JP2017178908A - 改変型組換えFcγRIIb - Google Patents
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Description
(1)配列番号1の68番目のイソロイシンのバリンへの置換。
(2)配列番号1の84番目のセリンのトレオニンへの置換。
(3)配列番号1の125番目のヒスチジンのアルギニンへの置換。
(4)配列番号1の158番目のリジンのメチオニンへの置換。
(5)配列番号1の162番目のアルギニンのヒスチジンへの置換。
(6)配列番号1の188番目のチロシンのアスパラギンへの置換。
(7)配列番号1の190番目のロイシンのセリンへの置換。
ヒトFcγRIIbのアミノ酸配列(UniProtデータベースにアクセッションナンバーP31994−1として登録・公開)基にDNAworks法(Nucleic Acid Res.,30,e43頁,2002年)を用いて、コドンを大腸菌型に変換し、配列番号8に示すヒトFcγRIIbのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を設計した。
(1)pETMalE21ベクターの構築
鋳型DNAとして特開2012−147772号公報で開示されているプラスミドベクターpETMalEFcR−p7を、PCRプライマーとして配列番号51および配列番号52に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてPCRを実施した。PCRは、表3に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、98℃で10秒間の第1ステップ、50℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル繰り返すことで実施した。得られたPCR産物をMalE21p1と命名した。
鋳型DNAとして実施例1に記載のプラスミドベクターpUC−FcγRIIbを、PCRプライマーとして配列番号53および配列番号54に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてPCRを実施した。PCRは、表3に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、98℃で5分の熱処理後、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル繰り返した後、72℃で5分処理後に4℃に冷却することで実施した。得られたPCR産物をFcγRIIb−p1と命名した。
発現ベクターpET−FcγRIIbのうち、制限酵素XbaI認識配列からHindIII認識配列までのポリヌクレオチドの配列を配列番号55に示す。
形質転換体FcγRIIbを、50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地に前培養液を1%(v/v)接種し、37℃で好気的に振とう培養を行なった。培養開始1.5時間後、培養温度を20℃に変更して30分間振とう培養後、終濃度0.01mMとなるようIPTGを添加し、引き続き20℃で22時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、BugBuster Protein extraction kit(Novagen社製)を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。調製した可溶性タンパク質抽出液中の組換えFcγRIIbの濃度を、以下に記すEnzyme−linked immunosorbent assay(ELISA)−1により測定した。
(1)ランダム変異導入ライブラリーの構築
エラープローンPCR法を用いて、組換えFcγRIIbをコードするポリヌクレオチドにランダムに変異を導入した。鋳型DNAとして発現ベクターpET−FcγRIIbを、PCRプライマーとして配列番号51および配列番号56に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンPCRは、表4に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を95℃で2分間熱処理し、95℃で30秒間の第1ステップ、60℃で30秒間の第2ステップ、72℃で90秒間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル繰り返し、最後に72℃で7分間熱処理することで実施した。得られたPCR産物をEPと命名した。
(2)生産性の向上した改変型組換えFcγRIIbの1次スクリーニング
前記の組換えFcγRIIbのランダム変異導入ライブラリーの各コロニー(約1800)を、50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地400μLに接種し、96穴ディープウェルプレートを用いて、37℃で好気的に一晩振とう培養した。培養後、20μLの培養液を600μLのLB培地(0.05mMのIPTG、0.3%のグリシン、および50μg/mLのカナマイシンを含む)に植え継ぎ、96穴ディープウェルプレートを用いて、さらに20℃で好気的に24時間振とう培養した。培養後、遠心操作により得られる培養上清を改変型組換えFcγRIIbサンプル溶液とした。次いで、50mMのTris−HCl緩衝液(pH8.0)を用いて5倍希釈した各改変型組換えFcγRIIbサンプル溶液について、それに含まれる可溶性の改変型組換えFcγRIIbの量を下記に示すELISA−2により評価した。
1次スクリーニングで選抜した各形質転換体を、50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地に前培養液を1%(v/v)接種し、37℃で好気的に振とう培養を行なった。培養開始1.5時間後、培養温度を20℃に変更して30分間振とう培養後、終濃度0.01mMとなるようIPTGを添加し、引き続き20℃で22時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、BugBuster Protein extraction kit(Novagen社製)を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。調製した可溶性タンパク質抽出液中の可溶性の改変型組換えFcγRIIbの濃度を、以下に記す改変型組換えFcγRIIbとIgGの結合性を利用した測定法であるELISA−3により測定した。
実施例3で判明したアミノ酸の置換のうちの5つのアミノ酸の置換(Ile68Val、Ser84Thr、Lys158Met、Arg162HisおよびTyr188Asn)を有する改変型組換えFcγRIIbであるFcγRIIb−m5を発現する形質転換体の作製を以下の方法で行った。
実施例3で判明したアミノ酸の置換のうちの7つのアミノ酸の置換(Ile68Val、Ser84Thr、His125Arg、Lys158Met、Arg162His、Tyr188AsnおよびLeu190Ser)を有する改変型組換えFcγRIIbであるFcγRIIb−m7を発現する形質転換体の作製を以下の方法で行った。
実施例2の形質転換体FcγRIIb、実施例3の形質転換体m1、実施例4の形質転換体m5、および実施例5の形質転換体m7を、それぞれ50μg/mLのカナマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
Claims (7)
- 以下の(a)または(b)の改変型組換えFcγRIIb。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、以下の(1)から(7)に記載のアミノ酸の置換を1つ以上含むアミノ酸配列からなる改変型組換えFcγRIIb
(1)配列番号1の68番目のイソロイシンがバリンに置換
(2)配列番号1の84番目のセリンがトレオニンに置換
(3)配列番号1の125番目のヒスチジンがアルギニンに置換
(4)配列番号1の158番目のリジンがメチオニンに置換
(5)配列番号1の162番目のアルギニンがヒスチジンに置換
(6)配列番号1の188番目のチロシンがアスパラギンに置換
(7)配列番号1の190番目のロイシンがセリンに置換
(b)上記(a)の組換えFcγRIIbのアミノ酸配列において、上記(1)から(7)に記載のアミノ酸の置換を除く領域中に1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつIgG結合性を有する改変型組換えFcγRIIb。 - 配列番号2から配列番号4のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の改変型組換えFcγRIIb。
- 請求項1または2のいずれかに記載の改変型組換えFcγRIIbをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項4に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる改変型組換えFcγRIIbを生産可能な形質転換体。
- 宿主が大腸菌である、請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項5または請求項6に記載の形質転換体を培養することにより改変型組換えFcγRIIbを生産する工程、得られた培養物から生産された改変型組換えFcγRIIbを回収する工程の2つの工程を含む改変型組換えFcγRIIbの製造方法。
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