JP2001526181A

JP2001526181A - 遺伝子輸送体であるグラフト共重合体

Info

Publication number: JP2001526181A
Application number: JP2000524412A
Authority: JP
Inventors: チョイ，ヨウン−フン; パーク，ジョン・サン
Original assignee: エクスプレション・ジェネティックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2001-12-18
Also published as: KR20010032879A; BR9814273A; IL136679A0; AU1820999A; ZA9811378B; AR013017A1; EP1032659A1; WO1999029839A1

Abstract

(57)【要約】選択された核酸を宿主細胞に輸送するために使われる、非毒性でポリマーである遺伝子キャリアは、多価陽イオン性の主ポリマーとグラフト化した、両親媒性で直鎖状の副ポリマーを有する、グラフト共重合体を含む。多価陽イオン性の主ポリマーは、静電的な相互作用により、核酸と複合体を形成する。両親媒性の副ポリマーは、多価陽イオンの細胞毒性を減少させ、また、溶解性を高める。副ポリマーのモル比は、トランスフェクション効率を最も高くするように調整し得る。同様に、核酸と、共重合体との比も、効率を最高にするように調整し得る。この組成物は、宿主細胞を選択された核酸により形質転換させる方法において使用することができる。ポリエチレングリコールとポリ-L-リジンのグラフト共重合体（PEG-g-PLL）は、特に効果的であり、遺伝子の発現は24時間以内にピークに達し、そして、少なくとも96時間は持続する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明はin vivoの適用に関わる利用のための遺伝子輸送体に関連する。さらに詳しくは、本発明は、選択された核酸と陽イオン性の重合体とが静電気的な複
合体を形成することにより、その核酸を効率的に宿主細胞に輸送する、非毒性の
組成物とその方法に関連する。ポリ-L-リジン（PLL）とポリオキシアルキルグリ
コールとのグラフト共重合体は特に効果的である。

【０００２】遺伝子は、宿主細胞がもつ生合成機構を利用して生理活性をもつタンパク質を
生産することができるため、様々な疾病状態の治療的利用のための非常に魅力的
な候補である（M.S.Wadhwa et al., 6 Bioconjugate Chemistry 283 (1995)）。
カルシウムリン酸沈澱法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、粒子衝撃
法（particle bombardment）、リポソームによる輸送、ウイルスベクター輸送、
及び、受容体を介した遺伝子輸送を含む、遺伝子の細胞内への輸送に関する多数
の確立されたプロトコールが存在する（同上）。これらの全ての方法は培養哺乳
動物細胞への遺伝子輸送に用いることができるが、in vivoの標的細胞に遺伝子を導入するには多くの難点がある。特に、カルシウムリン酸法と多価陽イオン沈
澱は、研究室での実用において、おそらく最も普及している二つの技術である（
PROFECTION Mammalian Transfection Systems, Technical Manual 2 (Promega C
orp., 1990)）；しかしながら、それらは比較的トランスフェクション効率が低いという特徴をもっている（A.V. Kabanov & V.A. Kabanov, 6 Bioconjugate Ch
emistry 7 (1995)）。これらの二つの技術は細胞内にRNA分子を導入するには効果的でないことは明らかであり、in vivoでのトランスフェクションには用いることができない（同上）。

【０００３】レトロウィルスまたはアデノウイルスのベクターを用いたトランスフェクショ
ンの方法（E.Gilboa et al., 4 Biotechniques 504 (1986); M.A. Rosenfeld et
al., 252 Science 431 (1991)）は、これらの限界のいくつかを克服している。
レトロウイルスベクターは、特に、外来遺伝子を、活発に分裂している細胞へ導
入することに首尾よく用いられてきており、その結果安定した形質転換株が得ら
れている（D.G. Miller et al., 10 Mol. Cell Biol. 4239(1990)）。しかしながら、レトロウイルスベクターを用いて宿主細胞のゲノムに遺伝子を挿入する方
法は、そのウイルスの感染経路に依存している。ヒトの遺伝子治療にレトロウイ
ルスの方法を適用することは、内因性ウイルスとの組換え（recombination）の可能性、発癌性作用、及び、免疫学的反応に関する深刻な懸念を引き起こす（A.
V. Kabanob & V.A. Kabanov, 6 Bioconjugate Chemistry 7 (1995); H.M. Temin
, 1 Human Gene Therapy 111 (1990)）。そのような懸念は、人の遺伝子治療へのウイルスベクターの利用を思いとどまらせてきた（D.G. Miller et al., 10 M
ol. Cell Biol. 4239 (1990)）。

【０００４】また一方で、陽イオン性リポソーム（H.M. Temin, 1 Human Gene Therapy 111
(1990)）、または、PLL（G.Y. Wu & C.H. Wu, 263 J. Biol. Chem. 14621 (198
8); E. Wagner et al., 87 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 3410 (1990); H. Farh
ood et al., 1111 Biochem.Biophys. Acta 239 (1992)）などの非ウイルス性の遺伝子輸送機構は、それぞれ独自の欠点を持っている。それらはヒトへの臨床使
用には安全であるとみられるが、典型的な非ウイルス性機構は低いトランスフェ
クション効率を提供するか、もしくは、核酸の沈澱を引き起こす（N.H. Caplen
et al., 1 Nature Medicine 1 (1995)）。現在、LIPOFECTIN（GIBCO/BRLの商標）プロトコールが、この領域で最も信頼性があるとされているが（J.H. Felgene
r et al., Enhanced Gene Delivery and Mechanism Studies with a Novel Seri
es of Cationic Lipid Formulations, 269 J. Biol. Chem.2550 (1994)）、しか
し細胞毒性が高いという不利な点を持っている（H. Farhood et al., 1111 Bioc
him. Biophys. Acta 239 (1992)）。

【０００５】上記の点から見て、安全で、かつ、効率的な遺伝子輸送機構の開発がこの技術
分野において重要な進歩であることは認められるだろう。

【０００６】発明の簡単な概要核酸を細胞内に輸送するための組成物と方法を提供することが、本発明の１つ
の目的である。

【０００７】安全かつ効率的な遺伝子輸送のための組成物と方法を提供することも、本発明
の一つの目的である。

【０００８】外来性のDNAまたはRNAを標的細胞に輸送するための、効率的で非ウイルス性で
ある組成物とその使用方法を提供することが、本発明の別の一つの目的である。

【０００９】 in vitroで遺伝子を標的細胞に輸送する方法を提供することが、本発明のまた
別の一つの目的である。

【００１０】 in vivoで遺伝子を標的細胞に輸送する方法を提供することが、本発明のさらに別の一つの目的である。

【００１１】これら及び、その他の目的は、選択された核酸を標的細胞に輸送するための組
成物を提供することにより示すことができ、ここで組成物は選択された核酸と静
電複合体を形成することにより形作られており、第一の陽イオン性のポリマーと
、第二の両親媒性のポリマーとからなる、生物学的適合性をもつグラフト共重合
体を含んでいる。好ましくは、第一のポリマーは、ポリ(L-リジン)、その誘導体
、及び、それらの混合物からなる群から選択されたメンバーであり、またより好
ましくは、ポリ(L-リジン)である。好ましくは、第二のポリマーは、ポリエチレ
ングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、α-置換ポリ（オキシアルキル）グリコール、ポリ（オキシアルキル）グリコールの共重
合体およびブロック共重合体、及び、その活性化誘導体からなる群から選択され
たメンバーなどの、ポリオキシアルキルグリコールである。ポリエチレングリコ
ールが特に望ましい。本発明の好ましい一態様において、グラフト共重合体は、
ポリ(L-リジン)の一つのε-アミノ基にグラフト化したポリエチレングリコールを含む。グラフト共重合体は、好ましくは、約5モル％から約25モル％のポリエチレングリコールを含み、より好ましくは、10モル％のポリエチレングリコール
を含む。

【００１２】本発明の別の観点では、選択された核酸を宿主細胞に輸送する組成物は、選択
された核酸と、第一の陽イオン性のポリマーと第二の両親媒性のポリマーとを含
む生物学的適合性をもつグラフト共重合体との、静電複合体を含む。本発明の好
ましい一態様において、核酸とグラフト共重合体は、約0.3対10の重量比で存在する。好ましくは、組成物は、効果的な量の、クロロキンといった抗エンドソー
ム作用をもつ薬剤をさらに含む。この効果的な量のクロロキンは、好ましくは、
約25-250μMであり、より好ましくは、約75-150μMである。

【００１３】本発明のさらに別の観点では、宿主細胞を選択された核酸で形質転換する方法
は、選択された核酸と生物学的適合性をもつグラフト共重合体とを含む静電複合
体の効果的な量を、宿主細胞と接触させることを含み、ここで生物学的適合性の
あるグラフト共重合体は、第一の陽イオン性のポリマーと第二の両親媒性のポリ
マーとを含み；宿主細胞が選択された核酸を取り込むようにする。

【００１４】本発明のまたさらに別の観点では、選択された核酸を個体に輸送するために組
成物を使用する方法は、宿主細胞が選択された核酸を取り込むように、複合体が
全身に循環し、宿主細胞と接触するように、第一の陽イオン性のポリマーと第二
の両親媒性のポリマーとを含む、選択された核酸と生物学的適合性をもつグラフ
ト共重合体とを含む、効果的な量の静電複合体を投与することを含む。

【００１５】発明の詳細な説明本組成物と遺伝子輸送のためのその使用方法が開示され、記載される前に、本
発明は、本明細書中に開示された特定の形状（configuration）、処理段階、及び、物質に限定されず、このような形状（configuration）、処理段階、及び、物質は多少変えることができることを理解すべきである。本明細書中で使用され
る用語は、特別な態様のみを記述する目的で用いられており、添付の請求の範囲
、及び、それに相当するものによってのみ本発明の範囲は限定されるため、限定
を意図したものではないこともまた理解すべきである。

【００１６】本明細書中、及び、添付の請求の範囲で使用される場合に、単数形の“a”、 “an”、及び、“the”は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の指示物を含んでいることに注意すべきである。したがって、例えば、“抗
エンドソーム作用を持つ薬剤”という言及には、2またはそれ以上のそのような薬剤の混合物を含み、“両親媒性のポリマー”という言及には、2またはそれ以上のそのようなポリマーの混合物を含み、そして“陽イオン性のポリマー”とい
う言及には、2またはそれ以上のそのような陽イオン性のポリマーの混合物を含む。

【００１７】本発明を記載し、そして請求する際に、以下の用語を以下に記載する定義にし
たがって使用するだろう。

【００１８】本明細書中で使用する場合に、“PEG-g-PLL”とは、PEGまたは他のポリ（オキ
シアルキル）グリコールがPLLのリジン残基のε-アミノ基と結合しているグラフ
ト共重合体のことを意味している。

【００１９】本明細書中で使用する場合に、xが1と100の間の数である“xmol％ PEG-g-PLL ”とは、xモル％のPEGを有するPEG-g-PLLのことをいう。例えば、5 mol％ PEG-g
-PLLは、5モル％のPEGを含有するPEG-g-PLLである。

【００２０】本明細書中で使用する場合に、“ポリ（オキシアルキル）グリコール”は、PL
Lとグラフト化した際に、生成する組成物を非毒性かつ水溶性にする、ポリエーテルグリコールポリマーのことをいう。ポリマーの個々の単量体部分は、約５個
までの炭素原子を有する炭素鎖を含む。好ましいポリ（オキシアルキル）グリコ
ールは、ポリエチレングリコール（PEG）ホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、α-置換ポリ（オキシアルキル）グリコール（例えばメトキシポリエチレングリコール、または、C₁-C₄のアルキル基を含むものなどの、他の適したアルキル置換誘導体）、ポリ（オキシアルキル）グリコール共重合体お
よびブロック共重合体、及び、それらの活性化誘導体が含まれる群から選択され
る。本発明で使用されるポリ（オキシアルキル）グリコールは、好ましくは、分
子量が約200から約50,000であり、より好ましくは約200から約20,000である。特
に好ましいポリ（オキシアルキル）グリコールは、ポリエチレングリコール（PE
G）である。PEGは、安価であり、アメリカ合衆国の食品医薬品局（FDA）によりヒトへの投与が認可されており、また、抗体反応を惹起しにくいため、好ましい
。

【００２１】本明細書中で使用する場合に、“PLL”とは、ポリ（L-リジン）、その誘導体、及び、それらの混合物のことをいう。PLLは、好ましくは、分子量が約200から
50,000の範囲であり、また、より好ましくは、約500から30,000の範囲である。

【００２２】本明細書中で使用する場合に、“効果的な量”とは、非毒性であるが、どのよ
うな医学的治療においても伴う妥当な利点／リスク比で、選択した局所もしくは
全身への効果と、成果を提供するのに十分である、核酸の量を意味する。

【００２３】本明細書中で使用する場合に、“投与”及び、類似した用語とは、輸送すべき
核酸と本発明に記載された遺伝子キャリア組成物とを混合することにより形成さ
れる複合体を、治療する個体に輸送して、複合体が、その複合体が標的細胞と接
触し得る生体内の場所に、全身的に循環することができるようにすることを意味
する。このように、この組成物は、全身投与により、典型的な例では皮下、筋内
、または静脈内投与、または腹腔内投与により、個体に投与することが好ましい
。このように使用するための注射可能物質は、液体溶液または懸濁液として、注
射前に溶液または懸濁液として調製するのに適した個体形状か、または乳濁液か
の、従来からの形状に調製し得る。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノール、その他同種類のものを含み；所望によ
り、湿潤剤または乳化剤、緩衝液、その他同種類のものなどの少量の補助物質を
添加することができる。

【００２４】核酸、即ちDNA及び／またはRNAの輸送は、ポリペプチドの発現を達成すること
、または、“アンチセンス”の核酸、特にアンチセンスRNAを用いてポリペプチドの発現を阻害することに使用できる。本明細書中で使用する場合に、“ポリペ
プチド”とは、どの長さのペプチドをも意味し、また、タンパク質も含む。本明
細書中で使用する“ポリペプチド”という用語は、他に特定のサイズについて記
載がない限り、特に意図した大きさの制限はなく、本明細書中で使用される、発
現し得る典型的なポリペプチドは、オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺
激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成
長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン様増殖因子、インスリン、エリ
スロポエチン、肥満蛋白であるレプチン、ソマトスタチン、グルカゴン、グルカ
ゴン様インスリン刺激因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、ガストリン
、インターロイキン-２及びその他のインターロイキン類とリンフォカイン類、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシト
ニン、エンケファリン、エンドルフィン類、アンギオテンシン類、レニン、ブラ
ジキニン、バシトラシン類、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラ
ミシジン類、及び、それらの合成類似体、改変体、薬学的に活性な断片、モノク
ローナル抗体、及び、ワクチン類からなる群から選択される。このグループには
、限定的なものとは考えられていない；発現されうるペプチドまたはタンパク質
薬剤にとっての唯一の限定は、機能性である。DNA及び／またはRNAの輸送は、遺
伝子治療、予防接種、及び、in vivoに核酸またはポリペプチドが投与されるべき全ての治療状況において有用である。例えば、アメリカ合衆国特許番号5,580,
859が本明細書中で参考文献として援用される。

【００２５】その核酸がDNAである場合、DNA配列そのものは複製することはできないが、複
製開始点をさらに含んでいるプラスミド中に挿入される。そのDNAは、ヒトの体内でも機能するCMV IEPプロモーターなどの転写プロモーターをも含み得る。そのDNAはDNAを転写する(transcribing）ためのポリメラーゼもコードし得る。クローン化した遺伝子を哺乳動物体内において発現させるための、多くの発現ベク
ターがこの技術分野において知られており、このような発現ベクターの多くは、
例えば、pEUK-C1（Clonetech,Palo Alto, Calif.）のように、市販されていて入
手できる。興味のある遺伝子はこの技術分野においてはよく知られている組換え
DNA技術に従って、このような発現ベクターに挿入できる。例えばJ.Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２d ed., 1989））が本明細書中で参考文献として援用される。この方法は、特定のポリペプチドの欠失、または
欠如、または変異に関連した疾病の治療に使用することができる。本発明の別の
観点に従うと、この方法は、ヒトまたは動物であってもよい個体への免疫を提供
し、免疫原に対する免疫応答を惹起する、免疫原性の翻訳産物をコードするDNA 及び／またはRNAの個体への輸送を含む。この方法は体液性免疫、細胞性免疫、または、それらの組合せを惹起するために使用され得る。

【００２６】本発明に記載の遺伝子キャリアを形成する例示的な方法は、ポリマーであるモ
ノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）をPLLのε-アミノ基とグラフト化さ
せることにより、成し遂げられる。直鎖状で、両親媒性のポリマーであるPEGは、in vivoにおいて、多くの酵素を、半減期をより長くさせるように変化させるために使用されてきた（F.F. Davis et al., in 4 Enzyme Engineering 169 (19
78); A. Abuchowski et al., 7 Cancer Biochem. Biophys.175 (1984)）。PEGは
また、インターロイキン-２を、溶解性を高めたり、in vivoにおける半減期を増
加させるように、変化させるためにも使用されてきた（N..V. Katre et al., 84
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 1487 (1987)）。PEGがグラフト化したPLL（PEG-
g-PLL）は輸送されるべき遺伝子と静電複合体を形成する際に、PEG鎖の溶解度を
高める効果により、溶解性の増加を提供する（図１）（A.V. Kabanov et al., 6
Bioconjugate Chemistry 639 (1995)）。添加されたPEG鎖により誘導される溶解性の増加は、プラスミドDNA／PLL複合体と比較すると、PLLの細胞毒性を増加させることなく、トランスフェクション効率に有利に作用する。むしろ、PEG鎖の存在は、PLL塩基の細胞毒性の減少にも作用し、トランスフェクション時間を改善する。静電複合体は、正に荷電したポリマー（例えばPLL）と負に荷電した核酸との親和性により形成される。

【００２７】

【実施例】

実施例１ PEG含量が5mol％、10mol％、及び、25mol％のPEG-g-PLLグラフト共重合体を図
２に概説した手順に従って合成した。塩化チオニル（SOCl₂）、トリエチルアミン（TEA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、及び、メトキシポリエチレングリコール（mPEGOCH₂CH₂OH; MW=550）はAldrich (Milwaukee, Wisconsin) より購入
した。PLL-臭化水素（反復単位120；MW=25000）は、Sigma (St. Louis, Missour
i) より購入した。

【００２８】例えば、5mol％PEG-g-PLLの合成は次に示すように行った。メトキシPEGOCH₂CH ₂ CO₂H はエチルブロモ酢酸を用いてmPEGOCH₂CH₂OH をアルキル化して合成した。
6 mg mPEGOCH₂CH₂CO₂Hを含む丸底フラスコに塩化チオニル（1.5 ml）を加え、40
分還流した後、真空条件下で塩化チオニルを蒸発させた。生成物を100μl DMSO に溶解し、25 mg PLL-臭化水素と160μl TEAをを含む1 ml DMSO溶液に対して、室温で撹拌しながら加えた。30分撹拌後、4 ml脱イオン水を加え、6 N HClでpH
1に合わせた。最後に、生成物を水で透析し、凍結乾燥した。PEG含量は溶媒とし
てD₂Oを使ってH¹-NMRにより決定した（示してはいない）。約3.5 ppmのピークが
、生成物中のmPEGの存在を示した。

【００２９】実施例２プラスミドpSV-β-gal（Promega Corp., Madison, Wisconsin; EMBL受託番号
X65335）は哺乳動物細胞へのトランスフェクション効率をモニターする陽性対照
ベクターである。プラスミドpSV-β-galはSV40の初期プロモーターとエンハンサ
ー配列、転写開始位置、β-ガラクトシダーゼをコードしている大腸菌lacZコーディング領域、及び、SV40スモールT抗原ポリアデニル化シグナルを含んでいる。SV40の初期プロモーターとエンハンサーはlacZ遺伝子の転写を駆動している。

【００３０】等量のプラスミドDNAと臭化エチジウム（各1μg）を20 mM HEPES（N-[2-ハイドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]）と0.15 M NaClを含む緩
衝液（pH7.4）1 mlに入れた。実施例１の手順に従って調製した、異なる量のPEG
-g-PLLをプラスミドDNA-臭化エチジウム混合物に加えた。この混合物の蛍光強度
を蛍光分光光度計（PCl, ISS Co., USA）（λ_ex =516 nm,λ_ex =590 nm）で測定
した。図３は蛍光消光アッセイの結果を示している。これらのデータはPEG-g-PL
LがプラスミドDNAを55％に濃縮したことを示している。PLLのプラスミドDNAの濃
縮力は、PLLと、PEGで修飾したPLLの誘導体の比較において、ほとんど差が認められなかった。

【００３１】実施例３この実施例では、PEG-g-PLLがDNAと複合体を形成しているかどうかを決定する
ためにゲル遅延アッセイを行った。実施例２で調製したpSV-β-galとPEG-g-PLL の混合物を1％アガロースゲルで電気泳動し、分画した。分画後、ゲルをエチジウムブロマイド（0.5μg/ml）で染色し、UVイルミネーターで発行させた。遊離のプラスミドDNAの移動度（示してはいない）は、複合体を形成しているPEG-g-P
LLの量が増加するに従って、遅延した。これらの結果はPEG-g-PLLがプラスミドD
NAと安定な複合体を形成したことを示している。完全な遅延はプラスミドDNA対P
EG-g-PLLの重量比が1：1及び、それ以上のときに達成された。

【００３２】実施例４この実施例では、実施例２の手順に従って調製したプラスミドDNA/PEG-g-PLL 複合体の大きさを、90度の角度で、プラスミドDNA対PEG-g-PLLの重量比１：３を
用いて、動的レーザー光散乱（Brookhaven BI-DS）により測定した。データは、
累積分析により解析した。図４はプラスミドのみの大きさと、異なる化合物との
複合体の大きさを示した。複合体の平均直径は約300 nmである。

【００３３】実施例５この実施例では、本発明に記載された組成物が、in vitroの哺乳動物細胞への
トランスフェクションを媒介するための効率を立証した。HepG2細胞（ヒト肝臓癌腫細胞）はthe American Type Culture Collection (Rockville, MD; ATCC受託番号 8065-HB)より入手した。PEG-g-PLLを用い、96穴プレートに20×10⁴cell
s/mlの濃度で細胞を播いてトランスフェクションを行った。プラスミドpSV-β-g
al DNA/PEG-g-PLL複合体は、1μgプラスミドDNAと3μg PEG-g-PLLを100μl無血清MEM培地に混合し室温で30分インキュベートして調製し、続いて10％(V/V) ウシ胎児血清（Hyclone Laboratories, Logan, Utah）と100μMクロロキン（Sigma
）を添加した。細胞浸透性の塩基であるクロロキンを使用して、部分的に細胞の
酸性の区画（compartments）を中和し、エンドソームとリソソームの融合を防ぐ
ことができた（P. Midoux et al., 21 Nucleic Acids Research 871-78（1993）
）。96穴プレートのそれぞれのウェルの培地をトランスフェクション混合液に交
換した。組織培養インキュベーター（Napco Co.）で37℃、5％CO₂において、細胞を４時間培養した。トランスフェクション混合液を取り除き、10％ウシ胎児血
清を含む新しい培養培地を各ウェルに加えた。さらに44時間、組織培養インキュ
ベーターで37℃、5％CO₂において、細胞を培養した。

【００３４】トランスフェクションされた細胞のin situ X-gal（5-クロロ-4-ブロモ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）染色は、発現されたβ-ガラクトシダーゼの検出に用いられた（J.R. Sanes et al., 5 EMBO J. 3133 (1986)）。96穴プレ
ートの各ウェルの細胞は、1×リン酸緩衝溶液（PBS）により２回洗浄し、100μl
の0.25％(v/v)グルタルアルデヒドにより室温で15分間固定した。グルタルアルデヒド溶液を取り除き、細胞を１×PBSでゆるやかに３回リンスした。次に、60 μlのX-gal溶液（1 mg/ml X-gal、2 mM MgCl₂、5 mM K₄Fe(CN)₆、及び、5 mM K₃ Fe(CN)₆）を加え、続いて、組織培養インキュベーターで37℃、16時間インキュベートした。X-gal溶液を取り除き、細胞を１×PBSで覆った。pSV-β-galプラス
ミドのトランスフェクション由来のβ-ガラクトシダーゼ酵素を発現している細胞は、X-galにより青く染色され、顕微鏡で観察し、数えることができた。

【００３５】図５に示した通り、トランスフェクション効率は、PEGによる修飾の程度が増加するにつれて、30倍まで増加した。試行された３つの程度の置換物の中で、10
mol％PEG-g-PLLが最も高いトランスフェクション効率を示した。25 mol％PEG-g
-PLLはかなり低いトランスフェクション効率を示した。このように、PLLへのPEG
修飾の最適な範囲は、約10 mol％であるとみられた。市販されており入手できる
トランスフェクション試薬である、LIPOFECTIN試薬（GIBCO/BRL）は、HepG2細胞
において、10 mol％PEG-g-PLLよりも、わずかに高いトランスフェクション効率を示した。LIPOFECTIN試薬は、膜を透過させた水中の、陽イオン性脂質であるN-
[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-n,n,n-塩化トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）とジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（DOPE）の1：1(w/
w)のリポソーム製剤である。

【００３６】実施例６この実施例では、一定量のプラスミドDNA（10μg/ml）と徐々に増加する量の1
0 mol％PEG-g-PLL（1-50μg/ml）を用いて種々の複合体を調製した。これらの複
合体は、次に、実施例５に示した手順に従って、HepG2細胞へのトランスフェクションに用いられた。図６に示す通り、トランスフェクション効率は、PEG-g-PL
L対プラスミドDNAの重量比が３：１にまで増加するにつれて増加した。さらに高
いPEG-g-PLL対プラスミドDNAの重量比においては、トランスフェクション効率は
減少した。

【００３７】実施例７この実施例では、PEG-g-PLLの細胞毒性が決定された。生細胞の割合はMTT（3-
[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-臭化ジフェニルテトラゾリウム）アッセ
イ（本明細書中に参考文献として援用するT. Mosman, 65 J. Immunol. Methods
55 (1983)）により決定した。

【００３８】実施例５に記載したトランスフェクション実験の最後に、トランスフェクショ
ン混合液を、26μlの2 mg/ml MTT溶液を含む新しい培養培地に置換した。プレー
トを組織培養インキュベーターにおいて、37℃で、さらに４時間インキュベート
し、その後、MTTを含む培地を吸引により除去し、150μlのDMSOを加えて、生細胞により形成されたホルマザン結晶を溶解した。マイクロプレートリーダー（Mo
del EL311, Bio-Tek instrument Co.）を使用して570nmでの吸光度を測定し、生
細胞の割合を以下の方程式から計算した：

【００３９】

【数１】

【００４０】図７に示す通り、HepG2細胞に対して、LIPOFECTIN試薬またはPLLが、中程度に
高い細胞毒性を示したのに対し、5 mol％、及び、10 mol％で修飾されたPEG-g-P
LLの両方は、非常に軽い細胞毒性を示した。25 mol％置換PEG-g-PLLは、5 mol％
または10 mol％置換PEG-g-PLLより低い細胞生存率を示したが、その細胞毒性は、LIPOFECTINまたはPLLのどちらよりもまだ低かった。そのため、本発明の組成物は、細胞毒性に関しては、知られていた物質にまさった改良物である。

【００４１】実施例８この実施例では、細胞生存率アッセイを、トランスフェクション後、24、48、
72、または、96時間に行われたことを除いては、実施例７の手順に従った。一般
に、トランスフェクションアッセイはトランスフェクション後48時間に行われる
が、24時間のみインキュベーションした後にアッセイを行った場合に、それと同
様のトランスフェクション効率が得られた（図８）。LIPOFECTIN試薬の場合には
、24時間インキュベーション後のβ-ガラクトシダーゼ活性は、48時間インキュベーション後のβ-ガラクトシダーゼ活性の半分だった（データは示していない）。さらに、プラスミドpSV-β-gal DNA/PEG-g-PLL混合液によりトランスフェク
ションした細胞ではその遺伝子発現レベルは96時間まで維持された（図８）。

【００４２】実施例９この実施例では、トランスフェクション効率におけるクロロキンの役割を決定
した。クロロキン濃度を0-100 μMに変化させたことを除いては、実施例５の手順に従った。図９は、細胞に首尾よくトランスフェクションするためにクロロキ
ンが必要不可欠ではないことを示しているが、しかしクロロキンはトランスフェ
クション効率を増加させる点で重要な役割を果たしている。クロロキン濃度を10
0 μMまで増加させるたところ、トランスフェクション効率は30倍まで増加した。

【００４３】実施例10 この実施例では、in vivoにおいて個体に遺伝子を輸送する方法を説明している。レプチン肥満タンパク質をコードする核酸、例えばヒトレプチン、またはラ
ットレプチンcDNA（本明細書中で参考文献として援用される、C.Guoxun et al.,
Disappearance of Body Fat in Normal Rats Induced by Adenovirus-medieted
Leptin, 93 Proc. Nat'l Acad. Sci USA 14795-99（1996））またはマウスレプ
チンcDNA（本明細書中で参考文献として援用される、P.Muzzin et al., Correct
ion of Obesty and Diabetes in Genetically Cloned Mice by Leptin Gene The
rapy, 93 Proc. Nat'l Acad. Sci USA 14804-14808）は、この技術分野において
よく知られている。哺乳動物の発現ベクターである、pEUK-C1（Clonetech, Palo
Alto, Calif.）はクローニングされたされた遺伝子を一過性に発現するように設計されている。このベクターは、4.9kbのプラスミドであり、細菌における増殖のため、pBR322複製開始点、及び、アンピシリン耐性マーカーを含んでおり、
そして哺乳動物細胞における選択された遺伝子の複製及び発現のため、SV40複製
開始点、SV40後期プロモーター、及び、SV40後期ポリアデニル化シグナルもまた
、含んでいる。SV40後期プロモーターとSV40後期ポリアデニル化シグナルの間に
、独特のXho I、Xba I、Sma I、sac I、及びBam HI制限酵素サイトである、マル
チクローニングサイト（MCS）が位置する。MCSにクローニングされたDNA断片は、SV40後期プロモーターからRNAとして転写され、クローニングされた断片中の１番目のATGコドンから翻訳される。クローニングされたDNAの転写産物はSV40 V
PIプロセッシングシグナルを使って、スプライシングされ、また、ポリアデニル
化される。レプチン遺伝子は、この技術分野では良く知られた技術を使って、pE
UK-C1のMCSにクローニングされる（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989)）。得られたプラスミドは、実施例２で説明した本発明に従って、複合体に組み込まれた後、ヒトまたは動物に輸
送される。

【００４４】効果的な量の得られた複合体が個体に全身投与され、複合体が血流に入り標的
細胞に接触するようにする。複合体が接触する標的細胞は、複合体を取り込み、
その結果レプチンDNAを取り込む。その後、レプチンDNAは、レシピエント細胞中
で発現され、肥満や糖尿病の治療に陽性の効果をもたらす。

【００４５】本発明の組成物は、PLLにより得られるものより改善されたトランスフェクション能力を提供する。本組成物はまた、低い細胞毒性、早期の遺伝子発現、及び
、早期遺伝子発現レベルの96時間までの維持をも明らかにした。これらの特徴は
、LIPOFECTIN試薬といった先行技術の化合物にまさる利点である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドDNAと本発明による実例となる遺伝子輸送組成物との複合体形成の概要図である。

【図２】図２は、本発明によるグラフト共重合体であるPEG-g-PLLの実例となる合成の概要を示している。

【図３】図３は、蛍光消光アッセイによるデータを示している。（□）PLL
対照、（◇）5モル％PEG-g-PLL、（）10モル％PEG-g-PLL、（△）25モル％PEG -g-PLL

【図４】図４は、pSV-β-gal（DNA）、pSV-β-galとPLLとの複合体（PLL）、pSV-β-galと5モル％PEG-g-PLLとの複合体（5mol％PEG）、pSV-β-galと10モル％PEG-g-PLLとの複合体（10mol％PEG）、及び、pSV-β-galと25モル％PEG-g-P
LLとの複合体（25mol％PEG）の動的レーザー光散乱による大きさ（直径）の測定
値を示している。

【図５】図５は、LIPOFECTIN試薬（Lipofectin）、PLL複合体（PLL）、5モル％PEG-g-PLL複合体（5mol％PEG）、10モル％ PEG-g-PLL複合体（10mol％PEG）
、及び、25モル％PEG-g-PLL複合体（25mol％PEG）を使用した、ヒト肝臓癌腫（H
epG2）細胞へのpSV-β-galのトランスフェクションに関するトランスフェクショ
ン効率を示している。

【図６】図６は、DNA対PEG-g-PLLの重量比の違いによるヒト肝臓癌腫（HepG
2）細胞へのトランスフェクション効率を示している。

【図７】図７は、対照（培地）、LIPOFECTIN試薬（Lipofectin）、PLL（PLL
）、5モル％PEG-g-PLL複合体（5mol％PEG）、10モル％ PEG-g-PLL複合体（10mol
％PEG）、及び、25モル％PEG-g-PLL複合体（25mol％ PEG）を使用して、pSV-β-
galをトランスフェクション後のヒト肝臓癌腫HepG2細胞の細胞生存率を示してい
る。

【図８】図８は10モル％PEG-g-PLL複合体を使用して、ヒト肝臓癌腫HepG2細
胞にpSV-β-galを導入した際の、トランスフェクション後24、48、72、及び、96
時間のトランスフェクション効率を示している。

【図９】図９は10モル％PEG-g-PLL複合体を使用したヒト肝臓癌腫HepG2細胞
へのpSV-β-galのトランスフェクションにおけるクロロキン濃度の作用を示して
いる。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年６月２０日（２０００．６．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４７】複合体が全身に循環して宿主細胞と接触し、その結果宿主
細胞が選択された核酸を取り込むように、選択された核酸と、第一の陽イオン性
のポリマーと第二の両親媒性のポリマーとを含む生物学的適合性をもつグラフト
共重合体とを含む、効果的な量の静電複合体を投与することを含む、選択された
核酸を個体に輸送するための組成物を使用する方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA11 DA02 EA04 GA11 HA17 4C076 AA18 CC29 EE23 EE41 FF67 FF68 4C084 AA13 AA19 MA24 NA10 ZB212 ZB382 ZC191 ZC192 4C086 AA01 AA02 BC28 EA16 MA03 MA05 MA24 ZC19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一の陽イオン性の重合体と第二の両親媒性の重合体を含む
、生物学的適合性をもつグラフト共重合体を含む、選択された核酸との静電複合
体を形成することにより形作られる組成物である、前記選択された核酸を標的細
胞に輸送するための前記組成物。
【請求項２】前記第一の重合体が、ポリ（L-リジン）、その誘導体、及び
、それらの混合物からなる群から選択されたメンバーである、請求項１の組成物
。
【請求項３】前記第一の重合体が、ポリ（L-リジン）である、請求項２の
組成物。
【請求項４】前記ポリ（L-リジン）が、約200から50,000の分子量を有する、請求項３の組成物。
【請求項５】前記第二の重合体が、ポリオキシアルキルグリコールである
、請求項１の組成物。
【請求項６】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリコ
ールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、α-置換ポリ（オキシアルキル）グリコール、ポリ（オキシアルキル）グリコール共重合体および
ブロック共重合体、及び、それらの活性化誘導体からなる群から選択されたメン
バーである、請求項５の組成物。
【請求項７】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約50,000 の分子量を有する、請求項６の組成物。
【請求項８】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約20,000 の分子量を有する、請求項７の組成物。
【請求項９】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリコ
ールである、請求項６の組成物。
【請求項１０】前記グラフト共重合体が、ポリ（L-リジン）のε-アミノ基とグラフト化しているポリエチレングリコールを含む、請求項１の組成物。
【請求項１１】前記グラフト共重合体が、約5モル％から約25モル％のポリエチレングリコールを含む、請求項10の組成物。
【請求項１２】前記グラフト共重合体が、約10モル％のポリエチレングリ
コールを含む、請求項11の組成物。
【請求項１３】選択された核酸と、第一の陽イオン性のポリマーと第二の
両親媒性のポリマーとを含む生物学的適合性をもつグラフト共重合体との静電複
合体を含む、選択された核酸を宿主細胞に輸送するための組成物。
【請求項１４】前記第一の重合体が、ポリ（L-リジン）、その誘導体、及
び、それらの混合物からなる群から選択されたメンバーである、請求項13の組成
物。
【請求項１５】前記第一の重合体が、ポリ（L-リジン）である、請求項14
の組成物。
【請求項１６】前記ポリ（L-リジン）が、約200から50,000の分子量を有する、請求項15の組成物。
【請求項１７】前記第二の重合体が、ポリオキシアルキルグリコールであ
る請求項13の組成物。
【請求項１８】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリ
コールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、α-置換ポリ（オキシアルキル）グリコール、ポリ（オキシアルキル）グリコール共重合体およ
びブロック共重合体、及び、それらの活性化誘導体からなる群から選択されたメ
ンバーである、請求項17の組成物。
【請求項１９】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約50,00
0の分子量を有する、請求項18の組成物。
【請求項２０】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約20,00
0の分子量を有する、請求項19の組成物。
【請求項２１】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリ
コールである、請求項18の組成物。
【請求項２２】前記グラフト共重合体が、ポリ（L-リジン）のε-アミノ基とグラフト化しているポリエチレングリコールを含む、請求項13の組成物。
【請求項２３】前記グラフト共重合体が、約5モル％から約25モル％のポリエチレングリコールを含む、請求項22の組成物。
【請求項２４】前記グラフト共重合体が、約10モル％のポリエチレングリ
コールを含む、請求項23の組成物。
【請求項２５】前記核酸と前記グラフト共重合体が、重量比約0.3対10で存在している、請求項13の組成物。
【請求項２６】効果的な量の抗エンドソーム作用をもつ薬剤をさらに含む
、請求項13の組成物。
【請求項２７】前記抗エンドソーム作用をもつ薬剤が、効果的な量のクロ
ロキンを含む、請求項26の組成物。
【請求項２８】前記効果的な量のクロロキンが、約25-250μMである、請求項27の組成物。
【請求項２９】前記効果的な量のクロロキンが、約75-150μMである、請求項28の組成物。
【請求項３０】宿主細胞が選択された核酸を取り込むように、選択された
核酸と、第一の陽イオン性のポリマーと第二の両親媒性のポリマーである生物学
的適合性をもつグラフト共重合体とを含む、効果的な量の静電複合体と宿主細胞
を接触させることを含む、前記選択された核酸により前記宿主細胞を形質転換す
る方法。
【請求項３１】前記第一のポリマーが、ポリ（L-リジン）、その誘導体、
及び、それらの混合物からなる群から選択されたメンバーである、請求項30の方
法。
【請求項３２】前記第一の重合体が、ポリ（L-リジン）である、請求項31
の方法。
【請求項３３】前記ポリ（L-リジン）が、約200から50,000の分子量を有する、請求項32の方法。
【請求項３４】前記第二の重合体が、ポリオキシアルキルグリコールであ
る請求項30の方法。
【請求項３５】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリ
コールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、α-置換ポリ（オキシアルキル）グリコール、ポリ（オキシアルキル）グリコール共重合体およ
びブロック共重合体、及び、それらの活性化誘導体からなる群から選択されたメ
ンバーである、請求項34の方法。
【請求項３６】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約50,00
0の分子量を有する、請求項35の方法。
【請求項３７】前記ポリオキシアルキルグリコールが、約200から約20,00
0の分子量を有する、請求項36の方法。
【請求項３８】前記ポリオキシアルキルグリコールが、ポリエチレングリ
コールである、請求項35の方法。
【請求項３９】前記グラフト共重合体が、ポリ（L-リジン）のε-アミノ基とグラフト化しているポリエチレングリコールを含む、請求項30の方法。
【請求項４０】前記グラフト共重合体が、約5モル％から約25モル％のポリエチレングリコールを含む、請求項39の方法。
【請求項４１】前記グラフト共重合体が、約10モル％のポリエチレングリ
コールを含む、請求項40の方法。
【請求項４２】前記核酸と前記グラフト共重合体が、重量比約0.3対10で存在している、請求項30の方法。
【請求項４３】効果的な量の抗エンドソーム作用をもつ薬剤をさらに含む
、請求項30の方法。
【請求項４４】前記抗エンドソーム作用をもつ薬剤が、効果的な量のクロ
ロキンを含む、請求項43の方法。
【請求項４５】前記効果的な量のクロロキンが、約25-250μMである、請求項44の方法。
【請求項４６】前記効果的な量のクロロキンが、約75-150μMである、請求項45の方法。
【請求項４７】複合体が全身に循環して宿主細胞と接触し、その結果宿主
細胞が選択された核酸を取り込むように、選択された核酸と、第一の陽イオン性
のポリマーと第二の両親媒性のポリマーとを含む生物学的適合性をもつグラフト
共重合体とを含む、効果的な量の静電複合体を投与することを含む、選択された
核酸を個体に輸送するための組成物を使用する方法。