KR20010032879A

KR20010032879A - 유전자 담체로서 융합된 공중합체

Info

Publication number: KR20010032879A
Application number: KR1020007006209A
Authority: KR
Inventors: 영훈 최; 종상 박
Original assignee: 익스프레션 제네틱스, 인코퍼레이티드
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2001-04-25
Also published as: BR9814273A; IL136679A0; JP2001526181A; AU1820999A; ZA9811378B; AR013017A1; EP1032659A1; WO1999029839A1

Abstract

선택된 핵산을 숙주로 전달하는데 사용하는 비-독성, 다인자 유전자 담체는 다가양이온 주(主)중합체에 융합된 직쇄 양친화성 부(副)중합체를 갖는 융합된 공중합체로 이루어진다. 양친화성 주중합체는 정전(靜電)상호작용으로 핵산과 복합체를 형성한다. 양친화성 부중합체는 다가양이온의 독성을 감소시키고, 용해성을 증가시킨다. 부중합체의 몰비율을 조절하여 트랜스펙션 효율을 최적화시킨다. 유사하게, 핵산 대 공중합체의 비율을 조절하여 효율을 최적화시킨다. 상기 조성물은 선택된 핵산으로 숙주세포를 형질전환시키기 위한 방법에 사용한다. 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리-L-리신(PEG-g-PLL)의 융합된 공중합체는 특히 효율적이어서, 24시간이내에 최대 유전자 발현을 얻을 수 있고, 상기 발현은 96시간이상 지속된다.

Description

유전자 담체로서 융합된 공중합체{GRAFTED COPOLYMERS AS GENE CARRIERS}

유전자는 다양한 질병상에서 치료용도의 매력적인 후보가 되는데, 그 이유는 이들이 숙주세포에 의해 제공된 생합성 기구를 이용하여 생리활성 단백질을 만들 수 있기 때문이다(M.S. Wadhwa et al., 6 Bioconjugate Chemistry 283 (1995)). 유전자를 세포로 전달하는 많은 기존의 프로토콜이 있는데, 이런 프로토콜에는 칼슘 인산염 침전, 에렉트로포레이션, 입자충격, 리포좀 전달, 바이러스-벡터 전달, 수용체-매개의 유전자전달이 포함된다. 비록, 이들 방법은 유전자를 배양된 포유동물세포로 전달하는데 사용할 수 있지만, 유전자를 생체내 표적세포로 전달하는 데에는 많은 어려움이 따른다. 특히, 칼슘 인산염 침전과 다가양이온 침전은 실험실에서 가장 많이 사용되고 있는 기술이다(PROFECTION Mammalian Transfection Systems, Technical Manual 2 (Promega Corp., 1990)); 하지만, 이들은 상대적으로 트랜스펙션 효율이 낮다(A.V. Kabanov ＆ V.A. Kabanov, 6 Bioconjugate Chemistry 7 (1995)). 이들 두 기술은 RNA 분자를 세포로 전달하는데 비효율적이어서, 생체내 트랜스펙션에 사용할 수 없다.

레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 이용한 트랜스펙션 방법(E. Gilboa et al., 4 Biotechniques 504 (1986); M.A. Rosenfeld et al., 252 Science 431 (1991))은 이런 단점중 일부를 극복한다. 특히, 레트로바이러스는 활발하게 분할하는 세포의 게놈으로 외인성 유전자를 도입하여 안정적인 형질전환체를 얻는데 성공적으로 사용하여 왔다(D.G. Miller et al., 10 Mol. CellBiol. 4239 (1990)). 하지만, 유전자를 숙주세포게놈으로 삽입하기 위하여, 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법은 바이러스 감염 경로에 의존한다. 사람유전자치료법에 레트로바이러스 방법을 적용하는 경우, 외인성 바이러스와의 재조합가능성, 종양유전자 효과, 면역반응에 관한 심각한 우려가 제기된다(A.V. Kabanov ＆ V.A. Kabanov, 6 Bioconjugate Chemistry 7 (1995); H.M. Temin, 1 Human Gene Therapy 111 (1990)). 이런 우려로 인해, 사람 유전자 치료법에 바이러스 벡터를 사용하는 것은 환영을 받지 못하고 있다(D.G. Miller et al., 10 Mol. Cell Biol. 4239 (1990)).

다른 한편으로, 비-바이러스 유전자 전달계(예, 양이온 리포좀)(H.M. Temin, 1 Human Gene Therapy 111 (1990), or PLL, G.Y. Wu ＆ C.H. Wu, 263 J. Biol. Chem. 14621 (1988); E. Wagner et al., 87 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 3410 (1990); H. Farhood et al., 1111 Biochem. Biophys. Acta 239 (1992)) 또한, 단점을 갖고 있다. 비록 이들이 사람의 임상용도에서 안정한 것으로 보이지만, 일반적인 비-바이러스계는 트랜스펙션 효율이 낮거나 또는 핵산의 침강을 유발한다(N.H. Caplen et al., 1 Nature Medicine 1 (1995)). 현재, 리포펙틴(LIPOFECTIN) (GIBCO/BRL의 상표)프로토콜은 이런 카테고리에서 가장 믿을만한 것으로 보인다(J.H. Felgner et al., Enhanced Gene Delivery and Mechanism Studies with a Novel Series of Cationic Lipid Formulations, 269 J. Biol. Chem. 2550 (1994)), 하지만, 이것은 세포 독성이 높다는 단점을 갖는다(H. Farhood et al., 1111 Biochim. Biophys. Acta 239 (1992)).

전술한 것에 비추어, 안전하고 효율적인 유전자 전달계의 개발은 당분야에 상당한 도움이 될 것으로 생각된다.

본 발명의 간단한 설명

본 발명의 목적은 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 안전하고 효율적인 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 외인성 DNA 또는 RNA의 표적세포로의 전달에 사용하기 위한 효율적인 비-바이러스 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자를 시험관내 표적세포로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자를 생체내 표적세포로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

이런 목적은 선택된 핵산을 표적세포로 전달하기 위한 조성물을 제공하여 해결할 수 있는데, 여기서 상기 조성물은 선택된 핵산과 정전(靜電)복합체를 형성하고, 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어진다. 바람직하게는, 제 1 중합체는 폴리(L-리신), 이의 유도체, 이의 혼합물에서 선택되고, 좀더 바람직하게는 폴리(L-리신)이 된다. 바람직하게는, 제 2 중합체는 폴리옥시알킬 글리콜이 되는데, 이들은 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 알파-치환된 폴리(옥시알킬)글리콜, 폴리(옥시알킬)글리콜 공중합체 및 블록 공중합체, 활성화된 이들의 유도체에서 선택된다. 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 이식편 공중합체는 폴리(L-리신)의 ε-아미노기와 융합된 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진다. 이식편 공중합체는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 5몰% 내지 25 몰%로 이루어지고, 좀더 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 10몰%로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 선택된 핵산을 숙주세포로 전달하기 위한 조성물은 선택된 핵산과 생리상보성 이식편 공중합체의 정전복합체로 이루어지고, 상기 생리상보성 이식편 공중합체는 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어진다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 핵산 및 이식편 공중합체는 0.3 내지 10의 중량비로 존재한다. 가급적, 조성물은 항-엔도좀 기능작용제(예, 클로로퀸)의 효과량으로 이루어진다. 클로로퀸의 효과량은 바람직하게는 25-250μM이고, 좀더 바람직하게는 75-150μM이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 선택된 핵산으로 숙주세포를 형질전환시키는 방법은 정전복합체의 효과량으로 숙주세포를 접촉시키는 것으로 이루어지고, 상기 정전복합체는 선택된 핵산과 생리상보성 이식편 공중합체로 이루어지는데, 여기서, 생리상보성 이식편 공중합체는 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어지고, 상기 숙주세포는 선택된 핵산을 흡수하게 된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 선택된 핵산을 개체에 전달하기 위한 조성물을 이용하는 방법은 정전(靜電)복합체의 효과량을 투여하는 것으로 이루어지고, 상기 정전복합체는 선택된 핵산 및 생리상보성 이식편 공중합체로 이루어지고, 상기 생리상보성 이식편 공중합체는 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어지고, 상기 복합체는 전신순환하여 숙주세포에 접촉하고, 상기 숙주세포는 상기 선택된 핵산을 흡수하게 된다.

본 발명은 생체내 용도와 관련하여 사용하기 위한 유전자 담체에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 핵산과 양이온 중합체와의 정전복합체를 구성하여, 선택된 핵산을 숙주세포로 효과적으로 전달하기 위한 비-독성 조성물 및 방법에 관한다. 폴리-L-리신(PLL)과 폴리옥시알킬 글리콜의 이식편 공중합체가 특히 효과적이다.

도1은 플라스미드 DNA 및 본 발명에 따른 유전자 전달 조성물사이의 복합체형성을 보여주는 개요도이다.

도2는 본 발명에 따른 융합된 공중합체인 PEG-g-PLL의 합성 개요를 보여준다.

도3은 형광 담금질 분석에서 얻은 자료를 보여준다: (□)PLL 컨트롤; (◇) 5 몰% PEG-g-PLL; (Ｏ) 10 몰% PEG-g-PLL; (△) 25 몰% PEG-g-PLL.

도4는 pSV-β-gal(DNA), pSV-β-gal와 PLL(PLL)의 복합체, pSV-β-gal와 5 몰% PEG-g-PLL(5 몰% PEG)의 복합체, pSV-β-gal와 10몰% PEG-g-PLL(10 몰% PEG)의 복합체, pSV-β-gal와 25몰% PEG-g-PLL(25 몰% PEG)의 복합체의 동적 레이저광 분산에 의한 크기(직경)결정을 보여준다.

도5는 리포펙틴(LIPOFECTIN) 시약(Lipofectin), PLL 복합체(PLL), 5몰% PEG-g-PLL 복합체(5몰% PEG), 10몰% PEG-g-PLL 복합체(10몰% PEG), 25몰% PEG-g-PLL 복합체(25몰% PEG)를 이용하여 pSV-β-gal로 사람 간암(종)세포(HepG2)를 트랜스펙션하는 경우의 트랜스펙션 효율을 보여준다.

도6은 DNA 대 PEF-g-PLL의 중량비 함수로 사람 간암(종)(HepG2)세포의 트랜스펙션 효율을 보여준다.

도7은 컨트롤 배지, 리포펙틴(LIPOFECTIN) 시약(Lipofectin), PLL 복합체(PLL), 5몰% PEG-g-PLL 복합체(5몰% PEG), 10몰% PEG-g-PLL 복합체(10몰% PEG), 25몰% PEG-g-PLL 복합체(25몰% PEG)를 이용하여 pSV-β-gal로 사람 간암(종) (HepG2)세포를 트랜스펙션하는 경우의 세포생존율을 보여준다.

도8은 트랜스펙션 24, 48, 72, 96시간 후, 10몰% PEG-g-PLL 복합체를 이용하여 pSV-β-gal로 실시한 사람 간암(종)HepG2 세포의 트랜스펙션 효율을 보여준다.

도9는 10몰% PEG-g-PLL 복합체를 이용하여 pSV-β-gal로 실시한 사람 간암(종)HepG2 세포의 트랜스펙션에 대한 클로로퀸 농도의 효과를 보여준다

유전자전달에 이용하기 위한 본 조성물 및 방법을 밝히기에 앞서, 본 발명은 이 글에서 밝힌 특정 구조, 처리단계, 물질에 한정하지 않는데, 그 이유는 이런 구조, 처리단계, 물질은 어느 정도 바꿀 수 있기 때문이다. 이 글에서 이용한 전문용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이지 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용한 바와 같이, 단수형 "어(a)," "언(an)," "더(the)"는 문장내에서 구체적으로 지시하기 전까지, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 가령, "항-엔도좀 기능작용제"에 대한 참고대상에는 두 개이상의 이런 작용제의 혼합물이 포함되고, "양친화성 중합체"에 대한 참고대상에는 하나이상의 이런 중합체가 포함되고, "양이온 중합체"에 대한 참고대상에는 두 개이상의 이런 양이온 중합체의 혼합물이 포함된다.

본 발명을 설명하고 주장함에 있어, 다음의 전문용어는 아래에 제시한 정의에 따른다.

이 글에서, "PEG-g-PLL"은 PEG 또는 다른 폴리(옥시알킬)글리콜이 PLL 리신 잔기의 ε-아미노기와 융합된 융합공중합체를 의미한다.

이 글에서, "x몰% PEG-g-PLL,"(x는 1 내지 100)은 x몰%의 PEG를 갖는 PEG-g-PLL를 의미한다. 가령, 5몰% PEG-g-PLL은 5몰% PEG를 함유한 PEG-g-PLL이다.

이 글에서, "폴리(옥시알킬)글리콜"은 PLL과 융합하여 생성 조성물을 비-독성과 수용성이 되게 하는 폴리에테르 글리콜 중합체를 의미한다. 중합체의 각 단량체 영역은 최대 5개의 탄소원자를 갖는 탄소사슬을 보유한다. 적절한 폴리(옥시알킬)글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 알파-치환된 폴리(옥시알킬)글리콜(예, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 또는 C₁-C₄알킬기를 보유한 것들과 같은 다른 적당한 알킬-치환된 유도체), 폴리(옥시알킬)글리콜 공중합체 및 블록 공중합체, 활성화된 이들의 유도체에서 선택된다. 본 발명에 사용한 폴리(옥시알킬)글리콜은 바람직하게는 200 내지 50,000의 분자량을 갖고, 좀더 바람직하게는 200 내지 20,000의 분자량을 갖는다. 특히 선호되는 폴리(옥시알킬)글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. PEG는 저렴하고, 미국 식품의약국에서 인체투여용으로 승인한 것으로, 항체반응 유도에 저항성을 나타내기 때문에 자주 사용된다.

이 글에서, "PLL"은 폴리(L-리신), 이의 유도체, 이의 혼합물을 의미한다. PLL은 바람직하게는 200 내지 50,000의 분자량을 갖고, 좀더 바람직하게는 500 내지 30,000의 분자량을 갖는다.

이 글에서, "효과량"은 비-독성이면서도 핵산을 선택된 국소성 또는 전신효과 및 효능을 제공할 수 있는 핵산의 일정량을 의미하는데, 이때, 임의의 의료치료에 수반되는 이익/위험 비율은 적당하다.

이 글에서 "투여" 및 유사한 용어는 치료할 개체에 본 발명에 따른 유전자 담체 조성물과 전달할 핵산을 혼합하여 만들어지는 복합체를 전달하는 것을 의미하는데, 이때, 상기 복합체는 체내의 여러 부위로 전신순환하고, 여기서 상기 복합체는 표적세포에 접촉할 수 있다. 따라서, 조성물은 가급적 전신투여, 전형적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 투여, 또는 복강내 투여하여 개체에 투여한다. 이런 용도의 주사용액은 액체용액 또는 현탁액과 같은 통상적인 형태, 주사직전 용액에 녹여 용액 또는 현탁액으로의 제조에 적당한 고형형태, 또는 유제로 만들 수 있다. 적당한 부형제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올등이 포함되며, 원하는 경우, 습윤제 또는 유화제등과 같은 첨가물질, 버퍼등을 미량 첨가할 수 있다.

핵산, 다시 말하면 DNA 및/또는 RNA의 전달은 폴리펩티드를 발현시키거나 또는 "앤티센스" 핵산, 특히, 앤티센스 RNA를 이용하여 폴리펩티드 발현을 억제하기 위하여 사용할 수 있다. 이 글에서, "폴리펩티드"는 임의의 길이를 가진 펩티드를 의미하여, 여기에는 단백질이 포함된다. 이 글에서 "폴리펩티드"는 특정 크기를 언급하는 경우가 아니라면, 임의의 크기로 제한하지 않는다. 발현되는 전형적인 폴리펩티드는 옥시톡신, 바소프레신, 아드레노코르티코영양성 호르몬, 상피생장인자, 프롤락틴, 황체형성 호르몬 방출 호르몬, 생장호르몬, 생장호르몬 방출인자, 인슐린-유사 생장인자, 인슐린, 에리트로포이에틴, 렙틴과 같은 비만단백질, 소마토스태틴, 글루카곤, 글루카곤-유사 인슐린영양성 인자, 파라티로이드 호르몬, 인터페론, 가스트린, 인터루킨 및 림포카인, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트로인, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔돌핀, 앤지오텐신, 레닌, 브래디키닌, 바시트래신, 폴리믹신, 콜리스틴, 티로시딘, 그라미시딘, 이들의 합성 유사체, 이들의 변형체 및 약리학적 활성단편, 단클론항체, 백신에서 선택된다. 이들은 한정하기 위한 것이 아니다; 발현되는 펩티드 또는 단백질 약물의 유일한 제한은 기능성이다. DNA 및/또는 RNA의 전달은 유전자 치료, 예방접종, 임의의 치료요법상황에서 유용한데, 상기 상황하에서, 핵산 또는 폴리펩티드는 생체내로 투여된다(U.S. 특허 No. 5,580,859).

핵산이 DNA인 경우, 이것은 자체로 복제가 불가능하고, 플라스미드로 삽입되는 DNA 서열인데, 여기서 플라스미드는 추가로 복제개시점을 포함한다. DNA는 또한, 인체에서 기능하는 CMV IEP 프로모터와 같은 전사프로모터를 보유한다. DNA는 또한 DNA를 전사하는 폴리메라제를 인코드할 수 있다. 포유동물에서 클론된 유전자의 발현을 위한 다수의 발현벡터가 당분야에 공지되어 있고, 많은 이런 발현 벡터들은 상업적으로 입수가능하다(예, pEUK-C1(Clontech, Palo Alto, Calif.)). 당분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 따라, 이런 발현 벡터로 관심있는 유전자를 삽입할 수 있다(E.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989)).

본 방법은 특정 폴리펩티드의 결핍, 부재 또는 돌연변이와 관련된 질병의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 방법으로 개체를 면역시킬 수 있는데, 여기서, 상기 개체는 사람 또는 동물이고, 상기 방법은 DNA 및/또는 RNA를 개체에 전달하는 것으로 이루어지고, 이때, DNA 및/또는 RNA는 면역원에 대하여 면역반응을 유도하는 면역원성 번역산물을 코드한다. 본 방법을 이용하여 체액 면역반응, 세포면역반응 또는 이 둘을 동시에 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 담체를 만드는 방법은 중합체 단일메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 PLL 리신의 ε-아미노기에 융합시켜 성취한다. PEG는 직쇄 양친화성 중합체로 다양한 효소를 변형하여, 이들이 생체내에서 좀더 긴 반감기를 갖도록 하는데 사용한다(F.F. Davis et al., in 4 Enzyme Engineering 169 (1978); A. Abuchowski et al., 7 Cancer Biochem. Biophys.175 (1984)). PEG는 또한, 인터루킨-2를 변형하여, 이것이 생체내에서 향상된 용해성과 반감기를 갖도록 하는데 사용한다(N.V. Katre et al., 84 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 1487 (1987)). PEG-융합된 PLL(PEG-g-PLL)이 전달할 유전자와 정전복합체를 형성하는 경우, 용해성이 증가하는데(도1), 이것은 PEG 사슬의 용해효과에 기인한다(A.V. Kabanov et al., Bioconjugate Chemistry 639(1995)). 부가된 PEG 사슬에 의해 유도된 용해성 증가는 플라스미드 DNA/PLL복합체에 비하여 트랜스펙션 효과에 우호적으로 작용하며, PLL 세포독성의 증가는 없다. 오히려, PEG 사슬의 존재는 PLL 염기의 세포독성을 감소시키고 트랜스펙션 지속기간을 향상시킨다. 정전복합체는 양-대전(帶電)된 중합체(예, PLL)와 음-대전된 핵산의 친화력에 의해 형성된다.

실시예 1

5mol%, 10mol%, 25mol%의 PEG 함량을 보유한 PEG-g-PLL의 이식편 공중합체는 도2에서 제시한 과정에 따라 합성하였다. 티오닐 클로라이드(SOCl₂), 트리에틸아민(TEA), 디메틸 술폭시드(DMSO), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEGOCH₂CH₂OH;MW=550)은 Aldrich(Milwaukee, Wisconsin)에서 구매하였다. PLL-하이드로브로미드(반복 단위=120; MW=25,000)는 Sigma(St. Louis, Misssouri)에서 구매하였다.

가령, 5몰% PEG-g-PLL의 합성은 다음과 같이 실시하였다: 메톡시 PEGOCH₂CH₂CO₂H는 mPEGOCH₂CH₂OH을 브로모아세트산에틸로 알킬화시켜 합성하였다. 티오닐 클로라이드(1.5㎖)는 6㎎의 mPEGOCH₂CH₂CO₂H가 담긴 원형바닥 플라스크에 첨가하고, 40분동안 환류하고, 이후 진공하에서 티오닐 클로라이드를 증발시켰다. 생성물은 100㎕의 DMSO에서 분해하고, 25㎎ PLL-하이드로브로마이드와 160㎕ TEA를 함유한 1㎖ DMSO에 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 30분 교반후, 4㎖의 탈이온화된 물을 첨가하고, 6N HCl로 반응혼합물의 pH를 1로 조정하였다. 최종적으로, 산물은 물에서 희석하고, 동결건조시켰다. PEG 함량은 D₂O를 용매(보이지 않음)로 하는¹H-NMR로 결정하였다. 3.5ppm에서 최대수치는 산물내 mPEG 존재를 의미한다.

실시예 2

플라스미드 pSV-β-gal(Promega Corp., Madison, Wisconsin; EMBL accession No. X65335)은 포유동물 세포의 트랜스펙션 효율을 모니터하기 위한 양성 조절 벡터이다. pSV-β-gal 플라스미드는 SV40 초기 프로모터와 증폭제 서열, 전사개시 위치, β-갈락토시다제를 인코드한 대장균(E.coli)lacZ 코딩 영역, SV40 작은 T 항원 폴리아데닐화 시그널을 보유한다. SV40 초기 프로모터 및 증폭제는 lacZ 유전자의 전사를 유도한다.

동량의 플라스미드 DNA와 에티디움 브로마이드(각각, 1㎍)는 20mM 헤페스(N-[2-히드록시에틸]피페라진-N¹-[2-에탄술폰산])와 0.15M NaCl를 함유한 1㎖ 버퍼(pH 7.4)에 넣었다. 실시예 1의 과정을 따라 만든 다양한 양의 PEG-g-PLL은 이후, 플라스미드 DNA-에티디움 브로마이드 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물의 형광밀도는 형광계수기(PCI, ISS Co., USA)(λ_ex= 516 nm, λ_em= 590 nm)로 측정하였다. 도3은 이 형광 담금질분석의 결과를 보여준다. 이들 자료에서, PEG-g-PLL이 최대 55%까지 플라스미드 DNA를 응축시킴을 알 수 있다. PLL과 이의 PEG-변형 유도체의 플라스미드 DNA 응축능력의 차이는 거의 없었다.

실시예 3

본 실시예에서, 겔 지체 분석을 실시하여, PEG-g-PLL이 DNA와 복합체를 형성하는지를 추가로 결정하였다. pSV-β-gal과 실시예 2와 같이 만든 PEG-g-PLL의 혼합물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분류하였다. 분류후, 겔은 에티디움 브로마이드(0.5㎍/㎖)로 염색하고, UV 조명기상에 조사하였다. 자유 플라스미드 DNA(보이지 않음)의 움직임은 복합체 형성을 위한 PEG-g-PLL양이 증가함에 따라 느려졌다. 이들 결과에서, PEG-g-PLL은 플라스미드 DNA와 안정적인 복합체를 형성함을 알 수 있다. 완전지체는 플라스미드 DNA:PEG-g-PLL의 1:1 중량비 이상에서 성취하였다.

실시예 4

본 실시예에서, 실시예 2의 과정에 따라 만든 플라스미드 DNA/PEG-g-PLL 복합체의 크기는 DNA 대 PEG-g-PLL의 1:3 중량비를 이용하여 90°각도에서 동적 레이저광 분산(Brookhaven BI-DS)으로 측정하였다. 자료는 누적분석으로 분석하였다. 도4는 단독 플라스미드의 크기와 다양한 화합물과의 복합체 크기를 보여준다. 복합체는 평균 300nm 직경을 갖는다.

실시예 5

본 실시예에서는 포유동물 세포의 시험관내 트랜스펙션을 매개하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 효능을 입증하였다. HepG2 세포(사람 간암(종)세포)는 American Type Culture Collection(Rockville, MD; ATCC accession No. 8065-HB)에서 얻었다. 트랜스펙션은 96-웰 평판에서 PEG-g-PLL을 이용하여 실시하고, 세포밀도는 20 x 10⁴세포/㎖가 되도록 접종하였다. 플라스미드 pSV-β-gal DNA/PEG-g-PLL 복합체는 100㎕ 혈청-무(無) MEM 배지에서 1㎍ 플라스미드 DNA와 3㎍ PEG-g-PLL을 혼합하고, 30분동안 실온에서 이를 배양하고, 이후, 10%(v/v) 태아 소 혈청(Hyclone Laboratories, Logan, Utah)과 100 μM 클로로퀸(Sigma)을 첨가하여 만들었다. 클로로퀸(세포침투염기)을 사용하여 세포의 산성 부분을 부분 중화시키고, 엔도좀과 리소솜과의 융합을 예방하였다(P. Midoux et al., 21 Nucleic Acids Research 871-78 (1993)). 각 96-웰 평판상의 배지는 트랜스펙션 혼합물로 대체하였다. 세포는 5% CO₂, 37℃로 조직배양 인큐베이터(Napco Co.)에서 4시간 배양하였다. 트랜스펙션 혼합물은 제거하고, 10% 태아 소 혈청을 보유한 새로운 생장배지를 각 웰에 첨가하였다. 세포는 5% CO₂, 37℃로 조직배양 인큐베이터에서 추가로 44시간 배양하였다.

트랜스펙션된 세포의 In situ X-gal(5-클로로-4-브로모-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드)염색은 발현된 β-갈락토시다제의 검출에 사용하였다(J.R. Sanes et al., 5 EMBO J. 3133 (1986)). 각 96-웰 평판상의 세포는 1X 인산염-완충식염수(PBS)로 두 번 세척하고, 실온에서 15분동안 100㎕ 0.25%(v/v)글루타르알데하이드로 고정시켰다. 글루타르알데하이드 용액은 이후 제거하고, 세포는 1X PBS로 세 번 부드럽게 세척하였다. 그 다음, 60㎕ X-gal 용액(1 ㎎/㎖ X-gal, 2 mM MgCl₂, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 5 mM K₃Fe(CN)₆)을 첨가하고, 이후 조직배양 인큐베이터에서 37℃로 16시간동안 배양하였다. X-gal 용액은 이후 제거하고, 세포는 1X PBS로 덮었다. pSV-β-gal 플라스미드의 트랜스펙션에서 β-갈락토시다제 효소를 발현하는 세포는 X-gal로 남색으로 염색하고, 현미경하에서 관찰하고 계수하였다.

도5에서 보는 바와 같이, PEG-변형의 정도가 증가함에 따라 트랜스펙션 효율이 최대 30배까지 증가하였다. 실험한 3 단계의 치환에서, 10몰% PEG-g-PLL이 최대의 트랜스펙션 효율을 보였다. 25 몰% PEG-g-PLL은 상당히 낮은 트랜스펙션 효율을 보였다. 따라서, PLL에서 PEG-변형의 최적범위는 대략 10몰%인 것으로 보인다. 상업적으로 입수가능한 트랜스펙션 작용제인 리포펙틴(LIPOFECTIN)시약(GIBCO BRL)은 HepG2 세포에서 10몰% PEG-g-PLL보다 트랜스펙션 효율이 약간 더 높았다. 리포펙틴(LIPOFECTIN)시약은 막-여과된 물에 녹인 양이온 지질 N-[1-(2,3-디올레이옥시)프로필]-n,n,n-염화트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)과 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 1:1(w/w) 리포좀 조성물이다.

실시예 6

본 실시예에서, 상이한 복합체는 플라스미드 DNA 일정량(10 ㎍/㎖)과 10몰% PEG-g-PLL의 증가량(1-50 ㎍/㎖)으로 만들었다. 실시예 5의 과정에 따라, 이들 복합체를 사용하여 HepG2 세포를 트랜스펙션시켰다. 도6에서 보이는 바와 같이, 트랜스펙션 효율은 PEG-g-PLL 대 플라스미드 DNA의 중량비가 3:1로 증가함에 따라 향상되었다. PEG-g-PLL 대 플라스미드 DNA의 비율이 더 높아지면, 트랜스펙션 효율은 감소하였다.

실시예 7

본 실시예에서, PEG-g-PLL의 세포독성을 결정하였다. 생존세포의 비율은 MTT(3-[4,5-디메틸에틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸룸 브로마이드)분석으로 결정하였다(T. Mosman, 65 J. Immunol. Methods 55 (1983)).

실시예 5에서 밝힌 트랜스펙션 실험 마지막에, 트랜스펙션 혼합물은 26㎕의 2 ㎎/㎖ MTT 용액을 함유한 새로운 생장배지로 대체하였다. 평판은 조직배양 인큐베이터에서 37℃로 4시간동안 추가배양하고, 이후 MTT-함유 배지는 흡인하여 제거하고, 150㎕ DMSO을 첨가하여, 생존세포에 의해 만들어진 포르마잔 결정체를 분해하였다. 흡수도는 극소평판 판독기(Model EL311, Bio-Tek instrument Co.)를 이용하여 570nm에서 측정하고, 생존세포의 비율은 다음의 공식으로 계산하였다.

세포 생존율 (%) =

도7에서 보이는 바와 같이, 5몰%-, 10 몰%-변형된 PEG-g-PLL은 HepG2 세포에서 매우 경미한 세포독성을 보인 반면, 리포펙틴(LIPOFECTIN)시약 또는 PLL은 중간이상의 세포독성을 보였다. 비록 25몰%-치환된 PEG-g-PLL은 5몰%- 또는 10몰%-치환된 PEG-g-PLL보다 세포 생존율이 낮았지만, 이의 세포독성은 리포펙틴(LIPOFECTIN) 또는 PLL보다 훨씬 낮았다. 따라서, 본 발명의 조성물은 세포독성의 측면에서 공지된 물질보다 이점을 갖는다.

실시예 8

본 실시예는 실시예 7의 과정을 따랐는데, 단 세포 생존율 분석을 트랜스펙션 24, 48, 72, 96시간후에 실시하였다. 일반적으로, 트랜스펙션 분석은 트랜스펙션 48시간후에 실시하지만, 24시간 배양한 후에 상기 분석을 실시한 경우에도 거의 동일한 트랜스펙션 효율을 얻었다(도8). 리포펙틴(LIPOFECTIN)시약의 경우에, 24시간 배양후 β-갈락토시다제 활성은 48시간 배양후 β-갈락토시다제 활성의 절반이었다(자료 제시하지 않음). 또한, 플라스미드 pSV-β-gal DNA/PEG-g-PLL 혼합물로 트랜스펙션된 세포는 최대 96시간까지 발현수준을 계속 유지했다(도8).

실시예 9

본 실시예에서는, 트랜스펙션 효율에 있어 클로로퀸의 역할을 결정하였다. 실시예 5의 과정을 따랐는데, 단 클로로퀸 농도는 0-100 μM으로 변하였다. 도9는 클로로퀸이 세포의 성공적인 트랜스펙션에 필수적인 것은 아니지만, 트랜스펙션 효율을 증가시키는데 있어 중요한 역할을 함을 보여준다. 클로로퀸의 농도가 최대 100 μM까지 증가함에 따라, 트랜스펙션 효율은 최대 30배까지 증가하였다.

실시예10

본 실시예는 생체내 유전자를 개체에 전달하는 방법을 설명한다. 사람 렙틴 또는 쥐 렙틴 cDNA(C. Guoxun et al., Disappearance of Body Fat in Normal Rats Induced by Adenovirus-mediated Leptin, 93 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 14795-99 (1996)), 또는 생쥐 렙틴 cDNA(P. Muzzin et al., Correction of Obesity and Diabetes in Genetically Cloned Mice by Leptin Gene Therapy, 93 Proc. Nat'l Acad. Sci USA 14804-14808)와 같은 렙틴 비만 단백질을 인코드한 핵산은 당분야에 공지된 것이다. 포유동물 발현 벡터인 pEUK-C1(Clontech, Palo Alto, Calif.)은 클론된 유전자의 일시발현을 위해 고안한 것이다. 상기 벡터는 4.9 kb 플라스미드로, pBR322 복제기점 및 박테리아상에서 증식을 위한 앰피실린 저항성 마크를 포함하고, 또한 SV40 복제기점, SV40 후기 프로모터, 포유동물에서 선택된 유전자의 복제와 발현을 위한 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. SV40 후기 프로모터와 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널사이에는 단일 XhoI, XbaI, SmaI, SacI, BamHI 제한위치의 다중클로닝위치(MCS)가 존재한다. MCS로 클론된 DNA 단편은 SV40 후기 프로모터로부터 RNA로 전사하고, 클론된 단편상의 제 1 ATG 코돈으로부터 번역한다. 클론된 DNA의 전사체는 접합(스플라이싱)하고, SV40 VPI 가공 시그널을 이용하여 폴리아데닐화시켰다. 렙틴 유전자는 당분야에 공지된 기술(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989))을 이용하여 pEUK-C1의 MCS로 클론한다. 생성된 플라스미드는 실시예 2에서 제시한 본 발명에 따라 만든 복합체로 통합한후, 사람 또는 동물로 전달한다.

생성된 복합체의 효과량을 개체에 전신투여하여, 복합체가 혈류에 진입하여 표적세포와 접촉하도록 한다. 복합체가 접촉한 표적세포는 복합체를 흡착하고, 따라서, 렙틴 DNA를 흡수한다. 렙틴 DNA는 이후 수용체 세포에서 발현시켜, 비만 또는 당뇨치료에 긍정적 효과를 발휘시킨다.

본 발명의 조성물은 PLL에서 얻은 것보다 향상된 트랜스펙션 능력을 제공한다. 본 조성물은 또한, 낮은 세포독성, 초기 유전자 발현, 최대 96시간까지 초기 유전자 발현수준의 유지를 증명하였다. 이들 특성은 리포펙틴(LIPOFECTIN)시약과 같은 선행화합물보다 유리한 점이다.

Claims

선택된 핵산을 표적세포로 전달하기 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 선택된 핵산과 정전복합체를 형성하는 형태를 가지고, 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 구성된 생리상보성 이식편 공중합체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신), 이의 유도체, 이의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서, 폴리(L-리신)은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 제 2 중합체는 폴리옥시알킬 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 알파-치환된 폴리(옥시알킬)글리콜, 폴리(옥시알킬)글리콜 공중합체 및 블록 공중합체, 활성화된 이들의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 20,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리(L-리신)의 ε-아미노기와 융합된 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 5몰% 내지 25몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 10몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
선택된 핵산을 숙주세포로 전달하기 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 선택된 핵산 및 생리상보성 이식편 공중합체의 정전복합체로 이루어지고, 상기 생리상보성 공중합체는 양이온 제 1 중합체 및 양친화성 제 2 중합체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신), 이의 유도체, 이의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 15항에 있어서, 폴리(L-리신)은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 제 2 중합체는 폴리옥시알킬 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 알파-치환된 폴리(옥시알킬)글리콜, 폴리(옥시알킬)글리콜 공중합체 및 블록 공중합체, 활성화된 이들의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 20,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리(L-리신)의 ε-아미노기와 융합된 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 22항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 5몰% 내지 25몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 10 몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 핵산 및 이식편 공중합체는 0.3 내지 10의 중량비로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 항-엔도좀 기능작용제의 효과량을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26항에 있어서, 항-엔도좀 기능작용제는 클로로퀸의 효과량으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서, 클로로퀸의 효과량은 25-250μM인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28항에 있어서, 클로로퀸의 효과량은 75-150μM인 것을 특징으로 하는 조성물.
선택된 핵산으로 숙주세포를 형질전환시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 정전복합체의 효과량으로 숙주세포를 접촉시키는 것으로 이루어지고, 상기 정전(靜電)복합체는 선택된 핵산 및 생리상보성 이식편 공중합체로 이루어지고, 이때 생리상보성 이식편 공중합체는 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어지고, 상기 숙주세포는 상기 선택된 핵산을 흡수하는 것을 특징으로 방법.
제 30항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신), 이의 유도체, 이의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31항에 있어서, 제 1 중합체는 폴리(L-리신)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 폴리(L-리신)은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 제 2 중합체는 폴리옥시알킬 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 알파-치환된 폴리(옥시알킬)글리콜, 폴리(옥시알킬)글리콜 공중합체 및 블록 공중합체, 활성화된 이들의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 50,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 200 내지 20,000의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 폴리옥시알킬 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리(L-리신)의 ε-아미노기와 융합된 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 5몰% 내지 25몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 이식편 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 10몰%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 핵산 및 이식편 공중합체는 0.3 내지 10의 중량비로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 항-엔도좀 기능작용제의 효과량을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 항-엔도좀 기능작용제는 클로로퀸의 효과량으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서, 클로로퀸의 효과량은 25-250μM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 클로로퀸의 효과량은 75-150μM인 것을 특징으로 하는 방법.
선택된 핵산을 개체에 전달하기 위한 조성물을 이용하는 방법에 있어서, 상기 방법은 정전복합체의 효과량을 투여하는 것으로 이루어지고, 상기 정전(靜電)복합체는 선택된 핵산 및 생리상보성 이식편 공중합체로 이루어지고, 상기 생리상보성 이식편 공중합체는 양이온 제 1 중합체와 양친화성 제 2 중합체로 이루어지고, 상기 복합체는 전신순환하여 숙주세포에 접촉하고, 상기 숙주세포는 상기 선택된 핵산을 흡수하는 것을 특징으로 방법.