CN100434520C - 聚肽型转染试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物，该共聚物为含有聚肽段和聚乙二醇段的三嵌段共聚物。三嵌段共聚物的构型为ABA型，其中，A指阳离子型聚肽段，B指聚乙二醇段。该共聚物用pH7～8的三羟甲基氨基甲烷-HCl溶液或三羟甲基氨基甲烷-HCl-乙烯二胺四乙酸缓冲溶液配制成浓度为5～30×10^-3mol/L的溶液可直接用于转染。本共聚物具有低毒、可生物相容、生物可降解、无免疫原性等优点，转染试剂的转染效率高，毒副作用低，另外，在合成过程中控制反应条件，可以得到各链段长度各不相同的嵌段共聚物，可以适应不同的转染对象和转染条件。相比于其他类型的转染试剂来说，本发明所提出的转染试剂的使用方法相对简单，保存方便，可室温保存，成本较低，具竞争力。

Description

聚肽型转染试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型转染试剂及其制作方法，具体地说，本发明提出了一种含有聚肽的嵌段共聚物，该共聚物可用作转染试剂，且在转染过程中具有特定的聚集体形态。

背景技术

转染试剂在生物学领域应用非常广泛，是生物学实验和生命科学研究中使用频率最高的试剂之一。它的作用是携带外源脱氧核糖核酸(DNA)片段，穿过细胞屏障，进入到有机体的细胞中，并使DNA片段在细胞内维持其生物功能。它要解决的问题是如何有效的、安全的将DNA送入细胞，而且尽量不对细胞产生干扰，因此，高的转染效率是对转染试剂的首要要求，除此以外，还要求转染试剂必须具有低毒、可生物相容、可生物降解等特点，以最大限度地减少对细胞的影响。但是现在使用的转染试剂都存在着这样或那样的缺点，不能完全满足这些条件。作为化学合成工作者，需要开发出新的更优异的转染试剂，以满足生命科学工作者的需要。

DEAE-葡聚糖(Diethylaminoethyl(二乙氨基乙基，简称DEAE)-dextran)和磷酸钙共沉淀法是使用较早的两种转染方法，这两种方法实施起来都很简单，但是前者使用范围小，毒副作用强，后者重复性差，都已经逐渐被淘汰。

阳离子脂质体是现在使用较多的转染试剂，带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后带剩余正电荷的复合物与带负电的细胞膜结合，通过细胞是内吞作用而进入细胞。它的使用方法很简单，转染效率高，应用范围广，相对于前两种试剂来说，有很大的优势，但是其毒性较大，限制了它的应用。

阳离子聚合物是新一代的转染试剂，带正电的聚合物可以与核酸中带负电的磷酸基团作用，形成带正电的复合物，然后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞，如聚乙烯亚胺、聚酰胺树枝状高分子、阳离子型聚肽等，由于它们是化学方法合成或修饰的，因此在原料的选用、分子构型的选择等方面都有很大的选择余地，生物相容性和生物可降解性原料的选用使它克服了以往的转染试剂不能克服的缺点。它不仅具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等优点，还克服了毒副作用强的缺点，并且现在还处于不断的发展中，具有很大的发展潜力。

研究表明，阳离子型聚肽可以有效地与DNA结合，保护DNA免受酶的降解，并且，它与DNA形成的复合物能够通过细胞屏障进入细胞，再加上良好的生理和理化性质，它成为合成阳离子聚合物转染试剂的首选材料。聚(L-赖氨酸)是阳离子型聚肽的典型代表，是最早用于转染的阳离子聚合物之一，但是，它与DNA形成的复合物的溶解度较低，不但使该复合物在溶液中易发生凝聚，还降低了转染效率，有必要对阳离子型聚肽进行修饰，改善它的一些性能，使它适合于转染。

相比于聚(L-赖氨酸)来说，聚乙二醇-聚(L-赖氨酸)两嵌段共聚物[Keiji Itaka等人，“Biomaterials”，第4495页-4506页(2003年)]与DNA形成的复合物的可溶性得到了了很大的提高，转染效果也比聚(L-赖氨酸)好，证明经聚乙二醇对阳离子型聚肽的修饰可以改善其转染效果；本小组合成了三嵌段共聚物聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸[杨子刚等人，“中国科学”，第35卷第6期，第492页-498页(2005年)]，它与DNA复合时具有类似组成生物膜的磷脂分子的结构，并取得了较好的转染效果。但是，该聚合物的聚乙二醇段过短(分子量1500道尔顿)，使聚合物的亲水性不足，影响了转染的效果，聚赖氨酸的重复单元数过少(20-50)，使聚合物与D\A的结合力不够强。本发明为了弥补了以上的缺点，改变了各链段的长度，提高了聚合物的转染效率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的转染试剂的不足，提供一种转染效率高，毒副作用低的新型转染试剂，以及该转染试剂的制备方法。提出了一种含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物

本发明通过阴离子开环聚合，合成含有聚肽段和聚乙二醇(PEG)段的三嵌段共聚物。构型为ABA型，其中，A指阳离子型聚肽段，如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸等，B指聚7二醇段，分子式下图所示。

式中，R⁺表示带正电的氨基酸侧链或氨基酸衍生物的侧链，m和n都为整数，其中聚乙二醇的重复单元数m的取值范围为57～294，优选57～175，聚肽的重复单元数2n为60～400，优选60～300，所使用的单端或双端氨基聚乙二醇的分子量为2000～10000道尔顿，优选2000～6000道尔顿。

本发明的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物的制备方法：

步骤1、将氨基酸环状酸酐溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成浓度为0.05～0.3摩尔/升溶液；

步骤2、将双端氨基聚乙二醇溶解在10～25倍体积的N，N-二甲基甲酰胺中配成溶液；

步骤3、将步骤2所得的溶液加入到步骤1所得的溶液中配成混合液，混合液中氨基酸环状酸酐与双端氨基聚乙二醇的摩尔比为60～400∶1，通入氮气、氩气、或氮气和氩气的混合惰性气体，搅拌，40～50℃反应60个小时以上，得到分子式1所示的嵌段共聚物；

所制得的共聚物产品用缓冲溶液溶解，进行转染。共聚物用pH7～8的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷-HCl-乙烯二胺四乙酸(EDTA)缓冲溶液配制成浓度为5～30×10^-3摩尔/升的溶液，该溶液即可直接用于转染。其中三羟甲基氨基甲烷与HCl的摩尔比，三羟甲基氨基甲烷、HCl、乙烯二胺四乙酸的摩尔比不限，只要缓冲溶液的pH为7～8即可。

本发明所使用的氨基酸环状酸酐为自制，制备方法为：将氨基酸溶解在四氢呋喃(THF)中，浓度约为0.3摩尔/升，加入过量三光气反应90分钟以上，将反应液倒入正己烷中，静置24小时，抽滤，得产物。

其余试剂均为市场购得，使用的有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和正己烷按通常的方法除水处理。

在溶液中，带正电荷的阳离子型聚肽可以通过静电作用有效地同带负电荷的DNA结合，并自动的聚集在一起成球状复合物，聚肽和DNA在中心，亲水性的PEG链向四周伸展，形成一种以聚肽和DNA为核，以PEG为壳的核-壳结构，即胶束。DNA包覆在胶束的中心并受到压缩，得到了有效的保护而免受损伤。

聚乙二醇是公认的无毒、可生物相容的生物工程材料，亲水的聚乙二醇链段大大的提高了复合物的溶解性，使它在溶液中或细胞中不会发生聚集或沉淀。本发明中涉及的氨基酸都是组成生物体的氨基酸，所以共聚物具有低毒、可生物相容、生物可降解、无免疫原性等优点，这对于减少对细胞的毒副作用，减少对转染实验结果的影响是很有利的。该聚合物同DNA结合形成的复合物带有剩余正电荷，过量的正电荷使复合物与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，穿越细胞屏障并通过内吞作用进入细胞。本发明的毒副作用小，同时有效的提高了转染效率，图3即为本发明的转染效果图。

另外，在合成过程中控制反应条件，可以得到各链段长度各不相同的嵌段共聚物，能适应不同的转染对象和转染条件。相比于其他类型的转染试剂来说，本发明所提出的转染试剂的使用方法相对简单，保存方便，可室温保存，成本低廉。

附图说明

图1为经实施例2和实施例3合成的转染试剂处理过的DNA与未经本发明处理的DNA在酶切实验中的电泳对比图。

图2为经实施例1合成的转染试剂处理过的DNA的电镜图片。

图3为实施例1合成的转染试剂转染昆虫细胞系Sf9(Spodoptera frugiperda 9，即草地夜蛾卵巢组织细胞)图片。

具体实施方式

应当了解的是，本发明所描述的并不仅仅局限于下文所描述的具体的步骤和物质，而是或多或少可以发生一些变化，不应理解为是对权利要求的限制。例如，本文所描述的氨基酸也可以是氨基酸的衍生物，并不仅仅指氨基酸。

实施例1聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的合成

称取2.2克N-苄氧羰基赖氨酸环状酸酐(Lys(z)-NCA)溶解在25毫升的DMF中，然后称取0.18克的双端氨基PEG(Fluka公司，美国)溶于8毫升的DMF并加入其中，通入N，、搅拌、加热到45°℃反应72小时，得到产物。将所得产物加入20毫升含质量分数为33％HBr的乙酸溶液中，搅拌，室温下反应一个小时，然后用无水乙醇沉淀，得产品聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸。

本实施例中所使用的双端氨基PEG分子量为3000道尔顿。

实施例2～7

采用不同分子量的双端氨基PEG，控制Lys(z)-NCA和双端氨基PEG的用量，发生如实施例1的聚合反应，得到各链段长度不相同的三嵌段聚肽型聚合物。

实施例	Lys(z)-NCA(克)	双端氨基PEG(克)	双端氨基PEG分子量(道尔顿)	产物
					2	1.66	0.18	2000	PLL31-PEG-PLL31
3	2.46	0.20	2000	PLL38-PEG-PLL38
					4	1.33	0.13	3000	PLL49-PEG-PLL49

5	1.89	0.22	5000	PLL69-PEG-PLL69
					6	2.26	0.23	5000	PLL83-PEG-PLL83
7	3.19	0.21	6000	PLL143-PEG-PLL143

实施例8：PLL-PEG-PLL的¹H-NMR分析

对实施例1所得的聚合物进行¹H-NMR分析，采用美国Varian公司INOVA-600型核磁共振光谱仪，以重水为溶剂，内标TMS。各化学位移的归属为：3.62ppm(-CH ₂ -CH ₂ -0-)，3.08ppm(δ-CH ₂ )，4.19-4.23ppm(α-CH)，1.38-1.42ppm(-(CH ₂ )₃-)，，由于PEG的分子量已知，由二者的峰面积比可以计算出聚合物中聚赖氨酸的重复单元数。通过计算，得出聚赖氨酸的重复单元数大约为58。与预期目标相符，这说明聚合物的组成可以人为的、比较精确地控制。

实施例9：酶切实验

选取实施例2和实施例3制得的的聚合物试剂进行测试。聚合物所带正电荷为赖氨酸的聚合度乘聚合物的物质量，DNA所带的负电荷由其中碱基的个数乘DNA物质的量，将聚合物和DNA配制为混合溶液，使二者电荷比为3∶1，并控制DNA的浓度为15微克/毫升，按照以下方法进行酶切实验：将0.2微升脱氧核糖核酸酶加入2微升10^-2摩尔/升脱氧核糖核酸酶I缓冲液，然后将上述溶液加入10微升配制好的聚合物与DNA的混合溶液，用双蒸水加到总体积为20微升，在温度为25℃时酶切80分钟，然后80℃水浴使酶失活。加入40微升1％的胰蛋白酶后瞬时离心，37℃水浴半小时，再加入60微升异戊醇与氯仿的混合溶液(异戊醇与氯仿的体积比为1∶24)，以12000转/分钟的转速离心5分钟后，取上层液并依次加入3微升3摩尔/升乙酸钠溶液以及100微升无水乙醇，在-20℃情况下静置40分钟，12000转/分钟离心10分钟后去掉液体，37℃烘干，加入15微升三羟甲基氨基甲烷-HCl溶液后电泳，用凝胶成像系统(UVP公司Bioimaging Systems)拍摄电泳结果。

其结果如图1所示共6条电泳带，从左向右看，分别为实施例3制得的的聚合物与DNA形成的复合物经核酶处理后的电泳带、实施例2制得的的聚合物与DNA的复合物经核酶处理后电泳带、DNA经核酶处理后的电泳带、没有用核酶处理的DNA、化学计量比时实施例2制得的的聚合物/DNA和实施例3制得的的聚合物/DNA未经核酶处理的电泳带。从图可以看出用本发明处理的DNA经核酶处理后带(第1条和第2条带)的亮度与未做任何处理的DNA(第4条带)基本相同，说明经本发明处理的DNA基本上没有损失，本发明与DNA形成的复合物对核酶有很好的抗性，而没有用本发明处理的DNA则完全降解了(第3条带)。这说明本发明可以有效地将DNA保护起来，使DNA不会在转染过程中被降解。

实施例10：聚离子复合物的电镜分析

采用H-7000FA(HITACH)型透射电子显微镜(TEM)进行测试，加速电压为80KV。将DNA和实施例1中制得的聚合物用pH 7.4的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液配制成如实施例9中所描述的聚合物和DNA的混合溶液，用质量分数为2.0％的乙酸铀将样品染色，在透射电子显微镜下观察其形态，图2即为该聚合物与DNA形成的聚离子复合物的透射电镜照片，从图中可以看出，聚离子复合物主要呈球形，直径大约为在20-100纳米之间，满足了穿越细胞屏障进入细胞的要求。由实例9得知DNA被聚合物包覆，结合电镜图片，即可说明DNA在球形胶束的中心，被聚合物有效地保护起来了。

实施例11：转染细胞系Sf9

对实施例1制得的转染试剂的转染效果进行测试，以证明本发明所提出的转染试剂具有较高的转染效率。

使用无抗生素的培养基培养细胞至细胞密度达到90％以上。在100微升无血清培养基中加入DNA，混匀，另取100微升无血清培养基中加入实施例1制得的聚合物，轻轻混匀。将上述两种溶液混合，27℃培育40分钟左右，然后补加无血清培养基至总体积为1毫升，混匀，并均匀地加入到细胞培养平板中，27℃培养4-6小时，去掉溶液后加入3毫升完全培养基培养72小时，然后后用激光共聚焦显微镜(LEICA公司TCS SP2型)观察并拍照。

图3即为转染结果图片，图中的亮斑为转染成功的细胞，因为转染的DNA中有绿色荧光蛋白基因，它表达的蛋白质使细胞在荧光照射下发光。从图中可以看出，大量的细胞被转染成功，说明该转染试剂具有很高的转染效率。

Claims (7)

1、一类含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物，其特征在于，所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物为含有聚肽段和聚乙二醇段的三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物的构型为ABA，其中，A指阳离子型聚肽段，B指聚乙二醇段，分子式为1所示，

式中，R⁺表示带正电的氨基酸侧链或氨基酸衍生物的侧链，m和n都为整数；所述的聚乙二醇的分子量为2000～10000道尔顿，聚乙二醇的重复单元数m的取值范围为57～294，聚肽的重复单元数2n为60～400，聚离子复合物直径在20-100纳米之间。

2、如权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量为2000～6000道尔顿。

3、如权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物，其特征在于，所述的聚乙二醇的重复单元数m的取值范围为57～175。

4、如权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物，其特征在于，所述的聚肽的重复单元数2n为60～300。

5、权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述的ABA型三嵌段共聚物的制备步骤为：

步骤1、将氨基酸环状酸酐溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为0.05～0.3摩尔/升的溶液；

步骤2、将双端氨基聚乙二醇溶解在5～25倍体积的N，N-二甲基甲酰胺中，配成溶液；

步骤3、将步骤2所得的溶液加入到步骤1所得的溶液中配成混合液，其混合液中氨基酸环状酸酐与双端氨基聚乙二醇段的摩尔比为30～200∶1，通入氮气、氩气、或氮气和氩气混合惰性气体，搅拌，40～50℃反应60个小时以上，得到分子式为1所示的嵌段共聚物；

其中所述的N，N-二甲基甲酰胺为市购品经除水处理。

6、权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物的应用方法，其特征在于，将所述的共聚物用缓冲溶液溶解，进行转染。

7、权利要求1所述的含有阳离子型聚肽的三嵌段共聚物的应用方法，其特征在于，将所述的共聚物用pH7～8的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷-HCl-乙烯二胺四乙酸缓冲溶液配制成浓度为5～30×10^-3摩尔/升的溶液直接用于转染。

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