CN106700528B - 一种超分子组装体及其制备和形貌调控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于聚乙二醇‑b‑聚‑L‑赖氨酸和聚脂肪醚树状分子‑b‑DNA杂化体的超分子组装体及其制备方法，并通过改变超分子组装体中聚乙二醇‑b‑聚‑L‑赖氨酸和聚脂肪醚树状分子‑b‑DNA杂化体的电荷比例关系实现了对于超分子组装体的形貌调控，从而为超分子组装结构的性质与组装机理研究拓展了新的思路，并使进一步拓宽超分子材料的应用领域成为可能。

Description

一种超分子组装体及其制备和形貌调控方法
技术领域
本申请属于超分子技术领域，涉及生物大分子与有机高分子相结合而形成的生物-有机杂化结构，具体地涉及一种超分子组装体及其制备和形貌调控方法。
背景技术
近年来，将生物大分子与有机高分子相结合而形成的生物-有机两嵌段杂化结构成为高分子材料领域一类新的研究热点，这类杂化材料由于可以保持两嵌段中每一嵌段各自的性质，使它们在溶液中往往会表现出多样的自组装行为，同时，其中的生物大分子嵌段还能保持生物大分子所特有的生物学性质，使其在生物纳米技术和药物运输等方面具有广泛的应用前景。特别是由核酸(DNA)与合成高分子相结合而形成的DNA-合成高分子嵌段共聚物，由于DNA嵌段在构筑纳米自组装结构过程中所表现出来的可控的二级结构、精确的识别性质以及多样的刺激响应性等特点，使得“DNA-合成高分子杂化共聚物”在生物材料和分子检测等领域具有广阔的应用前景。
利用简单高效的方法构建结构可控、性能稳定、生物相容并可降解的功能材料，是目前材料科学的一个重要发展方向。其中，基于非共价弱相互作用力的超分子材料，由于能够充分利用大量已合成的或天然存在的各种分子及其聚集体作为基本构造单元，具有原料来源的广泛性、构建过程的可逆性和组装结构的有序性等特点，受到研究人员的广泛关注。超分子材料的发展不仅能够极大地简化功能材料的构筑方法，还能拓展功能材料的应用领域。而在各种超分子非共价作用力当中，静电作用比之氢键、金属配体螯合作用、主客体作用等具有诸多优势：通过静电结合的方法可能制出通过普通合成方法难以制备出来的嵌段共聚物；末端带有正电或负电功能基团的聚合物能够通过自由基聚合时的链转移反应比较容易地获得，而不需要复杂繁琐的离子或可控自由基聚合物反应操作；静电作用在生物体系中极为普遍，故其毒性更低；更为重要的是，静电相互作用由于其良好的响应性与可逆性，使基于静电作用的自组装体系具有很好的动态可控性。因此，分子间的静电作用是构筑超分子自组装结构的重要非共价驱动力，通过静电作用制备的超分子组装体更可能实现形貌调控进而实现功能可控，并进一步拓展超分子材料的应用领域，然而目前并未有关于超分子组装体形貌调控方法的确切报道。
发明内容
本发明的一个目的在于针对现有技术的不足，利用聚氨基酸与DNA之间的静电作用为主的非共价相互作用，提供一种超分子组装体及其制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种超分子组装体的形貌调控方法，其可以有效地对上述超分子组装体的形貌进行调控。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种超分子组装体，其为基于聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-DNA杂化体的超分子组装体。
本发明所述的聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)由单甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH2)和L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)合成。
优选的，所述单甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH2)的Mn＝2000g/mol。
优选的，所述L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)按照如下方法合成：将L-赖氨酸(H-Lys(Z)-OH)和当量20％过量的三光气，于四氢呋喃(THF)溶剂中50℃反应至澄清后再反应1h，即转化成L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(NCA)。
进一步优选的，所述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)按照如下方法合成：(1)首先将单甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH2)在Schlenk瓶(施兰克瓶)中50℃油浴真空干燥6h，后冷却到室温；(2)L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，转移至前一步的Schlenk瓶中在氮气保护及室温下反应；(3)加入过量乙醚沉淀产物，再用三氟乙酸(TFA)溶解产物；(4)加入5倍当量的氢溴酸(HBr)或冰醋酸(CH3COOH)，在冰水浴中反应4h后用乙醚沉淀；(5)用稀HCl调节pH值使产物溶于水中，透析后冷冻干燥即得。
在本发明的一个优选实施方式中，所述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)按照如下方法合成：
(1)合成L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)：将L-赖氨酸(H-Lys(Z)-OH)和当量20％过量的三光气，于四氢呋喃(THF)溶剂中50℃反应至澄清后再反应1h，即转化成L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)；获得的L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)单体粗产物在手套箱中经四氢呋喃(THF)与正己烷重结晶纯化三次后得最终产物待用。
(2)合成聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)：首先将单甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH2，Mn＝2000g mol-1)在Schlenk瓶(施兰克瓶)中50℃油浴真空干燥约6h，后冷却到室温；步骤(1)得到的L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，然后用注射器抽取后转移至Schlenk瓶中在氮气保护及室温下反应；利用FT-IR(傅里叶变换红外光谱分析仪)光谱确认反应完成后，取少量样品配制成5mg/mL进行SEC/LLS(体积排除色谱/激光散射)测试，确定多分散性(PDI)与分子量(Mn)；过量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解产物，加入5倍当量的氢溴酸(HBr)或冰醋酸(CH3COOH)，在冰水浴中4h后用乙醚沉淀；用稀HCl调节pH值使产物溶于水中，透析后冷冻干燥得到产物。通过1H-NMR(氢谱)确认脱保护进行完全，并计算引发的聚氨基酸嵌段的聚合度DPn。
优选的，所述引发的聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为109，得到最终产物为PEG45-b-PLL109。
本发明所述的聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体按照如下方法合成：羟基为核心端的三代脂肪族聚醚型树枝分子(G3-ol)与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得亚磷酰胺活化试剂(G3-P)，然后与负载于多孔玻璃小球(CPG)上的DNA进行半固相合成，再依次通过四唑的活化、碘水氧化、浓氨水的脱保护并切掉CPG小球，最终得到聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体。
优选的，所述的DNA序列是经过设计后不具有特定二级结构的单链，其序列为：5’-TTTTAC ACA TCT ACT TCA-3’(DNA18)；此时合成的聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体为G3-b-DNA18，
上述聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的合成过程如图1所示。
进一步的，本发明将合成的聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体溶解于纯水中建立聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体的自组装体系，因为没有加入NaCl等电解质溶液，因此避免了电解质溶液对静电作用的屏蔽效应，从而可以利用电荷间的静电相互作用来对组装结构进行调控。在纯水体系中，聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体仍然能自组装形成球形的胶束结构，在该胶束结构中，依然是以树状分子组成胶束的疏水性内核，而胶束外壳结构为亲水性的带负电的DNA。该胶束具有这样的结构特征，更容易通过加入带正电荷的聚赖氨酸(PLL)与胶束带负电的DNA外壳发生静电相互作用，从而也有利于通过电荷相互作用调控组装结构的形貌。
在本发明的另一方面，提供一种超分子组装体的制备方法。
一种基于聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体的超分子组装体的制备方法，包括如下步骤：将聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体分别溶于水后制成溶液，再将聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)溶液加入到聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体溶液中混合均匀。
在本发明的又一方面，提供一种超分子组装体的形貌调控方法。
一种基于聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体的超分子组装体的形貌调控方法，包括如下步骤：(1)先将聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体按照等电荷比例混合；(2)再逐步增加体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)的含量，直至体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体达到等摩尔比。
优选的，所述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸为PEG45-b-PLL109。
优选的，所述聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体为G3-b-DNA18。
进一步优选的，所述步骤(2)中，当聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的电荷比为6:1时，体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)达到等摩尔比。
当聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体与聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸等电荷比例混合时，由于聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸中带正电荷的聚赖氨酸(PLL)嵌段数较多，因此每条聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸与多条聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体通过PLL和DNA间的电荷相互作用，形成电荷中性的锥形组装体参与到整个自组装过程中，这些锥形结构由于PEG嵌段的亲水性、G3-(DNA-PLL)嵌段的疏水性，使它们通过交叉并排的方式排列形成具有条纹状结构的片层形貌，如图2所示。
当体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸的含量继续增加时，优选的，当聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸与聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体的电荷比增加到6:1时，破坏了原来组装结构中电荷平衡的状态。由于嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸中聚赖氨酸多余正电荷之间的互相排斥作用，使新形成的组装结构中带状条纹发生弯曲，曲率的变化最终导致组装形貌的变化，从而形成具有不同尺寸大小的盘状结构。在新形成的盘状结构中，内部的分子排列方式与电荷中性时的结构具有相似性，可以认为聚赖氨酸嵌段多余正电荷的排斥作用是导致组装形貌发生改变的直接原因。
上述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体在不同摩尔比例混合时的自组装过程参见图2所示。
本发明提供了一种基于聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸和聚脂肪醚树状分子-DNA杂化体的超分子组装体及其制备方法，并通过改变超分子组装体中二者的比例关系实现了对于超分子组装体的形貌调控，从而为超分子组装结构的性质与组装机理研究拓展了新的思路，并使进一步拓宽超分子材料的应用领域成为可能。
附图说明
图1为聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的合成示意图。
图2为聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)不同摩尔比例混合时的自组装过程示意图。
图3为实施例5聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)在纯水溶液中形成的自组装结构在透射电子显微镜(TEM)下的形貌。
图4为实施例6聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的等电荷比共混超分子组装体在透射电子显微镜(TEM)下的形貌。
图5为实施例7聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的等摩尔比共混超分子组装体在透射电子显微镜(TEM)下的形貌。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：合成α-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)
(1)将L-赖氨酸(H-Lys(Z)-OH)和当量20％过量的三光气，于四氢呋喃(THF)溶剂中50℃反应至澄清后再反应一个小时，即转化成L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)的结构。
(2)获得的L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)单体粗产物在手套箱中经四氢呋喃与正己烷重结晶纯化三次后得最终产物待用。
实施例2：合成聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)
(1)首先将单甲氧基聚乙二醇伯胺(mPEG-NH2，Mn＝2000g mol-1)在Schlenk瓶中50℃油浴真空干燥大约6h，后冷却到室温；
(2)将实施例1的L-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐(Lys(Z)-NCA)在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，然后用注射器抽取后转移至Schlenk瓶中在氮气保护及室温下反应；利用FT-IR(傅里叶变换红外光谱分析仪)光谱确认反应完成后，取少量样品配制成5mg/mL进行SEC/LLS(体积排除色谱/激光散射)测试，确定多分散性(PDI)与分子量(Mn)；
(3)过量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解产物，加入5倍当量的氢溴酸(HBr)或冰醋酸(CH3COOH)，在冰水浴中4h后用乙醚沉淀；(4)用稀HCl调节pH值使产物溶于水中，透析后,冷冻干燥得到产物；
(5)通过1H-NMR确认脱保护进行完全，并计算引发的聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为109，得到最终产物PEG45-b-PLL109。
实施例3：制备聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)溶液
将实施例2的PEG45-b-PLL109溶于水，配置成摩尔浓度为9.175μM的溶液，测得溶液中聚赖氨酸侧链质子化的氨基正电荷摩尔浓度为1mM。
实施例4：合成聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)
(1)羟基为核心端的三代脂肪族聚醚型树枝分子(G3-ol)与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得亚磷酰胺活化试剂(G3-P)，
(2)然后与负载于多孔玻璃小球(CPG)上的DNA进行半固相合成，所述的DNA序列是经过设计后不具有特定二级结构的单链，其序列为：5’-TTT TAC ACA TCT ACT TCA-3’，
(3)再依次通过四唑的活化、碘水氧化、浓氨水的脱保护并切掉CPG小球，最终得到聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)。
实施例5：构建聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)自组装体系
将实施例4获得的聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)溶于水，配置成摩尔浓度为200μM的溶液，测得聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)，主链DNA磷酸二酯键中的负电荷摩尔浓度为3.6mM。
常温下静置过夜后，透射电子显微镜(TEM)下观察聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的自组装结构的形貌，结果如图3所示。
透射电子显微镜(TEM)的表征结果表明，在纯水体系中，聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)能自组装形成球形的胶束结构，在该胶束结构中，依然是以树状分子组成胶束的疏水性内核，而胶束外壳结构为亲水性的带负电的DNA。
实施例6：建立聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的等电荷比共混超分子组装体
将实施例3的聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)溶液加入到实施例5的聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)自组装体系中，PEG45-b-PLL109与G3-b-DNA18的摩尔比为0.165:1，由于单链DNA的嵌段数相对较少(18)，而聚赖氨酸嵌段数相对较多(109)，此时DNA与聚赖氨酸嵌段已经是等电荷比混合。
常温下静置过夜后，透射电子显微镜(TEM)下观察共混超分子组装体的形貌，结果如图4所示。
图4的TEM的表征结果表明，由于PEG45-b-PLL109两嵌段共聚物中带正电荷的聚赖氨酸(PLL)嵌段与G3-b-DNA18胶束结构中带负电的DNA外壳发生静电相互作用，使自组装结构从球状胶束状态转变成带条纹的无定形片层状组装形貌。形成的组装结构中条纹的宽度大约为7nm左右，这与G3-b-DNA18的尺寸基本吻合(在自由伸展状态下G3-b-DNA18的分子尺寸大约为8.7nm)，推测两亲性分子G3-b-DNA18在条纹状组装结构的形成过程中发挥了模板性骨架作用。
实施例7：建立聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体(G3-b-DNA18)的等摩尔比共混超分子组装体
向实施例6的共混超分子组装体中继续加入实施例3的聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG45-b-PLL109)溶液，直至G3-b-DNA18与PEG45-b-PLL109按照等摩尔比混合，此时G3-b-DNA18与PEG45-b-PLL109的电荷比例增加到1:6。
常温下静置过夜后，透射电子显微镜(TEM)下观察共混超分子组装体的形貌，结果如图5所示。
图5的TEM的表征结果表明，由于聚赖氨酸的嵌段数较多，所带有的正电荷数量也比DNA多，共混超分子组装体的组装形貌从等电荷比例时的条纹状无定形组装形貌转变为等摩尔比例时不同大小尺寸的、仍具条纹结构的圆盘状形貌。
本说明书上文中结合具体实施例对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。

Claims (2)

1.一种超分子组装体的形貌调控方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)先将聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸PEG-b-PLL和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体按照等电荷比例混合，(2)再逐步增加体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸PEG-b-PLL的含量，直至体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸PEG-b-PLL和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体达到等摩尔比；
所述步骤(2)中，当聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸PEG-b-PLL和聚脂肪醚树状分子-DNA杂化体的电荷比为6:1时，体系中聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸PEG-b-PLL和聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体达到等摩尔比；
所述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)按照如下方法合成：(1)首先将单甲氧基聚乙二醇伯胺mPEG-NH2在Schlenk瓶中50℃油浴真空干燥6h，后冷却到室温；(2)α-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐Lys(Z)-NCA在手套箱中溶解于干燥二甲基甲酰胺DMF中，转移至前一步的Schlenk瓶中在氮气保护及室温下反应；(3)加入过量乙醚沉淀产物，再用三氟乙酸TFA溶解产物；(4)加入5倍当量的氢溴酸HBr或冰醋酸CH3COOH，在冰水浴中反应4h后用乙醚沉淀；(5)用稀HCl调节pH值使产物溶于水中，透析后冷冻干燥即得，其中所述α-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐Lys(Z)-NCA按照如下方法合成：将H-Lys(Z)-OH和当量20％过量的三光气，于四氢呋喃THF溶剂中50℃反应至澄清后再反应1h，即转化成α-赖氨酸-N-羧基-环内酸酐Lys(Z)-NCA；所述聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体按照如下方法合成：羟基为核心端的三代脂肪族聚醚型树枝分子G3-ol与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得亚磷酰胺活化试剂G3-P，然后与负载于多孔玻璃小球CPG上的DNA进行半固相合成，再依次通过四唑的活化、碘水氧化、浓氨水的脱保护并切掉CPG小球，最终得到聚脂肪醚树状分子-b-DNA杂化体；
所述聚乙二醇-b-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)为PEG45-b-PLL109，其聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为109。
2.权利要求1所述的一种超分子组装体的形貌调控方法，其特征在于，所述的DNA是经过设计后不具有特定二级结构的单链，其序列为：5’-TTT TAC ACA TCT ACT TCA-3’。
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