JPH06504262A - 脈管形成性の病気の処置用の新規な方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　脈管形成性の病スの処置用の新規な方法とｗ１成物 本発明は１９８９年１月ｌＯ日出願の係属中の連続番号２９５９５５出願の−ｌ ｌＢ１１１続出−である１９８９年１２月２７日に出願の係嘱続中の連続［１５ １０２１出噛の一部皐続出１である。

斬し・い毛細血管の発達である脈管形成（アンキオゲネシスａｎＡ！ｉｏｇｅｎ ｅｓｉｓ）は発達中の＃１児及び成長期の人に於いて重要な過程である。し・か じ、Ｈ精な成人に於いては、脈管形成は傷の治＠及び月経サイクルにおいてのみ 有意義に生し・る。

現在では、成人に起っている脈管形成の多くは性質玉病的なものであることが広 く認識されている０例えば、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の形成は、 容量が数立方ミリメーターを越えるような充実性腫瘍の成長に必須のものである （フォークマン等、［１９８３］Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄ、　Ｓｉｗｐ、　１００ ：　１３２〜１４９）　、本発明者等は、発達しつつある腫瘍は成長因子を分泌 し、これが周りの内皮細胞を刺激して腫瘍へと分裂、移行させることと理解して いる　。

充実性腫瘍の成長の池に、脈管形成による機能不全を伴う他の症状は、糖犀病性 網膜症、水晶体後の線維増殖、血管新生性緑内障、乾瘤、線碓性血管瞳、免疫性 及び非免疫性炎り（リウマチ様間節炎を含む）、アテローム性動脈硬化症フラー ク内での毛細血管の増殖、血管［カボシ肉呻を含んでおり、これらは最近、制御 が損われた内皮細胞分裂及び毛管成長を特徴とする病気とし・て認められている 。これらのｒｆ状並ひに充実性腫瘍の成長は、脈管形成病（ａｎｇｉｎ＊ｐｎｉ ｒ　ｒｌ＋５ｐａｓｅｓ）とし・て紛称されている（フォークマン　ｌ　、　（ Ｆｏｌｋｍａｎ　、１．）及びＭ　、クラグスフルン（Ｍ、　Ｋｌａｇｓｂｒｕ ｎ）［１９８７］　５ｒ１ｅｎｔ：ｅ　２３５：４４２〜４４７）。

＠管形代病に加えて、内皮細胞の増殖が病原となっているか、少なくとも望まれ ないものとなっている池の症状がある。例えは子宮内膜症は通常は子宮の内壁を なし・でいるある種の内皮細胞の異常な増榊及び配置ｌこ特徴づけられろ。脈管 形成過程の抑制は、子宮内膜症を防止又は軽減するのに役立ち得ろ。また子宮の 内皮細胞成長の防止は、避妊の手段となり１４る。

内皮細胞の成長は傷の治卿と関連している。この成長は広範囲な外科手術の進行 中には、また過剰な閾痕形成が起きろる場合には望ましくない。ｊ：ｔつて内皮 細胞の増りを抑制する手段は、望まれないｌｑ項杉成を防Ｉヒ叉は少なくする助 けになる。

脈管彰１ｕ内皮細胞の増殖の機構は完全には特性化されていない。腫瘍のＩＱ黄 に於て新たな毛細血管の成長が生し・る前に、マストＪｊＩＩ鞄がＩＦ積するこ とが確認された。

しかし、マスト細胞単独では脈管形成を開始出来ない。

マストＩＩｒ！の生成物である・＼バリンは、脈管形成に必要な毛細血管の内皮 細胞の移動を著しく刺激することが示されている（フォークマン　ジエ−、［ｌ ９８４］　ＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉＳ：開始と調節、癌の浸入と転移：生物的及 び治療的な面、ジー、エル、ニコルマン（Ｇ、　Ｌ、　Ｎ１ｃｏｌｓｏｎ）及び エル。

ミラス（Ｌ、　Ｍｉｌａｓ）！１、ニューヨークのラヘンブレス　２０１〜２０ ８頁）。

幾つかの物質がインヒドロで内皮ＩＩ＠の成長を抑制する能力があることが知ら れている。内ＦｊｌＩＩ胞成長の最もよく研究された抑制剤の一つは、プロタミ ンであり、これは精子のみに見出される蛋白質である。プロタミンはＳ瘍の脈管 形成を抑制し・、その情の＃瘍の成長を抑制することが示されている（ティラー 　ニス、（Ｔａｙｌｏｒ　Ｓ、）及びジエー、フォークマン（１，Ｆｏｌｋｍａ ｎ）［１９８２］　Ｎａｔｕｒｅ　２９７：３０２〜３１２）　、プロタミンの 抗脈管形成活性はその良く知られた・＼バリン結合能力によるものであった（テ ィラー及びフォークマン［＋９８２］上記参昭）、プロタミンでの臨床試験は、 ７０タミン注１に関連する春性の為に行なわれていない、鮭の精子から通常単離 されるプロタミンは、人に於て抗原性であることが知られており、そして二次暴 露の時にこの蛋白質に対するアナフラキシー反応が観測されている。

少なくとも二つの他の化合物がそれらのヘパリン結合活性に間して研究されてい る。即ち、血小板ファクター４　（ＰＦ４）及びゾジャーヘーンソク７゛ロチイ ン（ｗａｊ。

ｒ　ｈａｓｉｃ　ｐｒｏ會ｅＩｎ）である。＆　ンヤ−ＪＸ−シ゛ツクフロ子イ ンはノ＼バリン結合活性を示すが、非常に毒性であるために実用的な有用性は殆 とない。

血小板ファクター４　（Ｐｌａｆｅｌｅｔ、　ｆａｃｔ、ｏｒ　４）は完全に配 ※す決定された良く知られた蛋白質である（トイエル。

ティー、エフ１、アール、エム、セニオル、ティー、チャン。

ソー。１ル、ケリフィン、７−ル、エル、ヘインリクソン及Ｕイー、ティー、カ イザー［１９８１］　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　７Ｒ：４５Ｒ５１５Ｆ＋７）。これは血小板凝集中に放出される７０ 個の残基の分泌性血小板蛋白質であり、分子量が約７、ＲｋｒｌＴある。・飄バ リン結合活性の証拠が存在し・、幾らかの抗脈管影成活性の徴候があるが（フォ ークマン［ｌ郭４］、ｈ記奏ＦＩｙ）、ｐＦ４は決して臨床的に有用性を有する ことが示されていない。

「オンコスタチンへ」と記載され、天体のＰＦ４と同しか又はｎ卸し・でいるよ うにみえる化合物が、腫瘍の成長に影響することが示されている（米国特許第４ ６４５８２８及び４７３７５［１号、両者ともトワートシソク（Ｔｗａｒｄｚｉ ｋ）等に１し発行されている）。し・かし・、これらの特許に報告された効果は 、免疫不全マウスに於いて緩慢増殖し、ているヒト癌８ａ瞼に間するものである 。これらの実験の結果は、宿主動物に元来存在する？、速成長し・でいるｌｌＩ 瘍へのマｈ果を予測する為に；Ｊ、容部に外挿する（、％てはめろ）ことが出来 ない。甲に、これらの特許に報告されている実験は、全くどんなアンキオスタチ ックなく脈管形成を抑制する）性質をも予測叉は開示していない。

ＰＦ４からの種々のペプチドが精製され、それらの性質が試験されている。いず れも脈管形成の抑制に於けるどんな役割も示し・でいない、ＰＦ４のＣ−１３ペ プチドは好中球及び単球に対し・、化学走性（ケモタクチック）であることが知 られている（オスダーマン　ディー、シー８、ジー、エル、クリフィン、アール 、エム、シニア、イー、ティー、カイザー及びエイチ、ティー、トイエル［１９ ８２］　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ｌ’ｏ＋ｕｗ 、　１０７　（１）：１３０−１３５）　＊単球の浸潤が、脈管形成因子の分泌 による局祁的な内皮細胞の増Ｍ及び移行を刺激するものと予測されることに注目 するのが重要である。従ってＰＦ４のペプチドは脈管形成を抑制しないで刺激す ることが予測される。

脈管形成の抑制性状のほか、ＰＦ４は好奇症性蛋白質のインターロイキン−８及 びβ−トロンボグロブリンの特徴的な構造上の特質を有し・ており、生体内で好 中球と単球に対し・て化学走性（ｒｈｐ＊ｎｔａｒｔｉＣ）であることが示され た（ウォルペ及びセラミ［１９８９年］　ＦＡＳＥＢ　、１ｏｕｒｎａｌ　３巻 ２５６５−２５７３頁）。よく特性化された好奇症性蛋白質とのＰＦ４の構造及 び活性の！Ｉ似性は、炎症部位における血小板の遍在的な凝固とともに、ＰＦ４ が炎症の内因的な媒介物であることを示唆し、でいる。このため、生体内ではＰ Ｆ４投与に犀って＃張があると予期される。

脈管形成及び内皮細胞増殖の有効かつ一毒な抑制物を見つけ出すことが有ｖ義な こととして、し・かも非常に長い間末ぬられてきた。脈管形成は隔を含めた広範 囲の破滅的な病気の開始及び進行に主要な役割を果す。これらの病気を処置する 為に、局所的及び／又は全身的に投与てきる有効て一毒性の薬剤は非常に有益で あり得るが。

長い間見つけ出す二とができなか・）た。

本発明のアミノ酸を同定するのに、以下の表が役立つ。

アスハラキン　へｓｎ　Ｎ ７スハ→キン峻　へ５ｒＩＤ へ５ｎａＵ／又は−Ａｓｒ＋　へｃＮｘ　Ｂノス千イシ　（゛きＳＣ ケル９ミン　Ｇｌｎ　Ｑ ケルマミン＃　ｆ↓Ｉｎ　Ｅ Ｇｌｎ及Ｕ／又はＧｌｕ　Ｇｌｘ　Ｚ ケリンン　ｆン１５　Ｇ ヒスチジン　Ｈ＋ｓ　Ｈ リンノ　しき５に メチオニン　Ｍｅｉ　Ｍ バリン　Ｖａｌ　Ｖ 発明の短いまとめ 本発明は、脈管形成と内皮′ａ＠増殖を伴う病気の治療に、Ｉｌｌ瞥え型ＰＦ４ （ｒＰＦ４）が臨床的有用性をもっているという発見に間する。更に、ＰＦ４断 片は、脈管形成の抑制剤である二とが示されている。＠管形成を抑制する能力は 、ＰＦ４内のカルボキシ末端の１３個しかないアミノ酸配列に対応する合成ペプ チド中に見出された。

本発明の更に一つの面は、脈管形成と内皮細胞増殖を抑制する強化された能力を もったＰＦ４１１似体類（突然変異体）及び断片の同定である。

本発明の更に一つの面は、ＰＦ４と抗炎症剤との朝合せによる脈管杉代病の処置 である。抗炎症剤は、好奇症性化合物の投与に伴う望んでいない膨張、痛み、又 は繍１ｉｕｉ傷を軽減する助けになる。

図面の簡単な説明 図１はネイティブ（ｎａｔ、１ｖｅ）なｒＰ　Ｆ　４のＤＮＡ配列とアミノ酸配 列を示す。

図２は、ｒＰ　Ｆ　＋１と種々の関連ペプチド類での処置から生ずる脈管形成の 抑制を示す。

図３は、ｒＰ　Ｆ　４にょる内皮細胞増殖の抑制を示す。

図４は、ｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　４−２４１のアルファらせん構造を示す。

図５は、ｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　Ｉ↓−２４１での処置から生ずる脈Ｗ杉成の 抑制を比較したものである。

図６は、ｒＰ　Ｆ　４叉はｒＰ　Ｆ　４−２４１での処置から生ずるヒトのへそ 静脈内皮細胞の増情抑制の比較である。

図７は、ｒＰＦ４又はｒＰ　Ｆ　４−２４１の糟瘍成長抑制能カを示す。

図８は、ｒＰ　Ｆ　４、ｒＰ　Ｆ　４とインドメタシン、又は緩衝液の注射後の 時間の間数とし・ての、マウスのフットパットの膨張を示す。

図９は、ｒＰ　Ｆ　４又はインドメタシンを加えたｒＰ　Ｆ　４での処置後の、 炎庁性ｍａ漫潤の定量を示す。

図１０は、ｒＰＦ４のみ、インドメタシンのみ、緩衝液のみ、又はｒＰ　Ｆ　４ とインドメタシンの投与後のｍｓ成長を示す。

象−ＩＩ謙（１）　ｊ￥　Ｗケ碧−一 本発明は、ｒＰＦ４及びｒＰＦ４のある類似体煩とペプチド断片による脈管形成 の生体内抑制に間する。ＰＦ４のこれらの類似体頻とへブチト断片は、脈管形成 病の処置に使用できる。本出願で使用される用語の「脈管形成病」は、充実性１ １ＪＩの成長と、糖尿病性網膜症、水晶体後の＆Ｉ碓増殖、血管新生緑内障、乾 瘤、線維性血管腫、免疫性及び非免疫性の炎症（関節リウマチを含む）、アテロ ーム性動脈硬化症フラーク内での毛細血管の増殖、血［１及びカボシ肉腫を含め た脈管形成による機能不全を伴うその他の症状とをさす。本発明はまた、抑制不 良の内皮細胞増殖病の処置へのｒＰ　Ｆ　４及びＰＦ４断片の使用に関する。

本発明は、ｒＰ　Ｆ　４が生体内で毛管形成と胚の血管新生を抑制するという予 想外の発見から生したものである。

また、全長組替え型ＰＦ４が成長因子依存性のヒト内皮細胞増殖を生体外で抑制 することも発見された。

脈管形成を抑制するＰＦ４の活性は、長さ１３個しがないアミノ酸のＰＦ４配列 に対応する合成ペプチドによって保持されていることが確定されたのも腫要であ る。特に、ＰＦ４のカルボキシル末端部分（Ｃ−１３）に対応する１３Ｎのアミ ノ酸の合成ペプチドが、強い脈管形成の抑制活性をもつことがわかった。

ＰＦ４が内支纏胞の純粋培養基の生育を直接に抑制するという発見は、有利な二 とにその効果がなんらかの池のｌｌｌ１ｌ！型によって媒介されるのでないこと を重味している。ＰＦ４及び関連ペプチド１偶が脈管形成を生体内で（ＣＡ　％ ｉ検定）また試１管内（インビトロ）で（内皮細胞増ψ検定）抑制するという発 見は、単球に対するＰＦ４の化学走性活性にかんがみて特に予想外であった。

Ｃ−１３へプチトの活性は、そ＃ｌがヘパリンの抗凝固活性に影響しえないこと からみて、特に驚異的である。ｃ−１３ペプチドの使用は、適量の減少（ｌｊ量 基盤）、抗原性となる可能性が減少すること、及び新規な適量形式で有効となろ 見込が増すことなと、ｒＰ　Ｆ　４全体よりも優れた幾つかの利点を提供してい る。

ＰＦ４のＣ−１３ペプチドはまた、ハッカネズミでＣｏｎ−Ａ詞発性の免疫抑制 を予防する能力を保持している。この能力は、ヘパリンに影響されず、恐らく脈 管形成を抑制するペプチドの能力とは独立している。

充実性＃ｌＩ瘍が数ケ方ミリシートルを越えて成長するには、脈管形成が必要と なることはよく理解されている。

このため、充実性締瘍のＩ！ｌ！Ｌ置には、ｒＰＦ４又はその断片を使用し・で 、脈管形成を抑制することにより腫瘍拒絶を起こさせろことが、新規かつ非常に 有利な治療手段を提示している。Ｃ−１３ベフチトがヘパリンの抗凝固活性に影 響せずに脈管形成を抑制する事実は、この小さなペプチドが同時的な抗凝固療法 に干渉しない利点をももつであろうことを例証している。更に、小ペプチド類は 一般に大きな蛋白質より抗原性が低く、このため、ＰＦ４断片は経口及び経皮投 与に有利に使用できる。これらの薬を体に行きわたらせるやり方は、それぞれ胃 腸管の毛管増殖（例えばカボジ肉１と皮膚病変部の処置に特に有用である。ＰＦ ４断片の病変内及び全身投与は、これらの症状の処置にも適している。

ヘパリン結合活性を欠くが、脈管形成を抑制する能力を保持しているようなＰＦ ４１１似体類がつくられた。「Ｐ　Ｆ　４−２４１として知られる一つのこのよ うな類似体は、合成ＰＦ４遺伝子のカセット突然変異誘発によってつくられ、そ の場合にＰＦ４のカルボキシ末端近くの４！のりジン残基をコートしたＤＮＡ配 列は、２個のＧｌｎ−Ｇ１１１カツプレツトをコートした配列に変換されたｅ　 ｒＰ　Ｆ　４−２４１が病変内に投与される場合、適量が病変部当たり約ｌｕｇ 〜約４　ｍｇの間にあるようにａ用される。全身投与には、ｒＰ　Ｆ　４−２４ １の適量は、体重ｋｇ当たり０．５　ｍｇ〜約１００−ｇの間にある。自然配列 のｒＰ　Ｆ　４　ｔｔひにペプチド断片の投与には、同様なまたそれより高い適 量を使用できる。

例えば、ｒＰ　Ｆ　４とその断片の適量は、ｒＰ　Ｆ　４−２４１の適量の２倍 以上でありうる。

上記のように、ＰＦ４は生体外て好中球と単球に対して化学走性であることが示 され、これが炎症応答を媒介しうろことを示唆している。これらの観察が生体内 の関連性をもつかどうかを見るために、ハツカネズミで急性及び慢性支管炎症を 誘発するＰＦ４の能力について試験し、た。絹替え型ヒトＰＦ４（ｒＰＦ４）を ネズミの皮膚に注射すると、２時間以内に急性炎症が誘発され、約１２−１８時 間にピークに達し、約３６時間に解消した。同量のチトクロームＣ，＠重液のみ 、又はアミノ末端ＰＦ４ペプチドの江嗜４は有意の炎症応答を誘発できなかった が、カルボキシ末＃１１ＰＦ４ペプチドは好奇症性であった。　ｒＰＦ・↓及び ４１アミノ＠　ＣＯＯＨ末鳩ペプチドの両方で誘発される炎症性浸潤は、好中球 とそれより少ない量の単核ｍ鞄からなっていた。炎症応答を引出すには比較的高 濃度のｒＰ　Ｆ　４がＩｉ・要であるが、これらの濃度は血小板凝集中に、又は ｒＰ　Ｆ　／Ｊ　、ＲＥｉ関連化合物頚の投与部位で、局所的に得られる。

有利な点とし・で、ｒＰ　Ｆ　Ｊの好奇症効果が、脈管形成の抑制活性を低下さ せずに抗炎症剤の全身投与によって著しく抑制されることがわかった。

受精卵を静置させて３日間３７℃で７０〜８０！の相対湿度で培養した。この間 、胚が卵の内容物の上表面に上昇した。

４日目の始めに、卵は逆ざまにすることなく割られ、注昏゛深く滅菌フラスチソ ク製ベトリ皿に旺が上表面にあるｔうに置いた６殻のないｔｉｌｌを史己こ７２ 時間３７゛Ｃで２，５〜３．５１のｆ１１２を汁！（７・でいる雰ｌ＃４気下て 培養（・、その後成長する牡は認め得る（゛へＮ１を発達させた。試験試料をｌ χ（警／〜）メチルセルロースと混合することによって造ったディスクを乾燥し 、主要な静脈（胃ａｊｏｒνｅｉｎ）の閏のＣＡＭ上に、胚からおよそ０．５ｅ ｗｌｉｔｂて置いた。３７℃で更に４８時閏培養後（２，５〜３．５ＸＣＯ２） 　、脈管形成を抑制する能力について試料を採点した。抑制はインブラントを取 巻く脳血帯域として現われ、このディスクを避けている静脈によって形成された エルボ−杉及びインブラントの領域に於ける毛細血管の減少し・た数を含んでい る場合が多い。

内皮纏抱増￥煕ユ ヒトの輪静脈内皮細胞（Ｈ１，Ｉ　Ｖ　Ｅ　Ｃ）を、ＩＯＸ　（ｖ／ｖ）牛給児 血清（ＦＢＳ）、１５０ｗｃｇ／＋ｍｌ内皮ＩＮ胞成長サブレメント（Ｅ（ＧＳ ）及び５単位／１の・＼バリンを含有しているメディアム（培地）　１９９　（ ｔ；１ｈｃｎ）中で、３７℃、４〜ＦｉＸＣＯ２で培養した。３〜４日毎に培養 基をトリフシン処理によって収穫し、希釈し・て再プレートし１、集合体に生育 させた。実験開始前にＩｌ＠を遠心分能し・、・＼バリンのない培地中に再懸濁 し・、！ｌｔ験物質（ＰＦ４）と共に３日間、標準の培養条件下で培養し・た。

培１！　Ｉｌｌ開の終りに細胞をトリプシン処理によって除き、パーティクルφ データ・エルシン１８０細胞カウンターで数えた。平均の間の統計的な有意性は 、不対データに対する標準のスチューデントを一試験（Ｓｔｕｄｅｎｆ、　ｆ− ｆｅｓｔ）で決定し・た。

ＤＮへ合成の抑制は、）、記のように細胞をプレートしでから、試験物ｎど一緒 に２４時間培汚することによってで一定された。更に６時間（Ｈ−チミンン（１ ７＋ｆ−ｉ／穴）を加え、フし一トを一７０℃で凍結させた。２回の凍結／解凍 １」１の後、綱＠をｗｋ紺フィルターヒに吸引し・、蒸留水で洗い、ＮＩｅｒｌ ＨてＩ’！１定し・、ｒ）〜へへの枚利能の取込みを力市常な（”、　５７Ｒ１ ，、／６１趨ハッカネスミ（生ｆ＊６−８週）に、Ｂ１６−Ｆｌｎゾラノーマ挿 瘍系統の対数相の細胞５ｘｌＯ５１１ｍを皮Ｆｔｅ種した。この操作は漸進的な 腫瘍成長を起こし、約１０口で大きな（３００ｍｍ’）壊死性腫瘍を生し、通常 Ｉ！瘍接挿の３遇間以内に未処理動物を死に至らしめた。

生体内のＩｌ壜成長と脈管形成を予防するｒＰ　Ｆ　４の効１′３を試験するた めに、腫瘍をもった動物に、腫瘍接種の１日後から始めて毎日、ｒＰＦ４又はｒ Ｐ　Ｆ　４の入っていない緩南Ｉαを斬牛ＩＩＩ壜へ直接に注射した。各被験動 物が受けろ特定の処理のユニホームにｊ）を包んだ研究員が、定量的な時間１： Ｉ隔て、子ンタルノキスによって腫瘍容積を測定した。

で？−−ゾ　ト　バ　フ　ト　對−一１＝試験物質を含有するＰ　Ｂ　Ｓ　（０ ，０５ｍｌ）を各ハッカネズミの右後岐足の裏に皮膚内性ＨＬ・た。試験物質を 含有りない希釈剤の同量を、左後肢足の裏に注射した。種々の時点で、足の夷の 厚みを、ハネ装填された工学用マイクロメーター（ファウラー社、英国ビッグス ウォルト）によって測定し・た。

神々の時点で、ハツカネズミをＦＦｉ殺し・、足の裏の組織を光学顕微鏡検査の ために準備した。この組織を使用して、ＮＪｆＩＩＩｌ砲型を定置した。生検標 本を少なくとも４８時間、１０％緩衝ホルマリン中で固定し・、次にパラフィン 場没と・＼マドキシリン及びエオシン染色という標準技法を用いて調製した。接 眼グリッドを使用して、各標本中の真皮の・ｌ細胞区域を１００ＱＸの倍率でコ ート方式によって検査し、炎症Ｉｉ＠を定電化し・た。群間の差は、スチューデ ント１試験又は４当な場合、分散分析によって評価した。

ｒＰ　Ｆ　４の生産 ＰＦ４部分の直向に特異なメチオニン残基を含有する一末端融合蛋白質として、 組替え型ＰＦ４を大勝菌中でつくった。もっと特定的には、自然配列のＰＦ４　 （図１）（ボンクスら、［１９Ｒ７年］　Ｂｌｏｏｄ　６９巻２１９頁）をコー トした合成遺伝子を、プラスミドｌ　Ｅ　Ｖ　２．２　（１９８６年６月３０日 寄託、呼出番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０９１）の複数制限部位領域へクローニング することによって、発現プラスミドｐＰＦ　４−２１１を構宰し・た。合成遺伝 子中のコドン用法を大勝開発ｆｑ用にＰ１適（ヒし、Ｐ　Ｆ　４　ｉ！　！云子 のへクダーへの指向性挿入を容易にするために、合成りＮヘリンカーを各末端に 含めた。ｐＲＥ　Ｖ　２．２への挿入用に制限部位Ｈｉｎｄｍ及び！”ｉｍａｌ を選択した。生ずる構造体ｐｐ　Ｆ　４−２１１は、特異なメチオニン残基によ ってＰＦ４配列から隔てられた大ＩＪＩＩＩβ−グルクロニダーゼ（Ｆ＋＋；） の３４アミノ酸を含有する融合蛋白質を発現し・た。

融合蛋白を発現する線略をリゾチーム（細胞ｇ当たりｌａｇ）、ＤＮアーゼＩ　 （細胞１００ｇ当たり５００単位）及びビーズミル処理にかけた。融合蛋白質を Ｆ３ＧとＰＦ４部分との間のメチオニンのところで開裂させるために、融合蛋白 ｙを含有する溶量・＼し・・ｌトを７０％蟻酸中のＣＮＢｒ（細胞１００ｇ当た り１０　ｇ）で処理した。ＣＮＢｒ／蟻酸の蒸発後、絹替え蛋白質を細胞出発材 料１００ｇ当たり５０ｗ門トリスーｃ　＋　（ｐＨ７，６）　、　５ＭＭ　Ｅ［ ｌＴＡ、及び１０　＋１Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔの２００１て抽出し、た。目妖配列のｒ Ｐ　Ｆ　４−２１１は、蛋白質をヘパリンアカロースに結合させ、汚染蛋白質を ０．６Ｍ　Ｎ　ａｃｔて除去し・、１．２Ｍ　Ｎａ（Ｉて溶離することによって 精製された。生ずる材料を２０常ＭＩ＄酸ナトリウム（ｐＨ４，０）へ透析し・ 、クマシープリリアントアルーで染色した１５％５ＯＳ−ＰＡケルトて分析し、 た、Ｃ′４逆柑逆圧高圧液体クロマトグラフィＰＬＣ）を用いて少量の汚染物質 を除去すると、生体内使用の蛋白質が調製さハた。

−ｒ　Ｐ　ｊ−」−−−？、ｊｊ　ＴＪｌ、−、Ｑ、−ｊｔｆ）　−郷（１）− Ｐ、ｆｉ−４Ｗ＠似体ｇｒｔ　ノ生産ｒＰ　Ｆ　ｒ↓−２４１と命名される突然 変異体をコートした合成遺伝子は、Ｐ　Ｆ　４の（゛末端近くの４個のりジン残 基に対するコドンを、ＢｈｅｌとＳ＋＋＋ａ１部位間でのカセット突然変異誘発 によって、２個のＧ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｕカップレットをコートした配列（ＣＡＡ　 Ｇ八へ）に代えることによって構築された。リンカ−は合成遺伝子の末端に含ま れており、遺伝子は上記のよ６に、ｒＲＥ　Ｖ　２．２へ挿入された。

その他のＰＦ４変異体又は類１１ノ体をコートした遺伝子は、同様な方法で調製 された。

突然変異体蛋白Ｎ（ｆＷえ’、ｉ　ｒＰ　Ｆ　ｌ−２４１）を上記のように開裂 し、抽出し・た。次に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトケラフィを使用し・て 抽出物を晴製し、Ｏ−ＩＭ　Ｎａ１ｌの勾配で溶離した。ＰＦ４蛋白質は、一般 に約０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶離され、これを２０　謂Ｍ燐酸！１衝液（ｐＨ７， ５）で透析し・た、試料を更に逆相ＨＰＬＣによって精製した。

ＰＦ４ベアチト類 標準同相合成手順に上ってペプチド類を調製し、固体支持体から切り離し・て脱 ｉ１−シ・、逆相ＨＰＬＣによって精製絽讐え型ヒトＩＬＩ　（ｒｌｌ、−１） をンエンザイム・コーポレーション（マサチューセ・）゛ソ州ケンフリツシ）か ら購入した。チトクロームＣと大１１１Ｍエンドトキシンをシグマケミカル社（ ミス−り州セントルイス）から購入した。

除枚性イントメタンンベレ・ｌトをｒノ・＼−チブ・リサーチ社（オハイオ州ト レド）から購入し・た。

（：　５７８１／　６，１、へ／、１、及びＣ３Ｈ／　Ｈｅ、ｌ雌ハッカネズミ （生後６−８週）をシャケリン・ラボラトリ−（メーン州バーバーバー）から購 入し・た。

次の実施例はＭ良の升ヨ態を含ぬた本発明の実施に対する手順を説明する。これ らの実施例は限定的なものとして解釈されるへきてない。特りこ別途記載し・な い限り、全ての％は重量、全ての溶媒混合物割合は容量による。

実施例１ 上記の様に製造した鶏の卵を種々の濃度の組替えＰＦ４又はＰＦ４の配列に由来 するペプチドを含有しているディスクで処理した。ｒＰ　Ｆ　４及び１３個のア ミノ酸しがないＣ末端ペプチドは、ＣへＮ１に於いて脈管形成を抑制し・た（第 １図）。各場合とも、抑制は投与量依存性であり、応答はほぼＰＦ４のＣ末端領 域を含有している抑制剤と同等である（モル基盤）。Ｐ　Ｆ　＝１のＮ末端ペプ チド（Ｎ−２９）は試験された最も高い濃度に於いてさえ脈管形成を抑制せず、 Ｐ　Ｆ　、１の全ての抗脈ｔＲ杉成活性はおそらく分子のＣｉ：端部分と関連し ・でいることを示唆している。ＰＦ４の（゛末端は「腸ンに冨んでいるので、こ の検定系において、ホリリノンを試験し、６．５ｎモル投与量で抑制を生しない 二とが分った。

実施例２ Ｐ　Ｆ　４のリンノに冨んた領域（６１〜６日の残基）もＰＦ・１によるｌ＼バ リンの結合と関連した領域である。ヘパリンは脈管形成を調節する役割を果たす ことが知られており、脈管形成は特性がよく分っている別のヘパリン結合蛋白質 であるプロタミンによっても影響を受け得る。ＰＦｌに基ついた合成ペプチドが ヘパリンに結合する能力を評価する為に１本発明者等はヘパリンによって阻害さ れる凝固カスケード酵素の活性を検定した。ここで使用されるＸａ因子の検定は 、デントンら（１９８３年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１、２０９巻４５５−４ＦｉＯ頁ですてに記述されている。プロタミンと血小板 ファクター４は、はぼ同し・モル濃度でトロンビンとＸａ因子のヘパリンによる 抑制を予防しう４゜ＰＦ４の４１アミノ酸のＣ末端ペプチド　（Ｃ−４１）はヘ パリン抑制の防＋ｈがより効果的τなかまたが、Ｃ−１３ペプチドはｒＰ　Ｆ　 ４の有効水準の１０倍の一度に於いてさえ、トロンビンの抑制を防止することが 出来なかった。この子炉外の発見は、Ｃ−１３ペプチドがヘパリン結合以外の何 等かの方法によって脈管形成を抑制することを示唆している。

実施例３ 多くの脈管形成剤は内皮細胞増殖の直接の抑制によって作用する。内皮細胞の分 裂及び成長は成長因子の存在によって厳密に制御され、そしてこれに厳密に依存 している。本発明者等は、野性型配列をもったｒＰＦ４（ｒＰＦ　４−２１１） 及び関連ペプチドの、成長因子に刺激されたヒト内反細抱増りの抑制を試験管内 （インヒドロ）で評価した０図３に示すように、ｒＰ　Ｆ　４は１．３μ門もの 低濃度で、投与量依存的な杉て内皮ｍ抱の成長を著しく抑制し、た。抑制は、こ こで使用されたヘパリンを含まない培地中で、３．２＋＋Ｍて完全であった。

実施例４ 内皮Ｉｌ胞増りの抑制に於けるＰＦ４のヘパリン結合活性のｍ！要性を評１西す る為に、５単Ｉｆｆ／ｍｌのｌ＼バリンを含有するか含有していない培地中て碑 吃を培養した。この実験ノ３日間の培養の間、ヘパリンの存在はこれらの細胞の 嘴端を刺激（−た、ｒＰＦＬは１昭４１００１）も、ヘパリン刺激（４５１）内 皮ｍｕｍの成長も、両方とも抑制した（表−１４，４±２．５　′６．０±０． ６　〜１００５ｕ／＋ｗｌヘハ　リノ　１８．９±　１．２　１）１４．０±　 ０．４　４５角は８＼１０４１つ■ルの榊え付けに基づく。

ｂ過当な？４昭と有！の差あ１１　（ｐ　＜　０００５）実施例５　ｖ−Ｐ−１ −１−７４１の１−ａＰ　Ｆ　４のカルボキシ末塙に於ける４つのりシン残基を 上記の様に２つのＧ　Ｉ　ｎ　−＋；　ｌ　１１力・ツブレットに変換すること によって、ＰＦ４突然変ｌ！体を造った。この蛋白質は明らかに、分子のこの領 域に対するαラセン形のの二次構造（図４）を１！持するが、同時に・＼バリン 結合活性の喪失を伴う。

二の蛋白質は自然Ｐ　Ｆ　４に対するポリグロー十ル抗体と反応性であり、アミ ノ酸分析によって適当な修飾を有し、でいることが決定されたつ有會義な点は、 ｗＩ製された突然前異体蛋白質がＸａ因子の抑制検定に於いて、ヘパリン結合活 性を欠いていたことである。

ここに記載された置換はベフチト断片並びに完全な長さのＰＦ４分子に対し・て 行なうことが出来る。例えばＣ−１３−２４１は次の配列を有する。

ＰｒＯ’ＬｐＨ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｎ−１＋ｌ１ｌ−ｌ　ｌｐ−ｌ　ＩＰ−１＋Ｉ ｎ−Ｇ１１１−１．Ｆ！ＩＩ−Ｌｅｌｌ−ら１０−ｅｒ ＊施例６１−ビー１−１−二μｍ１−（仁木表脈管−彰−秀ｊ口剌濁精製したｒ Ｐ　Ｆ　４−２４１を、鶏の絨毛犀［（ＣＡＭ）ＩＩ定に騎いて、毛細血ｖ１片 長の抑制能力について試験した。

試験し、た最も低濃度に於いてさえ（１，２５ｎｔ１１／テーイスク）　ｒＰＦ 　４−２４１は（゛へＮ１系において脈管形成を広範囲に抑制した（図５）。こ の抑制は膜上のより大きな職血管帯域しこよって示唆されろよ６；こ、元々のｒ ＰＦ４の同し１度によって生したものよりもいっそう有効であった。ｒＰＦ４− ２４１の抑制効果はヘパリンによって逆転されなかった。

実施例７１Ｐ−月」ど−７４１−ζこ木−４−１−上人叉！−胞増殖の抑制自然 のｒＰＦ４及Ｕ突然変異体ｒＰ　Ｆ　／ｌ−２４１によるヒト堕静脈内皮縞胞増 殖の抑制試験仁こ於いて、両方ともがこれらの細胞の増殖を抑制するのに有効で あることが示ざｔまた。この試験の結果は図６に示されている。

これらの結果は、Ｐ　Ｆ　４の効果がヘパリンの結合の為であったと１反定し・ た脈管形成のｒＰＦ４抑制の以前の理論からすると注目すべき事である。我々は 蛋白質を、元々のＰＦ４の構造的な特徴の多くを保持しつつも、検出可能なヘパ リン結合活性を欠くものとして設計したが、これは生体内で脈管形成を抑制する のに自然なＰＦＡよＩ）もより活性であり、試験管内で内皮細胞増殖を抑制する のにより活性であ（）得ろ。史に我々が設計した突然変異体は、ヘパリン抗凝固 療法に干渉することが予悸され腫瘍成長と脈管形成の予防におけるｒＰ　Ｆ　４ −２１１又はｒＰＦ↓−２１１のｔｂ力を試験Ｌ・た。生体内腫瘍成長の抑制は 、七の材料及び方法に記述されているように、ｒＰＦ４−２１１　（２０＊Ｍ　 Ｎａ＋ＩＡｃ中、ｐＨ４，０）　叉はｒＰ　Ｆ　４−２４１　（５０ｍＭ燐酸ナ トリウム、ｐ）ｌ　ｆｌ、５．５０間Ｍ　ＮａＣＩ）を直接に新生腫瘍中に注射 後、検定された。挿瘍接挿の７日以内に、緩衝液を注射された動物は明らかな三 次元的な＋ｍ瘍を有する一方、ｒＰＦ・ｌ−２１１で処理ざ１１た動物は水翼的 に腫瘍が％　カっ？＝（ＩＩＦ！７図）。ｒＰＦ４で続けてＪ！！Ｓ置すること はこれらの条件下、即ち未処理マウスですてに見られたよらに対照動物のＩＩＩ 壜か壊死を生し２．そし・て大きなものであるような条件下で、完全に櫓瘍成長 を抑制した。ｒＦ’Ｆ　４−２４１が抑制剤とし・で使用されたときにも、同し 効果が観潮された。

この発見は、脈管形成の抑制剤とし・てのｒＰ　Ｆ　４が、悪性！呻及び他の癌 の克服に臨床的有用性をもつとの提案を支持するものである６１１１瘍の漸進的 成長は新しい血管の形成を要求し、このことは抑制されれば腫瘍成長を制甲する の力ならず、既存血管の１舅１ヒを刺激し、並びに悪性の侵入物に対するその他 の１岑を増強する。

生体内の腫瘍成長のｒＰ　Ｆ　４によ乙抑制が、最初の接＃４（ｒＰＦ４の）の 三日ジノ内に明らかであったという発見！ｉ、ｒＰＦ４が長時間を要する免疫調 整（イミュノモンユレーション）によるものでなく、局所的な機構によってＩ！ 瘍成長を調節する横に１乍用することを示し・でいる。

更にｒＰ　Ｆ　４はインビトロて腸瘍ｍ胞の成長を直接に抑制しなかった。？蓬 って、ｒＰ　Ｆ　４は成長中の腫瘍に対する宿主の脈管財成的なの答を変えたよ ってある。

実施例９ 同定された構造及び機能の蛋白質は、アミノｒＩＩ配列を変更することによって 、もし２このよろな変更が有意に蛋白質の二次構造を変更させないならは、構渠 てきる二とが示された（カイザー　イー、ティー、及びエフ、ジエー。

ケズディ−［１９８４コ５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　２４９−２５５）。本発明 は、ヘパリン親和性を欠いていて、同し又はより高い脈管形成の抑制活性を実質 的に示す、本明細書に記述されたＰＦ４配列のその他の突然変異体又は断片類を 包含する。

好まし・い変更領域は、ｌ＼バリン結合領域に対応するカルボキシ末端近くのり シンに富んだ領域（残基６Ｏ−７０）である、一般的な規則として、６０＠目か ら７０番目のアミノ酸は削除できない６ｆた一瞬規則として位１ｔ６０と７０の 間で少なくとも１個の荷電された残基をもつ必要がある。この領域で両性の（ｌ −らせんを保つ必要はないと思われるが、両性構造が好まし・い。従って本発明 は蛋白質の二次構造を変えないか、又は構造が変えられたとし・でも生物的な活 性が保持されているような、本明細書に描かれたアミノ酸配仝りの突然変異体を 含んでいる。特にアミノ酸のコンサーハティフな置換を行なえることがＦＩＦ＠ されるへきであるつ泗才は、アミノ酸は次のクラスに分けられ得る。塩基性、疎 水性、峻性、極性及びアミド。一つのクラスのアミノ酸か同し・神ｌ１１（クラ ス）の別のアミノ酸に置きゆえられる置換は、その置換が実質的に化合物の生物 活性を変スない隊０１本発明の範囲内にあるものである６表２は各グラスに嘱す るアミノ酸の例を挙げている。

１二＝り 塩基性　Ｋ、Ｒ，Ｈ 極性　Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ アミド　Ｑ、Ｎ ある場合には非コンサーハティフな置換もされうる。

例えばＰＦ４のＣ末端の近くのりジン残基は任意の次のアミノ酸で置換され得る 。即ち、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｍ。

Ａ、Ｌ、及び１．臨界的な要因は、これらの置換が「ＰＦ４又はｒＰＦ４断片の 生物活性を有意に損なうものであってはならないという点である。

我々は、アミノ酸＃ｔ！！！を行なう＊験を行ない、生ずるｒＰ　Ｆ　４突然変 異体を生物活性について試験した。構築された神々の突然変異体を表３に示す。

表３ ｒＰＦ４−２１１　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７］　−ＰＬＹｋｋｌｌにに１、Ｌ ＥＳｒＰＦ４−２３１　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７］　−ＰＬＹｒＰＦ４−２４ １　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７］　−ＰＬＩＥＩＩＱＥＬＬＥＳｒＰＦ４−３０ ２　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７１−Ｐｌ、ＹＯ（＋１ｌＬＩＱｌ、ＬＥＳｒＰＦ ４−３０３　［ＰＦ４　ＡＡ　１５７］　−Ｐｌ、ＹｋｋｑＥＫＫＱＥＥｓｒｒ ’Ｆ４−３（１７［ｐＦ４　ＡＡ　Ｉ−ニー＋７］　−ｐｌｊ’ｌｌｌ［ｌ旧Ｅ ＬＥＳｒ　ｌ’　Ｆ　４・：（０８［Ｉ’Ｆ４　Ａ４　１−５７コ　−　Ｐ１〜 〜ＩＩ　ｌ　ｌ　Ｎ旧Ｌ　Ｅ　５ｒＰＦ４−：（１５［ＰＦ４　１Ａ　１−５７ ］　−Ｐｌｊｉ：Ｆｌ目；ＥＬＬＥＳこれらの・＼フ千トｔｉｔの＋１：物活性 を試験する実験の結果を表７１に示す。

表１↓ （八Ｍ　ＨＩＩ　Ｖ　Ｅ　Ｃ ｒＰＦ４〜２４１　＋＋　＋ ｒＰ　Ｆ　Ｌ−４４０２＋／　−− ｒｐＦ４−３Ｑ：１　＋　Ｎへ ｒＰＦｌ−：’（ｎ７　＋＋　＋＋ ｒＰＦＪｌ（ＩＲ＋　Ｎへ ｒｆ−’　Ｆ　ｌ−：（１５＋　Ｎへ ＼“へ＝入子不能（Ｎｏｔ　Ａｖａｉ　ｌａｌ＋ｌｐ）表１乞こ示す結果は、（ ゛へＮｌ横定績ひ）ｌ　Ｉｔ　Ｖ　Ｅ　Ｃ検定において″ａ胞成長の抑制に間す るｒＰ　Ｆ　４の生物活性を保持したｒＰＦ４突吠変毘体を構築てきることを明 確に例証している。これらのペプチド！０の二つ（ｒＰ　Ｆ　４−２４１とｒＰ Ｆ・↓−３０７）はこれらの検定で強化された活性を示した。ここに記述された 突妖変異体は、野性型ｒＰ　Ｆ　４（ｒＰ　Ｆ　４−２１１）と大部分相同であ るが、あるアミノ酸ａ換をもっているよ６なアミノ酸配９＋１である。これらの 置換はアミノ酸６０と７０の間で行なわれた。

生ずる化合物のほとんとは、Ｃ／＼Ｎ１及ＵＨ１ＪＶＥＣ検定において生物活性 を１νっでいるが、ヘパリンを結合しない。ＣＡ　％ｉ又はＨ（Ｉ　Ｖ　Ｅ　（ ’７横定て有意の活性を示さないｒＰ　Ｆ　４−３０２は、残基６０と７０の間 で荷電されたアミノ酸残基をもたない。有意の生物活性を示さないｒＰ　Ｆ　４ ・２３１も、アミノｒ！！！数６０で終っている。当業者がその他の「ＰＦ４突 妖変異体の生物活性を検討したい場合は、所望の突然変異を行なって、生ずるペ プチド類の活性を試験するのがＩＩＴ′Ｊ直人な手順であるろう本明細書の教示 を用いて、研究者は所望の性状をもつと予セされるペプチド類をｔ！４製し・、 容易に試験てきよｈ６例えば、完全な長さのｒＰ　Ｆ　４分子について記述され たばかりのアミノ酸置換は、Ｈに記述されたｌ−１３及び（−４１断片について も実施ｒＰ　Ｆ　４及Ｕ関連化合物類の炎症性状は、上記の足の裏（フ・・７ト ハソト）検定を用いて検討された。８時間に、ｒＰ　Ｆ　４−２１１　（２５ｔ ｒ　ｇ）をネスミ表皮へ局所注射すると、尼の裏（フノトハ・ノド）膨張（図８ ）及び全庁性細胞浸潤の定ｔ（図９）によって２一定されるとおり、活発なさ９ 症の答を引き起こＩ、たつよ（）高い投与量では、組線の水腫はそれ以上増加せ ず、やや低下さえした。好奇症効果を現わすには比較的高い局所一度のＰＦ４が 必要であることがわかった。ネズミ表皮へ注射されたＰＦ４（２５μｇ）で活発 な炎症応答が生ずるが、０．２５μｇで炎症応答は最低限であった。ｒＰ　Ｆ　 ４で誘発される急性炎症の時間的経過は広域で、約３６時間で解消する（図８） 。

ｒＰ　Ｆ　４で誘発される炎症の時間経過は、６時間と１２時間の閏で基線から ピークへ上昇し・、３６時間までにほぼ完全に解消する。

友蹟例ｊｌ　ｒＰ　Ｆ　４に対する抗炎症剤へ互Ｊ実験の４８時間前に、各ハッ カネスミに除放性インドメダシンベレリト（イノ・＼−チア・リサーチ、オハイ オ州トレト）　０．０５　＠ｇを軽いエーテル麻酔下に皮下に移植した。これら のベレットは、１４日間にわたり、内容物を持続的に放出する。

インドメタシンによる動物の全４処置は、ｒＰ　Ｆ　４の好奇症応答を著し・〈 鈍らせる（図８）、ｒＰＦ４とインドメタシンで％Ｊされたへ゛′ｌカネズミで の足の裏（）・ソトハソト）＃張の曲線下の面積は、ｒＰ　Ｆ　４のみで処置さ れたハツカネズミの曲線下の面積の４５．７％である。炎症性細胞浸潤も、イン ドメタシン処賞によって部分的に解消された。これらの実験結果を表５にまとめ た。

表５ 好炎症性姿答 ％置　膨張　浸潤 ｒＰＦ４　＋＋　＋＋ ｒＰ　Ｆ　４−２４１　＋　＋ ｒＰＦ４／イントメダンン　＋／−＋／−二のよろに、イシドシタシンはＰＦ４ 又はＰＦ４間連関連物ｆ＠の投与に伴う膨張を減少するために使用できる。

他の非ステロイド抗炎症剤も使用出来る。本発明の鞘合せ及び方法に有用な抗炎 り剤は、ス千ロイド及び非ステロイドの抗炎症剤を包含する。非ステロイド抗炎 症剤は、アセチルサリチル酸（アスピリン）、サリチル酸メチル、サリチル酸ナ トリウム、フェニルブタシン、オキシフェンアダシン、アバシン、インドメタシ ン、スリンダック、トルメチン、メフＩナミンクアシット、イブプロフェン、ナ アロキセン、フェノフロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、及びそ の他の化合物類を包含するが、これらに限定はされない。本発明の組合せと方法 に有用なその他の抗炎症剤は、天然給源に由来するリボコルチン１、又は絹替え 手法（合雫国特許出ａ第６９０．＋４６号、１！　７１２．３７６号、’！？ｆ １５．８７７号、及び第７７２．８９２号；ウォールナー・ヒーら、［１９８６ 年］　Ｎａｔｕｒｅ　３２０巻？？−８１頁）によってつくられるリボコルチン 及びリボコルチン様ポリベフチト頚、及びウロモジュリン（マクモア・エイ・ヴ イー及びジェイ・エム・テラカー［１９Ｆ１５年］　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９＠ 　４７９−４８１頁）、又はシクロスポリンとその誘導捧類を包含する０本発明 に８ｔ−ＩてＰｌ！用でき罵ステロイド抗炎症剤は、ヒトロコーチソンを包含す るが、これに限定はされない、、＋１！当な抗炎症剤は、ロイコトリエン又はプ ロスタグランジン合成の抑制剤を包含する。

（１１□２−−−−−−イー４−し叉−タ−／−とζ−帆−命準−亙−ｒ　Ｐ　 Ｆ　４の抗膿瘍活性 二の実験で４群のハッカネスミを使用した。２群のハツカネスミに、除放性イン ドメタシンベレット（５０μｇ）を、左わき復の皮嗜下に外科的に移植し・た、 他の２群はイントメタンンｑ！装置を受けなかった。４群全部のハツカネズミの 右わき請に、呼ＮＩを皮下移植した。

図１０に示すように、Ｐ　Ｆ　４へのインドメタシン添加はＰＦ４の抗腫瘍活性 を妨げなかった。ｌｌＩ瘍を緩衝液のみ又はインドツタシンのｈで処置したＩ！ ！６日以後、移植さ＃ｌた＃４４は！、連に成長１−た、　７４明的に、ＰＦ４ 叉はＰＦ４とイシドシタシンの組合せによって処置されたとき、ＩＩ瘍＋、１全 くでないにしても、はとんど成長しなかった。

これらの結果から、ＰＦ４は抗炎症剤インドメタシンと組合せた時でも、その抗 呻瘍活性を保持し・ていることが明らかである。

４１貫１３　ＰＦ４ζ板子症剤の投−５本発明の鞘合せ及び方法は、ある場合に は、ＰＦ４のｈ′、こ基つく慣用の処置方法で許容される量より高い投与量で、 ＰＦ４叉は関連化合物類の投与を可能としている。

従って、本発明の組合せ及び方法はＰＦ４のみの高投与量での９５置の炎症効果 を有利に減少又は排除する。このため、抗炎症剤と組合せたＰ　Ｆ　、１の使用 は、慣用的に許容される低投与量のＰＦ４のみに基づく療法で必要とされる処置 間開を縮小させろことができる。

本発明の絽合せ及び方法は、ヒトを含めた任意の哺乳類をｖ！！ｕするのに有用 である。本発明に従って、本発明の緒合せによる製薬上有効な量の２活性成分、 すなわちＰＦ４と抗炎症剤によって、脈Ｗ杉成叉は内皮細胞増殖の抑制に十分な 時間にわたり、哺乳類を処置する。

本発明に従って、拳学的有ｎ拳の抗炎症剤とＰＦ４（又はＰＦ４関連化合物類） は逐次的に、又は同時的に芒者に投与ざｊししＰＦ、ｌの最も有効な投与方式と 適量範囲は、処置しようとする＠気のタイプ、その病気の程壇と経過、以前の冶 帰法、壺者の健康状態、及びＰＦ４への応答と９３賞をするＰ；師の判断によっ て変わる。ＰＦ４は一連のｑ！！貫の璽同間での一時点て台者に投与できる。

好まし・くは、抗炎症剤とＰＦ４は逐次的に患者に投与され、抗炎症剤はＰＦ１ ％Ｎの前、後、又は前と後の両方で投与されろう逐次的投与はＰＦ・ｌ処置の少 なくとも同し・日（２４時間以内）に抗炎症剤を処置すること、またＰＦ−１を 投与しない日々に抗考げ剤の継続処置を伴う。

抗炎症剤の慣用的な投４方式と欅４’！！Ｉ＠範囲を使用できる（製ルマン・エ イ・ンーら（編）［治療の薬理学的基＠　（ＴｈｅＰｈａｒ＊ａｃｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」６’Ｊ７−７１３頁、 １４８２頁、＋４８９−９１頁［１９ＲＯ年ｊ　：医師卓上参考書（Ｐｈｙｓｉ ｃｉａｎｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　Ｈ１Ｂ６年版）拳例えばイント メダンンは約２５−５０　＋１ｇのｙ＋！置で１日３回経０投与できる。それよ り高い投与量も使用できる。その代わりに、７スビリン（約１５０（＋−２００ ０１１１Ｒ／日）、イアブロフＩン（約１２００−３２００　ｍｙ、１日）、又 は慣用的治装置のその他の抗炎症剤を使用できる。抗炎症剤の適量は、個々の患 者に対して滴定できる。

本発明の一つのｊｉ　ＰＪにｊ、Ｙっτ、τ者は抗炎症剤とＰＦ４との同時処置 を受けろことができる。ＰＦ４の局所的、病変内、父は静脈内注射が好まし・い （キルマンら、前掲、１２９０−９１頁を参詔）。抗炎症剤は、皮下注射、皮下 の除放性インフラントによって、又は経口的に投与されるのが好ましい。

その代わりに患者は、抗がん、抗腫瘍、又は抗炎症活性を示す薬剤の慣用の投与 方式に従って、ＰＦ４　（又はＰ　Ｆ　７１関連化合物類）と抗炎σ剤との絹合 せを含めてなる組成物を受けることができろ。これらは、例えば非経口、皮下、 静脈内、又は病変内投与経路を包含する。

これらの治療法に使用される４＃！成物は、種々の形式でありうる。これらは例 えは、錠剤、丸薬、散剤、液体溶液又は墾濁液、座薬、注ＩＮ及び注入液のよう な固体、半固体、及び液体適量形式を包含する。好ましい形式は、言回された投 与方式と治療用途によって変わる。組成物は、好ましくは当業者に知られた慣用 の製薬玉受は入れられる担体及び助剤をも包含する。好ましくは、本発明の組成 物は単ＩＪ適量形式にあり、通常は患者に１日１回以上投与されろ。

本発明化合物轄はりｔ・ノーム技術、除放性カプセル、移植可能なポンフ、及び 生物分解性容器を利用しでも投与できろ。これらの送り出し・方法は、長門用に わたって均一の適量を提供できるのが有利である。

ＰＦ４叉は関連化合物類は、静脈内、筋肉内、病変内、又は皮下注射を含めた製 薬上受は入れられる任意の適量形式で、患者に投与できる。有効投与量は体重ｋ ｇ当たり約０．０１ないし約１．０　ｍｇの範囲にあるが、それより低い、又は 高い投与量も使用できることは認められる。更に本発明方法及び組成物において は、ＰＦ４のみで処置された壺者に典ヤ的に許容さｔＩろものより高いＰＦ４の 投与量が有利に使用できる。当炊ながら、本発明組成物と方法が他の治療法と絹 合せτ使用てきろことは理解されよ患者の症状改善が起きたら、必要に応して維 持投与量が投与される。その後、症状の間数として、改善された状すが維持され る水準まで投与＠又は回数又は両方とも少なくすることができろ。症状が所望の 水準まで軽減されたとき、処置を停止すべきである。し・かじ、患者は病状のと の上うな再発に降し、でも長間的ζこは間欠的な処置を・ｇ・要とするかも１口 れない。

実施例１４ Ｆ記のよつに、ＰＦ４及び関連化合物類は抗炎症剤と連係して投与できる。また 上で明らかにされたように、ＰＦｌ及び関連（ヒ合ｖＱ類は、他の治ゆ法と絹合 せて使用できる。例えは、ＰＦ４及び関連化合物類は、脈管形成抑制剤、抗呻瘍 剤、免疫調整剤、炎症媒介物質、及び造血因子と共に使用できる。

Ｐ　Ｆ　４と絹合せて使用できる脈管形成抑制剤にはステロイド類、硫酸化量ｍ 　類／ンクロテキストリン、レチノイド類、眞閘頌抽出物に由来する７クロスボ リン類及びその池の脈管形成抑制剤、トロンホスボンジン（又はその断片）、ｒ ｒ、　β又はｒ−インターフェロン、Ｉｌｌｌｌ化因子−〇、繊碓芽祷胞成長因 子拮抗剤、アンキオケニン拮抗剤、にび脈管本代抑制性状を屯・つなある種の抗 生物質がある。本発明ＣＩ：従って使用できる脈管形成抑制性をもった抗生物ド には、ツマキリンとその類似体類、及びハーヒマインンがある。

本発明のＰＦ４化合物類は、生物療法、化学療法、及び枚剖＆！蹄擾療法と絹合 ぜて使用できる。生物剤は腫瘍壊死因子、インター７エ自ン！自、及び腫瘍選択 的抗体又は免疫毒素のような化合物類を含む、ＰＦ４と朝会せて使用できる化学 療法剤は、トキリルヒンン、Ｉソトレキセート、シス７ラチン、ウインフラステ ン、ヴイングリスチン、及Ｕ７レオマインンを含む。

ＰＦ４叉は関連化合物類自か免疫調整剤、炎症媒介ｍ＊、又は造血因子と共に使 用される糾合＋’ｔＪＶＩ法も、本発明に従って実施できる。これらの組成物は 、例えはインターフェロン類、インダーロイキンｔＪ　（＋−８）　、腫瘍壊死 因子α又はβ、形質転換成長因子β、エリスロボイエチン、集落刺激因子（帆球 、顆綺球、及び顆粒球−単球）、及び巨核球刺激因子でありうる。

これらの絹合せ＃法のＩ＃ｉ！稈でのＰＦ４又は関連化合物類の投与は、上に実 施例１３て述べたとおりに達成できる。組合＋ｔ＃法の投与に対し・で、ＰＦ４ 又は関連化合物類の投与のタイミングは、絹合せ療法の性質と処置の目標によっ て吏わる。ある形の％賞が第二の形の処置を容易にずろのに役立つ場合、容易に する処置は第二の処置の前又は同時に起こ１１　’ｌる。両者のｑ！Ｓ貞か相乗 効果をもたらす場合は、処置の同時適用を行ない得る。

關合せ療法の使用は、個々の治帰剤のより低い用量の投与を容易にし、そｈ　Ｉ こよって毒性又はその他の副作用の可能性を低下させる。また、適当な絹合せの 使用によって、医師は複数の病状及び／又は原因を処置することができ、それに よって治療法全体の価値が高まる。

本明細書に記載された実施例及び具体例は、説明のみを目的とするものであり、 実Ｉｉｖ例や具体例から当業者は種々の変更及び幡正の示唆を得ることができる こと、そしてそれらの変更や脩ＩＥは本出軸の精神と範囲、及び添付の特許請求 の範囲に含まれるべきであることが理解されるべきである。

図１ 配列一覧表 （１）　一般情報 （１）　出願人：　セオドア・メイアン、Ｐｈ、Ｄ。

（ＩＩ）　発明の名称：　脈管形成病の処置用の新規な方法及び組成物 （Ｉｌｌ）　配列の数二　一つ （ＩＶ）　連絡先 （Ａ）　宛先：　サリヮンチク＆サリヮンチク（Ｂ　）　ｍＲ：　２４２１　Ｎ ｖ４１１街／Ａ　Ｉ　’＋（Ｃ）　市：　ゲインスピル （Ｄ）　州：　フロリダ （Ｅ）　国：　合東国 （Ｆ　）　ＺＩＰ　：　３２６０６ （Ｖ）　コンピューター読取り形式 （Ａ）　媒体のタイプ：３．５インチ・ディスケット、ｌ。

４４　Ｍｂ記記憶電 電Ｂ）　コンビ】−ター：マツキントラシュ５Ｅ（Ｃ）Ｏ５：　マツキントラシ ュ （Ｄ）　ソフトウェア：マイクロソフト・ワード（バージョン４．０） （νｌ）　現行出願データ （Ａ）　出願番号：　Ｐ（Ｔ−Ｌ’５９１１０５２４６（Ｂ）　出順日：　ＨＩ ９１年７月２４日（Ｃ１分類： （〜１１）　先行出願データ 下記の出＠を含めた先行出願の全部 （Ａ）　出願番号：　０７　／　５５８　、９９９（Ｂ）　出頓日　：　１９９ ０年７月２７日（〜１１１）弁理士／代理人情報 （へ）名前：　サリワン千り、デビ・ソト・Ｒ（Ｂ）９録番号：　３１．７９４ （Ｃ）　参　明　／　ト　ケ　’　ｔ・　＃　：　ＲＩＩＥ９．１−２（ＩＸ） 　通信情報 （Ａ）　電話：　９０４−：（７Ｆｌ−Ｒ１００（Ｂ）　フックス：　９０４− ３７２−５８００（Ｃ）　テレ・ソクス： （２）配列確認番号の情報 （１）　配列特性 （Ａ）　長さ：　２４　ｔ： （Ｂ）　タイプ：　咳酸 （Ｃ）　績：　１本鎖 （Ｄ）　トホロシー：　線状 ネ（＼Ｉ）　配タリ記述：　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　Ｎ＋’、Ｍ　Ｉ図　２ 巳　３ ｒＰＦ−４（μＭ） 口　５ 口　６ 徴ｚ７　（μＭ） ｆＪ７ 日ζｉ 口　８ シー占（；二５ヴ斗Ｒシ）　（コ季ｌり口　９ 辻８咋兄゛蒙 口　１０ ＃Ｚ４ｚチぞｐｊ　Ｌｆ４ｐｔｚＨｉ５．、化ｎ　（ａＣｉ）国際調査報告 ７ヨ ＦｅｍＰＣＴハＳ＾り１０１１ｕ店舅かヤｅ嘴１噛１１１ｅｍｆｆｌｌ−１’１ ４１２８ｏｉ１１国際調査報告 ＵＳ　９１０５２４６ Ｓ＾　５０８４１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合物 と、脈管形成抑制剤である一以上の追加化合物類とそ含めてなる、脈管形成病の 処置用の薬剤組成物。
2. ２．上記の追加的な脈管形成抑制化合物が、スデロイト頬、硫酸化多糖類、シク ロテキストリン、レチノイド類、シクロスポリン類、トロンボスボンシン、ラミ ニン、インダーフェロン類、腫瘍壊死因子−α、繊維芽細胞成長因子拮抗剤、ア ンキオゲニン拮抗剤、フマギリン、ハーヒマイシン、及び上に名前をあげた化合 物類の類似体類又は断片からなる群から選はれる、請求項１に記載の薬剤組成物 。
3. ３．上記の第一の化合物がｒＰＦ４−２４１又はその脈管形成抑制性の断片であ る、請求項１に記載の組成物。
4. ４．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合物 と、抗腫瘍活性をもった一つ以しの追加の化合物とを含めてなろ、脈管形成病の 処置用の薬剤組成物。
5. ５．抗腫瘍活性をもった上記の化合物が、腫瘍壊死因子、インターフェロン類、 腫瘍選択的抗体又は免疫毒素、トキソルヒシン、メソトレキセート、シスプラチ ン、ヴィンフラスチン、ヴィンケリスチン、プレオマイシン、及び注射可能な放 射性同位元素からなる群から選はれる、請求項４に記載の薬剤組成物。
6. ６．上記の第一化合物がｒＰＦ−１．２４１又はその脈管形成抑制性の断片であ る、請求項４に記載の組成物。
7. ７．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合物 と、免疫調整剤、炎症媒介物質、及び造血因子からなる群から選はれる一つ以上 の追加化合物とを含めてなる、脈管形成病の処置用の薬剤組成物。
8. ８．ヒ記の追加化合物が、インダーフェロン類、インターロイキン類、腫瘍壊死 因子β、形質転換成長因子β、エリスロボイエチン、集落刺激因子、巨核球刺激 因子、及び上に名前をあげた化合物の類似体又は断片からなる群から選はれる、 請求項７に記載の薬剤組成物。
9. ９．上記の第一化合物がｒＰＦ４−２４１又はその脈管形成抑制性の断片である 、請求項７に記載の組成物。
10. １０．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合 物と、脈管形成抑制剤である一つ以上の追加化合物類との脈管形成病の処置に有 効な量を、その処置を必要とずるヒト又は動物に投与することからなる脈管形成 病の処置法。
11. １１．上記の追加の脈管形成抑制化合物が、ステロイド類、硫酸化多糖類、シク ロデキストリン、レチノイド類、シクロスポリン類、トロンボスボンジン、ラミ ニン、インターフェロン類、腫瘍壊死因子−α、繊維芽細胞成長因子拮抗剤、ア ンギオグニン拮抗剤、フマギリン、ハーヒマイシン、及び上に名前をあげた化合 物類の類似体類又は断片からなる群から選はれる、請求項１０に記載の方法。
12. １２．上記の第一の化合物がｒＰＦ４−２４１又はその脈管形成抑制性の断片で ある、請求項１０に記載の方法。
13. １３．上記の化合物類が単一の薬剤組成物中で受人れられる薬剤担体と組み合わ される、請求項１０に記載の方法。
14. １４．錠剤、丸薬、散剤、液体溶液又は懸濁液、座薬、注時及び注入液、リボソ ーム類．除放性カプセル、移植可能なボンフ．及ひ生物分解性容器かいなる群か ら選ばれる手段によって、上記のヒト又は動物に投与される、請求項１３に記載 の方法。
15. １５．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合 物と、抗腫瘍活性をもった一以上の追加化合物との有効量を、脈管形成病の処置 の必要なヒト又は動物へ投与することを含めてなる、脈管形成病を処置する方法 。
16. １６．抗腫瘍活性をもった上記の化合物が、腫瘍壊死因子、インターフェロン類 、腫瘍選択的抗体又は免疫毒素、トキソルビシン、メソトレキセート、シスプラ チン、ウィンアラスチン、ウィンクリスチン、プレオマイシン、及び注射可能な 放射性同位元素からなる群から選はれる、請求項１５に記載の方法。
17. １７．上記の第一の化合物がｒＰＦ４−２４１又はその脈管形成抑制性の断片で ある、請求項１５に記載の方法。
18. １８．上記の化合物類が、単一の薬剤組成物中で、受人れられる薬剤担体と組み 合わされる、請求項１５に記載の方法。
19. １９．上記の化合物類が、錠剤、丸薬、散剤、液体溶液又は懸濁液、座薬、注射 及び注入溶液、リボソーム類、除放性カフセル、移植可能なボンフ、及び生物分 解性容器からなろ群から選はれる手段によって、上記のヒト又は動物に投与され ろ、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．ｒＰＦ４又はその脈管形成抑制性の突然変異体又は断片である第一の化合 物と、免疫調整剤、炎症媒介物質、及び造血因子か、らなる群から選はれる一以 上の追加化合物の有効量を、脈管形成病の処置の必要なヒト又は動物に投与する ことを含めてなる脈管形成病を処置する方法。
21. ２１．上記の追加化合物が、インダーフェロン類、インダーロイキン類、腫瘍壊 死因子β、形質転換成長因子β、エリスロボイエチン、集落刺激因子、巨核球刺 激因子、及ひ上に名前をあけた化合物の類似体又は断片からなろ群かい選はれろ 、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．上記の第一の化合物がｒＰＦ１４−２４１又はその脈管形成抑制件の断片 である、請求項２０に記載の方法。
23. ２３．上記の化合物類が、単一の薬剤組成物中で、受人れられる薬剤担体と組み 合わされる、請求項２０に記載の方法。
24. ２４．上記の化合物類が、錠剤、丸薬、散剤、液体溶液又は懸濁液、座薬、注射 及ひ注入溶液、リボソーム類、除放性カフセル、移植可能なボンフ、及ひ生物分 解性容器からなる群から選はれる手段によって、上記のヒト又は動物に投与され る、請求項２３に記載の方法。