JPH06506702A - 脈管形成性の病気の処置用の新規な方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　脈管形成性の＠気の処置用の新規な方法と組成物 発明の背景 本発明の分野は脈管形成（血管形成）である。

新し・い毛細血管の発達である脈管形成（アンギオゲネシスａｎｇｉｏｇｅｎｅ ｓｉｓ）は発育中の胎児及び成長する人の重要な過程である。しかし、健康な成 人に於いては、脈管形成は傷の治癒及び月経サイクルにおいてのみ有意義に生し ・る。

現在では、成人に起っている脈管形成作用の多くは性質上病的なものであること が広く認識されている。例えば、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の形成 は、容量が数立方ミリメーターを越えるような充実性腫瘍の成長に必須のもので ある（フォークマン等、［１９８３］Ｃ１ｂａＦｏｕｎｄ、　Ｓｙ＋＊ｐ、　１ ００：　１３２〜１４９）　、本発明者等は、発達しつつある！！瘍は成長因子 を分圧・し、これが周りの内皮細胞を刺激して腫瘍へと分裂、移行させることと 理解している。

充実性腫瘍の成長の他に、脈管形成による機能不全を伴う他の症状は、糖尿病性 網膜症、水晶体後の線維増殖、血管新生性緑内障、乾面、線維性血管腫、免疫性 及び非免疫性炎症（リウマチ様関節炎を含む）、アテローム性動脈硬化症プラー ク内での毛細血管の増殖、血管腫、カボジ肉腫を含んでおり、これらは最近、制 御が損われた内皮細胞分裂及び毛管成長を特徴とする病気としで認められている 。これらの症状並びに充実性腫瘍の成長は、脈管形成病（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ 　ｄｉｓｅａｓｅｓ）として総称されている（フォークマン　Ｊ　、　（Ｆｏｌ ｋ＋ｗａｎ　Ｊ、）及びＭ、クラグスブルン（Ｍ、　ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）［１ ９８７］　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２〜４４７）。

脈管形成病に加えて、内皮細胞の増殖が病原となっているか、少なくとも望まれ ないものとなっている他の症状がある。例えば子宮内膜症は通常は子宮の内壁を なしているある種の内皮細胞の異常な増殖及び配置に特徴づけられる。脈管形成 過程の抑制は、子宮内膜症を防止又は軽減するのに役立ち得る。また子宮の内皮 細胞成長の防止は、避妊の手段となり得る。

内皮細胞の成長は傷の治癒と間違している。この成長は広範囲な外材手術の進行 中には、また過剰な癒痕形成が起きろる場合には望ましくない。従って内皮細胞 の増殖を抑制する手段は、望まれない癒痕形成を防止又は少なくする助けになる 。

脈管形成及び内皮細胞の増殖の機構は完全には特徴が明らかにされていない。腫 瘍の位置に於て新たな毛細血管の成長が生しる前に、マスト細胞が蓄積するとい うことが確認されている。しかし、マスト細胞単独では脈管形成を開始出来ない 。マスト細胞の生成物であるヘパリンは、脈管形成に必要な毛細血管の内皮細胞 の移動な著しく刺激することが示されている（フォークマン　ジェ−、［１９８ ４］　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：開始と調節、癌の侵入と転移：生物的及び治 療的な面、ジー、エル、ニコルソン（Ｇ、　Ｌ。

Ｎ１ｃｏｌｓｏｎ）及びエル、ミラス（１，？１ｉｌａｓ）編、ニューヨークの ラヘンブレス　２０１〜２０８頁）。

幾つかの物質が試験管内（インビトロ）て内皮細胞の成長を抑制する能力がある ことが知られている。内皮細胞成長の最もよく研究された抑制剤の一つは、プロ タミンであり、これは精子のみに見出される蛋白質である。

プロタミンはｍ瘍の脈管形成を抑制し、その後の腫瘍の成長を抑制することが示 されている（ティラー　ニス、（Ｔａｙｌｏｒ　Ｓ、）及びジエー、フォークマ ン（Ｊ、　Ｆｏｌｋｍａｎ）［１９８２］Ｎａｔｕｒｅ　２９７：　３０７〜３ １２）　、プロタミンの抗脈管形成活性はその良く知られたヘパリン結合能力に よるものであった（ティラー及びフォークマン［１９８２］上記参照）、プロタ ミンでの臨床試験は、プロタミン注射に関連する毒性の為に行なわれていない、 鮭の精子から通常単離されるプロタミンは、人に於て抗原性であることが知られ ており、そして二次暴露の時にこの蛋白質に対するアナフラキシー反りが観測さ れている。

少なくとも二つの他の化合物がそれらのヘパリン結合活性に間し・で研究されて いる。即ち、血小板第４因子（ＰＦ４）及びメジャーヘーシソクプロテイン（爾 ａｊｏｒｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である。メジャーヘーシツクブロテイン はヘパリン結合活性を示すが、非常に毒性であるために実用的な有用性は殆どな い。

血小板第４因子は完全に配列決定された良く知られた蛋白質である（トイエル、 ティー、エフ０、アール、エム。

セニオル、ディー、チャン、ジー、エル、グリフイン、アール、エル、ヘインリ クソン及びイー、ティー、カイザー［１９８１１Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：４５８５−４５８７）　、これは血小板凝集中 に放出される、７０個の残基の、分泌可能な血小板蛋白質であり、分子量が約７ ．８Ｋｄである。ヘパリン結合活性の証拠が存在し、幾らかの抗脈管形成活性の 徴候があるが（フォークマン［＋９８４］上記参照）、ＰＦ４は決して臨床的に 有用性を有することが示されていない。

ｒオンコスタチンＡ」と記載され、天然のＰＦ４と同しか又は類似しているよう にみえる化合物が、［１！１の成長に影響することが示されている（米国特許第 ４６４５８２８及び４７３７５８０号、両者ともトワードジック（Ｔｗａｒｄｚ ｉｋ）等に対し発行されている）、シかし、これらの特許に報告された効果は、 免疫不全マウスに於いて緩慢増殖しているヒト癌ｌｓ＠に関するものである。こ れらの実験の結果は、宿主動物元来のものである急速成長しているｌ’ｉ［への 効果を予測する為には、容易に外挿する（あてはめる）ことが出来ない。更に、 これらの特許に報告されている実験は、全くとんなアンギオスタチツクな（脈管 形成を抑制する）性質をも予ｉｌｌ又は開示していない。

ＰＦ＝↓からの種々のペプチドがＳＯＵされ、それらの性質が試験されている。

いずれも脈管形成の抑制に於けるどんな役割も示していない。ＰＦ４のＣ−１３ ペプチドは好中球及び単球に対し、化学走性（ケモタクチック）であることが知 られている（オスターマン　ディー、ジー９、ジー、エル、グリフイン、アール 、エム、シニア、イー、ティー、カイザー及びティー、エイチ、トイエル［＋９ ８２］　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｇ＋、１０ ７　（ｌｃＩ３０−１３５）　＊　単球の浸潤が、脈管形成因子の分泌による局 部的な内皮細胞の増殖及び移行を刺激するものと予測されることに注目するのが 重要である。従ってＰＦ４のペプチドは脈管形成を抑制しないで刺激することが 予測される。

脈管形成の抑制性状のほか、ＰＦ４は好炎症性蛋白質のインターロイキン−８及 びβ−トロンボグロブリンの特徴的な構造上の特質を有しており、生体内で好中 球と単球に対して化学走性（ｃｈｅｗ、ｏｔａｃｔｉｃ）であることが示された （つすルベ及びセラミ［１９８９年コＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３巻２５６ ５−２５７３頁）、よく特性が明らかにされた好炎症性蛋白質とのＰＦ４の構造 及び活性の類似性は、炎症部位における血小板の遍在的な凝固とともに、ＰＦ４ が炎症の内因的な媒介物であることを示唆している。このため、生体内ではＰＦ ４投与に伴って膨張があると予期される。

脈管形成及び内皮細胞増殖の有効かつ無毒な抑制物を見つけ出すことが有意義な こととして、しかも非常に長い閏求められてきた。脈管形成は癌を含めた広範囲 の破滅的な病気の開始及び進行に主要な役割を果す、これらの病気を処置する為 に、局所的及び／又は全身的に投与てきる有効て無毒性の薬剤は非常に有益であ り得るが、長い間見つけ出すことができなかった。

本発明のアミノ酸を判別するのに、以下の表が役立つ。

アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ａｓｎ及び／又はＡ　ｓｐ　Ａ　ｓｘ　Ｂシスティン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ Ｇｌｎ及び／又はＧ　ｌｕ　Ｇ　ＩＸ　Ｚグリシン　ｃｒｙ　ｃ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ イソロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ 本明細書で使用するコンザーバテイブなアミノ酸置換という用語は、アミノ酸を 第一のアミノ酸と生物学的に適合性である別のアミノ酸で置換することを意味す る。

発明のまとめ 本発明は脈管形成と内皮細胞の増殖を伴う病気の治療における臨床的な有用性な ＰＦ４が有しているという発見に関するものである。ざらにＰＦ４の断片は脈管 形成の抑制剤であることが実証される。脈管形成を抑制する能力が、ＰＦ４中の 配列に対応する合成ペプチド中のカルボキシ末端のわずか１３個のアミノ酸で発 見された。

本発明はＰＦ４と抗炎症剤の組合せて脈管形成病を処置することを特徴とする。

抗炎症剤はプロ炎症化合物の投与に伴い得る望まれない＃潤、痛み、又は組織破 壊を軽減する助けをする。

本発明はまた、単独又は抗炎症剤との組合せの０ずれかてＰＦ４て悪性の内皮細 胞を含有している腫瘍を治療する方法を特徴としている。特に本発明はＰＦ４で 脳の腫瘍を処置する方法によって特徴づけられる。

詳細な記載 図面について先ず記載する。

図面 図１はネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）なｒＰ　Ｆ　４のＤＮＡ配列とアミノ酸配列 を示す。

図２は、ｒＰ　Ｆ　４と種々の間違ペプチド類での処置から生ずる脈管形成の抑 制を示す。

図３は、ｒＰ　Ｆ　４による内皮細胞増殖の抑制を示す。

図４は、ｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　４−２４１のアルファらせん構造を示す。

図５は、ｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　４７２４１での処置から生ずる脈管形成の抑 制を比較したものである。

図６は、ｒＰ　Ｆ　４又はｒＰ　Ｆ　４−２４１での処置から生ずるヒトの誼静 脈内皮細胞の増殖抑制の比較である。

図７は、ｒＰ　Ｆ　４又はｒＰ　Ｆ　４−２４１の腫瘍成長抑制能力を示す。

Ｖ８は、ｒＰ　Ｆ　４、ｒＰ　Ｆ　４とインドメタシン、又は緩衝液の注射後の 時間の間数としての、マウスの足Ｉｆ（肉ｉｔ　ｆｏｏｔｐａｄ）の膨張を示す 。

図９は、ｒＰ　Ｆ　４又はインドメタシンを加えたｒＰ　Ｆ　４での処置後の、 炎症性細胞浸潤の定量を示す。

図１Ｏは、ｒＰＦ４のみ、インドメタシンのみ、緩衝液のみ、又はｒＰ　Ｆ　４ とインドメタシンの投与後の腫瘍成長を示す。

本発明は、ｒＰ　Ｆ　４、及びｒＰ　Ｆ　４のある類似体類やペプチド断片によ る脈管形成の生体内抑制に間する。ＰＦ４のこれらの類似体類とペプチド断片は 、脈管形成病の処置に使用できる。本出願で使用される用語の「脈管形成病」は 、充実性腫瘍の成長と、舟状の変性（ｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ）を含めた脈管形成による機能不全を伴うその他の症状とをさす。本発明はまた 、調節不良の内皮１ａｌｌ！！増殖病の処置へのｒＰ　Ｆ　４及υＰＦ４断片の 使用に間する。

ｒＰＦ４、ＰＦ４又はこれらの類似体及び断片によって処置できる充実性腫瘍の 種類には、小細胞肺癌を含むあらゆるｆｌ類の肺の！ＩＩＩ、乳の＋ｉ瘍、結％ Ｉ／直腸、前立腺、頭頚部、胃、膀胱、腎臓、すい臓、肝臓、卵巣及び子宮：肉 腫；黒色腫及び他の転移性の皮膚癌；非転移性の皮膚癌（例えばカボシ肉腫、基 底細胞癌）；及び最も好ましくは脳の腫瘍が含まれる。

本発明の組成物及び方法を使用して処置できる腫瘍の種類には外科手術的に接近 できない腫瘍及び／又は化学療法及び放射線療法に抵抗性のＩ［ｉ［が含まれる ０手術後又は未手術の進行した侵入性の悪性腫瘍は、本発明の組成物及び方法を 使用して処置できる。本発明は外科的な切除に続く補助療法として使用でき、そ して既知の転移性の＠ス及び非転移性の癌を処置するのに使用できる。

上記の腫瘍及び病気の治療は、病気の種類とひどさ並びに病気の場所の接近可能 性に依存して全身的、部分的（ｒｅｇ＊ｏｎａｌ）又は局所的（病栗内）であり 得る。全身的治療には静脈内ポーラス（ｂｏｌｕｓ）注射（ワンショットの注射 ）及び注入、皮下注射、移植錠、再充填可能なレザボア及び持効性のデボ製剤、 及び筋肉内注射が含まれる。以下により詳細に説明されるように、本発明者は全 身的投与において有用な有効抗ｉｔｓ投与量が非常に高くなければならないこと を発見した。このような異常に高い適量が最大の効果を得るためには必要である が、受は入れられる程度の低い毒性した伴わずに投与できる。部分的な処置（ｒ ＋４ｉｏｎａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）には原発性の肝臓腫瘍及び肝臓の転移の 治療のための、そして腎［脳及びすい臓ｍｉのための動脈内投与が含まれる。部 分的な腹腔内治療は卵巣の＋ｉ＊の治療に使用できる６局所的な治療は脳、子宮 、膀胱、頭頚部の腫瘍、カボジ肉腫及びその他の非転移性の皮膚癌、さらに外科 的に切除することを伝染性が除外してしまった転移性の皮膚癌、及び語間と直！ ＩＩｔＩＡに使用できる。

脳ｍ瘍は一般に可能ならば初期の外科的な切除で治療され、続いて強力な化学療 法及び放射線療法が行なわれる。攻撃性の脳腫瘍（高いグレードの星細胞腫、多 形性膠芽腫）は、転移による伝染よりも、不完全な外科的な除去のためにそれら のもとの場所近くで再発することによって死を究極的に生しる。最初の病巣の場 所における手術後の処置を重点的に行う方法は、従って効果的な治療を行ない健 康な組織に対する損傷を減少させるために望ましい。

本発明は、生体内で毛管形成を抑制し並びに胎児の血管新生を抑制するｒＰＦ４ の能力を一部利用するものである。

全長の組替えＰＦ４も成長因子依存性の人の内皮細胞増殖を試験官内で抑制する 。

脈管形成を抑制するＰＦ４の活性は、長さ１３個しかないアミノ酸のＰＦ４配列 に対応する合成ペプチドによって保持されていることが確定されたのも重要であ る。特に、ＰＦ４のカルボキシル末端部分（Ｃ−１３）に対応する１３個のアミ ノ散の合成ペプチドが、強い脈管形成の抑制活性をもつことがわかった。

ＰＦ４が内皮細胞の純粋培養基の生育を直接に抑制するという発見は、有利なこ とに、その効果がなんらかの池の細胞型によって媒介されるのでないことを意味 している。

Ｃ−１３ペプチドの活性は、それがヘパリンの抗凝固活性に影響しえないことか らみて、特に驚異的である。　Ｃ−１３ペプチドの使用は、適量の減少（重量基 盤）、抗原性となる可能性が減少すること、及び新規な適量形式で有効となる見 込が増すことなと、ｒＰ　Ｆ　４全体よりも優れた幾つかの利点を提供している 。

ＰＦ４のＣ−１３ペプチドはまた、ハツカネズミでＣｏｎ−Ａ誘発性の免疫抑制 を予防する能力を保持している。この能力は、ヘパリンに影響されず、恐らく脈 管形成を抑制するペプチドの能力とは独立している。

充実性腫瘍が数立方ミリメートルを越えて成長するには、脈管形成が必要となる ことはよく理解されている。

このため、充実性腫瘍の処置には、ｒＰ　Ｆ　４又はその断片を使用して、脈管 形成を抑制することにより腫瘍成長を阻止することが、新規かつ非常に有利な治 療手段を提示している。但し、本明纏書に記載した治療法の幾つかに於けるＰＦ ４の効果は脈管形成の抑制で全て説明がつくものではない。例えば、我々はカボ ジ肉腫なとの悪性の内皮細胞を含有する特定の種類の癌では、ＰＦ４が抑制的で あることを発見した。

Ｃ−１３ペプチドがヘパリンの抗凝固活性に影響せずに脈管形成を抑制する事実 は、この小さなペプチドが同時的な抗凝固療法に干渉しない利点をももつであろ うことを立証している。更に、小ペプチド類は一般に大きな蛋白質より抗原性が 低く、このため、ＰＦ４断片は経口及び経皮投与に有利に使用できる。これらの 薬を体に行きわたらせるやり方は、それぞれ胃腸管の毛管増殖（例えばカボジ肉 腫）と皮膚病変部の処置に特に有用である。ＰＦ４断片の病巣内及び全身投与は 、これらの症状の処置にも適している。

ヘパリン結合活性を欠くが、脈管形成を抑制する能力を保持しているようなＰＦ ４類似体類がつくられた。「Ｐ　Ｆ　４−２４１として知られる一つのこのよう な類似体は、合成ＰＦ４遺伝子のカセット突然変異誘発によってつくられ、その 場合にＰＦ４のカルボキシ末端近くの４個のリジン残基なコートしたＤＮＡ配列 は、２個のＧｌｒ＋−ＧＩＵカッブレットをコートした配列に変換された。ｒＰ 　Ｆ　４−２４１が病巣内に投与される場合、適量が病巣当たり約１μｇ〜約４ 　ｒｓｇの間にあるように適用される。全身投与には、ｒＰ　Ｆ　４−２４１の 適量は、体重ｋｇ当たり０．５　＋＋＋ｇ　〜約１００　Ｂの間にある。天然配 列のｒＰ　Ｆ　４並びにペプチド断片の投与には、同様なまたそれより高い適量 を使用できる。

例えば、ｒＰ　Ｆ　４とその断片の適量は、ｒＰ　Ｆ　４−２４１の適量の２倍 以上でありうる。

上記のように、ＰＦ４は試験管内て好中球と単球に対して化学走性であることが 示され、これが炎症応答を媒介しうろことを示唆している。これらの観察が生体 内の関連性をもつかどうかを見るために、ハツカネズミで急性及び慢性皮膚炎症 を誘発するＰＦ４の能力について試験した。朝替え型ヒトＰＦ４（ｒＰＦ４）を ネズミの皮膚に注射すると、２時間以内に急性炎症が誘発され、約１２−１８時 閉じピークに達し、約３６時間に解消した。当量のチトクロームＣ５緩ｆｆ１ｉ （Ｗのみ、又はアミノ末端ＰＦ４ペプチドの注射は有意の炎症応答を誘発できな かったが、カルボキシ末端ＰＦ４ペプチドは好炎症性であった。ｒＰＦ４及び４ １アミノＩ！１ｌｉｃＯＯＨ末端ペプチドの両方で誘発される炎症性浸潤は、好 中球とそれより少ない量の単核細胞からなっていた。炎症応答を引出すには比較 的高濃度のｒＰ　Ｆ　４が必要であるが、これらの濃度は血小板凝集中に、又は ｒＰ　Ｆ　４又は関連化合物類の投与部位で、局所的に得られる。

有利な点として、ｒＰ　Ｆ　４の好炎症効果が、脈管形成の抑制活性を低下させ ずに抗炎症剤の全身投与によって著しく抑制されることがわかった。

受精卵を静置させて３日間３７℃で７０〜８ｏｚの相対湿度で培養した。この間 、胚が卵の内容物の上表面に上昇した。

４日目の始めに、卵は逆さまにすることなく割られ、注意深く滅菌プラスチック 製ベト９皿に胚が上表面にあるように置いた。殻のない卵を更に７２時間３７℃ で２．５〜３．５２のＣ０２を含有している雰囲気下で培養し、その後成長する 胚は認め得るＣＡＭを発達させた。試験試料を１１（Ｗ／■）メチルセルロース と混合することによって造ったディスクを乾燥し、主要な静脈（ｍａｊｏｒ　ｖ ｅｉｎ）の閏のＣＡＭ上に、胚からおよそ０．５ｃ厘離して置いた。３７℃で更 に４８時間培養後（２，５〜３．５ＸＣＯ２）　、脈管形成を抑制する能力につ いて試料を採点した。抑制は移植錠を取巻く駆血帯域として現われ、このディス クを避けている静脈によって形成されたエルボ−形を含みそして移植錠の領域に 於いて毛細血管の数が減少している場合が多い。

内皮纏胞増殖検−ま ヒトの請静脈内皮纏胞（ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ）を、ＩＯＸ　（ｖ／ｖ）牛胎児血清 （ＦＢＳ）、＋５０ｍｃｇ／ｍｌ内皮細胞成長サブレメント（ＥＣＧＳ）及び５ 単泣／−１のヘパリンを含有しているメディアム（培地）　１９９　（Ｇｉｂｃ ｏ）中で、３７℃、４〜５ｚＣ０２テ培養した。３〜４日毎に培養基をトリプシ ン処理によって収穫し、希釈して再プレートし、集合体に生育させた。実験閏始 前に細胞を遠心分離し、ヘパリンのない培地中に再懸濁し、試験物質（ＰＦ４） と共に３日間、標準の培養条件下で培養した。ｔｇａ期間の終りに細胞をトリプ シン処理によって除き、パーティクル・データ・エルシン１８０細胞カウンター で数えた。平均の閏の統計的な有意性は、不対データに対する標準のスチューデ ントを一試験（Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ−ｔｅｓｔ）て決定した。

ＤＮＡ合成の抑制は、上記のように細胞をプレートしてから、試験物質と一緒に ２４時間培養することによって測定された。更に６時間３Ｈ−チミジン（ｌμＣ ｉ／穴）を加え、プレートを一７０℃で凍結させた。２回の凍結／解凍開門の後 、′ａ抱を繊維フィルター上に吸引し、蒸留水で洗い、Ｍ　ｅＯＨで固定し、Ｄ ＮＡへの放射能の取込みをカウントした。

生体内ＩＩｌ瘍成長検定 正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌ハツカネズミ（生後６−８週）に、Ｂ１６−ＦＩＯメ ラノーマ腫瘍系統の対数相の細胞５χ１０６個を皮下接種した。この操作は漸進 的な腫瘍成長を起こし、約１０日で大きな（３００ａｍ’）壊死性腫瘍を生じ、 通常ｍｇＩ接種の３週間以内に未処理動物を死に至らしめた。

生体内のａｍ成長と脈管形成を予防するｒＰ　Ｆ　４の効力を試験するために、 ｆｉｇをもった動物に、腫瘍接種の１日後から始めて毎日、ｒＰ　Ｆ　４又はｒ Ｐ　Ｆ　４の入っていない緩衝液を新生腫瘍へ直接に注射した。各被験動物の受 ける特定処理がなんであるかを知らされていない研究員が、定期的な時間１隔て 、デジタルノギスによって腫瘍容積を測定した。

足随りｆｏｏｔｐａｄ）検定 試験物質を含有するＰ　Ｂ　Ｓ　（０，０５ｍｌ）を各ハッカネズミの右後の足 踵に皮膚内注射した。試験物質を含有しない希釈剤の同量を、左後足踵に注射し た０種々の時点て、足の裏の厚みを、バネ装填された工学用マイクロメーター（ ファウラー社、英国ビッグスウォルド）によって測定した。

種々の時点て、ハツカネズミをｒＲ段し、足随のＭ１織を光学顕微鏡検査のため に準備した。この組織を使用して、浸潤細胞型を定量した。生検標本を少なくと も４８時閏、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、次にパラフィン埋没とヘマトキ シリン及びエオシン染色という標準技法を用いて調製した。接眼グリッドを使用 して、各標本中の真皮の４細胞区域を１００ＯＸの（８率てコート方式によって 検査し、炎症細胞を定量化した。群間の差は、スチューデント１試験又は適当な 場合、分散分析によって評価した。

ｒＰ　Ｆ　４の生産 ＰＦ４部分の直前に特異なメチオニン残基を含有するＮ−末端融合蛋白質として 、ＭＡｖえ型ＰＦ４を大腸菌中てつくった。もっと特定的には、自然配列のＰＦ ４　（図１）（ボンクズら、［１９８７年コＢｌｏｏｄ　６９巻２１９頁）をコ ードした合成遺伝子を、プラスミドｐＲＥ　Ｖ　２．２　（１９８６年７月３０ 日寄託、呼出番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０９１）の複数制限部位領域へクローニン グすることによって、発現プラスミドｐＰＦ　４−２１１を構築した。合成遺伝 子中のコドン用法を大腸菌発現用に＃ｌａ化し、ＰＦ４遺伝子のへフタ−への指 向性挿入を容易にするために、合成りＮＡリンカ−を各末端に含めた。ｐＲＥ　 Ｖ　２．２への挿入用に制限部位１（ｉｎｄｍ及びＳ■ａｌを遇択した。生ずる 構造体ｐｐ　Ｆ　４−２１１は、特異なメチオニン残基によってＰＦ４配列から 隔てられた大腸菌β−グルクロニダーゼ（Ｂ６）の３４アミノ酸を含有する融１ 合蛋白質を発現した。

融合蛋白を発現する細胞をリゾチーム（細胞ｇ当たりＩ　Ｂ）　、Ｄ　Ｎａ５ｅ ｌ　（Ｉｆ胞１０（Ｉｇ当たり５００単位）及びビーズミル処理にかけた。＠合 蛋白質をＢＧとＰＦ４部分との間のメチオニンのところで１裂させるために、融 合蛋白質を含有する溶菌ベレットを７０％蟻酸中のＣＮＢｒ　（’ａｌ胞１００ ｇ当たり１０ｇ）で処理した。ＣＮＢｒ／蟻酸の蒸発後、絹替え蛋白質を細胞出 発材料１００ｇ当たり５０ｍＭ　）リス−Ｃ１（ｐＨ７，６）　、　５　ｍＭ　 ＥＤＴＡ、及び１０　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔの２００　ｍｌで抽出した。天然配列の ｒＰ　Ｆ　４−２１１は、蛋白質をヘパリンアガロースに結合させ、汚染蛋白質 を０．６Ｍ　Ｎ　ａｃｌで除去し、１．２Ｍ　Ｎ　ａｃＩて溶離することによっ て精製された。

生ずる材料を２０−Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）へ透析し、クマシーブリリ アントブルーで染色した１５％５ＤＳ−ＰＡゲル上で分析した。Ｃ４逆相高圧液 体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて少量の汚染物質を除去すると、生体内 使用の蛋白質が調製された。

ｒＰ　Ｆ　４−２４１及びその他のＰＦ４類似体類の生産ｒＰ　Ｆ　４−２４１ と命名される突然変異体をコートした合成遺伝子は、ＰＦ４のＣ末端近くの４個 のりジン残基に対するコドンを、ＢｂｅｌとＳ■ａ１部位間でのカセット突然変 異誘発によって、２１ＩＩのＧ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｕカップレットをコートした配列 （ＣＡＡ　ＧＡＡ）に代えることによって構築された。リンカ−は合成遺伝子の 末端に含まれており、遺伝子は上記のように、ｒＲＥ　Ｖ　２．２へ挿入された 。

その他のＰＦ４変異体又は類似体をコートした遺伝子は、同様な方法て′Ａｌｌ された。

突然変異体蛋白質（例えばｒＰ　Ｆ　４−２４１）を上記のように閉袋し、抽出 した０次に、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィを使用して抽出物を精製 し、Ｏ−ＬＭ　Ｎ　ａｃＩの勾配で溶離した。ＰＦ４蛋白質は、一般に約０．５ Ｍ　Ｎ　ａｃｔて溶離され、これを２０−Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）ｌ　７．５）で透 析した。試料を更に逆相ＨＰＬＣによって精製した。

ＰＦ４ペプチド−鴎 標準固相合成手順によってペプチド類をＦＡＩ！シ、固体支持体から切り離して 脱封鎖し、逆相ＨＰＬＣによって精製組替え型ヒトＩＬ−１（ｒｌＬ−１）をジ エンザイム・コーポレーション（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入し た。チトクロームＣと大ｌＩＩ菌エンドトキシンをシグマケミカル社（ミズーリ 州セントルイス）から購入した。

除放性インドメタシンベレットをイノベーチプ争すサーチ社（オハイオ州トレド ）から購入した。

ハツカネズミ。

Ｃ５７Ｂ＋／　６Ｊ、　Ａ　／Ｊ、及びＣ３Ｈ／　ＨｅＪ＋ｌｌ　ハツカネズミ （生後６−８週）をジャクジン・ラボラトリ−（メーン州バーバーバー）から購 入した。

次の実施例は最良の形態を含めた本発明の実施に対する手順を説明する。これら の実施例は限定的なものとして解釈されるへきてない。特に別途記載しない限り 、全ての％は重量、全ての溶媒混合物割合は容量による。

実施例１ 上記の様に製造した鶏の卵を種々の濃度の組替えＰＦ４又はＰＦ４の配列に由来 するペプチドを含有しているディスクで処理した。ｒＰＦ４及び１３個のアミノ 酸しかないｃ、ｔ＊ペプチドは、ＣＡＭに於いて脈管形成を抑制した（図２）、 各場合とも、抑制は投与量依存性であり、応答はほぼＰＦ４のＣ末＃領域を含有 している抑、ｖＪ剤と同等である（モル基盤）、ＰＦ４のＮ末端ペプチド（Ｎ− ２９）は試験された最も高い濃度に於いてさえ脈管形成を抑制せず、ＰＦ４の全 ての抗脈管形成活性はおそらく分子のＣ末端部分と関連していることを示唆して いる。ＰＦ４のＣ末端はリジンに冨んでいるので、この検定系において、ポリリ ジンを試験し、６．５μモル投与量で抑制を生しないことが分った。

実施例２ ＰＦ４のリジンに富んだ領域（６１〜６６の残基）もＰＦ４によるヘパリンの結 合と間違した領域である。ヘパリンは脈管形成を調節する役割を果たすことが知 られており、脈管形成は特性がよく分っている別のヘパリン結合蛋白質であるプ ロタミンによっても影響を受け得る。ＰＦ４に基づいた合成ペプチドがヘパリン に結合する能力を評価する為に、本発明者等はヘパリンにょフて阻害される凝固 カスケード酵素の活性を検定した。ここで使用されるＸａ因子の検定は、デント ンら（１９８３年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　２０９巻４５５−４６０頁ですてに記述されている。プロタミンと血小板 第４因子は、はぼ同しモル濃度でトロンビンとＸａ因子のヘパリンによる抑制を 予防しうる。ＰＦ４の４１１１１のアミノ酸のＣ末端ペプチド（Ｃ−４１）はヘ パリン抑制の防止がより効果的でなかったが、Ｃ−１３ペプチドはｒＰ　Ｆ　４ の有効水準の１０倍の１度に於いてさえ、トロンビンの抑制を防止することが出 来なかった。この予想外の発見は、Ｃ−１３ペプチドがヘパリン結合以外の何等 かの方法によって脈管形成を抑制することを示唆している。

実施例３ 多くの脈管形成剤は内皮細胞増殖の直接の抑制によって作用する。内皮細胞の分 裂及び成長は成長因子の存在によって厳密に制御され、そしてこれに厳密に依存 している０本発明者等は、野性型配列をもったｒＰＦ４（ｒＰＦ　４−２１１） 及び関連ペプチドの、成長因子に刺激されたヒト内皮細胞増殖の抑制を試験管内 （インビトロ）で評価した。図３に示すように、ｒＰ　Ｆ　４は１．３μ阿もの 低濃度で、投与量依存的な形て内皮細胞の成長を著しく抑制した。抑制は、ここ で使用されたペバリンを含まない培地中で、３．２μ−で完全であった。

実施例４ 内皮細胞増殖の抑制に於けるＰＦ４のヘパリン結合活性の重要性を評価する為に 、５単位／１のヘパリンを含有するか含有していない培地中で細胞を培養した。

この実験の３日間の培養の間、ヘパリンの存在はこれらの細胞の増殖を刺激した ＊　ｒＰ　Ｆ　４は対照の内皮細胞成長も（１ｏｏ’ｒ、＞　、ヘパリン刺激内 皮細胞の成長も（４５ｚ）、両方ともかなり抑制したく表１）。

−１４，４±２．５　ｂ６．０±０．６　〜】００５ｕ／ｍｌへ＋ピリン　１８ ．９±　１．２　ｂ１４．０±　０．４　４５−は８ｘｌＯ’／ウエルの植え付 けに基づく。

ｂ適当な対照と有意の差あり（ｐ　＜　０．００５）実施例５　ｒＰ　Ｆ　４− ２４１の構築ＰＦ４のカルボキシ末端に於ける４つのりジン残基を上記の様に２ つのＧｌｎ−Ｇｌｕカッブレットに変換することによって、ＰＦ４突然変異体を 造った。この蛋白質は明らかに、分子のこの領域に対するαラセン形のの二次構 造（図４）を保持するが、同時にヘパリン結合活性の喪失を伴う。

この蛋白質は天然のＰＦ４に対するポリクローナル抗体と反応性であり、アミノ 酸分析によって適当な修飾を有していることが決定された。有意義な点は、精製 された突然変異体蛋白質がＸａ因子の抑制検定に於いて、ヘパリン結合活性を欠 いていたことである。

ここに記載された置換はペプチド断片並びに完全な長さのＰＦ４分子に対して行 なうことが出来る。例えばＣ−１３−２４１は次の配列を有する。

Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−丁ｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉ　Ｉｅ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ｅｒ 実施！１６　ｒＰＦ４−２４１による脈管形成の抑制精製したｒＰ　Ｆ　４−２ ４１を、鶏の絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定に於いて、毛細血管成長の抑制能力につい て試験した。

試験した最も低濃度に於いてさえ（＋、２５ｒ＋ｔＸ／テーイスク）　ｒＰＦ　 ４−２４１はＣＡＭ系において脈管形成を広範囲に抑制した（図５）、この抑制 は膜上のより大きな無血管帯域によって示唆されるように、元々のｒＰ　Ｆ　４ の同じ濃度によって生したものよりもいっそう有効であった。ｒＰＦ４−２４１ の抑制効果はヘパリンによって逆転されなかった。

実施例７　ｒＰ　Ｆ　４−２４１によるヒト内皮細胞増殖の抑制天然のｒＰ　Ｆ 　４及び突然変異体ｒＰ　Ｆ　４−２４１によるヒト請静脈内皮ｍ胞増殖の抑制 試験に於いて、両方ともがこれらの細胞の増殖を抑制するのに有効であることが 示された。この試験の結果は図６に示されている。

これらの結果は、ＰＦ４の効果がヘパリンの結合の為であったと仮定した脈管形 成のｒＰ　Ｆ　４抑制の以前の理論からすると注目すべき事である。我々は蛋白 質を、元々のＰＦ４の構造的な特徴のほとんどを保持しつつも、検出可能なヘパ リン結合活性を欠くものとして設計したが、これは生体内で脈管形成を抑制する のに自然なＰＦ４よりもより活性であり、試験管内で内皮細胞増殖を抑制するの により活性であり得る。更に我々が設計した突然変異体は、ヘパリン抗凝固療法 に干渉することが予想されない。

実施例８　生体内の１ｌＩｆｌ！成長の抑制腫瘍成長と脈管形成の予防における ｒＰ　Ｆ　４−２１１又は「Ｐ　Ｆ　４−２４１の効力を試験した。生体内腫瘍 成長の抑制は、４−２１１　（２ＯｍＭ　Ｎａ０Ａｃ中、ｐＨ４，０）又はｒＰ 　Ｆ　４−２４１　（５０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６，５，５０ｍＭ　ＮａＣ ｌ中）を直接に新生腫瘍中に注射後、検定された。ｉｌｌ接種の７日以内に、緩 衝液を注射された動物は明らかな三次元的な腫瘍を有する一方、ｒＰ　Ｆ　４− ２１１で処理された動物は本質的に腫瘍が簾かった（図７）。ｒＰＦ４て続けて 処置することは、これらの条件下、即ち未処理マウスですでに見られたように対 照動物の腫瘍が壊死を生じ、そして大きなものであるような条件下で、完全に腫 瘍成長を抑制した。　ｒＰ　Ｆ　４−２４１が抑制剤として使用されたときにも 、同し効果が観測された。

この発見は、脈管形成の抑制剤としてのｒＰ　Ｆ　４が、悪性黒腫及び他の癌の 克服に臨床的有用性をもつとの提案を支持するものである。ｌｌＩ瘍の漸進的成 長は新しい血管の形成を要求し、新しい血管形成はそれが抑制されれば腫瘍成長 を制限するのみならず、既存血管の退化を刺激し、並びに悪性の侵入物に対する その他の応答を増強する。

生体内の＋ｍｓ成長のｒＰＦ４による抑制が、最初の接種（ｒＰＦ４の）の三日 以内に明らかであったという発見は、ｒＰ　Ｆ　４が長時間を要する免疫調整（ イミュノモジュレーション）によるものでなく、局所的な機構によってｍｉ成長 を調節する様に作用することを示している。

更にｒＰ　Ｆ　４はインビトロで腫！細胞の成長を直接に抑制しなかった。従っ て、ｒＰ　Ｆ　４は成長中の腫瘍に対する宿主の脈管形成的な応答を変えたよっ てある。

実施例９ もしアミノ酸配列の変更が有意に蛋白質の二次構造を変更させないならば、同定 された構造及び機能の蛋白質は、アミノ酸配列を変更することによって構築でき ることが示された（カイザー　イー、ティー、及びエフ、ジエー。

ケズディー［１９８４］５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　２４９−２５５）、本発明 は、ヘパリン親和性を欠いていて、同し又はより高い脈管形成の抑制活性を実質 的に示す、本明細書に記述されたＰＦ４配列のその池の突然変異体又は断片類を 包含する。

好ましい変更領域は、ヘパリン結合領域に対応するカルボキシ末端近くのリジン に富んだ領域（残基６Ｏ−Ｔｏ）である、一般的な規則として、６０番目から７ ０番目のアミノ酸は削除できない。また一般規則として位置６ｏと７０の閏で少 なくとも１個の荷電された残基なもつ必要がある。この領域で両性のα−らせん を慄っ必要はないと思われるが、両性構造が好ましい。従って本発明は蛋白質の 二次構造を変えないか、又は構造が変えられたとしても生物的な活性が保持され ているような、本明細書に描かれたアミノ酸配列の突然変異体を含んでいる。特 にアミノ酸のコンザーバティブな置換を行なえることが理解されるへきである。

例えば、アミノ酸は次のクラスに分けられ得る。塩基性、疎水性、酸性、極性及 びアミド。一つのクラスのアミノ酸が同じ種類（クラス）の別のアミノ酸に置き 換えられる置換は、その置換が実質的に化合物の生物活性を変えない限り、本発 明の範囲内にあるものである０表２は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げてい る。

塩基性　Ｋ、Ｒ，Ｈ 酸性　Ｅ、Ｄ 極性　Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ アミド　Ｑ、Ｎ ある場合には非コンザーバティブな置換もされうる。

例えばＰＦ４のＣ末端の近くのりジン残基は任意の次のアミノ酸で置換され得る 。即ち、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｍ。

Ａ、Ｌ、及び■、臨界的な要因は、これらの置換が「ＰＦ４又はｒＰＦ４断片の 生物活性を有意に損なうものであってはならないという点である。

我々は、アミノ酸置換を行なう実験を行ない、生ずるｒＰ　Ｆ　４突然変異体を 生物活性について試験した。構築された種々の突然変異体を表３に示す。

ｒＰＦ４−２１１　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７コ　−　ＰＬＹににＩＩにＫＬＬ ＥＳｒＰＦ４−２３１　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７コ　−　ＰシｙｒＰＦ４−２ ４１　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７］　−ＰＬＹＱＥＩＩＱＥＬＬＥＳｒＰＦ４− ３０２　［ＰＦ４　ＡＡ　ｌ−５７］　−ＰＬＹＱＱＩＩＱＱＬＬＥＳｒＰＦ４ −３０３　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７］　−ＰＬＹににＱＥＫＫＱＥＥＳｒＰＦ ４−３０７　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７コ　−　ＰＬＹＱＩＥＩＱＬＥＬＥＳｒ ＰＦ４−３０８　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７］　−ＰＬＹＮＤＩＩＮＤＬＬＥＳ ｒＰＦ４−３１５　［ＰＦ４　ＡＡ　１−５７コ　−　ＰＬＹＧＥＩ　ＩＧＥＬ ＬＥｓこれらのベブチＦ’　１１１の生物活性を試験する実験の結果を表４に示 す。

表　４ ＣＡＭ　ＨＵＶＥＣ ｒＰ　Ｆ　４−２１１　＋　＋ ｒＰ　Ｆ　４−２３１　＋　／−− ｒＰ　Ｆ　４−２４１　＋　＋　＋ ｒＰ　Ｆ　４−３０２　＋／−− ｒＰＦ４−３０３　＋　ＮＡ ｒＰ　Ｆ　４−３０７　＋　＋　＋　＋ｒＰ　Ｆ　４−３０８　＋　Ｎ　Ａ ｒＰ　Ｆ　４−３１５　＋　Ｎ　Ａ ＮＡ＝入手不能（Ｎｏｔ　Ａｖａｉ　ｆａｂｌｅ）表４に示す結果は、ＣＡＭ検 定及びＨＵＶＥＣ検定において細胞成長の抑制に間するｒＰ　Ｆ　４の生物活性 を保持したｒＰ　Ｆ　４突然変異体を構築できることを明確に例証している。こ れらのペプチド類の二つ（ｒＰ　Ｆ　４−２４１とｒＰ　Ｆ　４−３０７）はこ れらの検定で強化された活性を示した。ここに記述された突然変異体は、野性型 ｒＰ　Ｆ　４（ｒＰ　Ｆ　４−２１１）と大部分相同であるが、あるアミノ酸置 換をもっているようなアミノ酸配列である。これらの置換はアミノ酸６０と７０ の間で行なわれた。

生ずる化合物のほとんどは、ＣＡＭ及びＨＵＶＥＣ検定において生物活性を保っ ているが、ヘパリンを結合しない、ＣＡＭ又はＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ検定て有意の活 性を示さないｒＰ　Ｆ　４−３０２は、残基６０と７０の間で荷電されたアミノ 酸残基をもたない。有意の生物活性を示さないｒＰ　Ｆ　４−２３１も、アミノ 酸数６０で終っている。当業者がその池のｒＰＦ４突然変異体の生物活性を検討 したい場合は、所望の突に変異を行なって、生ずるペプチド類の活性を試験する のが単刀直入な手順てあろう６本明細書の教示を用いて、研究者は所望の性状を もつと予想されるペプチド類をｒＩ４Ｉ！シ、容易に試験できよう０例えば、完 全な長さのｒＰ　Ｆ　４分子について記述されたばかりのアミノ酸置換は、上に 記述されたＣ−１３及びＣ−４１断片についても実施できる。

実施例１０　ｒＰＦ４及び関連化合物類の炎症性状ｒＰ　Ｆ　４及び関連化合物 類の炎症性状は、上記の足返（ｆｏｏｔｐａｄ）検定を用いて検討された。８時 閏に、ｒＰＦ４−２１１　（２５μ８）をネズミ表皮へ局所注射すると、足廼（ フットバット）膨張（図８）及び炎症性細胞浸潤の定量（図９）によって測定さ れるとおり、活発な炎症応答を引き起こした。より高い投与量では、ｆｌＪ織の 水腫はそれ以上増加せず、やや低下さえした。好炎症効果を現わすには比較的高 い局所濃度のＰＦ４が必要であることがわかった。ネズミ表皮へ注射されたＰＦ ４（２５μｇ）で活発な炎症応答が生ずるが、０．２５μｇで炎症応答は最低限 であった。ｒＰＦ４て誘発される急性炎症の時閉的経過は広域で、約３６時閉で 解消する（図８）。

ｒＰ　Ｆ　４で誘発される炎症の時間経過は、基線から急速に上昇し、６時閏と １２時間の間でピークに達し、３６時間までにほぼ完全に解消する。

実施例１１ｒＰＦ４に対する抗炎症剤の効果実験の４８時間前に、各ハツカネズ ミに除放性インドメタシンベレット（イノベーチブ・リサーチ、オハイオ州トレ ド）　０．０５　Ｂを軽いエーテル麻酔下に皮下に移植した。これらのベレット は、１４日間にわたり、内容物を持続的に放出する。

インドメタシンによる動物の全身処置は、ｒＰ　Ｆ　４の好炎症応答を著しく鈍 らせる（図８）。ｒＰ　Ｆ　４とインドメタシンで処置されたハツカネズミでの 足Ｉｆ（フットバラ）”）ＷＡＩ張の曲線下の面積は、ｒＰ　Ｆ　４のみて処置 されたハツカネズミの曲線下の面積の４５．７％である。炎症性細胞浸潤も、イ ンドメタシン処置によって部分的に解消された。これらの実験結果を表５にまと めた。

Ａに　艶」　リ Ｎ−２９−− ｒＰ　Ｆ　４−２４１　＋　＋ ｒＰＦ４／インドメタシン　＋／−＋／−このように、インドメタシンはＰＦ４ 又はＰＦ４間達間違の投与に伴う膨張を減少するために使用できる。池の非ステ ロイド抗炎症剤も使用出来る０本発明の組合せ及び方法に有用な抗炎症剤は、ス テロイド及び非ステロイドの抗炎症剤を包含する。非ステロイド抗炎症剤は、ア セチルサリチル＃！Ｉ（アスピリン）、サリチル酸メチル、サリチル酸ナトリウ ム、フェニルブタシン、オキシフェンブタシン、アバシン、インドメタシン、ス リンダック、トルメチン、メフェナミソクアンット、イブプロフェン、ナプロキ セン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、及びその他の 化合物類を包含するが、これらに限定はされない。本発明の絹合ぜと方法に有用 なその池の抗炎症剤は、天然′ｆＩｇに由来するりボニルチン類、又は絹替え手 法（米国特許出願第６９０．１４６号、第７１２．３７６号、第７６５，８７７ 号、及び第７７２．８９２号；ウォールナー・ビーら、［１９８６年コＮａｔｕ ｒｅ　３２０巻７７−８１頁）によってつくられるリボコルチン及びリボコルチ ン様ポリペプチド類、及びウロモジュリン（マクモア・エイ・ヴイー及びジェイ ・エム・デツカ−［１９８５年］　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９巻４７９−４８１頁 ）、又はシクロスポリンとその誘導体類を包含する。本発明に従って使用できる ステロイド抗炎症剤は、ヒドロコーチシンを包含するが、これに限定はされない 。

この実験で４群のハッカネズミを使用した。２群のハツカネズミに、除放性イン ドメタシンペレット（５０μ８）を、左わき腹の皮膚下に外科的に移植した。他 の２群はインドメタシン処置を受けなかった。４群全部のハッカネズミの右わき 腹に、腫瘍を皮下移植した。

図１Ｏに示すように、ＰＦ４へのインドメタシン添加はＰＦ４の抗腫瘍活性を妨 げなかった。腫瘍を緩衝液のみ又はインドメタシンのみて処置した第６日以後、 移植された腫瘍は急速に成長した。対照的に、ＰＦ４又はＰＦ４とインドメタシ ンの組合せによって処置されたとき、腫瘍は全くでないにしても、はとんど成長 しなかった。

これらの結果から、ＰＦ４は抗炎症剤インドメタシンと絹合せた時でも、その抗 Ｉ！瘍活性を保持していることが明らかである。

実施例１３　ＰＦ４と抗炎症剤の投護 本発明の絹合せ及び方法は、ある場合には、ＰＦ４のみに基づく慣用の処置方法 で許容される量より高い投４量で、ＰＦ４又は関連化合物類の投与を可能として いる。

従って、本発明の組合せ及び方法はＰＦ４のみの高投与量での処置の炎症効果を 有利に減少又は排除する。このため、抗炎症剤と絹合せたＰＦ４の使用は、慣用 的に許容される低投与量のＰＦＩ↓のみに基づく療法で必要とされる処置期間を 縮小させることができる。

本発明の組合せ及び方法は、ヒトを含めた任意の哺乳類を処置するのに有用であ る。本発明に従って、本発明の絹合せによる製薬上有効な量の２活性成分、すな わちＰＦ４と抗炎症剤によって、脈管形成又は内皮細胞増殖の抑制に十分な時間 にわたり、哺乳類を処置する。

本発明に従って、薬学的有効量の抗炎症剤とＰＦ４（又はＰＦ４関連化合物類） は逐次的に、又は同時的に患者に投与される。ＰＦ４の最も有効な投与方式と適 量範囲は、処置しようとする病気のタイプ、その病気の程度とＭ過、以前の治療 法、患者の健康状態、及びＰＦ４への応答と処置をする医師の判断によって変わ る。ＰＦ４は一連の処置の期間での一時点て患者に投与できる。

好ましくは、抗炎症剤とＰＦ４は逐次的に患者に投与され、抗炎症剤はＰＦ４処 置の前、後、又は前と後の両方で投与される。逐次的投与はＰＦ４処置の少なく とも同じ日（２４時閏以内）に抗炎症剤を処置すること、またＰＦ４を投与しな い日々に抗炎症剤の継続処置を渾う。

抗炎症剤の慣用的な投与方式と標準適量範囲を使用できる（ギルマン・エイ・ジ ーら（＆り「治療の薬理学的基ｉ１　（Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ ｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）Ｊ　６９７−７１３頁、１ ４８２頁、＋４８９−９１頁［１９８０年］　；医師卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃ ｉａｎｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　１９８６年版）。例えばインドメ タシンは約２５−５０　Ｉｌｇの適量で１日３回経日没与できる。それより高い 投与量も使用できる。その代わりに、アスピリン（約１５００−２０００　＋ｇ ｇ／日）、イブプロフェン（約１２００−３２００　ｍｇ１日）、又は慣用的治 療量のその他の抗炎症剤を使用できる。抗炎症剤の適量は、個々の患者に対して 滴定できる。

本発明の一つの態様に従って、患者は抗炎症剤とＰＦ４との同時処置を受けるこ とができる。ＰＦ４の局所的、病巣内、又は静脈内注射が好ましい（ギルマンら 、前掲、＋２９０−９１頁を参照）。抗炎症剤は、皮下注射、皮下の除放性移植 錠によって、又は経口的に投与されるのが好ましい。

その代わりに患者は、抗がん、抗１Ｅ又は抗炎症活性を示す薬剤の慣用の投与方 式に従って、ＰＦ４　（又はＰＦ４間達間違物￥Ｊｉ）と抗炎症剤との絹合せを 含めてなる組成物を受けることができる。これらは、例えば非経口、皮下、静脈 内、又は病巣内投与経路を包含する。

実施例１４　全身投与のための投与物 腫瘍の治療のために全身的にＰＦ４が使用されるときに、非常に高いＰＦ４の投 与量が要求されることが発見され、そしてこれらの高い投与量は受け入れられな い高い水準の毒性を有してはいないことが発見された。高い投与量のＰＦ４が必 要であること及び高い投与量のＰＦ４に対し耐性があることを実証する実験は以 下のようにして実施された。

８１６ねずみメラノマ細胞系統の細胞をマウスの尾の静脈に静脈内注射した。３ ０秒後、ｒＰＦ４　（食塩水中又は酢酸塩緩衝液中）を異なる尾の静脈を経由し て、同じマウスに注射した。２１日後、試験動物及び対照動物の腫瘍のｌｉＲを 光学的に、及び肺への転移を計数することにより、そしてマウスの肺の重さを計 ることによって測定した。

表６を参照すると、ＰＦ４は両方のパラメーターによって測定されるように投与 量に依存する効果を生じた。　ＰＦ４が全身的に投与された時に最適な結果が観 測された。５０００μｇ／体重ｋｇを越える投与量の時に、最適の結果が観測さ れた。これらの投与量において、どんな観測される毒性又は他の思い影響も認め られなかった。

群　平均重量°　投与量　転移の数°　肺。

−−一其−員−ぐｍ−Ｏ−メ■し−む、ＬＱ」つ　く数／マウス〉□対照　＋７ ．７　０　１３１３．２　４４３（緩衝液のみ） ０．３７５１１ｇｒＰＦ４　１９．０　１９．７　１１２．２　５２５０．７５ ｗｇ　ｒＰＦ４　１８．７　４０．１　６６．０”　４０４＋、５Ｂ　ｒＦ’Ｆ ４　１７．８　８４．２　５４．７”　３５７本　群当り６匹のマウスの平均 十　対照群からの統計的な差、ｐ（０，０５４１ＬＬ入　全身□り一炸Ｊ 限定されるものではないが、小細胞肺癌、頭頚部癌、肉腫、乳癌、結腸癌などを 含めた全ての用途に対し零貢的に全身的処置は均等である。　ＰＦ４は直接静脈 内注射により、又は好ましくは単−処置当り０．５〜４時閏時読持続静脈内注入 により投与できる。！！者は院内又は外来患者として処置できる。患者はまた移 植可能な皮下ポルタル、レザボア又はポンプを使用して処置できる。複数の静脈 又は皮下投与が可能であり、移植可能な処置方法の場合には持続的放出のために 設計された処方が特に有用である。！！者は周期当りｒＰＦ４を０．３〜１２８ の投与量で処置されることができ、好ましくは１日当り６０ｍ１ｂ）ら２．５１ の容量中のｋｇ当り４〜１８０ｍｇで処置できる。

適量はポーラス注射又は静脈内注入として単一適量投与として定義され、又は化 合物は１日の期閏にわたって静脈注入として患者に投与できる。それ以外にも化 合物は適量が２４時間の肋間にわたり分配されるように期間的に中断される幾つ かのポーラス注射として投与出来る。

最も好ましい処置方法は、１日当り１回の注射又は注入で患者に化合物を投与す ることである。

患者は毎日又は６週間の間通おきに、又はおそらく−生処置できる。患者らはま た連続的に週当り３回処置できるか、又は彼等は毎日−生処置できる。

実施例１８　部分的処置 部分的な処置は限定されるものではないが、原発性の肝ＩＩ癌、脳及び腎臓癌、 及び結ＩＩＩ／直腸癌からの肝臓転移を含めて患者中で特定の臓器中の癌の処置 に有用である。処置は動脈内注入によって達成できる。影響を受けた臓器へ処置 を向けるためにカテーテルが外科的又は血管造影的に移植される。カテーテルに 連結された皮下のポルタル（ｐｏｒｔａｌ）が慢性の処置のために使用でき、又 は移植できる再充填可能なポンプも用いることもできる。

患者は単−投与当り１０〜４００＋＊　Ｉの容量中の０．０５〜１ｇの「ＰＦ４ （１〜２０Ｂ／ｋｇ）を受けることができる。処置の投与計画は全身処置につい て上に記載したのと同しである。

組成物 これらの治療法で使用される組成物も種々の形態であり得る。これらには例えば 固体、半固体、及び液体投与形、例えば錠剤、丸薬、粉末、液体溶液、又は懸濁 液、リポソーム、座薬、注１可能及び注入可能な溶液が含まれる。好ましい形態 は意図される投与形態に依存し、治療用途に依存する。組成物はまた好ましくは 当業者に知られている慣用の製薬上受は入れられる担体及び助剤を含む、好まし くは本発明の組成物は単位投与形であって、通常患者に１日当り１〜それ以上の 回数投与される。

ＰＩ３又は関連化合物は静脈内、筋肉内、病巣内又は皮下注射を含めた任意の薬 理学的に受け入れられる投与形で患者に投与され得る。有効投与量は体重ｋｇ当 り約０．００３〜約２００ｍｇの範囲であり得、より低いそしてより高い投与量 も有用であることが認識される。上に議論したように非常に高い投与量が全身投 与に刻して好ましい、もちろん本発明の組成物及び方法は、池の治療法と組合せ て使用できることが理解されるへきである。

患者の症状の快方が一旦生じたならば、必要ならば維持的投与量が投与される。

その後、投与の適量又は頻度又はそれらの両方が、症状の間数として、快方した 症状が維持される水準に減少できる。症状が望まれる水準に軽減された時に治療 がやめられるへきである。しかし患者は長期的な観点に基づいて、なんらかの病 気の症状のある場合には、間歇的な処置を必要とし得る。

本明細書に記載された実施例及び具体例は、説明のみを目的とするものであり、 実施例や具体例から当業者は種々の変更及び修正の示唆を得ることができること 、そしてそれらの変更や修正は本出願の精神と範囲、及び添付の特許請求の範囲 に含まれるへきであることが理解されるべきである。

■１ ・ｒＰＦ４−２１１ 圓　２ ｒＰＦ４　＄Ｍ） ｍ　ｒＰＦ４”２４ｊ ９生ｒｐＦ４ １作９−＠）１　ｒＰＦ４−２４１ ｅｒＰＦ４−２１１ ０　了で〒−μ ■ｒＰＦ−４−２１１ ・＊　＝：　ｔ　’１．捧ｒＰＦ−４−２４１圀　Ｖ 口？９楢機軸眠 −阜臓細８８ 已主射印試楽 ■　穐１１九 　ｒＰＦ４ ・　イン１゛メ７シン

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．頭頸部の腫瘍の治療における使用のための医薬の製造のための組替え又は合 成ＰＦ４、ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
2. ２．肺の腫瘍の治療における使用のための医薬の製造のための組替え又は合成Ｐ Ｆ４、ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
3. ３．乳の腫瘍の処置における使用のための医薬の製造のための組替え又は合成Ｐ Ｆ４、ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
4. ４．結腸の腫瘍の処置における使用のための医薬の製造のための組替え又は合成 ＰＦ４、ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
5. ５．直腸癌の処置における使用のための医薬の製造用の組替え又は合成ＰＦ４、 ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
6. ６．前立腺癌の処置における使用のための医薬の製造用ための組替え又は合成Ｐ Ｆ４、ＰＦ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
7. ７．胃癌の処置における使用のための医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
8. ８．膀胱癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関連化 合物又はそれらの断片の用途。
9. ９．腎臓癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関連化 合物又はそれらの断片の用途。
10. １０．すい臓癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関 連化合物又はそれらの断片の用途。
11. １１．肝臓癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関連 化合物又はそれらの断片の用途。
12. １２．卵巣癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関連 化合物又はそれらの断片の用途。
13. １３．子宮がんの処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関 連化合物又はそれらの断片の用途。
14. １４．転移性の皮膚癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、Ｐ Ｆ４関連化合物又はそれらの断片の用途。
15. １５．悪性黒腫の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４関 連化合物又はそれらの断片の用途。
16. １６．基底細胞癌の処置に使用する医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、ＰＦ４ 関連化合物又はそれらの断片の用途。
17. １７．班点状変性の処置の使用のための医薬製造用の組替え又は合成ＰＦ４、Ｐ Ｆ４関連化合物又はそれらの断片の用途。