CN108884455A - 治疗酶的偶联装配体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及偶联装配体,其中免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连结部分偶联至治疗酶;并且涉及偶联装配体,其中非肽聚合物连结部分特异性地偶联至免疫球蛋白Fc;其生产方法;和包含其的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及治疗酶的缀合物、制备该缀合物的方法和包含该缀合物的组合物,在该缀合物中免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接至治疗酶。
背景技术
通常地,蛋白质比如治疗酶具有低稳定性并且因而容易被血液中的蛋白水解酶修饰并分解。因此,为了维持这些蛋白质的血液浓度和效能,将它们频繁地施用至患者是必要的。但是,在施用至患者的蛋白质药物大多数处于注射形式的情况下,频繁的注射以维持活性多肽的血液浓度可能使得患者遭受过度痛苦。为了解决这些问题,存在不断的努力以通过增加治疗酶的血液稳定性并以高水平维持它们的血液浓度持续较长时间段来最大化药理学功效。需要治疗酶的这种长效制剂以增加治疗酶的稳定性并同时以维持药物自身的效能处于足够高水平,以及不引起患者中的免疫反应。
具体而言,溶酶体贮积病(LSD)是由具体酶中的遗传缺陷引起的致命性紊乱,其可能引起死亡,并且替代疗法对于缺损酶的治疗是必不可少的(Frances M.Platt et al.,JCell Biol.2012Nov 26;199(5):723-34)。酶替代疗法是溶酶体贮积病的标准疗法,并且该疗法通过替代缺陷酶具有缓解现有症状或延迟疾病进展的效果。但是,由于要求每一或两周一次持续2小时至6小时的连续静脉内施用药物,患者和他们的家庭成员的日常生活可能被限制。由于用于治疗人中的溶酶体贮积病的重组酶的半衰期是非常短的——在10分钟至少于3小时的范围内,因此要求终生施用重组酶,因而引起患者的不便。因此,延长重组酶的半衰期具有高度必要性。
另外地,对于研发用于溶酶体贮积病的治疗剂存在增加的需要,这是由于如下问题:用于治疗溶酶体贮积病的酶的体内贮存位置彼此不同,治疗酶未能到达骨髓等。
发明内容
[技术问题]
本发明的目标是提供酶缀合物,在该酶缀合物中治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的另一个目标是提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含该酶缀合物。
本发明的仍另一个方面是提供用于制备该酶缀合物的方法。
[发明的有益效果]
本发明涉及治疗酶缀合物,并且具体地涉及如此酶缀合物:在该酶缀合物中治疗酶、非肽聚合物连接部分和免疫球蛋白Fc通过共价键连接在一起,从而具有增强的转胞吞作用、体内生物利用度、组织分布、和骨髓靶向性以及酶的体内持续时间。通过本发明制备的酶缀合物可以有效地用于治疗溶酶体贮积病(LSD)。
[附图说明]
图1示出芦荟糖苷酶(半乳糖苷酶,agalsidase)β缀合物的PK实验的结果。
图2示出芦荟糖苷酶β缀合物的体外酶活性的结果。
图3示出长效芦荟糖苷酶β缀合物的体外细胞内摄取活性的结果。
图4示出伊米苷酶缀合物的体外酶活性的结果。
图5示出加硫酶(galsulfase)缀合物的体外酶活性的结果。
图6示出艾杜糖苷酸酶缀合物的体外酶活性的结果。
[技术方案]
本发明的一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
在具体实施方式中,酶选自β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、乙酰辅酶A-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺6-硫酸酯酶(GALN)、透明质酸酶、α-岩藻糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶(唾液酸酶)、N-乙酰-葡糖胺-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白(mucolipin)-1、α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、N-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、LAMP-2、cystinosin、唾液酸转运蛋白(sialin)、神经酰胺酶、酸性-β-葡糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、NPC1、组织蛋白酶A、SUMF-1、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和三肽基肽酶1。
本发明的另一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
在具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中溶酶体贮积病(LSD)选自粘多糖贮积病(MPS)、糖原贮积病和鞘类脂累积病。
在另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中粘多糖贮积病(MPS)选自粘多糖贮积病I型(MPS I)和粘多糖贮积病VI型(MPS VI)。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中糖原贮积病是蓬珀病。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中鞘类脂累积病选自法布里病和高歇病。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中该酶缀合物相比于不与免疫球蛋白Fc区连接的酶具有增加的转胞吞作用和生物利用度(BA)。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中转胞吞作用通过免疫球蛋白Fc区与新生Fc受体(FcRn)之间的结合介导。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中酶缀合物相比于不与免疫球蛋白Fc区连接的酶具有增加的组织分布。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中酶缀合物相比于不与免疫球蛋白Fc区连接的酶具有增加的骨髓靶向性。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是无糖基化的(aglycosylated)。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区包括选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四种结构域。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区包括铰链区。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是具有不同起源的结构域的杂化物,所述结构域源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白——其由相同起源的结构域构成——组成的二聚体或多聚体。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc片段。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中免疫球蛋白Fc区是人无糖基化的IgG4Fc片段。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中酶缀合物是在其中非肽聚合物连接部分连接至酶的N端的酶缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含酶缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含α-半乳糖苷酶A缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含艾杜糖苷酸酶缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含α-葡糖苷酶缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含伊米苷酶缀合物。
在具体实施方式中,本发明提供药物组合物,其中该药物组合物增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接。
在具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中酶选自β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、乙酰辅酶A-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺6-硫酸酯酶(GALN)、透明质酸酶、α-岩藻糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶(唾液酸酶)、N-乙酰-葡糖胺-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、N-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、LAMP-2、cystinosin、唾液酸转运蛋白、神经酰胺酶、酸性-β-葡糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、NPC1、组织蛋白酶A、SUMF-1、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和三肽基肽酶1。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中α-半乳糖苷酶A和非肽聚合物连接。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中芳基硫酸酯酶B(ARSB)和非肽聚合物连接。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中艾杜糖苷酸酶和非肽聚合物连接。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中α-葡糖苷酶和非肽聚合物连接。
本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中伊米苷酶和非肽聚合物连接。
在具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合。
在另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中非肽聚合物是聚乙二醇。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中步骤(a)的非肽聚合物的反应性基团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中醛基选自丙醛基或丁醛基。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、戊酸琥珀酰亚胺酯、甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙酸琥珀酰亚胺酯、丁酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺、或碳酸琥珀酰亚胺酯。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中非肽聚合物在两个末端处具有作为反应性基团的醛基。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中非肽聚合物分别在两个末端处具有作为反应性基团的醛基和马来酰亚胺基。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供酶缀合物,其中非肽聚合物分别在两个末端处具有作为反应性基团的醛基和琥珀酰亚胺基。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备酶缀合物的方法,其中该方法进一步包括将非肽聚合物连接部分连接至酶的N端的连接物质分离的步骤。
[具体实施方式]
在下文,将详细地描述本发明的示例性实施方式。同时,本文公开的说明和示例性实施方式中的每种可以运用于其它说明和示例性实施方式。即,本文公开的各种因素的所有组合属于本发明的范围。而且,本发明的范围不应当被下文提供的具体公开内容限制。
为了实现上述目标,本发明的一方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
具体地,酶缀合物可以是在其中非肽聚合物连接部分连接至免疫球蛋白Fc区和酶的酶缀合物。
在本发明的具体实施方式中,酶缀合物是通过使非肽聚合物与游离Fc区和游离酶反应获得的酶缀合物,其中在重复单元的种类、数目和位置方面,非肽聚合物与非肽聚合物连接部分是相同物质。在游离Fc区和游离酶的反应中使用的非肽聚合物可以是在重复单元的两个末端处具有反应性末端基团的物质,其化学结构不同于重复单元的化学结构。在这样的用于制备酶缀合物的过程中,获得酶缀合物,其中非肽聚合物的重复单元通过在由化学反应转化反应性末端基团时生成的共价键连接至酶和Fc区,其中与游离酶和游离免疫球蛋白Fc区的每个化学反应通过非肽聚合物的反应性末端基团引起。即,在本发明的具体实施方式中,非肽聚合物通过制备过程转化为酶缀合物内的非肽聚合物连接部分。
可以包含在本发明的酶缀合物中的酶不被具体地限制,而是可以包括通过将其制备为本发明的酶缀合物——而不是未缀合形式的酶——而延长其体内持续时间可以获得优势的任何酶。在本发明的示例性实施方式中,酶缀合物是治疗酶的缀合物。
具体地,酶缀合物可以是如此酶缀合物,在其中酶选自β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、乙酰辅酶A-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺6-硫酸酯酶(GALN)、透明质酸酶、α-岩藻糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶(唾液酸酶)、N-乙酰-葡糖胺-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、N-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、LAMP-2、cystinosin、唾液酸转运蛋白、神经酰胺酶、酸性-β-葡糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、NPC1、组织蛋白酶A、SUMF-1、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和三肽基肽酶1,但是可以治疗溶酶体贮积病(LSD)的任何酶可以非限制地包含在本发明中,不管酶的种类或起源如何。
本发明的另一个方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
如本文所使用,术语“治疗酶”或“酶”指用于治疗由于酶的缺乏、缺陷、功能障碍等出现的疾病的酶,并且该酶可以通过酶替代疗法、施用等治疗患有该疾病的对象。具体地,酶可以是用于治疗由于溶酶体酶的缺乏、缺陷等可能出现的疾病的酶,但是不限于此。
如本文所使用,术语“溶酶体”——其为存在于细胞质中的细胞器中的一种——包含许多水解酶并分解体内不需要的物质比如大分子、细菌等,并帮助分解的产物在细胞的其它部分中被利用。溶酶体的功能可以通过许多酶执行。当具体酶由于突变、缺陷等失去其功能时,其引起溶酶体分解功能的丧失并导致细胞中必须被分解的大分子等的积累并诱导细胞损伤等,从而引起疾病。
如本文所使用,术语“溶酶体贮积病(LSD)”指由于上述溶酶体功能的丧失而导致的罕见遗传疾病,并且酶促替代疗法对于缺损或缺陷酶的补充是必不可少的。在本发明中,术语“溶酶体贮积病”与“溶酶体贮积紊乱”可以可互换地使用。可以基于缺损或缺陷酶将溶酶体贮积病分类为(i)鞘类脂累积病、(ii)粘多糖贮积病、(iii)糖原贮积病、(iv)粘脂糖症、(v)寡糖症、(vi)脂沉积症、(vii)溶酶体运输疾病等。
在下文,将根据其分类详细描述溶酶体贮积病。
如本文所使用,术语“鞘类脂累积病”指使鞘脂的糖侧链或胆碱侧链水解的溶酶体酶的遗传缺陷综合征。本文包括根据每种贮存脂质的分布分类的疾病,比如由半乳糖脑苷脂酶的缺陷引起的克腊比病、由α-半乳糖苷酶A的缺陷引起的法布里病、由鞘磷脂酶的缺陷引起的尼-皮二氏病、由葡糖脑苷脂酶的缺陷引起的高歇病、由氨基己糖苷酶A的缺陷引起的泰-萨二氏病等,并且它们对应于常染色体隐性遗传病,除了为X伴性遗传病的法布里病之外。
如本文所使用,术语“法布里病(还称为法布里氏病)”指由α-半乳糖苷酶A——存在于溶酶体中的水解酶——的活性的缺乏引起的糖脂代谢的先天性障碍的疾病,并且其是X连锁隐性遗传的遗传疾病。法布里氏病在儿童时期早期期间不显示明显症状,但是四肢疼痛和湿疹等从儿童时期出现,并且在青春期之后出现心血管表现和肾病变。其治疗可以包括酶促替代疗法、基因疗法等。
如本文所使用,术语“高歇病”指由于遗传病导致缺乏葡糖脑苷脂酶而引起的脂代谢的先天性障碍的疾病,并且具体地,其是常染色体(1号染色体)隐性遗传病。该疾病由肝脏、脾脏和骨髓中的老细胞的积累引起。在严重的情况下,已知该疾病可以转移入眼睛、肾脏、心脏和神经系统并因而引起并发症。其治疗可以包括酶促替代疗法、基因疗法等。
如本文所使用,术语“粘多糖贮积病(MPS)”指粘液多糖的遗传水解酶缺陷的综合征,并且其已知由分解糖链的酶、硫酸酯酶、乙酰转移酶等的缺陷引起,并且也被称为软骨代谢障碍病(gargoylis)。粘多糖贮积病(MPS)的主要症状是尿液中粘多糖的过多排泄。目前,MPS可以分类为6种疾病类型,其中I型包括胡尔勒综合征和谢伊综合征;II型包括亨特综合征;III型包括A、B、C和D型桑菲列普综合征;IV型包括莫尔基奥综合征A和B;和VI型包括马-兰二氏综合征;和VII型包括斯利综合征。
如本文所使用,术语“胡尔勒综合征”是属于由α-L-艾杜糖苷酸酶——粘多糖的水解酶——的缺陷引起的I型粘多糖贮积病(MPS)的疾病,并且其是罕见的常染色体隐性遗传病。胡尔勒综合征展示类似于亨特综合征的症状,但是更严重,并且患有胡尔勒综合征的大部分患者在10岁之前死亡。除了亨特综合征的症状之外,比如智力残疾,耳聋,肝脏和脾脏的增大,身体特性比如低鼻梁、厚唇、大舌头等,和严重的骨骼畸形等,胡尔勒综合征还伴随角膜混浊。
如本文所使用,术语“马-兰二氏综合征”——属于VI型粘多糖贮积病(MPS)——是由于对氨基葡聚糖的分解必需的芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的缺陷发生的常染色体隐性遗传病。马-兰二氏综合征是通过硫酸皮肤素的沉积发生的疾病,由于骨骼、心瓣、脾脏、肝脏、角膜等中酶的缺陷硫酸皮肤素未被分解。
如本文所使用,术语“糖原贮积病(也被称为糖原病)”指由糖原的积累引起的糖代谢的先天性障碍的疾病并且已知被分类为I至VII亚型。与溶酶体贮积病(LSD)相关联的糖原贮积病的亚型是II型(蓬珀病)和III b(达农病(Danon disease))。
II型糖原贮积病被称为酸性麦芽糖酶缺乏症或蓬珀病,并且其是由α-葡糖苷酶(α-1,4-葡糖苷酶或酸性α-葡糖苷酶)的缺陷引起的疾病,并且患者已知经历肝脏和肾脏的增大、肌无力、舌头的增大、心脏的增大、呼吸困难等,并且在数月内死亡。
如本文所使用,术语“用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶缀合物”或“酶缀合物”指如此酶缀合物:其中具有治疗溶酶体贮积病的效果的酶通过非肽聚合物连接部分连接至免疫球蛋白Fc区,并且该缀合物可以提供通过该酶预防或治疗溶酶体贮积病的效果。
本发明的酶缀合物通过将能够增加治疗酶的半衰期的物质连接至酶可以提供增强的持续时间。因此,术语本发明的“酶缀合物”可以与“长效缀合物”可互换地使用。
另外地,本发明的酶缀合物可以被用作用于酶促替代疗法(ERT)的药物。酶促替代疗法可以经由通过补充成为对象疾病起因的耗尽或缺陷酶而恢复劣化的酶功能而被用于预防或治疗疾病。
具体地,其中Fc区连接至FcRn的本发明的酶缀合物与不连接至Fc区的酶相比具有增强的转胞吞活性的效果。
虽然酶连接至Fc区并形成大分子,但是由FcRn介导的增强的转胞吞作用不仅可以帮助维持细胞内摄取率,而且帮助治疗酶通过被吸收入体内执行酶自身的功能同时维持酶活性持续长时间段来治疗溶酶体贮积病。
同时,被用于溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶尤其是ERT酶具有低的体内生物利用度(BA)并且因而它们具有问题,因为它们必须经由静脉内注射被施用。静脉内注射引起不便,其要求患者每次静脉内注射都要来医院。另外,静脉内注射可以诱导过敏型超敏反应,从而引起与频繁注射药物相关联的副作用(输液反应)。
由于由FcRn结合区的转胞吞作用引起的增加的生物利用度,本发明的酶缀合物能够使得皮下注射代替静脉内注射,并且施用的这种改变能够使得自注射并且因而增加患者的便利和降低输液反应,从而最小化副作用。
另外地,对于用于溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶尤其是ERT酶,必要的是去除在具体组织中建立的废物并且因而均匀分布入每个组织是非常重要的。但是,当前使用的ERT酶大多显示在肝脏中较高的分布程度,并且因而研发可以提供相对均匀分布进入体内的各个器官的药物是必要的。
通过由于在血液中增加的半衰期和FcRn结合区的转胞吞作用在除了肝脏之外的各个组织中——具体而言,在骨髓、脾脏、肾脏等中——具有高体内浓度,本发明的酶缀合物具有优异的分布,因而能够最大化治疗功效。具体而言,本发明的酶缀合物具有高骨髓靶向性。骨髓是具有存在于骨骼内的软结构的组织,并且通过增加对骨髓组织的靶向性通过酶促替代疗法凭借在骨髓中的药理作用可以预期额外效果,并且因而可以有效地治疗溶酶体贮积病。
具体而言,溶酶体贮积病发生于身体的各个器官中,并且具体地,骨髓中的溶酶体贮积病引起各种副作用,包括骨骼的异常症状、成骨的抑制、或通过抑制红血球生成激素和血小板生成激素——其必须基本上在骨髓中产生——导致的贫血。但是,当前可利用的商业治疗酶治疗在骨髓中具有非常低水平的分布,因而频繁地引起上述副作用。在这方面,由于高骨髓靶向性,本发明的酶缀合物可以被用作酶促替代疗法的优异治疗剂。
因此,通过在免疫球蛋白Fc区和FcRn之间的结合,本发明的酶缀合物与不连接至免疫球蛋白Fc区的酶相比具有增强的转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性。
在本发明的酶缀合物中包含的治疗酶可以非限制性地包括具有治疗溶酶体贮积病的效果的任何酶,并且具体地包括下面描述的酶。
如本文所使用,术语“α-半乳糖苷酶A”,其还被称为芦荟糖苷酶,指与法布里病相关联的酶,并且其是将糖脂或糖蛋白的端部α-半乳糖基部分水解为半乳糖和葡萄糖的酶。在本发明中,术语α-半乳糖苷酶A可以与α-半乳糖苷酶或芦荟糖苷酶可互换地使用。α-半乳糖苷酶或芦荟糖苷酶可以是芦荟糖苷酶α或芦荟糖苷酶β。
如本文所使用,术语“伊米苷酶(imiglucerase)”指具有糖基神经酰胺(glycosylceramide)水解酶活性的酶和水解葡糖脑苷脂——糖脂代谢的中间体——的β-糖苷键的酶,并且是人β-葡糖脑苷脂酶的重组形式。伊米苷酶已知与高歇病相关联。
如本文所使用,“艾杜糖苷酸酶”,其也称为L-艾杜糖苷酸酶、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)或拉罗尼酶(laronidase),参与氨基葡聚糖比如硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的水解。在本发明中,术语艾杜糖苷酸酶可以与拉罗尼酶可互换地使用。
如本文所使用,术语“芳基硫酸酯酶B(ARSB)”指存在于肝脏、胰腺和肾脏的溶酶体中的芳基硫酸酯酶,并且该酶具有通过分解氨基葡聚糖水解硫酸酯的作用。芳基硫酸酯酶B已知与粘多糖贮积病VI(马-兰二氏综合征)相关联。在本发明中,术语芳基硫酸酯酶B可以与加硫酶可互换地使用。
如本文所使用,术语“α-葡糖苷酶”指参与将淀粉或二糖分解为葡萄糖的一种葡糖苷酶,并且α-葡糖苷酶的缺陷引起蓬珀病的发生。在本发明中,术语α-葡糖苷酶可以与阿葡糖苷酶(alglucosidase)或酸性α-葡糖苷酶(GAA)可互换地使用。
在本发明的示例性实施方式中,制备缀合物(实施例3),其中用于治疗溶酶体贮积病的酶,比如艾杜硫酸酯酶(idursulfase)、芦荟糖苷酶、伊米苷酶、加硫酶和拉罗尼酶分别连接至免疫球蛋白Fc区和非肽聚合物,并且确认每种酶缀合物的体外和体内活性(实施例4-8)。
结果,确认了尽管酶连接至Fc区,但是每种酶缀合物的酶显示在半衰期、转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的全部中具有增加,同时维持它们的酶活性。
可以包含在本发明的酶缀合物中的治疗酶可以处于它们的天然形式,并且另外地,可以非限制性地包括由酶的部分组成的片段或其酶类似物——其中选自一些氨基酸的取代、添加、缺失、修饰和其组合的变体发生,只要它们具有与处于其天然形式的那些相同的酶活性。
酶类似物可以包括相应酶的生物相似物(biosimilar)和生物更好物(biobetter)。例如,关于生物相似物,考虑到已知酶和用于其表达的宿主之间的差别、糖基化特征与其程度之间的差别和相对于标准序列在相应酶的具体氨基酸残基中的取代程度的差别——其中取代程度不是100%取代,它们属于生物相似酶。酶可以通过在动物细胞、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、织物细胞和活体动物等中的遗传重组产生,并且制备方法不限于此,并且酶可以是商业可利用的酶。
另外地,酶可以包括与上述酶或其类似物的氨基酸序列具有至少80%,更具体地90%,并且甚至更具体地91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同源性的氨基酸序列,并且酶可以通过重组技术或商业可获得的那些技术由微生物获得,但是不限于此。
如本文所使用,术语“同源性”表示与野生型蛋白质的氨基酸序列或编码氨基酸的核苷酸序列的相似性程度,并且其包括与本发明的氨基酸序列或核苷酸序列具有上述百分比水平的相同序列的那些序列。可以通过肉眼比较两个给定序列确定同源性或者可以使用生物信息学算法确定同源性,生物信息学算法能够通过排列用于比较的对象序列进行同源性的分析。两个给性氨基酸序列之间的同源性可以被指示为百分数。有用的自动化算法可用于Wisconsin遗传学软件包(Genetics Computer Group,Madison,WI,USA)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA计算机软件模块中。在上述模块中自动化的排列算法包括Needleman&Wunsch、Pearson&Lipman和Smith&Waterman的序列排列算法。对序列排列和同源性测定的其它有用算法在包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL W的软件中是自动化的。
酶和其类似物的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列可以获得自已知数据库比如NCBI的GenBank,但是不限于此。
如本文所使用,术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白分子的区,除了重链和轻链的可变区、免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)之外。免疫球蛋白Fc区可以进一步包括重链恒定区处的铰链区。具体而言,本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括Fc区的一部分或全部的片段,并且在本发明中,免疫球蛋白Fc区可以与免疫球蛋白片段可互换地使用。
天然Fc具有在重链恒定区1的位置Asn297处的糖链,但是大肠杆菌源重组Fc被表达为无糖基化形式。从Fc去除糖链导致Fcγ受体1、2和3以及补体(c1q)与重链恒定区1的结合亲和力的下降,导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖性细胞毒作用的降低或丧失。
如本文所使用,术语“免疫球蛋白恒定区”可以指Fc片段,其包括重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)(或包含重链恒定区4(CH4)),除了免疫球蛋白的重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区(CL)之外,并且可以进一步包括在重链恒定区处的铰链区。进一步,本发明的免疫球蛋白恒定区可以是包括含有重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区(CL)的Fc区的一部分或全部的扩大的免疫球蛋白恒定区,除了免疫球蛋白的重链和轻链的可变区之外,只要其具有与天然蛋白质相比基本上类似或更好的生理学功能。再者,其可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的区。即,本发明的免疫球蛋白恒定区可以包括(1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域,(2)CH1结构域和CH2结构域,(3)CH1结构域和CH3结构域,(4)CH2结构域和CH3结构域,(5)恒定区的一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合,和(6)重链恒定区的每个结构域和轻链恒定区的二聚体。包括免疫球蛋白Fc片段的免疫球蛋白恒定区是生物可降解的多肽,其可以在体内被代谢并且因而其可以安全地被用作药物运载体。另外,免疫球蛋白Fc区片段与整个免疫球蛋白分子相比在复合物的生产、纯化和产率方面是更有优势的,这是由于其相对低的分子量。进一步,由于其缺乏Fab——由于一种抗体与另一种抗体在氨基酸序列中的差异其展现高度不均匀性,因此预期显著地增强均匀性并降低诱导血液抗原性的可能性。
同时,免疫球蛋白恒定区可以起源于人或动物,比如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等,并且可以优选地是人起源的。另外,免疫球蛋白恒定区可以选自源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或杂化物的恒定区,具体地源自IgG或IgM——其在人血液中是最丰富的——的恒定区,并且最具体地,源自IgG——其已知提高配体结合蛋白的半衰期——的恒定区。在本发明中,免疫球蛋白Fc区可以是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体,单链免疫球蛋白由相同起源的结构域构成。
如本文所使用,术语“组合”意思是编码相同起源的单链疫球蛋白恒定区(具体地Fc区)的多肽连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即,二聚体或多聚体可以由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc的Fc片段的两个或更多个片段制备。
如本文所使用,术语“杂化物(hybrid)”意思是编码不同起源的两个或更多个免疫球蛋白恒定区的序列存在于免疫球蛋白恒定区(优选地,Fc区)的单链中。在本发明中,各种杂化物形式是可能的。即,杂化物结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgDFc的CH1、CH2、CH3和CH4的一到四个结构域组成,并且可以进一步包括铰链区。
IgG可以被分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类,并且本发明可以包括其组合或杂化物,具体地,IgG2和IgG4亚类,并且更具体地,IgG4的Fc区,其罕见地具有效应子功能比如补体依赖性细胞毒作用(CDC)。
免疫球蛋白恒定区可以具有与天然形式相比为相同程度、或较大或较小程度的糖基化形式,或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白恒定区的增加的或降低的糖基化或去糖基化可以通过常规方法实现,例如化学方法、酶促方法、或使用微生物的遗传工程方法。在本文中,当去糖基化时,结合至免疫球蛋白恒定区的补体(C1q)变得显著降低并且抗体依赖性细胞毒作用或补体依赖性细胞毒作用被降低或去除,从而不诱导不必要的体内免疫应答。在这方面,去糖基化的或无糖基化的免疫球蛋白恒定区与药物运载体的目的更一致。因此,免疫球蛋白Fc区可以甚至更具体地是源自人IgG4的无糖基化的Fc区,即人IgG4源无糖基化的Fc区。人源Fc区与非人源Fc区相比是更优选的,非人源Fc区可以充当人体内的抗原并且引起不期望的免疫应答,比如产生针对抗原的新抗体。
进一步,本发明的免疫球蛋白恒定区不仅包括天然氨基酸序列而且包括其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物意思是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、保守或非保守取代或其组合,其具有不同于野生型氨基酸序列的氨基酸序列。例如,已知对于连接重要的IgG Fc中位置214到238、297到299、318到322或327到331处的氨基酸残基可以被用作适合于修饰的位点。可以使用各种衍生物,比如通过去除能够形成二硫键的位点、从天然Fc去除数个N端氨基酸、或添加甲硫氨酸至天然Fc的N端制备的那些衍生物。另外,补体固定位点例如C1q固定位点或ADCC位点可以被消除以去除效应子功能。制备免疫球蛋白恒定区的序列衍生物的技术在国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478等中公开。
蛋白质或肽分子中不改变分子活性的氨基酸取代在本领域中是熟知的(H.Neurath,R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979)。最通常的取代发生于氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间,在两个方向中。任选地,氨基酸可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰。
上述免疫球蛋白恒定区衍生物可以是如此衍生物:其与本发明的免疫球蛋白恒定区具有相同生物学活性,但是具有针对热、pH等的免疫球蛋白恒定区的增加的结构稳定性。进一步,免疫球蛋白恒定区可以获得自由人或动物比如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等分离的天然形式,或者可以是由转化的动物细胞或微生物获得的其重组体或衍生物。在本文中,可以通过从人或动物有机体分离完整免疫球蛋白并利用蛋白酶处理它们而从天然免疫球蛋白获得免疫球蛋白恒定区。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化为Fab和Fc区,并且胃蛋白酶处理导致pF’c和F(ab)2片段的产生。这些片段可以经历尺寸排阻色谱以分离Fc或pF’c。
优选地,人源免疫球蛋白恒定区可以是获得自微生物的重组免疫球蛋白恒定区。
如本文所使用,术语“非肽聚合物”包括与至少两个重复单元连接的生物相容性聚合物,并且可以与“非肽连接体”可互换地使用。重复单元通过随机共价键代替肽键连接在一起。在本发明中,非肽聚合物可以通过在其末端处包括反应性基团(一个或多个)经由与组成缀合物的其它元件(一个或多个)的反应形成缀合物。
如本文所使用,术语“非肽聚合物连接部分”指缀合物中的组成元件,该缀合物通过将在两个末端处具有反应性基团的非肽聚合物通过非肽聚合物的每个反应性基团连接至免疫球蛋白Fc区和治疗酶而形成。
在本发明的具体实施方式中,酶缀合物可以是其中免疫球蛋白Fc区和治疗酶通过非肽聚合物连接在一起的酶缀合物,所述非肽聚合物在两个末端处包括可以连接至免疫球蛋白Fc区和治疗酶的反应性基团。
具体地,虽然不被具体地限于此,但是非肽聚合物可以是选自如下的非肽聚合物:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物比如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸和其组合。在更具体的实施方式中,非肽聚合物可以是聚乙二醇,但是不限于此。另外地,本领域已知的上述物质的衍生物和可以以本领域中的技术水平容易生产的衍生物也属于本发明的范围。
非肽聚合物的分子量可以在超过0kDa至200kDa,并且具体地1kDa到100kDa,更具体地1kDa到50kDa,甚至更具体地1kDa到20kDa,甚至更具体地3.4kDa到10kDa的范围内,甚至还更具体地大约3.4kDa,并且不限于此。
在本发明的具体实施方式中,非肽聚合物的两个末端可以分别地连接至免疫球蛋白Fc区的胺基或硫醇基;或者连接至治疗酶的胺基或硫醇基。
具体地,非肽聚合物可以包括在两个末端处分别可以连接至免疫球蛋白Fc和治疗酶的反应性基团,并且具体地可以连接至免疫球蛋白Fc或治疗酶的赖氨酸的胺基、半胱氨酸的硫醇基或N端的反应性基团,但是不限于此。
更具体地,非肽聚合物的反应性基团可以选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物,但是不限于此。
在上文中,醛基的实例可以包括丙醛基或丁醛基,但是不限于此。
在上文中,作为琥珀酰亚胺衍生物,可以使用琥珀酰亚胺基羧甲基、戊酸琥珀酰亚胺酯、甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙酸琥珀酰亚胺酯、丁酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺或碳酸琥珀酰亚胺酯,但是琥珀酰亚胺衍生物不限于此。
非肽连接体可以通过反应性基团连接至免疫球蛋白Fc和治疗酶并转化为非肽聚合物连接部分。
另外地,通过醛键经由还原烷基化产生的最终产物与通过酰胺键连接的最终产物相比更加稳定。醛反应性基团与N端在低pH条件下选择性地反应,而其与赖氨酸残基在高pH(例如,pH 9.0)下形成共价键。
在非肽聚合物的两个末端处的反应性基团可以彼此相同或不同,并且另外,非肽聚合物可以具有在两个末端处的醛基;分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和马来酰亚胺基;或分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和琥珀酰亚胺基,但是反应性基团不限于此。
例如,非肽聚合物可以具有在一个末端处的马来酰亚胺基和在另一个末端处的醛基、丙醛基、或丁醛基。再例如,非肽聚合物可以具有在一个末端处的琥珀酰亚胺基和在另一个末端处的丙醛基或丁醛基。
当在3-戊酮(propion)侧末端处具有羟基反应性基团的聚(乙二醇)被用作非肽聚合物时,可以通过已知的化学反应将羟基活化为各种反应性基团或使用具有商业可获得的修饰的反应性基团的聚(乙二醇)来制备本发明的酶缀合物。
在具体实施方式中,非肽聚合物可以是如此非肽聚合物:在其中非肽聚合物的反应性基团可以连接至治疗酶的半胱氨酸残基,并且更具体地,连接至半胱氨酸的-SH基团,但是不限于此。
当使用马来酰亚胺-PEG-醛时,马来酰亚胺基可以通过硫醚键连接至治疗酶的-SH基团,并且醛基可以通过还原烷基化连接至免疫球蛋白Fc的-NH2基团,但是不限于此,并且这仅仅是实施方式。
通过还原烷基化,结构例如-PEG-O-CH2CH2CH2NH-免疫球蛋白Fc可以通过将在免疫球蛋白Fc区的N端处的氨基使用具有-CH2CH2CH2-的结构的连接体反应性基团连接至位于PEG的一个末端处的氧原子来形成;和可以是如此结构,在该结构中PEG的一个末端通过硫醚键连接至位于治疗酶的半胱氨酸处的硫原子。上面描述的硫醚键可以包括的结构。
但是,非肽聚合物不被具体地限于上述实施方式,而其仅仅是实施方式。
另外地,在上述缀合物中,非肽聚合物的反应性基团可以连接至位于免疫球蛋白Fc区的N端处的-NH2,但这仅仅是实施方式。具体地,本发明的治疗酶可以通过治疗酶的N端连接至具有反应性基团的非肽聚合物。
如本文所使用,术语“N端”指肽的氨基末端,并且出于本发明的目的,其指可以连接至非肽聚合物的位置。例如,但是不限于此,N端不仅可以包括在N端的最外末端处的氨基酸残基而且可以包括靠近N端的所有氨基酸残基,并且具体地,从第1个氨基酸残基至第20个氨基酸残基。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包含用于治疗溶酶体贮积病的治疗酶缀合物。
具体地,酶与上面描述的相同。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病的α-半乳糖苷酶A和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病的艾杜糖苷酸酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病的α-葡糖苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物组合物,其包含酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病的伊米苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
术语“溶酶体”、“溶酶体贮积病”、“α-半乳糖苷酶A”、“芳基硫酸酯酶B”、“艾杜糖苷酸酶”、“α-葡糖苷酶”、“伊米苷酶”、“免疫球蛋白Fc区”、“非肽聚合物连接部分”和“酶缀合物”与上面描述的相同。
如本文所使用,术语“预防”指的是通过施用用于治疗溶酶体贮积病的上述治疗酶或包含该治疗酶的组合物抑制或延迟溶酶体贮积病的发生的所有活动,并且术语“治疗”指的是通过施用治疗酶或包含该治疗酶的组合物改善或有利地改变溶酶体贮积病的症状的所有活动。
如本文所使用,术语“施用”指的是通过任何适合的方法将具体物质引入患者,并且组合物的施用途径可以是能够使得组合物递送至体内的靶标的任何常规途径,例如,腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、真皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。
用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的本发明的药物组合物可以通过施用缺乏、缺陷或缺损酶——其成为患有溶酶体贮积病的对象的溶酶体贮积病的原因,从而恢复溶酶体酶的功能而提供治疗溶酶体贮积病的效果。
在一方面,本发明提供药物组合物,其可以增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性。
本发明的药物组合物可以帮助酶缀合物——其中治疗酶连接至Fc区——通过结合至FcRn受体容易地穿过细胞膜并且还可以帮助更有效地从血管到达组织。
因此,本发明的药物组合物可以具有增强的转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性,因而展现用于治疗溶酶体贮积病的优越治疗效果。
本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂可以是非天然存在的。药学上可接受的运载体可以包括,对于口服施用,粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等;对于注射,缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等,其可以组合使用;并且对于外部施用,碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等,但是不限于此。
如本文所使用,术语“药学上可接受的”指的是具有足够量以展现治疗效果并且不引起副作用的性质,并且可以容易地由本领域技术人员基于医学领域中熟知的因素确定,比如疾病的种类,患者的年龄、体重、健康状况、性别、药物敏感性,施用途径,施用方法,施用频率,治疗持续时间,待同时混合或施用的药物(一种或多种)等。
本发明的组合物的制剂类型可以不同地通过与上述药学上可接受的运载体组合制备。例如,对于口服施用,组合物可以被配制为片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片等。对于注射,组合物可以被配制为单位剂量安瓶或多剂量容器。组合物还可以被配制为溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。
同时,适合的运载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。另外地,组合物可以进一步包含填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、防腐剂等。
另外地,本发明的药物组合物可以以选自如下的任何制剂形式制备:片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊、悬浮液、用于内用的药水、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水性溶剂、冻干制剂和栓剂。
另外地,组合物可以被配制为适合于患者身体的单位剂型,并且根据药学领域中的典型方法被具体地配制为对于蛋白质药物有用的制品从而通过口服或非肠道途径施用,比如皮内、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺部、经皮、皮下、腹腔内、鼻内、胃内、外用、舌下、阴道、或直肠,但是施用途径不限于此。
另外地,可以通过与被批准为药品的各种药学上可接受的运载体比如生理盐水或有机溶剂混合使用缀合物。对于增加稳定性或吸收性,可以使用糖类比如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖,抗氧化剂比如抗坏血酸或谷胱甘肽,螯合剂,低分子量蛋白质,或其它稳定剂作为药品。
本发明的药物组合物的施用剂量和频率由活性成分(一种或多种)的类型连同各种因素决定,比如待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别、体重和疾病的严重性。
本发明的组合物的总有效剂量可以以单次剂量施用至患者或者可以根据分次治疗方案以多次剂量持续长时间段施用。在本发明的药物组合物中,活性成分(一种或多种)的含量可以根据疾病严重程度而改变。具体地,本发明的缀合物的总每日剂量可以为大约0.0001mg至500mg/患者的1kg体重。但是,除了药物组合物的施用途径和治疗频率之外,还考虑各种因素施用有效剂量的缀合物,所述因素包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率。在这方面,本领域技术人员可以容易地确定适合于本发明的药物组合物的具体用途的有效剂量。根据本发明的药物组合物不具体地限于制剂以及施用途径和模式,只要其显示本发明的效果。
本发明的仍另一个方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含酶缀合物的组合物。
在具体实施方式中,本发明提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含α-半乳糖苷酶A缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含艾杜糖苷酸酶缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含α-葡糖苷酶缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法,其包括给需要其的对象施用包含伊米苷酶缀合物的组合物。
酶缀合物、包含酶缀合物的组合物、溶酶体贮积病以及预防和治疗溶酶体贮积病与上面描述的相同。
如本文所使用,术语“对象”指的是怀疑患有溶酶体贮积病的对象,并且怀疑患有溶酶体贮积病的对象指的是包括人、大鼠、牛等的哺乳动物,其具有溶酶体贮积病或处于发展溶酶体贮积病的风险下,但是非限制性地包括可以利用本发明的缀合物或包含该缀合物的组合物治疗的任何对象。
本发明的方法可以包括施用药学上有效量的包含缀合物的药物组合物。组合物的适合的总每日剂量可以由执业医师在正确的医学判断的范围内确定,并且组合物可以每天施用一次或以分开的剂量每天施用数次。但是,出于本发明的目的,优选地,用于任何具体患者的具体治疗上有效剂量的组合物可以根据各种因素不同地应用,所述因素包括待实现的应答的种类和程度、具体组成——包括是否偶尔伴随使用其它药剂、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、施用的时间和途径、组合物的排泄率、治疗的持续时间、与具体组合物组合或同时使用的其它药物、和医学领域中熟知的类似因素。
本发明的仍另一个方面提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含酶缀合物。
在具体实施方式中,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含α-半乳糖苷酶A缀合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含艾杜糖苷酸酶缀合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含α-葡糖苷酶缀合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的组合物,其包含伊米苷酶缀合物。
本发明的仍另一个方面提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用酶缀合物或包含酶缀合物的组合物。
在具体实施方式中,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用α-半乳糖苷酶A缀合物或包含α-半乳糖苷酶A缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物或包含芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用艾杜糖苷酸酶缀合物或包含艾杜糖苷酸酶缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用α-葡糖苷酶缀合物或包含α-葡糖苷酶缀合物的组合物。
另外地,本发明提供用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的方法,其包括给对象施用伊米苷酶缀合物或包含伊米苷酶缀合物的组合物。
酶缀合物、包含酶缀合物的组合物、转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性与上面描述的相同。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
在具体实施方式中,本发明提供α-半乳糖苷酶A缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
另外地,本发明提供芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
另外地,本发明提供艾杜糖苷酸酶缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
另外地,本发明提供α-葡糖苷酶缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
另外地,本发明提供伊米苷酶缀合物用于预防或治疗溶酶体贮积病的用途。
酶缀合物、溶酶体贮积病、预防和治疗与上面描述的相同。
本发明的仍另一个方面提供酶缀合物或包含酶缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
在具体实施方式中,本发明提供α-半乳糖苷酶A缀合物或包含α-半乳糖苷酶A缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
另外地,本发明提供芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物或包含芳基硫酸酯酶B(ARSB)缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
另外地,本发明提供艾杜糖苷酸酶缀合物或包含艾杜糖苷酸酶缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
另外地,本发明提供α-葡糖苷酶缀合物或包含α-葡糖苷酶缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
另外地,本发明提供伊米苷酶缀合物或包含伊米苷酶缀合物的组合物用于增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性的用途。
酶缀合物、包含酶缀合物的组合物、转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性与上面描述的相同。
本发明的仍另一个方面提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
具体地,酶与上面描述的相同。
在具体实施方式中,本发明提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加α-半乳糖苷酶A的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加芳基硫酸酯酶B(ARSB)的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB);
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加艾杜糖苷酸酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加α-葡糖苷酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在仍另一个具体实施方式中,本发明提供用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其中方法包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加伊米苷酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中酶和非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在本发明中,F可以选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、具体氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、肝素和弹性蛋白,并且更具体地,FcRn结合物质可以是免疫球蛋白Fc区,但是不限于此。
F可以通过共价化学键或非共价化学键连接至X,并且F和X可以经由L通过共价化学键、非共价化学键或其组合连接。
另外地,L可以是肽聚合物或非肽聚合物。
当L是肽聚合物时,其可以包括一个或多个氨基酸,例如,1至1000个氨基酸,但是不具体地限于此。在本发明中,各种已知的肽连接体可以被用于在F与X之间连接(例如,包括[GS]x连接体、[GGGS]x连接体和[GGGGS]x连接体等,其中x是1或更大的自然数),但是肽连接体不限于此。
当L是肽聚合物时,非肽聚合物可以是选自下列的一种:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合,并且更具体地,聚乙二醇,但是不限于此。
另外地,步骤(a)中的非肽聚合物的反应性基团可以是选自下列的一种:醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物,并且更具体地,丙醛基或丁醛基,或者琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基、戊酸琥珀酰亚胺酯、甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙酸琥珀酰亚胺酯、丁酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺或碳酸琥珀酰亚胺酯,但是不限于此。
另外地,非肽聚合物可以具有在两个末端处作为反应性基团的醛基;或具有分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和马来酰亚胺基;或具有分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和琥珀酰亚胺衍生物,但是反应性基团不限于此。
另外地,本发明的仍另一个方面提供用于制备酶缀合物的方法,其进一步包括分离连接的材料的步骤,在连接的材料中非肽聚合物连接部分连接至酶的N端。
通过本发明的制备方法——通过将治疗酶连接至Fc区——制备的酶缀合物帮助酶缀合物通过结合至具有FcRn受体的Fc区容易地穿过细胞膜,并且还帮助酶缀合物更有效地从血管到达组织。
增加的转胞吞作用、生物利用度和组织分布的全部可以帮助包含在酶缀合物中的用于治疗溶酶体贮积病的酶展现靶疾病的有效治疗效果,同时维持身体中的酶活性。
另外地,酶缀合物可以是增加酶或其类似物的半衰期的那些酶缀合物。
在下文,将参照下列实施例更详细地描述本发明。但是,这些实施例仅出于说明性目的,并且本发明不意欲被这些实施例限制。
实施例1:酶生产
为了生产长效酶,培养和纯化动物细胞,其中动物细胞的表达载体被引入。
用于制备本发明中的缀合物的酶是芦荟糖苷酶β、伊米苷酶、加硫酶和拉罗尼酶。
实施例2:制备酶缀合物-1
将非肽聚合物连接至免疫球蛋白Fc区并纯化。
将非肽聚合物共价地连接至在实施例1中纯化的酶的N端。具体而言,非肽聚合物是线性聚合物,其具有在两个末端处的醛基(-CHO)和聚乙二醇(CH2CH2O)n)骨架。非肽聚合物的大小根据骨架的数目决定,并且醛基(-CHO)——其是非肽聚合物的反应性基团——共价地结合至赖氨酸残基的-NH2——其是组成蛋白质的元件,或N端的-NH2。非肽聚合物的醛基(-CHO)特异性地在特定反应条件下与N端的-NH2反应,并且以特定方式共价结合至N端的非肽聚合物酶通过纯化获得。
实施例3:制备酶缀合物-2
免疫球蛋白Fc区——其连接至在实施例2中纯化的非肽聚合物——连接至在实施例1中纯化的酶。
取决于非肽聚合物连接的位置,酶可以显示它们活性的不同。即,酶的体内半衰期或活性可以取决于酶的位点特异性结合而增强。因此,根据本发明的酶的结构,通过规定待连接至非肽聚合物的位置制备缀合物。
实施例3-1:制备通过聚乙二醇连接芦荟糖苷酶和免疫球蛋白Fc的缀合物
如下制备包括芦荟糖苷酶β的缀合物。
为了将制备的醛-聚乙二醇(Mw=10,000Da)-醛(ALD-PEG-ALD)(SUNBRIGHT DE-100AL2,NOF CORPORATION,Japan)连接体连接至芦荟糖苷酶的N端,芦荟糖苷酶β和ALD-PEG-ALD以1:50摩尔比(芦荟糖苷酶β:10mg/mL)在4℃下反应2小时。具体而言,在100mM磷酸钠(pH 5.6)的存在下进行反应,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。未反应的芦荟糖苷酶β和单连接的芦荟糖苷酶β通过使用包含10mM磷酸钠(pH 6.0)的缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source 15Q(GE,USA)柱纯化。
然后,将连接至纯化的聚乙二醇连接体的芦荟糖苷酶β与免疫球蛋白Fc片段以1:10摩尔比(总蛋白质浓度:10mg/mL)在4℃到8℃下反应12小时至16小时。具体而言,磷酸钾(pH 6.0)被用作反应溶液,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。在完成反应之后,将反应溶液施加至使用包含10mM磷酸钠(pH 6.0)的缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source15Q(GE,USA)柱,并且然后施加至使用包含20mM Tris(pH 7.5)、5%(v/v)甘油、柠檬酸钠(pH 4.0)、氯化钠和10%甘油)的缓冲液的浓度梯度的Protein A(GE,USA)柱,并且最终施加至使用包含氯化钠的磷酸钠缓冲液的SuperdexTM 200(GE,USA)柱,并且纯化其中免疫球蛋白Fc通过聚乙二醇连接体共价连接至芦荟糖苷酶β的缀合物。具体地,在实施例2中纯化的非肽聚合物酶和免疫球蛋白Fc区通过在非肽聚合物的另一个末端上的未反应的醛基(-CHO)和N端的NH2共价结合,并且在共价结合之后纯化,从而完成酶缀合物的制备。
最终制备的芦荟糖苷酶β-聚乙二醇连接体-免疫球蛋白Fc缀合物处于如此形式:其中芦荟糖苷酶单体通过聚乙二醇连接体连接至由两条链组成的免疫球蛋白Fc的一条链。
实施例3-2:制备通过聚乙二醇连接伊米苷酶和免疫球蛋白Fc的缀合物
如下制备包括伊米苷酶的缀合物。
为了将醛-聚乙二醇(Mw=10,000Da)-醛(ALD-PEG-ALD)(SUNBRIGHT DE-100AL2,NOF CORPORATION,Japan)连接体连接至伊米苷酶的N端,伊米苷酶和ALD-PEG-ALD以1:50摩尔比(伊米苷酶的浓度:10mg/mL)在25℃下反应1小时。具体而言,在100mM磷酸钾(pH 6.0)的存在下进行反应,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。未反应的伊米苷酶和单连接的伊米苷酶通过使用包含20mM磷酸钠(pH 6.0)和2.5%(v/v)甘油的缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source 15S(GE,USA)柱纯化。
然后,将连接至纯化的聚乙二醇连接体的伊米苷酶与免疫球蛋白Fc片段以1:50摩尔比(总蛋白质浓度:40mg/mL)在4℃到8℃下反应12小时至16小时。具体而言,100mM磷酸钾(pH 6.0)被用作反应溶液,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。在完成反应之后,将反应溶液施加至使用包含10mM柠檬酸钠(pH 5.0)的缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source 15S(GE,USA)柱,并且施加至使用包含20mM Tris(pH 7.5)、5%(v/v)甘油、10mM柠檬酸钠(pH 3.7)、氯化钠和10%甘油)的缓冲液的浓度梯度的Protein A(GE,USA)柱,并且最终施加至使用包含氯化钠的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.1)的SuperdexTM 200(GE,USA)柱,并且纯化其中免疫球蛋白Fc通过聚乙二醇连接体共价连接至伊米苷酶的缀合物。
具体地,纯化的非肽聚合物酶和免疫球蛋白Fc区通过在非肽聚合物的另一个末端上的未反应的醛基(-CHO)和N端的NH2共价结合,并且在共价结合之后纯化,从而完成酶缀合物的制备。
最终制备的伊米苷酶-聚乙二醇连接体-免疫球蛋白Fc缀合物处于如此形式:其中伊米苷酶单体通过聚乙二醇连接体连接至由两条链组成的免疫球蛋白Fc的一条链。
实施例3-3:制备通过聚乙二醇连接加硫酶和免疫球蛋白Fc的缀合物
如下制备包括加硫酶的缀合物。
为了将醛-聚乙二醇-醛(Mw=10kDa)(SUNBRIGHT DE-100AL2,NOF CORPORATION,Japan)连接体连接至加硫酶的N端,加硫酶和ALD-PEG-ALD以1:20摩尔比(加硫酶的浓度:1mg/mL)在25℃下反应2小时。具体而言,在12mM磷酸钠和150mM氯化钠(pH 5.8)的存在下进行反应,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。未反应的加硫酶和单-PEG加硫酶通过使用20mM Tris(pH 7.0)缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source 15Q(GE,USA)柱和利用1.8M硫酸铵平衡的Source ISO(GE,USA)柱纯化。
然后,将连接至纯化的聚乙二醇连接体的加硫酶与免疫球蛋白Fc片段以1:20摩尔比(总蛋白质浓度:50mg/mL)在4℃到8℃下反应12小时至16小时。具体而言,磷酸钾(pH6.0)被用作反应溶液,并且将20mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。在完成反应之后,将反应溶液施加至使用20mM Tris缓冲液(pH 7.0)和氯化钠浓度梯度的Source 15Q(GE,USA)柱,并且然后施加至使用包含20mM Tris(pH 7.0)、5%(v/v)甘油、柠檬酸钠(pH 3.0)和10%甘油)的缓冲液的浓度的Protein A(GE,USA)柱,并且最终施加至利用1.8M硫酸铵平衡的Source ISO(GE,USA)柱,并且纯化其中免疫球蛋白Fc通过聚乙二醇连接体共价连接至加硫酶的缀合物。
具体地,纯化的非肽聚合物酶和免疫球蛋白Fc区通过在非肽聚合物的另一个末端上的未反应的醛基(-CHO)和N端的NH2共价结合,并且在共价结合之后纯化,从而完成酶缀合物的制备。
最终制备的加硫酶-聚乙二醇连接体-免疫球蛋白Fc缀合物处于如此形式:其中加硫酶单体通过聚乙二醇连接体连接至由两条链组成的免疫球蛋白Fc的一条链。
实施例3-4:制备通过聚乙二醇连接拉罗尼酶和免疫球蛋白Fc的缀合物
如下制备包括拉罗尼酶的缀合物。
为了将醛-聚乙二醇(Mw=10kDa)-醛(ALD-PEG-ALD)(SUNBRIGHT DE-100AL2,NOFCORPORATION,Japan)连接体连接至拉罗尼酶的N端,拉罗尼酶和ALD-PEG-ALD以1:100摩尔比(拉罗尼酶的浓度:0.58mg/mL)在4℃至8℃下反应大约16小时。具体而言,在100mM磷酸钾(pH 6.0)的存在下进行反应,并且将10mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。具有聚乙二醇连接体的单连接的拉罗尼酶通过使用磷酸钾(pH 6.0)和氯化钠浓度梯度的Source 15S(GE,USA)柱以及使用磷酸钾(pH 6.0)和硫酸铵浓度梯度的Source 15ISO(GE,USA)柱纯化。
然后,将连接至聚乙二醇连接体的纯化的拉罗尼酶与免疫球蛋白Fc片段以1:10摩尔比(总蛋白质浓度:20mg/mL)在4℃到8℃下反应14小时。具体而言,100mM磷酸钾(pH6.0)被用作反应溶液,并且将10mM氰基硼氢化钠作为还原剂加入至其。在完成反应之后,将反应溶液施加至使用磷酸钾(pH 6.0)缓冲液和氯化钠浓度梯度的Source 15S(GE,USA)柱,并且最终施加至使用包含20mM Tris(pH 7.5)、5%(v/v)甘油和100mM一水柠檬酸(pH3.7)的缓冲液,和10%甘油和100mM一水柠檬酸(pH 4.0),和10%甘油的浓度梯度的Protein A(GE,USA)柱,并且纯化其中免疫球蛋白Fc通过聚乙二醇连接体共价连接至拉罗尼酶的缀合物。
具体地,纯化的非肽聚合物酶和免疫球蛋白Fc区通过在非肽聚合物的另一个末端上的未反应的醛基(-CHO)和N端的NH2共价结合,并且在共价结合之后纯化,从而完成酶缀合物的制备。
最终制备的拉罗尼酶-聚乙二醇连接体-免疫球蛋白Fc缀合物处于如此形式:其中拉罗尼酶单体通过聚乙二醇连接体连接至由两条链组成的免疫球蛋白Fc的一条链。
实施例4:对酶缀合物的药代动力学实验
本发明人试图通过检查在实施例中制备的酶缀合物的药代动力学来确认酶缀合物的效果。
实施例4-1:确认长效伊米苷酶缀合物的药代动力学(PK)
本发明人确认了在实施例中制备的长效伊米苷酶缀合物的PK活性。
比较艾杜硫酸酯酶(对照组)和在实施例中制备的长效艾杜硫酸酯酶缀合物在来自血液收集时每个组的三只ICR小鼠中的血液稳定性和其药代动力学系数。
具体地,分别以基于伊米苷酶每只小鼠1.5mg/kg的量静脉内注射对照组和测试组。在注射后的0、2、5、10、20和60分钟时从利用静脉内注射的组中的小鼠收集血液样本,并且通过ELISA分析使用伊米苷酶的抗体测量血清中蛋白质的量。
作为PK分析的结果,长效伊米苷酶缀合物与对照组相比显示血液半衰期和曲线下面积(AUC)二者的增加,并且具体而言,血液半衰期显示了至少4倍增加。AUC表示体内暴露于药物分子的程度。
实施例4-2:确认长效芦荟糖苷酶缀合物的PK
比较芦荟糖苷酶β(对照组)和在实施例中制备的长效芦荟糖苷酶β缀合物在来自血液收集时每个组的一或三只ICR小鼠中的血液稳定性和其药代动力学系数。
具体地,分别以基于芦荟糖苷酶β每只小鼠1.0mg/kg的量静脉内和皮下注射对照组和测试组。在注射后的0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、8、24和48小时时从利用静脉内和皮下注射的组中的小鼠收集血液样本。对于利用静脉内注射的测试组中的小鼠,在注射后的0、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144和168小时时收集血液样本,而对于利用皮下注射的测试组中的小鼠,分别在注射后的0、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144和168小时时收集血液样本。通过ELISA分析使用芦荟糖苷酶β的抗体测量血清中蛋白质的量。
结果,长效芦荟糖苷酶β缀合物与对照组相比显示血液半衰期、Cmax和AUC全部的增加。另外地,长效芦荟糖苷酶β缀合物的生物利用度(BA)显示为58.2%,其与芦荟糖苷酶β(3.3%)的生物利用度相比高大约18倍,因而确认长效芦荟糖苷酶β缀合物的优异的BA(图2)。
Cmax表示最大药物浓度,AUC表示体内暴露于药物分子的程度,并且BA表示体内利用率。
本发明人试图根据如下确认每种上述制备的缀合物的体外活性。
实施例5:确认芦荟糖苷酶缀合物的活性
实施例5-1:长效芦荟糖苷酶缀合物的体外酶活性
本发明人进行体外酶活性的测量,用于测量根据长效芦荟糖苷酶缀合物制品的芦荟糖苷酶β的酶活性的改变。
具体地,将已知为酶的底物的4-硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷与芦荟糖苷酶β和长效芦荟糖苷酶β缀合物在37℃下反应20分钟,并且通过测量其最终产物4-硝基苯酚的吸光度测量相应物质的酶活性。
结果,确认芦荟糖苷酶β和长效芦荟糖苷酶β缀合物的酶活性(比活性)分别为63.6μmol/min/μg和56.3μmol/min/μg。最后,芦荟糖苷酶的长效缀合物的酶活性与游离芦荟糖苷酶β的酶活性相比为88.6%,因而确认根据长效芦荟糖苷酶缀合物制品的酶活性的降低是可以忽略的(图2)。
实施例5-2:长效芦荟糖苷酶缀合物的细胞内摄取活性
由于芦荟糖苷酶β在通过甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)被吸收进入细胞之后起作用,因此根据如下检查长效芦荟糖苷酶β缀合物的制品是否可以影响酶的细胞摄取的活性。
具体地,已知表达M6PR的CCD986SK细胞(人皮肤成纤维细胞)首先分别与芦荟糖苷酶β和长效芦荟糖苷酶β缀合物反应,并且在37℃下诱导细胞内摄取。24小时之后,细胞中存在的芦荟糖苷酶β和长效芦荟糖苷酶β缀合物通过酶活性测量分析确认。
结果,确认了长效芦荟糖苷酶β缀合物的细胞内摄取活性(K摄取=29.3nM)相对于芦荟糖苷酶β的细胞内摄取活性(K摄取=13.7nM)为大约47%。与M6PR的结合和细胞内吸收活性(相对于芦荟糖苷酶β)的降低是由于长效缀合物的空间位阻,并且该降低可以被由于长效缀合物制品产生的缀合所改善的PK弥补(图3)。
实施例5-3:确认长效芦荟糖苷酶缀合物与M6P受体的结合亲和力
为了确认芦荟糖苷酶β和长效芦荟糖苷酶β缀合物与甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)的结合亲和力,使用表面等离子共振(BIACORE T200,GE healthcare)进行分析。
具体地,通过胺偶联将M6PR固定至CM5芯片。然后,利用HBS-EP缓冲液稀释芦荟糖苷酶β至200nM至12.5nM的浓度,连接至其中M6PR被固定10分钟的芯片,解离6分钟,并且使用BIAevaluation软件计算结合亲和力。长效芦荟糖苷酶β缀合物的相对结合亲和力通过与芦荟糖苷酶β的结合亲和力比较被数字化。
结果,确认长效芦荟糖苷酶β缀合物的受体结合亲和力是芦荟糖苷酶β的受体结合亲和力的大约68%(表1)。看起来长效芦荟糖苷酶β缀合物与M6PR的相对低的结合亲和力是由于相同原因:当生理学活性多肽与Fc区形成融合蛋白时,生理学活性多肽通常显示其与其受体的结合亲和力的降低。为了有助于理解本发明,而非意欲严格地束缚于本发明的具体的作用理论,低结合亲和力可能是由于当免疫球蛋白Fc和芦荟糖苷酶β被共价地结合时,由于芦荟糖苷酶区上的空间位阻,与受体的缔合速率常数(ka)降低。在长效缀合物的情况下,一旦长效缀合物被连接,在解离速率常数(kd)方面与不形成缀合物的游离芦荟糖苷酶相比不存在区别。
[表1]
确认本发明的长效芦荟糖苷酶β缀合物的活性的结果在下面总结。
[表2]
实施例6:确认伊米苷酶缀合物的活性
实施例6-1:长效伊米苷酶缀合物的体外酶活性
比较伊米苷酶(对照组)和上面制备的长效伊米苷酶缀合物(测试组)的体外酶活性。
具体地,为了测量酶活性,p-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷被用作底物,并且通过定量根据酶活性产生的p-硝基苯酚(pNP)的量计算每单位时间产生的产物的量并获得绝对的酶活性(比活性)。以基于伊米苷酶的0.1μg/mL浓度处理对照组和测试组。分别利用20、16、12、8、4、2、1和0mM处理底物,并且在37℃下反应45分钟。通过测量在405nm下的吸光度定量最终产生的pNP的量。使用定量的pNP的浓度、反应体积和反应时间计算μmole/min/mg的值。最后,最后通过将在Michaelis-Menten方程中的值x取代为底物的浓度并将y值取代为上面计算的值计算为酶活性的Vmax的值(μmole/min/mg=U/mg)。
结果,确认伊米苷酶和长效伊米苷酶缀合物的酶活性分别为48.5U/mg和45.2U/mg。最后,长效伊米苷酶缀合物的酶活性与对照组的酶活性相比为93%,因而确认通过与免疫球蛋白Fc的缀合在酶活性方面没有降低(图4)。
实施例6-2:确认长效伊米苷酶缀合物与M6P受体的结合亲和力
为了确认与M6PR的结合亲和力,使用伊米苷酶(对照组)和上面制备的长效伊米苷酶缀合物(测试组)通过表面等离子共振(SPR,BIACORE T200)进行分析。M6PR购买自R&DSystems Inc.。在通过胺偶联将M6PR固定至CM5芯片之后,通过对于对照组以100nM至6.24nM的浓度和对于测试组以200nM至12.5nM的浓度流动确认结合亲和力。
HBS-EP缓冲液(pH 7.5)被用作运行缓冲液。所有测试物质利用运行缓冲液稀释并被诱导以缀合,并且使用运行缓冲液进行解离。使测试物质流入固定至芯片的M6PR持续10分钟,并且然后经历解离过程持续6分钟。
然后,对于不同浓度的对照组或测试组的缀合,使5mM NaOH/50mM NaCl流入缀合物持续大约30秒,其缀合至M6PR。使用BIAevaluation程序分析M6PR和伊米苷酶或长效伊米苷酶缀合物之间的结合亲和力。使用1:1朗缪尔结合模型计算缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和力常数(KD)值。
结果,确认通过与免疫球蛋白Fc的缀合在解离常数方面不存在大的差别,但是在偶合常数方面存在差别。因此,测试组的结合亲和力与对照组的结合亲和力相比显示了大约22%的降低(表3)。看起来长效伊米苷酶缀合物与M6PR的相对低的结合亲和力是由于相同原因:当生理学活性多肽与Fc区形成融合蛋白时,生理学活性多肽通常显示其与其受体的结合亲和力的降低。为了有助于理解本发明,而非意欲严格地束缚于本发明的具体的作用理论,低结合亲和力可能是由于当免疫球蛋白Fc和伊米苷酶被共价地结合时,由于伊米苷酶区上的空间位阻,与受体的缔合速率常数(ka)降低。在长效缀合物的情况下,一旦长效缀合物被连接,在解离速率常数(kd)方面与不形成缀合物的游离伊米苷酶相比不存在区别(表3)。
[表3]
确认本发明的长效伊米苷酶缀合物的活性的结果在下面总结。
[表4]
实施例7:确认加硫酶的酶缀合物的活性
实施例7-1:长效加硫酶缀合物的体外酶活性
比较加硫酶(对照组)和上面制备的长效加硫酶缀合物(测试组)的体外酶活性。
具体地,为了测量酶活性,4-甲基伞形酮基硫酸酯(4-MUS)被用作底物,并且通过测量4-甲基伞形酮(4-MU)——其通过在37℃下进行酶反应20分钟生成——的荧光,测量对象物质的酶活性。
结果,确认加硫酶和加硫酶的长效缀合物的酶活性分别为72.3μmole/min/mg和81.3μmole/min/mg。最后,加硫酶的长效缀合物的酶活性与对照组的酶活性相比为112%,因而确认通过与免疫球蛋白Fc的缀合在酶活性方面没有降低(图5)。
实施例7-2:确认长效加硫酶缀合物与M6P受体的结合亲和力
为了确认与M6PR的结合亲和力,使用加硫酶(对照组)和上面制备的长效加硫酶缀合物(测试组)通过表面等离子共振(SPR,BIACORE T200)进行分析。
具体地,M6PR购买自R&D Systems Inc.。在通过胺偶联将M6PR固定至CM5芯片之后,通过以100nM至6.24nM的浓度流动确认测试物质的结合亲和力。
HBS-EP缓冲液(pH 7.5)被用作运行缓冲液。所有测试物质利用运行缓冲液稀释并被诱导以缀合,并且使用运行缓冲液进行解离。使测试物质流入固定至芯片的M6PR持续10分钟,并且然后经历解离过程持续6分钟。
然后,对于不同浓度的对照组或测试组的缀合,将5mM NaOH/50mM NaCl流入缀合物,其缀合至M6PR持续大约30秒。使用BIAevaluation程序分析M6PR和加硫酶或长效加硫酶缀合物之间的结合亲和力。使用1:1朗缪尔结合模型计算缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和力常数(KD)值。
结果,确认通过与免疫球蛋白Fc的缀合在解离常数方面不存在大的差别,但是在偶合常数方面存在差别。因此,测试组的结合亲和力与对照组的结合亲和力相比显示了大约25%的降低(表3)。看起来长效加硫酶缀合物与M6PR的相对低的结合亲和力是由于相同原因:当生理学活性多肽与Fc区形成融合蛋白时,生理学活性多肽通常显示其与其受体的结合亲和力的降低。为了有助于理解本发明,而非意欲严格地束缚于本发明的具体的作用理论,低结合亲和力可能是由于当免疫球蛋白Fc和加硫酶被共价地结合时,由于加硫酶区上的空间位阻,与受体的缔合速率常数(ka)降低。在长效缀合物的情况下,一旦长效缀合物被连接,在解离速率常数(kd)方面与不形成缀合物的游离加硫酶相比不存在区别(表3)。
[表5]
确认本发明的长效加硫酶缀合物的活性的结果在下面总结。
[表6]
实施例8:确认艾杜糖苷酸酶缀合物的活性
实施例8-1:长效艾杜糖苷酸酶缀合物的体外酶活性
为了测量根据长效艾杜糖苷酸酶缀合物制品的酶活性的改变,测量体外酶活性。
具体地,将已知为酶的底物的4-甲基伞形酮基α-L-艾杜糖苷酸(iduronide)(4-MUI)与艾杜糖苷酸酶和长效艾杜糖苷酸酶缀合物在37℃下反应30分钟。通过测量相对于其最终产物4-甲基伞形酮(4MU)的荧光测量相应物质的酶活性。
结果,确认艾杜糖苷酸酶和长效艾杜糖苷酸酶缀合物的酶活性(比活性)分别为127.5±15.8μmol/min/mg和132.2±24.3μmol/min/mg。最后,长效艾杜糖苷酸酶缀合物的酶活性与艾杜糖苷酸酶的酶活性相比为105.7±32.2%,因而确认根据长效缀合物制品的酶活性没有降低(图6)。
实施例8-2:确认长效艾杜糖苷酸酶缀合物与M6P受体的结合亲和力
为了确认与M6PR的结合亲和力,使用艾杜糖苷酸酶(对照组)和上面制备的长效艾杜糖苷酸酶缀合物(测试组)通过表面等离子共振(SPR,BIACORE T200)进行分析。
具体地,M6PR购买自R&D Systems Inc.。在通过胺偶联将M6PR固定至CM5芯片之后,通过对于对照组以50nM至3.125nM的浓度和对于测试组以100nM至6.25nM的浓度流动确认测试物质的结合亲和力。
HBS-EP缓冲液(pH 7.5)被用作运行缓冲液。所有测试物质利用运行缓冲液稀释并被诱导以缀合,并且使用运行缓冲液进行解离。使测试物质流入固定至芯片的M6PR持续10分钟,并且然后经历解离过程持续6分钟。然后,对于不同浓度的对照组或测试组的缀合,将5mM NaOH/50mM NaCl流入缀合物持续大约30秒,其缀合至M6PR。使用BIAevaluation程序分析M6PR和艾杜糖苷酸酶或长效艾杜糖苷酸酶缀合物之间的结合亲和力。使用1:1朗缪尔结合模型计算缔合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和力常数(KD)值。
结果,确认通过与免疫球蛋白Fc的缀合在解离常数和偶合常数两方面存在差别。因此,测试组的结合亲和力与对照组的结合亲和力相比显示了大约13%的降低。
看起来长效艾杜糖苷酸酶缀合物与M6PR的相对低的结合亲和力是由于相同原因:当生理学活性多肽与Fc区形成融合蛋白时,生理学活性多肽通常显示其与其受体的结合亲和力的降低。为了有助于理解本发明,而非意欲严格地束缚于本发明的具体的作用理论,低结合亲和力可能是由于当免疫球蛋白Fc和艾杜糖苷酸酶被共价地结合时,由于艾杜糖苷酸酶区上的空间位阻,与受体的缔合速率常数(ka)降低(表7)。
[表7]
确认本发明的长效艾杜糖苷酸酶缀合物的活性的结果在下面总结。
[表8]
上述结果暗示本发明的酶缀合物与其它治疗酶相比具有优异的转胞吞作用、体内生物利用度(BA)、组织分布和骨髓靶向性,并且因而可以被用作治疗溶酶体贮积病(LSD)的有效治疗剂。
根据上文,本发明所属领域的技术人员将能够理解本发明可以以其它具体形式体现而不改变本发明的技术概念或基本特征。在这方面,本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本发明的范围。相反,本发明意欲不仅覆盖示例性实施方式,而且覆盖各种替代方案、修改、等价物和可以包含在本发明的精神和范围内的其它实施方式,如由所附权利要求书所限定的。
Claims (73)
1.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
2.根据权利要求1所述的酶缀合物,其中所述酶选自β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、乙酰辅酶A-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺6-硫酸酯酶(GALN)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、透明质酸酶、α-岩藻糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶(唾液酸酶)、N-乙酰-葡糖胺-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、N-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、LAMP-2、cystinosin、唾液酸转运蛋白、神经酰胺酶、酸性-β-葡糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、NPC1、组织蛋白酶A、SUMF-1、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和三肽基肽酶1。
3.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
4.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
5.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
6.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
7.一种酶缀合物,其中用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物连接部分连接。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的酶缀合物,其中所述溶酶体贮积病选自粘多糖贮积病(MPS)、糖原贮积病和鞘类脂累积病。
9.根据权利要求8所述的酶缀合物,其中所述粘多糖贮积病(MPS)选自粘多糖贮积病I型(MPS I)和粘多糖贮积病VI型(MPS VI)。
10.根据权利要求8所述的酶缀合物,其中所述糖原贮积病是蓬珀病。
11.根据权利要求8所述的酶缀合物,其中所述鞘类脂累积病选自法布里病和高歇病。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述酶缀合物与不连接至免疫球蛋白Fc区的酶相比具有增加的转胞吞作用和生物利用度(BA)。
13.根据权利要求12所述的酶缀合物,其中所述转胞吞作用通过在免疫球蛋白Fc区和新生Fc受体(FcRn)之间的结合介导。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述酶缀合物与不连接至免疫球蛋白Fc区的酶相比具有增加的组织分布。
15.根据权利要求14所述的酶缀合物,其中所述酶缀合物与不连接至免疫球蛋白Fc区的酶相比具有增加的骨髓靶向性。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区包括选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四种结构域。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区包括铰链区。
19.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
20.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区的每个结构域是具有不同起源的结构域的杂化物,所述结构域源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
21.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体,所述单链免疫球蛋白由相同起源的结构域构成。
22.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc片段。
23.根据权利要求22所述的酶缀合物,其中所述免疫球蛋白Fc区是人无糖基化的IgG4Fc片段。
24.根据权利要求1-11中任一项所述的酶缀合物,其中所述酶缀合物是其中非肽聚合物连接部分连接至所述酶的N端的酶缀合物。
25.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求1或2所述的酶缀合物。
26.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求3所述的酶缀合物。
27.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求4所述的酶缀合物。
28.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求5所述的酶缀合物。
29.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求6所述的酶缀合物。
30.一种用于预防或治疗溶酶体贮积病(LSD)的药物组合物,其包括权利要求7所述的酶缀合物。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的药物组合物,其中所述药物组合物增加转胞吞作用、生物利用度、组织分布和骨髓靶向性。
32.用于制备酶缀合物的方法,其包括:
(a)将用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的治疗酶与非肽聚合物连接的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述酶选自β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、乙酰辅酶A-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺6-硫酸酯酶(GALN)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、透明质酸酶、α-岩藻糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶(唾液酸酶)、N-乙酰-葡糖胺-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、α-N-乙酰-氨基半乳糖苷酶、N-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、LAMP-2、cystinosin、唾液酸转运蛋白、神经酰胺酶、酸性-β-葡糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、NPC1、组织蛋白酶A、SUMF-1、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和三肽基肽酶1。
34.用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-半乳糖苷酶A;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
35.用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB)和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的芳基硫酸酯酶B(ARSB);
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
36.用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的艾杜糖苷酸酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
37.用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的α-葡糖苷酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
38.用于制备由下面的式1表示的酶缀合物的方法,其包括:
(a)连接用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶和非肽聚合物的步骤;和
(b)将连接的物质与能够增加所述酶的体内半衰期的生物相容性物质连接的步骤,在所述连接的物质中所述酶和所述非肽聚合物连接;
[式1]
X-La-F
其中:
X是用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的伊米苷酶;
L是非肽聚合物;
a是0或自然整数,条件是当a是2或更大时,每个L彼此独立;和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,其中F选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、具体氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、肝素和弹性蛋白。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述FcRn结合物质是免疫球蛋白Fc区。
41.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,其中所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。
43.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,其中步骤(a)的所述非肽聚合物的反应性基团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述醛基是丙醛基或丁醛基。
45.根据权利要求43所述的方法,其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、戊酸琥珀酰亚胺酯、甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙酸琥珀酰亚胺酯、丁酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺或碳酸琥珀酰亚胺酯。
46.根据权利要求43所述的方法,其中所述非肽聚合物具有在两个末端处作为反应性基团的醛基。
47.根据权利要求43所述的方法,其中所述非肽聚合物具有分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和马来酰亚胺基。
48.根据权利要求43所述的方法,其中所述非肽聚合物具有分别在两个末端处作为反应性基团的醛基和琥珀酰亚胺基。
49.根据权利要求32-38中任一项所述的方法,进一步包括分离所述连接的物质的步骤,其中非肽聚合物连接部分连接至所述酶的N端。
50.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求1或2所述的酶缀合物。
51.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求1或2所述的酶缀合物。
52.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求3所述的酶缀合物。
53.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求3所述的酶缀合物。
54.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求4所述的酶缀合物。
55.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求4所述的酶缀合物。
56.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求5所述的酶缀合物。
57.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求5所述的酶缀合物。
58.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求6所述的酶缀合物。
59.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求6所述的酶缀合物。
60.一种用于增加酶的转胞吞作用的组合物,其包括权利要求7所述的酶缀合物。
61.一种用于增加酶的组织分布的组合物,其包括权利要求7所述的酶缀合物。
62.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求1或2所述的酶缀合物。
63.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求1或2所述的酶缀合物。
64.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求3所述的酶缀合物。
65.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求3所述的酶缀合物。
66.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求4所述的酶缀合物。
67.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求4所述的酶缀合物。
68.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求5所述的酶缀合物。
69.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求5所述的酶缀合物。
70.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求6所述的酶缀合物。
71.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求6所述的酶缀合物。
72.一种用于增加酶的转胞吞作用的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求7所述的酶缀合物。
73.一种用于增加酶的组织分布的方法,其包括给需要其的对象施用权利要求7所述的酶缀合物。
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