DE69736692T2

DE69736692T2 - Kationisches Vehikel: DNS Komplexe und ihre Verwendung in Gentherapie

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Publication number: DE69736692T2
Application number: DE69736692T
Authority: DE
Inventors: Archibald James Mixson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2017-07-17
Also published as: EP1342477A1; DE69736692D1; EP0819758B1; EP0819758A3; ATE340259T1; EP0819758A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf kationische Vehikel-DNS-Komplexe (d.h. kationische Liposom-DNS-Komplexe, kationische Polymer-DNS-Komplexe), wie in den Ansprüchen definiert.
Hintergrund der Erfindung
I. Gentherapie
Die Entwicklung von Techniken der Gentherapie zur Behandlung von neoplastischen und Stoffwechselerkrankungen nähert sich der klinischen Anwendung. Das größte Hindernis bei der Behandlung maligner Erkrankungen verbleibt im Transport des Transgens durch einen Vektor zum entfernten Zielgewebe.
Gentragende Vektoren werden allgemein in viral und nicht-viral eingeteilt. Unglücklicherweise unterliegen alle bis heute beschriebenen Vektoren wesentlichen Beschränkungen. Z.B. können replikationsdefiziente retrovirale Vektoren sich teilende Zellen wirkungsvoll transfizieren. Die lokale intratumorale Injektion von Retroviren, die ein Thymidinkinase-Transgen enthalten, wurde erfolgreich dazu verwendet, die Regression von Gliomzellen zu beeinträchtigen. (Culver et al., Science, 256:1550-1552 (1992)).
Allerdings besitzen Retroviren das Potenzial, Insertionsmutagenese zu verursachen. Das führt dazu, dass ihre Anwendung auf die direkte Injektion in einen Tumor oder auf ex-vivo-Gentransferversuche beschränkt ist. Im Gegensatz zu retroviralen Vektoren können adenovirale Vektoren auch sich nicht-teilende Zellen transfizieren und ihr Potenzial, Insertionsmutagenese zu verursachen, ist in hohem Maße verringert. Allerdings besitzen sie die unerwünschte Eigenschaft, das Immunsystem beim Menschen zu aktivieren. (Crystal, Science, 270:404-410, (1995). Es gibt Versuche, die Immunogenität von adenoviralen Vektoren zu minimieren, jedoch wird die potenzielle Toxizität viraler Vektoren höchstwahrscheinlich ihre Anwendung für die systemische Zufuhr von Genen in der näheren Zukunft limitieren.
Zu den nicht-viralen DNS-Vektoren gehören Liposome, Peptide, Proteine und Polymere (Ledley, Current Opinion in Biotechnology, 5:626-636 (1994)). Von diesen sind Liposome die am häufigsten verwendeten nicht-viralen DNS- Vektoren. Der größte Vorteil von Liposomen gegenüber Retroviren ist, dass DNS nicht in das Genom eingebaut wird, und sie sind, im Gegensatz zu adenoviralen Vektoren, nicht immunogen. Allerdings ist die größte Einschränkung der Liposome, dass sie bei der Transfektion vieler verschiedener Zelltypen weniger wirkungsvoll sind als virale Vektoren. Bis vor kurzem war ihr medizinischer Nutzen eingeschränkt, da sie schnell durch Phagozyten aufgenommen werden. Neuerliches Interesse an Liposomen als Vektoren erwachte durch zwei technologische Fortschritte und führte zu einer Renaissance in diesem Gebiet. Zum einen stellen sterisch stabilisierte Liposome (sog. Stealth-Liposome) einen bedeutenden Durchbruch dar, und zwar insofern, als dass sie nicht reaktiv sind und nicht bereitwillig vom retikuloendothelialen System (RES) aufgenommen werden. Stealth-Liposome bestehen aus Lipiden, die sauerstoffreiche Kopfgruppen besitzen (Ethylenglykol oder Glykolipide), die eine sterische Barriere außerhalb der Membran bilden. Das hat zur Folge, dass Stealth-Liposome hundertmal länger im Blut verweilen als konventionelle Liposome, wodurch die pharmakologische Wirksamkeit erhöht wird. (Papahajopoulos, In: Stealth liposomes, Ed., Lasic et al, CRC Press (1995); und Lasic et al., Science, 267:1275-76 (1995)). Allerdings sind Stealth-Liposome noch nicht besonders effizient bei der Transfektion von Zellen oder als DNS-Vektoren.
Der zweite bedeutende Fortschritt der Liposomtechnologie war die Verwendung von kationischen Liposomen im Komplex mit negativ geladener DNS. Kationische Liposome können sich an DNS anlagern und die Transfektionseffizienz um mehrere Größenordnungen steigern. Beim kationischen Liposom-DNS-Komplex sind die Nukleinsäuren bzw. die Oligonukleotide nicht eingekapselt, sondern auf einfache Weise durch elektrostatische Wechselwirkungen mit kleinen unilamellaren Vesikeln komplexiert. Die genaue Natur des kationischen Liposom-DNS-Komplexes ist nicht geklärt, aber es treten komplizierte topologische Umlagerungen des Liposom-DNS-Komplexes auf, einschließlich Kondensation von DNS, Aggregation von Liposomen und Fusion. Dieser supramolekulare Komplex kann Zellen in vitro zugegeben, parenteral injiziert oder als Aerosol über die Atemwege verabreicht werden (Lasic et al., Science, 267:1275-1276 (1995)). Weiterhin zeigte die intravenöse Injektion von CAT-Genen, komplexiert mit kationischen Liposomen, bei Mäusen eine 40%-ige Transfektionseffizienz bei gut vaskularisiertem Gewebe, wie beispielsweise der Milz (Zhu et al., Science, 261:209-211 (1993)). Allerdings bleibt eine große Herausforderung der Gentherapie die systemische Zufuhr von Transgenen zum Tumor oder zum peritumoralen Bereich, welche die Größe der Primärtumoren und ihrer Metastasen wirksam verringert. Die Ursache liegt darin, dass, anders als die Milz und das Knochenmark, welche stark vaskularisiert sind und eine ausgeprägte Kapazität zur Filterung von Makromolekülen besitzen, die meisten Organe und Tumoren nicht über diese Filterkapazität verfügen und die Transfektionseffizienz bei diesem Gewebe mittels Liposome gering ist (Marshall, Science, 269:1051-1055 (1995)). Eine zusätzliche Einschränkung bei kationischen Lipsom-DNS-Komplexen besteht darin, dass ihre Halbwertszeit im Blutstrom weniger als eine Stunde beträgt. (Allen et al., In: Liposome Technology – Vol. III, Hrsg., Gregoriadis G. et al., CRC Press (1993)). Eine ausreichende Transfektion der Zielzellen durch Vektoren, die therapeutische Gene tragen, ist bisher der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Gentherapie gewesen.
II. Tumorsupressorgene
Tumorsupressorgene sind wohlbekannt. Zu ihnen gehören das p53-Gen (Baker et al., Science, 249:912-915 (1990)), das p21-Gen (El-Deiry et al., Cell, 75:817-825 (1993); und Harper et al., Cell, 75:805-816 (1993)), und das Rb-Gen (Bookstein et al., Science, 247:712-715 (1990)).
Man weiß, dass Mutationen im Tumorsuppressorgen p53 in über 50% aller Tumoren beim Menschen vorkommen, einschließlich metastatischen Brustkrebses. Brustkrebs ist eine der häufigsten Todesursachen bei Frauen in Nordamerika und Westeuropa und betrifft fast 10% der Bevölkerung bis 80 Jahren und es werden eine Million neue Fälle bis zum Ende dieses Jahrzehnts vorhergesagt (Miller et al., Int. J. Cancer, 37:173-177 (1986)).
Obwohl die molekulare Grundlage der mehrstufigen Karzinogenese bei Brustkrebs nicht gut verstanden ist, wurde eine Korrelation zwischen dem metastatischen Potential von Brustkrebs und dem Auftreten von Punktmutationen im p53-Gen festgestellt (Wang et al., Oncogene, 8:279-288 (1993)). Verschiedene Gruppen konnten feststellen, dass die Wiedereinführung des Wildtyp-p53 in eine Tumorzelle die therapeutische Eigenschaft besitzt, die Proliferation des mutierten Produkts auszuschalten (Bookstein et al., Cancer, 71:1179-1186 (1993); Chen et al., Science, 250:1576-1580 (1990); und Baker et al., Science, 249: 912-915 (1990)). So zeigten beispielsweise eine in-vitro-Transfektion und retroviral-vermittelter Transfer einer einzelnen Kopie des p53-Transgens bei einer Vielzahl von Tumorzellen, einschließlich Brustkrebszellen, eine Abnahme der Wachstumsrate und/oder eine abgeschwächte Tumorentwicklung, nachdem diese transfizierten Zellen Nacktmäusen eingepflanzt wurden (Wang et al., Oncogene, 8:279-288 (1993); Baker et al., Science, 249:912-915 (1990)); Bookstein et al., Science, 247:712-715) (1990); Cheng et al., Cancer Res., 52:222-226 (1992); Isaacs et al., Cancer Res., 51:4716-4720 (1991); Diller et al., Mol. Cell. Biol., 10:5772-5781 (1990); Chen et al., Oncogene, 6:1799-1805 (1991); und Zou et al., Science, 263:526-529 (1994)).
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die intratracheale Injektion eines Retrovirus, der das p53-Transgen enthält, das Wachstum von Lungentumoren signifikant hemmte (Fujiwara et al., J. Natl. Cancer. Inst., 86:1458-1462 (1994)). Weiterhin wurde gefunden, dass eine systemische intravenöse Zufuhr eines Vektors, der einen β-Actin-Promotor enthielt, zusammen mit der p53-kodierenden Sequenz, die mit kationischen Liposomen komplexiert war, das Tumorwachstum einer malignen Brustkrebszelllinie, die Nacktmäusen injiziert wurde, beeinflusste. (Lesoon-Wood et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res., 36:421 (1995); und Lesoon-Wood et al., Human Gene Ther., 6:39-406 (1995)). Von den 15 Tumoren, die in dieser Studie behandelt wurden, sprachen vier dieser Tumoren nicht auf die Behandlung an. Auf Grund der Tatsache, dass diese Tumoren nicht auf die Behandlung ansprachen, wurde bei der vorliegenden Erfindung nach neuen Therapien gesucht, um die Größe dieser Tumoren effektiv zu verringern. Auf der Grundlage von in-vitro-Daten zu p53 war zu erwarten, dass p53 die Größe dieser Tumoren auf Grund effizienter Transfektion des Tumors verringert. Allerdings waren weniger als 5% des Tumors nach drei Injektionen eines kationischen Liposom-Markergens (CAT) transfiziert. Somit könnte das Primärziel des kationischen Liposom-p53-Komplexes das vaskuläre System des Tumors sein. Unter der Voraussetzung, dass für die Entwicklung jedes menschlichen Tumors und der Metastasen die Angiogenese eine entscheidende Rolle spielt (Fidler et al., Cell, 79:185-188 (1994)), sollte diese Therapie auf eine Vielzahl von Tumoren weitgehend anwendbar sein.
P53 koordiniert vielfältige Antworten auf DNS-Schäden. DNS-Schäden erhöhen den Level an p53-Protein. Nach einem DNS-Schaden besteht eine wichtige Funktion des Wildtyp-p53 darin, die Progression von Zellen von der G1- zur S-Phase zu kontrollieren. Kürzlich fanden mehrere Gruppen, dass p53 die Transkription des p21-Proteins (auch bekannt als WAF1 oder Cip1) aktiviert, einem Inhibitor von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) (El-Deiry et al., ebenda; und Harper et al., ebenda). Es wird angenommen, dass die Hemmung der CDK-Aktivität die Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F und verwandter Transkriptionsfaktoren des Retinoblastomproteins Rb blockiert, was in der Folge die Transkription von Genen, welche für den Eintritt in die S-Phase nötig sind, verhindert. (Harper et al., ebenda; und Xiong et al., Nature, 366:701-704 (1993)).
III. Anti-angiogene Proteine
Proteine mit anti-angiogener Wirkung sind wohlbekannt. Zu diesen gehören: Thrombospondin-1 (Kosfeld et al., J. Biol. Chem., 267:16230-16236 (1993); Tolsma et al., J. Cell Biol., 122:497-511 (1993); und Dameron et al., Science, 265:1582-1584 (1995)), IL-12 (Voest et al., J. Natl. Cancer Inst., 87:581-586 (1995)), Protamin (Ingber et al., Nature, 348:555-557 (1990)), Angiostatin (O'Reilly et al., Cell, 79:315-328 (1994)), Laminin (Sakamoto et al., Cancer Res., 5:903-906 (1991)), und ein Prolactin-Fragment (Clapp et al., Endocrinol., 133:1292-1299 (1993)). Zusätzlich wurden mehrere anti-angiogene Peptide aus diesen Proteinen isoliert (Maione et all, Science, 247:77-79 (1990); Woltering et al., J. Surg. Res., 50:245-251 (1991); und Eijan et al., Mol. Biother., 3:38-40 (1991)).
Thrombospondin-1 (im Folgenden mit „TSP-1" bezeichnet) ist ein großes, trimeres Glykoprotein, das aus drei identischen Untereinheiten von je 180 kDa besteht (Lahav et al. Semin. Thromb. Hemostasis, 13:352-360 (1987)), die durch Disulfidbrücken verknüpft sind (Lawer et al., J. Cell Biol., 103:1635-1648 (1986); und Lahav et al., Eur. J. Biochem., 145:151-156 (1984)). Die anti-angiogene Aktivität wird überwiegend in der zentralen Stalk-Region dieses Proteins gefunden (Tolsma et al., ebenda). Es gibt mindestens zwei verschiedene strukturelle Domänen innerhalb dieser zentralen Stalk-Region, die die Neovaskularisierung hemmen (Tolsma et al., ebenda).
Neben TSP-1 gibt es fünf weitere Proteine (Fibronectin, Laminin, Plättchenfaktor-4, Angiostatin und das Prolactin-Fragment) aus denen Peptide isoliert wurden, die die Angiogenese hemmen. Zusätzlich sind Analoga des Peptids Somatostatin bekannt, die die Angiogenese hemmen.
Fibronectin (FN) ist ein wichtiger Bestandteil der Oberfläche vieler normaler Zellen und außerdem ein potenter Zellausbreitungsfaktor. Während der Transformation wurde der Verlust von zellulärem FN beobachtet. Darüber hinaus stellt die Zugabe von Fibronectin zu transformierten Zellen den normalen Phänotyp wieder her. Man fand, dass entweder Heparin-bindende oder der Zelladhäsion dienende Fragmente des FN experimentelle Metastasis hemmen kann, woraus sich schließen lässt, dass die Proteoglykane der Zelloberfläche wichtig sind für die Vermittlung der Zelladhäsion von metastatischen Tumorzellen (McCarthy et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:108-116 (1988)). Weiterhin fand man, dass FN und eines seiner Peptide die Angiogenese in vivo inhibiert (Eijan et al., Mol. Biother., 3:38-40 (1991)).
Laminin ist ein bedeutender Bestandteil der Basalmembran und man weiß, dass es mehrere biologisch aktive Zentren besitzt, die an Endothel- und Tumorzellen binden. Laminin ist ein kreuzförmiges Molekül, das aus drei Ketten besteht: eine A-Kette und zwei B-Ketten. Mehrere Sites im Laminin wurden als Zellbindungsdomänen identifiziert. In vitro fördern diese Sites zelluläre Aktivitäten wie die Zellausbreitung, die Migration und die Zelldifferenzierung. Von zwei Peptiden von zwei Sites der B1-Kette des Laminins ist bekannt, dass sie die Angiogenese inhibieren (Grant et al., Path. Res. Pract., 190:854-863)).
Plättchenfaktor-4 (PF4) ist ein Protein aus den α-Granula der Plättchen und wurde ursprünglich durch seine hohe Affinität zu Heparin charakterisiert. Das Protein wird von den Plättchen während der Aggregation als hochmolekularer tetramerer Komplex aus dem PF4-Polypeptid und Chondroitinsulfat freigesetzt, der bei hohen Ionenstärken dissoziiert.
PF4 besitzt mehrere biologische Eigenschaften, einschließlich Immunosuppression, chemotaktische Aktivität für neutrophile Granulozyten und Monozyten sowie für Fibroblasten, Hemmung der Knochenresorption und Hemmung der Angiogenese. Die angiostatischen Eigenschaften von menschlichem PF4 werden von der C-terminalen, Heparin-bindenden Region des Moleküls bestimmt. Bei einem davon abgeleiteten, aus 12 Aminosäuren bestehenden synthetischen Peptid wurde eine merkliche angiostatische Wirkung entdeckt (Maione et al., Science, 247:77-79 (1990)).
Obwohl Somatostatin kein Protein ist, ist es ein natürlich vorkommendes, aus 14 Aminosäuren bestehendes zyklisches Peptid, dessen bekannteste Funktion darin besteht, die Sekretion des Wachstumshormons (GH, growth hormone) zu hemmen. Somatostatin kommt weit verteilt im Gehirn vor, wo ihm eine neuromodulatorische Rolle zufällt. Außerdem findet es sich in mehreren Organen des Gastrointestinaltraktes, wo es als parakriner Faktor oder als echter zirkulierender Faktor fungieren kann. Die Rolle, die das auch als Somatotropin Release Inhibitory Factor (SRIF) bekannte Neuropeptid Somatostatin bei Krebserkrankungen des Menschen spielt, ist nicht völlig geklärt. Neuere Untersuchungen zu Somatostatinrezeptoren in normalem und neoplastischem menschlichen Gewebe kommen zu dem Schluss, dass diese Rolle komplex ist und sowohl direkte als auch indirekte Mechanismen beinhaltet. Einer der Anti-Tumor-Mechanismen dieser synthetischen Somatostatin-Analoga könnte ein anti-angiogener Effekt sein (Woltering et al., J. Surg. Res., 50:245-50 (1990)). In einer neueren Studie wurde die Fähigkeit zur Hemmung der Angiogenese von nativem Somatostatin und neun Somatostatin-Analoga überprüft. Das potenteste Somatostatin-Analogon erwies sich als etwa doppelt so potent wie das natürlich vorkommende Somatostatin (Barrie et al., J. Surg. Res., 55:446-50 (1993)).
Angiostatin ist ein 38 kDa großes Fragment des Plasminogens. Während Plasminogen keine fibrinogene Aktivität zeigt, besitzt Angiostatin eine merkliche anti-angiogene Aktivität (O'Reilly MS, et al., Cell, 79:315-28 (1994)). Angiostatin wurde isoliert, als beobachtet wurde, dass der Primärtumor die Bildung von Metastasen unterdrückte. Das heißt, dass, als der Primärtumor entfernt wurde, die Metastasen zu wachsen begannen.
Schließlich erwies sich ein 16 kDa großes Fragment des Prolactins als anti-angiogen. Ähnlich dem Plasminogen ist Prolactin nicht anti-angiogen, doch das Prolactin-Fragment erwies sich in vivo und in vitro als potenter Inhibitor der Angiogenese (Clapp C. Et al., Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)).
Trotz der Belege, dass anti-angiogene Peptide effektive Anti-Tumor-Agentia sind und trotz des beträchtlichen Interesses daran, Gene in das Gefäßsystem zu dirigieren, hat es keine Veröffentlichungen über wirksame in-vivo-Gentherapien mit DNS-Sequenzen gegeben, die bekanntermaßen anti-angiogen wirken.
Es gibt mehrere Gründe dafür, warum eine Gentherapie unter Verwendung anti-angiogener Gene nicht anwendet wurde oder warum anti-angiogene Peptide wirksam sind und ein Komplex aus Liposom und anti-angiogenem Gen möglicherweise nicht. Zum einen existieren signifikante physikalische Unterschiede zwischen den Liposom-DNS-Komplexen und ihren Peptiden. Kationische Liposome haben eine Halbwertszeit von weniger als eine Stunde (Allen T.M. und Pophajopoulos D., In: Liposome Technology, Vol. III, Hrsg., Gregoriades G. Et al., CRC Press (1993)), wohingegen die wirksamsten antiangiogenen Peptide (z.B. Angiostatin) eine Halbwertszeit von zwei Tagen besitzen (Folkman J, The John Krantz, Jr Lecture in Pharmacology, UMAB, 4/30/96). Da kationische Liposome, wenn sie mit DNS zusammengebracht werden, große Aggregate bilden, wird die Distribution dieser Komplexe wahrscheinlich von der der viel kleineren Peptide stark abweichen. Diese Eigenschaft der Liposome könnte die geringe Transfektionseffizienz bei einem Tumor erklären. Aus diesem Grund ist es ungewiss, ob die Liposom-DNS-Komplexe ihre zellulären Ziele erreichen.
Des Weiteren sind die genauen Zielrezeptoren oder die Mechanismen dieser anti-angiogenen Peptide unbekannt (Tolsma, ebenda). Beispielsweise ist nicht bekannt, ob es sich bei diesen Zielrezeptoren um intra- oder extrazelluläre Rezeptoren handelt. Die Ablesung der mit Liposomen komplexierten anti-angiogenen Gene zur Bildung des entsprechenden Proteins erfolgt innerhalb der Zelle, und Proteine ohne sekretorische Signalsequenzen verbleiben innerhalb der Zelle. Somit ist nicht klar, wie ein anti-angiogenes Peptid, das auf einem systemisch transfiziertem Gen kodiert war, sein zellulläres Ziel bzw. seinen Zielrezeptor erreicht.
Das einzige transfizierte anti-angiogene Gen, welches Tumorwachstum hemmen konnte, ist das full-length Thrombospondin-1. In dieser Studie (Weinstat-Saslow et al., Cancer Research, 54:6504-6511, (1994)) wurden Mäusen Tumorzellen eingepflanzt, die in vitro, verglichen mit Baseline-Zellen, einen 15-fach höheren Spiegel an Thrombospondin-1 erzeugten. Das transfizierte full-length Thrombospondin-1 wurde von den Tumorzellen ausgeschüttet, um die Angiogenese zu hemmen und verkleinerte den Tumor effektiv um 60%. Somit konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass eine 100%-ige Transfektion der Tumorzellen mit einem hochexprimierten, anti-angiogenem Gen die Größe eines Tumors verringern konnte.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, kationische Vehikel-DNS-Komplexe zu schaffen, und zwar Liposom-Komplexe, die für anti-angiogene Peptide kodierende DNS enthalten oder kationische Komplexe, die für anti-angiogene Peptide kodierende DNS enthalten, beides zusammen mit dem Tumorsuppressorprotein p53.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Liposom-Komplexe zu schaffen, die für anti-angiogene Peptide kodierende DNS enthalten, in Kombination mit DNS, die ein Tumorsuppressorgen kodiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Liposom-Komplexe zu schaffen, die Konkatamere der gleichen oder anderer für anti-angiogene Peptide kodierende DNS enthalten.
Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, diese Komplexe zur Herstellung eines Medikaments zu verwenden.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, welche aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden, sind von einer Ausführungsform gelöst – durch einen kationischen Liposom-DNS-Komplex, umfassend DNS, die für ein anti-angiogenes Peptid kodiert und DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
Folglich betrifft die Erfindung einen kationischen DNS-Komplex, umfassend für ein anti-angiogenes Peptid kodierende DNS, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex zusätzlich DNS umfasst, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, wobei das Tumorsuppressorprotein p53 ist und wobei das anti-angiogene Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
Weiterhin bezieht sie sich auf die Verwendung eines Komplexes zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Tumor-Angiogenese wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Liposom vorzugsweise 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid einschließt und auch Polyethylenglykol umfassen kann, vorzugsweise ein pegyliertes Lipid – 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000) – und einen gerichteten Liganden, vorzugsweise das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf einen kationischen Polymer-DNS-Komplex, umfassend DNS, welche für ein anti-angiogenes Peptid kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex zusätzlich DNS umfasst, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert und wobei das Tumorsuppressorprotein p53 ist und wobei das anti-angiogene Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines kationischen Polymer-DNS-Komplexes, umfassend DNS, welche für ein anti-angiogenes Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Tumorwachstums bei einem Individuum, vorzugsweise die Verabreichung desselben an ein Tumortragendes Individuum sowie auf die obige Anwendung, bei der der Komplex zusätzlich DNS umfasst, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
Auf Grundlage der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann auf dem Gebiet der Gentherapie andere kationische Carrier (Polylysin, Polyhistidin, Polycat57, Superfect und Polyethylenimin), komplexiert mit den anti-angiogenen Genen, zur Inhibierung von Tumoren verwenden könnte.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie in einer vorhergehenden Ausführungsform diskutiert, werden die oben beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst durch einen nicht-viralen DNS-Komplex, umfassend DNS, die für ein anti-angiogenes Peptid kodiert und DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
Der spezielle, nicht-virale Carrier (Liposome – neutral oder nicht-kationisch, siehe unten), Polyethylenimin (Avanti Lipids), Polylysin (Sigma), Polyhistidin (Sigma), Superfect (Qiagen) ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung, obwohl kationische Liposome bevorzugte Carrier sind. Beispiele kationischer Lipide, welche bei der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, schließen ein: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (Avanti, Birmingham, AL, USA), 1,2-Dimyristol-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (Avanti, Birmingham, AL, USA) und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) (Syntex Corp., Palo Alto, CA, USA).
Die kationischen Lipide werden vorzugsweise in einer Mischung mit Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) verwendet. In der vorliegenden Erfindung ist die Menge an kationischem Lipid, das sich in der Mischung befindet, allgemein im Bereich von 100% bis 40% (Massenanteil, m/m), vorzugsweise um 50% (m/m); und die Menge an DOPE, das sich in der Mischung befindet, ist allgemein im Bereich von 0% bis 60% (m/m), vorzugsweise um 50% (m/m); und die Menge an pegyliertem Lipid (1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000)), das sich in der Mischung befindet, ist allgemein im Bereich von 0% bis 10% (m/m), vorzugsweise um 1 % (m/m).
Der spezielle Ligand ist abhängig vom Tumor bzw. vom peritumoralen Gewebe, das angegriffen werden soll. Beispiele von Angriffszielen sind HER2 (Brust), CEA (Dickdarm), der Ferritin-Rezeptor (Brust, Lunge und Ovarien) sowie das Gefäßsystem des Tumors (α5β3-Integrin oder der Gewebsfaktor).
Antikörper gegen HER2, CEA und das Gefäßsystem des Tumors werden zu 1 % mit der Hydroxylgruppe des pegylierten Lipids mit einem wasserlöslichen Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid) gekoppelt und über eine Sepharose CL-6B-Säule gereinigt. Auf ähnliche Weise werden Liganden des Tumors (Ferritin) und/oder dessen Gefäßsystems (das Peptid RDG) kovalent an die Hydroxylgruppe des pegylierten Lipids gebunden.
Das spezielle verwendete Tumorsuppressorgen ist das p53-Gen. Das p53-Gen ist das Tumorsuppressorgen, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Zu den Beispielen für anti-angiogene Peptide gehört ein Fragment des Thrombospondin-1 (TSPf), welches folgende Aminosäuresequenz besitzt (die Aminosäuresequenzen, von denen bekannt ist, dass sie anti-angiogen wirken, sind unterstrichen):
ein Konkatamer von TSPf mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenz des Introns ist unterstrichen):
MTEENKELANELRRPPLCYHNGVQYRNNEEWTVDSCTECHCQNSVTICKKVSCPI MPCSNATVPDGECCPRCWPSDSADDGWSPWSEWTSCSTSCGNGIQQRGRSCD

das Laminin-Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz: MYIGSR (SEQ-ID Nr.: 5), welches von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen, das Stopcodon ist fett gedruckt):
GTCGACATGTATATTGGTTCTCGTTAA GTCGAC(SEQ-ID Nr.: 6);
ein Konkatamer der Lamininsequenz mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind unterstrichen):
MYIGSRGKSYIGSRGKSYIGSRGKS (SEQ-ID Nr.: 7), welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen und die Sequenzen der Introns sind fett gedruckt):
ein Peptid des Plättchenfaktor-4 mit der folgenden Aminosäuresequenz:
MLYKKIIKKLLES (SEQ-ID Nr.: 9), welches von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen):
GTCGACATGCTTTATAAGAAGATCATCAAGAAGCTTCTTGAGAGTTAAGTCGAC (SEQ-ID Nr.: 10);
ein Konkatamer des Plättchenfaktor-4-Peptids mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind unterstrichen):
MLYKKIIKKLLESGKSLYKKIIKKLLESGKSLYKKIIKKLLESGKS (SEQ-ID Nr.: 11), welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen und die Sequenzen der Introns sind fett gedruckt):
der Somatostatin-Inhibitor mit der folgenden Aminosäuresequenz: MFCYWKVCW (SEQ-ID Nr.: 13), welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen):
GTCGACATGTTCTTGTATTGGAAGGGATTGTGGTAAGTCGAC (SEQ-ID Nr.: 14);
ein Konkatamer des Somatostatin-Inhibitors mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind unterstrichen):
MFCYWKVCWGKSFCYWKVCWGKSFCYWKVCWGKS (SEQ-ID Nr.: 15), welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen und die Sequenzen der Introns sind fett gedruckt):
der Fibronectin-Inhibitor mit der folgenden Aminosäuresequenz: MGRGD (SEQ-ID Nr.: 17), welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen):
GTCGACATGTCTTTGTCTTGGAAGACTTTGACTTAAGTCGAC (SEQ-ID Nr.: 18);
ein Konkatamer des Fibronectin-Inhibitors mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind unterstrichen):
MGRGDGKSGRGDGKSGRGDGKS (SEQ-ID Nr.: 19); welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen und die Sequenzen der Introns sind fett gedruckt):
das Angiostatin, mit der folgenden Aminosäuresequenz:
welche von der folgenden DNS-Sequenz kodiert wird (die Sal1-Schnittstellen sind unterstrichen):

ein Konkatamer des Angiostatin mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind fett gedruckt):

das Prolactin, mit der folgenden Aminosäuresequenz:
ein Konkatamer des Prolactin mit der folgenden Aminosäuresequenz (die Sequenzen der Introns sind unterstrichen):
Eine erhöhte Wirksamkeit wird sich mit Konkatameren des anti-angiogenen Gens einstellen. Dadurch wird die Dosierung des Anti-Angiogens erhöht, ohne die Menge an Vektor zu erhöhen, die nötig ist, um diese Gene an ihren Zielort zu bringen. Ähnlich den Konkatameren wird ein Plasmid mit zwei oder mehr Promotoren, ein Plasmid mit der IRES-Sequenz (internal ribosomal entry site) zwischen zwei Sequenzen und ein anti-angiogenes Peptid mit einer sekretorischen Sequenz den Transport von Genen zum therapeutischen Ziel ohne merkliche Steigerung der DNS-Konzentration erhöhen. Konkatamere können sich bis zu einer Länge von ungefähr 4400 Basen erstrecken (das entspricht dem Kodierbereich eines großen Proteins), wobei die Zahl der möglichen Konkatamere von der Basenzahl einer einzelnen anti-angiogenen Einheit abhängt.
Für Fibronectin läge der Bereich für Konkatamere ungefähr zwischen 2 und 66. Obwohl die Maximalzahl der anti-angiogenen Einheiten für das TSPf bei ungefähr 6 liegt, lässt sich die Zahl dieser Konkatamere durch Entfernung der Sequenzen, die keine anti-angiogenen Effekte zeigen, erhöhen, wie im Folgenden gezeigt:
ATG(CTGAGGCGGCCTCCCCTATGCTATCACAACGGAGTTCAGTACAGAAATAA CGGTAAAAGATCCCCGTGGTCATCTTGTTCTGTGACATGTGGTGATGGTGTGAT GGTAAAAGAAGTGGTACCCTGTAGACAAGACAGTGGACACCTCCTCCCCAT)_n TAA (SEQ-ID Nr.: 29), wobei die die korrespondierende Aminosäuresequenz die folgende ist:
M(LRRPPLCYHNGVQYRNNEEINTVDSGKSSPWSSCSVTCGDGVITRIGKSSPWDI CSVTCGGGV)_n (SEQ-ID Nr.: 30), wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 24 ist. Auf ähnliche Weise kann die Zahl der Konkatamere des Plättchenfaktor-4-Peptids, des Somatostatin-Inhibitors, des Angiostatins und des Prolactins erhöht werden.
Da mehr als ein Anti-Angiogenese-Pfad existiert, wird angenommen, dass Konkatamere, die aus zwei oder mehr Arten von Inhibitoren bestehen, eine höhere Wirksamkeit besitzen als die homogenen Konkatamere. Beispielsweise können heterogene Konkatamere von TSPf und dem Fibronectin-Inhibitor in denselben Vektor eingefügt werden. Ein Beispiel für ein heterogenes Konkatamer, welches für die vorliegende Erfindung verwendbar ist, ist:
Die erste Sequenz in Klammern stellt die Nukleotidsequenz von TSPf dar, wohingegen die zweite Sequenz in Klammern das anti-angiogene Fragment darstellt, welches aus dem Fibronectin isoliert wurde, wobei x und y für die Anzahl der Wiederholungen von TSPf bzw. Fibronectin stehen. Außerdem wird die Zahl, die sich durch Addition von x und y ergibt, im Allgemeinen 4400 Basen nicht überschreiten.
Die oben angeführten heterogenen Konkatamere müssen nicht nur auf anti-angiogene Peptide beschränkt sein. Beispielsweise können das Protein Angiostatin oder das große Polypeptid-Fragment des Prolactins durch die oben genannten Gene, die für ein anti-angiogenes Peptid kodieren, modifiziert werden. Im Übrigen wird die Anzahl der Nukleotidbasen in Abhängigkeit vom anti-angiogenen Inhibitor variieren. In diesem Konkatamer von großen und kleinen anti-angiogenen Inhibitoren beträgt das Verhältnis von großen zu kleinen Inhibitoren 0,1 bis 0,9, vorzugsweise 1:1.
Ein Startsignal für die Translation, Met, wurde in alle oben genannten Peptide eingeführt; außerdem wurde ein Stopcodon (TAA) für die Transkription in alle oben angeführten DNS-Sequenzen eingefügt.
Die in den obigen Sequenzen hervorgehobenen Sal1-Schnittstellen sind nützliche Klonierwerkzeuge für die Insertion von DNS in den BAP-Vektor, von dem bekannt ist, dass er nützlich ist bei der effektiven in-vivo-Proteinexpression vom β-Actin-Promotor (Ray et al, Genes Dev., 5:2265-2273 (1991)). Zur Einklonierung in andere Vektoren können andere Restriktionsschnittstellen in die DNS eingebaut werden.
Weitere, für die Gentherapie nützliche Vektoren, die bei der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, umfassen Plasmide mit einem Promotor des Affenvirus (SV40), z.B. pZeoSV (Invitrogen); oder der CMV-Promotor, z.B. PcDNA3, pRc/CMV oder pcDNA1 (Invitrogen). Plasmide mit einem CMV-Promotor können ein Intron in der 5'-Region der multiple cloning site enthalten (Zhu et al., ebenda). Plasmide, die den BGH-Terminator anstelle des viralen SV40-polyA-Terminators enthalten, z.B. PcDNA3, pRc/CMV, pRc/RSV (Norman et al., IBC's 5th Annual Meeting (1995), sowie Vektoren von Invitrogen), können ebenso bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um dadurch die Expression des Tumorsuppressorgens und der anti-angiogenen Peptide in Zellen zu steigern. Wie zuvor gesagt, wird ein Vektor, der zwei oder mehr Promotoren enthält, die therapeutische Wirksamkeit stark verbessern. Vektoren, die die IRES-Sequenz enthalten, welche die Translation zweier verschiedener kodierender Gene von einem mRNA-Transkript erlaubt, werden ebenso die Wirksamkeit der Therapie signifikant erhöhen.
Eine Expression der DNS, die für das Tumorsuppressorprotein kodiert und der DNS, die für das anti-angiogene Peptid kodiert kann durch Verwendung einer Vielfalt an Promotoren erreicht werden, wobei der verwendete Promotor für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend ist.
Beispielsweise kann der Promotor ein universeller Promotor sein wie der β-Actin-Promotor, ein Affenvirus-Promotor oder der CMV-Promotor oder ein gewebespezifischer Promotor wie der leberspezifische α-Fetoprotein-Promotor (Kaneko et al, Cancer Res., 55:5283-5287 (1995)), der Tyrosinkinase-Promotor, der spezifisch für Melanomzellen ist (Hughes et al, Cancer Res., 55:3339-3345 (1995)) oder der Enolasepromotor, der spezifisch für Neuronen ist (Andersen et al, Cell. Molec. Neurobiol, 13:503-515 (1993)).
Die genaue Menge an DNS, die im kationischen Komplex der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, ist nicht entscheidend. Im Allgemeinen liegt die Gesamtmenge an DNS im Bereich von 0,005 bis 0,32 µg/pM an Liposom, vorzugsweise 0,045 bis 0,05 µg/pM an Liposom.
Die DNS, die ein Tumorsuppressorgen kodiert, ist im Allgemeinen in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM an Liposom vorhanden, vorzugsweise 0,028 bis 0,04 µg/pM an Liposom.
Das Molverhältnis der DNS, die das Tumorsuppressorgen kodiert zu der DNS, die für das anti-angiogene Peptid kodiert, ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Im Allgemeinen liegt das Molverhältnis zwischen 1:5 und 5:1, vorzugsweise um 1 zu 1.
Die DNS, die das Tumorsuppressorgen kodiert und die DNS, die für das anti-angiogene Peptid kodiert können sich auf demselben Vektor oder auf verschiedenen Vektoren befinden.
Kationische Liposome werden ähnlich wie andere Liposome dargestellt. Kurz beschrieben, wird das kationische Lipid (mit oder ohne DOPE) in einem Lösemittel gelöst, z.B. Chloroform. Die Lipide werden anschließend über Nacht in einem Rundkolben an einem Rotationsverdampfer getrocknet. Die erhaltenen Lipide werden dann mit sterilem Wasser über eine Dauer von einer Stunde hydratisiert, um Liposome in Form langer multilamellarer Vesikel zu bilden. Die Verringerung der Größe der Liposome kann durch Ultraschallbehandlung (Sonifikation) geschehen oder dadurch, dass die Liposome vor und zurück durch eine Polycarbonatmembran gedrückt werden. Anschließend wird die DNS der Lösung, die die Liposome nach ihrer Bildung enthält, zugefügt.
In einer weiteren Ausführungsform wurden die die oben genannten Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst durch eine Methode zur Hemmung des Tumorwachstums in einem Individuum, umfassend die Verabreichung eines kationischen Liposom-DNS-Komplexes an ein Tumortragendes Individuum, umfassend DNS, die ein Tumorsuppressorgen kodiert und DNS, die für ein anti-angiogenes Peptid kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des kationischen Liposom-DNS-Komplexes umfasst der Komplex zusätzlich DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der kationische Polymer-DNS-Komplex zusätzlich DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die kationischen Liposome in dem kationischen Liposom-DNS-Komplex ein kationisches Lipid (d.h. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid und kann weiterhin ein Polyethylenimin umfassen (d.h. ein pegyliertes Lipid – 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000)) und einen gerichteten Liganden (das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die kationischen Liposome in den Komplexen ein kationisches Polymer (Polyethylenimin, Polylysin, Polyhistidin und Superfect) und können auch Polyethylenglykol umfassen und einen gerichteten Liganden (das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2 und CEA)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Tumorsuppressorprotein in den Komplexen p53.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das anti-angiogene Peptid in den Komplexen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die für ein anti-angiogenes Peptid kodierende DNS, die in den kationischen Liposom-DNS-Komplexen verwendet wird, in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM an Liposom vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die für ein anti-angiogenes Peptid kodierende DNS in dem kationischen Polymer-DNS-Komplex in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/µg an Polymer vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die für ein Tumorsuppressorprotein kodierende DNS in den Komplexen in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die für ein Tumorsuppressorprotein kodierende DNS in den Komplexen in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/pM vor.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Verwendung eines kationischen Polymer-DNS-Komplexes, umfassend DNS, die für ein anti-angiogenes Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Tumor-Wachstums in einem Individuum, welche die Verabreichung desselben an ein Tumor-tragendes Individuum umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Komplex bei der angeführten Verwendung zusätzlich DNS, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das kationische Liposom bei der angeführten Verwendung 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid und kann auch Polyethylenglykol umfassen (d.h. ein pegyliertes Lipid – 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000) und einen gerichteten Liganden, (das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das kationische Polymer bei der angeführten Verwendung ein Polyethylenimin (d.h. ein pegyliertes Lipid – Polycat57, Polylysin, Polyhistidin und Superfect) und kann auch Polyethylen umfassen und einen gerichteten Liganden (das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Tumorsuppressorprotein, welches in dem kationischen Komplex verwendet wird, p53.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das anti-angiogene Peptid, welches für das kationische Polymer verwendet wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die für ein anti-angiogenes Peptid kodierende DNS, welche in dem kationischen Komplex verwendet wird, in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM an Liposom oder 0,016 bis 0,33 µg/µg an Polymer vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die für ein Tumorsuppressorprotein kodierende DNS, welche in dem Komplex verwendet wird, in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM an Liposom oder 0,016 bis 0,33 µg/µg an Polymer vor.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der kationische Polymer-DNS-Komplex ein Plasmid mit einem oder mehreren Promotoren, die entweder dasselbe Genprodukt exprimieren (SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30) oder eine Kombination dieser Genprodukte.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der kationische Liposom-DNS-Komplex ein Plasmid mit einer internal-ribosomal-entrysite-Intronsequenz zwischen zwei Genen (SEQ-ID Nr.: 2,SEQ-ID Nr.: 4, SEQ-ID Nr.: 6, SEQ-ID Nr.: 8, SEQ-ID Nr.: 10, SEQ-ID Nr.: 12, SEQ-ID Nr.: 14, SEQ-ID Nr.: 16, SEQ-ID Nr.: 18, SEQ-ID Nr.: 20, SEQ-ID Nr.: 22, SEQ-ID Nr.: 24, SEQ-ID Nr.: 26, SEQ-ID Nr.: 28 und SEQ-ID Nr.: 29), welche entweder gleich oder unterschiedlich sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das anti-angiogene Protein im kationischen Liposom-DNS-Komplex oder im kationischen Polymer-DNS-Komplex sekretorisch und aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
Der spezielle Typ von Tumor, der in der vorliegenden Erfindung behandelt werden kann, ist nicht entscheidend. Beispiele von Tumoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen solide Tumoren ein, z.B. Lungen-, Dickdarm-, Gehirn-, Brust- und Hauttumoren. Alle diese Tumoren sind zur Aufrechterhaltung ihres Wachstums stark von der Blutversorgung abhängig.
Die spezielle Art der Verabreichung des Liposom-DNS-Komplexes der vorliegenden Erfindung ist nicht entscheidend. Beispiele solcher Formen sind intravenöse, subkutane und intratumorale Injektionen. Die intravenöse Injektion ist die bevorzugte Verabreichungsform, da diese eine bessere Distribution zu den in der Entwicklung befindlichen Blutgefäßen des Tumors bietet.
Die Menge an zu verabreichendem kationischen Liposom-DNS-Komplex hängt ab vom Alter, Gewicht, Geschlecht des Individuums, ebenso vom Volumen des Tumors und von der Wachstumsrate des Tumors in dem Individuum. Im Allgemeinen beträgt die zu verabreichende Menge etwa 5 bis 60 µg, vorzugsweise etwa 9 bis 16 µg.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Darstellung und sind in keiner Weise dazu bestimmt, den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
BEISPIEL 1
Herstellung von DNS-Vektoren
A. TSP-1-Vektor
Der kodierende Bereich des TSP-1-Gens ist wohlbekannt (Genbank-Nr. X14787). Das TSP-1-Gen wurde in die Xba1-Site des BAP-Vektors insertiert (Ray et al., ebenda), um dadurch einen TSP-1-Vektor zu schaffen, wobei die Expression des TSP-1-Gens durch den β-Actin-Promotor kontrolliert wird.
Genauer gesagt wurden die TSP-1-cDNA und das Bluescript-Plasmid (Promega) mit Hind1 und Xba1 verdaut und anschließend die TSP-1-cDNA in das Bluescript-Plasmid ligiert. Als nächstes wurden das Bluescript-Plasmid, das die TSP-1-cDNA enthielt und der BAP-Vektor mit Sal1 und BamH1 verdaut und die TSP-1-cDNA in die Xba1-Site des BAP-Vektors insertiert. Die richtige Orientierung des TSP-1-Gens in dem BAP-Vektor wurde durch DNS-Sequenzierung bestätigt.
B. TSPf-Vektor
Der TSPf-Vektor ist ein Vektor, der ein DNS-Fragment des TSP-1-Gens enthält, welches zwei anti-angiogene Domänen besitzt (Nukleotide 992-1650) (Tolsma et al., ebenda), sowie ein Start- und ein Stopcodon.
Das DNS-Fragment wurde hergestellt mittels PCR unter Verwendung von Thrombospondin-1-cDNA als Templat und 100 pmol von jedem der folgenden Primer 5'-TAGGTCTAGA ATGACTGAAGAGAACAAAGAG-3' (SEQ-ID Nr.: 24); und 5'-ATGGTCTAGA TTAGAGACGACTACGTTTCTG-3' (SEQ-ID Nr.: 25), um somit die Nukleotide 1013 bis 1650 des TSP-1-Gens zu amplifizieren. Beide Primer enthalten Xba1-Schnittstellen (unterstrichen). Der erste Primer enthält ein ATG-Startcodon (fett gedruckt) und der zweite Primer ein TTA-Stopcodon (fett gedruckt).
Das resultierende Fragment des TSP-1-Gens aus 638 Basenpaaren (im folgenden TSPf genannt) kodiert für die Peptide, von denen bekannt ist, dass sie Angiogenese-Inhibitoren sind (Tolsma et al., ebenda).
Nach der Amplifikation wurde das DNS-Fragment gereinigt und mit Xba1 verdaut. Das verdaute Fragment wurde in die Xba1-Site des BAP-Vektors insertiert, so dass die Expression des TSPf-Gens durch den β-Actin-Promotor kontrolliert wurde (Ray et al., ebenda, Lesoon-Wood et al., Human Gene Ther., 6:395-405 (1995)). Die korrekte Orientierung des Fragments in dem BAP-Vektor wurde durch Verdau mit BamH1 verifiziert und durch DNS-Sequenzierung bestätigt.
C. Der p53-Vektor
Die kodierende Sequenz des p53-Gens wurde mit Xba1 aus dem Plasmid p1SVhp53c62 (Zakut-Houri et al., EMBO J., 4:1251-1255 (1985)) ausgeschnitten und in die multiple-cloning-sites des pGEM3Z-Vektors (Promega, Madison, WI, USA). Der Verdau des resultierenden Vektors mit Sal1 und BamH1 erzeugte ein 1900bp-Fragment, welches dann in die Sal1 und BamH1- Schnittstellen des BAP-Vektors insertiert wurden, so dass die Expression des p53-Gens durch den β-Actin-Promotor kontrolliert wurde. Die korrekte Orientierung des p53-Gens in dem BAP-Vektor wurde durch DNS-Sequenzierung bestätigt.
BEISPIEL 2
Darstellung der kationischen Liposom-DNS-Komplexe
Von einer DOTMA-DOPE-Liposommischung ist bekannt, dass sie Endothelzellen in vitro effizient transfiziert (Tilkins et al., Focus, 16:117-119 (1994)). Dementsprechend wurden Liposom-DNS-Komplexe unter Verwendung von DOTMA-DOPE im Verhältnis 1:1 hergestellt, im Wesentlichen so, wie durch Debs et al. beschrieben (J. Biol. Chem., 265:10189-10192 (1990)). Auf ähnliche Weise können Liposome hergestellt werden, indem DOPE im Verhältnis 1:1 mit anderen kationischen Lipiden gemischt wird, wie beispielsweise 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphophocholin und 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphophocholin.
Im Einzelnen wurde eine Mischung von 400 nmol von DOTMA und DOPE über Nacht an einem Rotationsverdampfer getrocknet. Anschließend wurden die Lipide mit 1,5 ml Wasser für 2 Stunden rehydratisiert. Als nächstes wurde die milchige Liposom-Emulsion solange in einem Ultraschallbad sonifiziert bis der Ansatz klar war. Der resultierende Liposom-Ansatz wurde dann 15- bis 20-mal unter Verwendung eines LiposofastBasic-Extruders (Avestin, Ottawa, Kanada) durch einen 50nm-Polycarbonatfilter gepresst.
Die verwendete DNS bestand entweder aus (1) dem leeren BAP-Vektor; (2) dem TSP-1-Vektor alleine; (3) dem TSPf-Vektor alleine; (4) dem p53-Vektor alleine; (5) dem p53-Vektor plus dem TSP-1-Vektor oder (6) dem p53-Vektor plus dem TSPf-Vektor.
Die DNS-Präparation erfolgte unter Verwendung des Maxi-Kits von Quiagen (Quiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) mit anschließendem zweimaligen Waschen in 70%igem Ethanol (v/v). Zur Entfernung von restlichem Salz wurde die DNS dann 24h gegen Wasser dialysiert.
Etwa 400 pmol des Liposom-Ansatzes wurden in einem Eppendorfgefäß mit 18 bis 35 µg an totaler DNS sanft vermischt. Die Menge in jedem Eppendorfgefäß reichte aus für zwei Injektionen. Die gleiche Menge an DNS wurde sowohl bei Kombinationstherapien als auch bei den Monotherapien injiziert. Wenn beispielsweise jeder Maus 16 µg DNS bei der Kombinationstherapie (8.0 µg p53 + 8.0 µg TSPf) injiziert wurden, dann wurden 16 µg p53 jeder Maus einer zweiten Gruppe injiziert.
BEISPIEL 3
Anti-angiogener Effekt von kationischen Liposom-DNS-Komplexen
Die anti-angiogenen Effekte der kationischen Liposom-DNS-Komplexe, welche in Beispiel 2 beobachtet wurden, wurden mit Mäusen durchgeführt, die von dem MDA-MB-435 Brustkrebstumor befallen waren (American Type Tissue Culture, Bethesda, MD, USA) und die p53-defizient waren.
Im Einzelnen wurden, nach Verabreichung des Anästhetikums Metofan an 126 weibliche athymische Nacktmäuse, diesen unter Verwendung eines Steppers (Tridak) und einer 27,5-G-Nadel 2,0 × 10⁵ MDA-MB-435-Tumorzellen in den Fettgewebskörper der Brust injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse, deren Tumoren wuchsen, nach Therapieformen in Gruppen zu je 18 Mäusen eingeteilt. Die Therapien waren wie folgt: (1) ohne Behandlung; (2) leere BAP-Vektoren; (3) nur TSP-1-Vektor; (4) nur TSPf-Vektor; (5) nur p53-Vektor; (6) p53-Vektor + TSP-1-Vektor und (7) p43-Vektor + TSPf-Vektor. Den Mäusen wurden zwei intravenöse Injektionen verabreicht: die erste Injektion 14 Tage, nachdem den Mäusen die malignen Zellen injiziert worden waren, und die zweite Injektion 24 Tage, nachdem den Mäusen die malignen Zellen injiziert worden waren. Die erste Injektion bestand aus 200 pmol der Liposome, komplexiert mit 16 µg totaler DNS. Die zweite Injektion bestand aus 200 pmol der Liposome, komplexiert mit 8.0 µg totaler DNS. Die Größe der Tumoren wurde 7 Tage nach der zweiten Injektion gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Anti-Tumoreffekte von TSP-1 und TSPf
Wie oben in Tabelle 1 aufgeführt, ergaben sich nach 2 Injektionen bei der mit p53 behandelten Gruppe statistische Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (p < 0,05). Allerdings unterschied sich die mit p53 behandelte Gruppe statistisch nicht von der Gruppe, die mit dem leeren BAP-Vektor behandelt wurde. Das ist ein ähnliches Ergebnis wie von Leeson-Wood et al., Human Gene Ther., 6:395-406 (1995), beschrieben, wo sich die p53-Gruppe bis nach 5 Injektionen statistisch nicht von der Gruppe, die mit dem leeren BAP-Vektor behandelt wurde, unterschied.
Allerdings wurden Tumoren von p53 in Kombination mit TSPf wirkungsvoller reduziert als von p53 allein. Das heißt, nach nur 2 Injektionen dieser Kombinationstherapie gab es eine um 35% höhere Reduktion des Tumorwachstums als mit p53 allein. Die Kombinationsgruppe unterschied sich statistisch sowohl von der unbehandelten als auch von der BAP-Leervektor-Gruppe (p < 0,01). Obwohl TSPf für sich genommen geringfügig weniger wirksam war als p53, war TSPf unerwarteterweise wesentlich wirksamer als TSP-1. Tatsächlich zeigte die Gruppe, die mit dem full-length TSP-1 behandelt wurde, keinen größeren Effekt als die mit dem Leervektor behandelte oder die unbehandelte Gruppe. Das wurde aus verschiedenen Gründen nicht erwartet: 1) sowohl das full-length-Thrombospondin-1 als auch das Fragment desselben enthielten das anti-angiogene Peptid; 2) in einer früheren ex-vivo-Studie (Weinstat-Saslow et al., ebenda) war das full-length-Thrombospondin-1 wirksam bei der Inhibierung von Tumorwachstum; und 3) das full-length-Thrombospondin-1 besitzt vermutlich eine sekretorische Sequenz, so dass das sekretierte Protein die Endothelzellproliferation inhibieren kann, wohingegen das Thrombospodin-Fragment keine sekretorische Sequenz besitzt.
Unabhängig davon, ob eine sekretorische Sequenz existiert, hätte man vor der Existenz der vorliegenden Erfindung vorhergesagt, dass der Komplex aus Liposom und anti-angiogenem Gen keine effektive Antitumortherapie ermöglichen würde. Wie von Leeson-Wood et al. berichtet, war die Effizienz der Transfektion des Tumors durch kationische Liposome sehr gering. Tatsächlich konnte diese nicht durch Primer-Extension gemessen werden. Wir wissen durch Weinstat-Saslow et al., dass hohe Spiegel an exprimiertem TSP-1 in 100% der Tumorzellen das Tumorwachstum in einem ex-vivo-System nur um 60% verringern. Extrapoliert man diese Ergebnisse, so hätte eine relativ hohe Effizienz der Transfektion mit dem Komplex aus Liposom und anti-angiogenem Gen von 20% zu einer unwesentlichen Reduktion (20%/100% × 60% = 12%) des Tumors geführt. Dieser Wert der Tumorreduktion hätte nicht zu statistisch signifikanten Unterschieden bei den Komplexen aus Liposom und anti-angiogenem Gen geführt. Eine Transfektionseffizienz des Tumors oberhalb von 10% wäre mit einer Anzahl von Methoden leicht messbar gewesen, einschließlich der Methode der Primer Extension (verwendet von Leeson-Wood et al.). Die Transfektionseffizienz des Tumors mit diesen kationischen Liposomen konnte als kleiner 5% ermittelt werden.
Auf Grundlage von Berichten, dass ein anti-angiogenes Peptid ein effektives Antitumoragens sei (Tolsma et al., Bouck et al.) und auf Grundlage von Berichten, dass DNS, die für ein full-length-anti-angiogenes Protein kodiert, ex vivo ein effektives Antitumoragens sei (Weinstat-Saslow et al.), war es daher in keiner Weise offensichtlich, dass für ein anti-angiogenes Peptid kodierende DNS alleine ein wirksames Antitumoragens in vivo sein würde.
Es wurde ein zweites Experiment durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Kombinationstherapie mit p53 und TSPf bei geringeren Dosen wirksam war und um zu bestätigen, dass die Kombination von p53 und TSPf die Tumorgröße wesentlich stärker verringern konnte als p53 allein.
Im Einzelnen wurden 36 Mäusen 2.0 × 10⁵ MDA-MB-435-Tumorzellen in den Fettgewebskörper der Brust injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse, deren Tumoren wuchsen, nach Therapieformen in Gruppen zu je 18 Mäusen eingeteilt. Die Therapien waren wie folgt: (1) leerer BAP-Vektor; (2) nur p53-Vektor und (3) p53-Vektor + TSPf-Vektor. Den Mäusen wurden intravenös 200 pmol der Liposome, komplexiert mit 8.0 µg totaler DNS injiziert. Anschließend wurden die Mäuse bei den 4 folgenden Injektionen auf gleiche Weise mit 200 pmol der Liposome, komplexiert mit 12 µg totaler DNS, behandelt. Zwischen den einzelnen Injektionen lagen jeweils 10 Tage. Die Größen der Tumoren wurden vor jeder einzelnen Injektion und 7 Tage nach der letzten Injektion gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 aufgeführt: Tabelle 2 Anti-Tumor-Effekte von p53 und TSPf
Wie oben in Tabelle 2 dargestellt, verhielt sich die Kombinationstherapie mit p53 und TSPf statistisch unterschiedlich zu der Therapie mit BAP, was die Behandlung mit p53 allein nicht tat. Dieses Experiment bestätigte, dass p53 und TSPf wirkungsvoller waren als p53 allein. Weiterhin vergrößerte eine Behandlung mit anderer Dosierung, ohne eine initiale Boosterdosis von 16 µg DNS wie in dem Experiment in Tabelle 1, den Unterschied zwischen der Kombinationstherapie und den Behandlungen mit p53 allein.
Als nächstes wurden MCF7-Zellen (American Type Tissue Culture, Bethesda, MD, USA), die zu einer Mammakarzinomszelllinie mit zwei normalen p53-Allelen gehören, analog wie oben beschrieben untersucht, mit den Ausnahmen, dass den Mäusen 4,0 × 10⁶ Zellen injiziert wurden und dass die dritte Injektion 12 µg der DNS enthielt. Zwischen jeder Injektion lagen 10 Tage. Neun Mäusen wurden Injektionen gemäß der folgenden Verabreichungen gegeben, ausgenommen Behandlung (1), bei der 8 Mäuse behandelt wurden: (1) unbehandelt; (2) BAP; (3) p53 und (4) p53 + TSPf. Die Größe der Tumoren wurde 7 Tage nach der dritten Injektion gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Effekt von p53 und TSPf auf MCF7-Zellen
Wie oben in Tabelle 3 gezeigt, war die wirksamste Therapie gegen MCF7-Zellen p53 und TSPf. Das Signifikanzniveau für die Kombinationstherapie mit p53 und TSPf lag, im Vergleich zur Kontrollgruppe (unbehandelt) oder zur BAP-Gruppe, höher als jenes für p53 allein.
Das obige Experiment zeigte, dass p53 und TSPf die MCF7-Tumoren stärker reduzierte als bei den unbehandelten oder den mit BAP behandelten Gruppen. 4 × 10⁵ MCF7-Zellen wurden bilateral in die Fettgewebskörper der Brust der 28 Nacktmäuse injiziert. Nach 2 Wochen Wachstum wurden die Mäuse wahllos in vier Gruppen aufgeteilt: 1) leerer Vektor; 2) p53; 3) p53 + TSPf und 4) ohne Behandlung. Die Mäuse erhielten genau eine Injektion von200 pmol an Liposomen, komplexiert mit 14 µg DNS und die Tumoren wurden 10 Tage nach der Behandlung vermessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, weist die zusätzliche Reduzierung des Tumors durch die kombinierte Anwendung von p53 und TSPf (siehe auch obige Tabellen 1 und 2), verglichen mit der Anwendung von p53 allein, darauf hin, dass TSPf und p53 unterschiedliche Wirkmechanismen besitzen. Obwohl dadurch nicht ausgeschlossen ist, dass das Ziel von p53 das Gefäßsystem des Tumors ist, ist der Mechanismus der Tumor-Inhibierung durch p53 gegenwärtig nicht bekannt. Allerdings muss jeder Mechanismus der Tumorhemmung durch p53 oder Thrombospondin-1 zu der geringen Transfektionseffizienz im Tumor beitragen. Mit einem Liposom, komplexiert mit einem Chloramphenicol-Acetyltransferasemarker, wurde erneut gezeigt, dass weniger als 5% des von MDA-MB-435-Zellen abstammenden Tumors mit dem Marker-Gen transfiziert war.
Neben p53 und dem anti-angiogenen Fragment des Thrombospondin-1 konnten wir feststellen, dass Liposome, komplexiert mit DNS, die für das Laminin-Peptid kodiert, das Tumorwachstum hemmen. Im Einzelnen wurden 24 weiblichen athymischen Nacktmäusen, nach Verabreichung des Anästhetikums Metofan, 3,0 × 10⁵ MDA-MB-435 Tumorzellen in den Fettgewebskörper der Brust unter Verwendung eines Steppers und einer 27.5-G-Nadel injiziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse auf verschiedene Behandlungsmethoden aufgeteilt, mit je 8 Mäusen je Methode. Die Behandlungsmethoden waren wie folgt: (1) BAP; (2) Laminin und (3) p53 + Laminin. Den Mäusen wurden intravenös 200 pmol der Liposome, komplexiert mit 12,5 µg totaler DNS, 6,25 µg von jedem Vektor, wenn eine Kombination angewendet wurde. Die Mäuse erhielten dann 3 Injektionen im Abstand von jeweils 10 Tagen. Die Tumoren wurden zum Zeitpunkt jeder Injektion vermessen sowie bei der letzten Injektion. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5
Wie oben in Tabelle 5 gezeigt, waren kationische Liposome, die eine Kombination von DNS enthielten, die für das Laminin-Peptid und für p53 kodierten, bei der Reduktion des Tumorwachstums unerwartet effektiver als wenn nur DNS verwendet wurde, die für das anti-angiogene Peptid allein kodierte.
In-vitro-Assays zeigten, dass kationische Polymere die gegenwärtigen Therapieverfahren signifikant verbessern werden. Wenn ein Carrier wie ein kationisches Lipid in diesen in-vitro-Assays verwendet wurde, so war der inhibitorische Effekt (der Gene p53, TSPf und der Kombination von p53 und TSPf) nur marginal, wohingegen ein anderer Vektor, Superfect (ein kationisches Polymer), als Carrier sehr viel effektiver war. Das heißt, dass Superfect, verglichen mit den kationischen Liposomen, 15-mal effektiver war bei der Transfektion von Endothelzellen mit dem CAT-Marker.
Das in diesem Abschnitt verwendete kationische Liposom war DOSPER (Boehringer), welches von den 14 getesteten Lipiden die besten Ergebnisse brachte. Zu dieser Reihe von 14 Lipiden, die von uns getestet wurden, gehörte auch Lipofectin (BRL), das eine Mischung von DOTMA und DOPE ist und das wir in einer in-vivo-Studie verwendet haben. Kurz zusammengefasst, haben wir 1 × 10⁶ Huvec-Zellen in jede Vertiefung einer 6er-Mikrotiterplatte gegeben. 24 Stunden, nachdem die Zellen ausgesät worden waren, wurden 25 µl an Superfect, komplexiert mit 2 µg DNS, jeder Platte zugegeben. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Menge an CAT-Protein mittels eines Assays bestimmt. Tabelle 6
Dieses Experiment zeigt deutlich, dass dieses kationische Polymer bei der Transfektion von Endothelzellen, welche wahrscheinlich ein Ziel des therapeutischen Gens sind, ein herausragendes Agens ist. Wir stellten fest, dass Superfect für viele verschiedene Zelllinien ein besseres Transfektionsagens ist als kationische Liposome. Da Superfect, das ein kationisches Polymer ist, ein solch effizienter DNS-Carrier ist, ergibt sich klar die Möglichkeit, dass non-virale Carrier als eigene Klasse von Carriern bei der Reduktion der Tumorgröße erfolgreich sein werden. Daher sollten neben Liposomen auch andere non-virale Carrier in diesem Patent enthalten sein.
Die Transfektion von Huvec-Zellen mit verschiedenen Inhibitoren wurde wie folgt durchgeführt: 1.0 × 10⁵ Huvec-Zellen (Clonetics), eine humane Endothelzelllinie, wurden in jede Vertiefung einer 6er-Mikrotiterplatte ausplattiert und anschließend in einen CO₂-Inkubator bei 37°C gestellt. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen transfiziert mit 25 ml Superfect (Qiagen), ein kationisches Polymer, komplexiert mit 2,0 mg verschiedener DNS-Vektoren, d.h. (1) BAP-Vektor; (2) p53-Vektor; (3) TSPf-Vektor und (4) p53-Vektor + TSPF-Vektor. Nachdem die Zellen diesem Komplex für 2 Stunden bei 37°C ausgesetzt waren, wurde das Medium entfernt und durch frisches EGM-Medium (Clonetics Inc.) ersetzt, das 10% (v/v) FCS-Serum und 1 % Glutamin (w/v) enthielt. Anschließend wurden die Zellen in einen CO₂-Inkubator bei 37°C gestellt. Vierundzwanzig Stunden später wurde die Zahl der Zellen in jeder Vertiefung durch ein 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay (MTS-Assay) bestimmt (beschrieben von Buttke et al., J. Immunol. Methods, 157:233-240 (1993)).
Die Abbildung zeigt den Effekt verschiedener Behandlungsmethoden auf Endothelzellen in vitro. Es wurde festgestellt, dass sich der auf die BAP-Kontrolle bezogene Anteil signifikant verringert, wenn BAP-p53 und BAP-TSPf zur Behandlung verwendet werden. Eine weitere synergetische Verringerung wird erreicht, wenn BAP-p53T/SPf zur Behandlung verwendet wird. Auflistung der Sequenzen

Claims

Kationischer Liposom-DNS-Komplex, umfassend DNS, welche für ein antiangiogenes Peptid kodiert, wobei der Komplex zusätzlich DNS umfasst, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Tumorsuppressorprotein p53 ist, wobei das antiangiogene Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kationischen Liposome aus einem kationischen Lipid bestehen, vorzugsweise 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin und N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid und ebenso aus Polyethylenglykol bestehen können, vorzugsweise ein pegyliertes Lipid – 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000) und einen gerichteten Liganden, vorzugsweise das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2.
Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kationischen Liposome an ihrer äußeren Membran die Bindung an ein kationisches Polymer, Polyethylenimin, umfassen, vorzugsweise Polycat57, Polylysin, Polyhistidin und Superfect und auch Polyethylenglykol und einen gerichteten Liganden, vorzugsweise das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2 und CEA, umfassen kann.
Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 μg/pM vorliegt.
Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, in einer Menge von 0,016 bis 0,33 μg/pM vorliegt.
Verwendung eines Komplexes zur Herstellung eines Medikaments um die Tumorangiogenese gemäß Anspruch 1 zu inhibieren, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Liposom vorzugsweise 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin und N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid einschließt und auch Polyethylenglykol umfassen kann, vorzugsweise ein pegyliertes Lipid – 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Polyethylenglykol-2000) und einen gerichteten Liganden, vorzugsweise das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2.
Kationischer Polymer-DNS-Komplex, umfassend die DNS, welche für ein antiangiogenes Peptid kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex zusätzlich DNS umfasst, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, wobei das Tumorsuppressorprotein p53 ist und wobei das antiangiogene Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 3, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 9, SEQ ID Nr.: 11, SEQ ID Nr.: 13, SEQ ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 27 und SEQ ID Nr.: 30.
Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für antiangiogenes Peptid kodiert, in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/µg Polymer vorliegt.
Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, in einer Menge von 0,0025 bis 0,16 µg/pM vorliegt.
Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/pM vorliegt.
Verwendung eines kationischen Polymer-DNS-Komplexes nach Anspruch 7, umfassend DNS, welche für ein antiangiogenes Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Tumorwachstums bei einem Individuum, welche vorzugsweise die Verabreichung desselben an ein von einem Tumor befallenes Individuum umfasst.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex zusätzlich DNS umfasst, welche für ein Tumorsuppressorprotein kodiert.
Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenimin, vorzugsweise Polycat57, Polylysin, Polyhistidin und Superfect und auch Polyethylenglykol und einen gerichteten Liganden umfassen kann, vorzugsweise das Aminosäurepeptid RGD, Ferritin oder Antikörper, gerichtet gegen HER2.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das antiangiogene Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID Nr.: 1, SEQ-ID Nr.: 3, SEQ-ID Nr.: 5, SEQ-ID Nr.: 7, SEQ-ID Nr.: 9, SEQ-ID Nr.: 11, SEQ-ID Nr.: 13, SEQ-ID Nr.: 15, SEQ-ID Nr.: 17, SEQ-ID Nr.: 19, SEQ-ID Nr.: 21, SEQ-ID Nr.: 23, SEQ-ID Nr.: 25, SEQ-ID Nr.: 27 und SEQ-ID Nr.: 30.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein antiangiogenes Peptid kodiert, in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/µg Polymer vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die für ein Tumorsuppressorprotein kodiert, in einer Menge von 0,016 bis 0,33 µg/µg Polymer vorliegt.