチルインドカルボシアニン　パーコレート（ＤｉＩ）で標識したアセチル化ＬＤＬを５μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加し、同条件で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水で３回ウェルを洗浄し、最終的に１２５μｌの０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で細胞を溶解した。溶解液の蛍光波長は、励起光５３０ｎｍ、蛍光５９０ｎｍで測定し、同溶解液の蛋白質量で除した値を細胞あたりのＤｉＩ－アセチル化ＬＤＬの取り込み量とした。結果を図９に示す。
　なお、図中、「＋ＩｇＧ」は、ネガティブコントロールであるウサギＩｇＧ（市販品）でマクロファージ細胞を前処理した結果を示し、「＋Ａｎｔｉ-ｓＳＲＡ」は抗可溶化ＳＲ－Ａ抗体でマクロファージを前処理した結果を示す。

　図９で示されるように、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体は、ウサギＩｇＧに比べて、アセチル化ＬＤＬについて細胞内への取り込みを有意に（ｐ＜０．０５）阻害していることから、マクロファージ細胞上のネイティブなＳＲ－Ａ蛋白質に対しても抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体は中和抗体として機能することが確認できた。一方、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に対する抗体を含まないウサギＩｇＧを用いた場合、アセチル化ＬＤＬの細胞内への取り込みは、ウサギＩｇＧを用いない場合に比べて、有意差があるとはいえなかった（図中、ＮＤ）。

（実施例７）
　実施例１で得られた可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いて、日本エスエルシー株式会社より入手した自然発症脳卒中モデルラット（ＳＨＲＳＰ／Ｉｚｍ系、雄、８週齢）の腸間膜動脈における脂質沈着数に対する抑制能を評価した。

　上記ラットは、日本クレア（株）製のＨｉｇｈＦａｔＤｉｅｔ特殊飼料（コール酸ナトリウム、α―トコフェロール抜き）及び生理食塩水（大塚製薬社製）を自由摂取の形態で与え、３週間を飼育期間とした。

　尾静脈注射による可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質の投与は、高脂肪食負荷前に２週間に１回ずつの頻度で合計３回投与し、投与量は２５０μｇ／匹で行った。コントロールとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を同量・同回数で投与した。

　また、自然発症脳卒中モデルラットを用いた腸間膜動脈の脂質沈着に関する実験は、既報
（ＪａｐａｎｅｓｅＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．３９，ｐ６０１－６０９，１９７５）を参考に、下記のように変法して行った。

　３週間の各高脂肪食負荷後に、ジエチルエーテルでラットの吸入麻酔を行い、開腹・開胸を行った。開腹・開胸したラットから腸間膜動脈を周囲脂肪組織とともに摘出し、摘出後にＰＢＳバッファー中でピンセットを用いながら腸間膜動脈の周囲脂肪組織を除去した。得られた腸間膜動脈を６０％イソプロパノールで洗浄・平衡化した後に、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液による腸間膜動脈に沈着した脂質の染色を行い、６０％イソプロパノール／３０％イソプロパノール／ＰＢＳバッファーへと段階的にイソプロパノール濃度を下げながら脱色操作を行った。最終的に、顕微鏡下でＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色により染色された脂質沈着数を計測した。なお、染色後に脂質沈着はリング状で観察されることから、１リングを１個の沈着数として測定した。２人による測定を行い、その２人の平均値をｎ＝１での測定数とした。

　図１０は、ワクチン製剤として可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を尾静脈より投与した時に、３週間後に腸間膜動脈で形成された脂質沈着数を動脈硬化の指標として解析したグラフである。この図で示されるように、このようにコントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同様に静脈注射したラット（図中、ＢＳＡ　ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含むワクチン製剤を用いた場合（図中、可溶化ＳＲ－Ａ）の方が、有意に（ｐ＜０．０５）動脈での脂質沈着を抑制していることが分かる。したがって、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を静脈から投与することにより、短期間で抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体の産生誘導を行うことが可能となり、抗可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質抗体が生体内の細胞膜上に発現しているネイティブのＳＲ－Ａ蛋白質と結合して、ＳＲ－Ａ蛋白質における変性ＬＤＬ等のリガンドとの結合を阻害した結果、動脈硬化を短期間で効果的・有意に抑制することが可能であることが確認できた。即ち、前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質は、抗動脈硬化用のコンポーネントワクチン製剤として使用できることがわかる。

　なお、前記ワクチン製剤を投与したラットには、体重が減少したり、疾患や異常行動は見られなかったことから、前記ワクチン製剤は安全性に優れることがわかる。

　また、図１１は前記高脂肪食負荷後３週間で採血したラット血清を用い、ウェスタン解析において中和抗体が誘導・産生されているか否かを検証した図である。図１１から、ＳＲ－Ａ蛋白質に対する抗体が、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を免疫したラット血清（図中、ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｓｅｒｕｍ）中には存在し、コントロールであるＢＳＡ投与のラットの血清（図中、ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｅｒｕｍ）では検出されていないことがわかる。この結果を踏まえると、可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を投与することにより、ラットにおいて抗ＳＲ－Ａ抗体が短期間で誘導・産生され、その結果として図１０に見られるように動脈硬化の指標となる腸間膜動脈での脂質沈着数が減少したと考えられた。

　本発明は、その好ましい態様を参照して、詳細に示され、かつ記載されているが、形態及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずに、本明細書中でなされ得ることは、当業者によって理解される。
　例えば、上記実施例において、ＳＲ－Ａ蛋白質として、ヒトの脾臓由来のＳＲ－Ａ２以外のＳＲ－Ａ1、ＳＲ－Ａ３又はＭＡＲＣＯを用いることもできるし、他の哺乳動物由来のＳＲ－Ａ蛋白質を用いることもできる。
　組換えＳＲ－Ａ遺伝子としては、実施例１の一次ＰＣＲ産物を使用することもできる。また、別のプライマーセットを用いることで、ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ－Ａ遺伝子を作製することもできる。
　また、動物培養細胞の種類を、フリースタイル２９３Ｆ細胞以外のものに変更することもできる。さらに免疫化に用いる動物を、ウサギ、ラット以外の動物に変更することもできる。

Claims

　以下のａ工程及びｂ工程を含むことを特徴とする、可溶化クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ－Ａ）蛋白質の製造方法。
ａ工程：ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させた組換えＳＲ－Ａ遺伝子を導入した動物培養細胞を、無血清培地で培養して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を産生させる工程。
ｂ工程：可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含む培養液又はその培養処理液を精製して可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を回収する工程。
　前記組換えＳＲ－Ａ遺伝子として、分泌シグナルの下流に、ＳＲ－Ａ蛋白質のＮ末端から膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異又は欠失させたＳＲ－Ａ遺伝子と、タグ配列とを含むＤＮＡ構造物を用いる請求項１に記載の製造方法。
　前記可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質が多量体を形成している請求項１又は２記載の製造方法。
　請求項１～３いずれか記載の製造方法で製造された可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質。
　請求項４記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を含むワクチン製剤。
　請求項４記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に、被検物質を作用させる工程を有することを特徴とするＳＲ－Ａ蛋白質に対する被検物質の親和性の評価方法。
　請求項４記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質に、被検物質とリガンドとを作用させる工程を有することを特徴とする、ＳＲ-Ａ蛋白質とリガンドの結合に対する被検物質の作用の評価方法。
　請求項４記載の可溶化ＳＲ－Ａ蛋白質を用いて、動物種を免疫することにより作製された抗血清又は抗体。
　生体内でＳＲ－Ａ蛋白質とそのリガンドとの結合を抑制するような中和作用を持つ請求項８記載の抗血清又は抗体。