WO2004099287A1

WO2004099287A1 - ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体

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Publication number: WO2004099287A1
Application number: PCT/JP2004/006488
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Naoki Kanayama; Keiji Itaka; Shigeto Fukushima; Atsushi Harada
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2003-05-08
Filing date: 2004-05-07
Publication date: 2004-11-18
Also published as: EP1621569B1; AU2004236542B2; EP1621569A1; US8318205B2; US7780957B2; AU2004236542A1; US20070059271A1; KR101111926B1; JP4535229B2; EP1621569A4; CA2524907C; US20100137512A1; JP2004352972A; CA2524907A1; KR20060007049A

Abstract

ポリ(エチレングリコール)セグメントと特定のアミン残基1種以上を側鎖に有するポリ(アミノ酸誘導体)セグメントからなるブロック共重合体が提供される。かような共重合体とポリヌクレオチド等とのポリイオンコンプレックスも提供される。これらのブロック共重合体は、DNAを初めとする作用物質の生体内送達用キャリヤーとして有用である。

Description

明細書ポリェチレングリコール一ポリカチオンプロック共重合体技術分野

本発明は、親水性セグメントとしてポリエチレングリコール構造部分とカチオン性セグメントとして種々構造のァミン残基側鎖を持つポリアミノ酸構造部分を有するブロック共重合体、ならびに該共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質のポリイオンコンプレックスに関する。背景技術

カチオン性のプロック共重合体であるポリエチレングリコール一 b l o c k—ポリ（し一リシン）に代表されるポリエチレングリコールーポリカチオンブロック共重合体とァニオン性高分子は、水中で両者間に作用する静電相互作用を駆動力として球状のミセルを自発的に形成する。この粒子は、粒径が数十ナノメータで、コア（または内核）にカチオンとァニオンのポリイオンコンプレックス、シェル (または外殻）にポリエチレングリコール（以下、 P E Gともいう。）層を有するコアーシェル構造を有しており、ポリイオンコンプレックス（P I C ) ミセルと呼ばれている（例えば、非特許文献 1参照。文献名等は後述する. 以下、同様。）。このように、 P I Cミセルは内核にァニオン性の高分子を保持することが可能であり、数十ナノメータという粒径とコア一シェル構造により生体の異物認識機構を回避することが期待できるため、現在、天然のァニオン性高分子である D N Aの運搬体（ベクター）としての応用が検討されている。このようにカチオンプロック共重合体を用いた遺伝子ベクターの開発の優位性が明らかとなつているにもかかわらず、現在検討されているカチオン性のブロック共重合体は、合成上の制限などの理由から P E G— block—ポリ（ L—リシン）、 P E G— block—ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（例えば、特許文献 1参照。）、 P E G— block—ポリエチレンィミンにとどまつている。

一般的にこれらの P I Cミセルは、生理的条件下で相当安定である力実際の使用に際しては、静脈注射による投与後の希釈によって P I Cミセルが解離してしまうことや、血清タンパク質と相互作用すること等、生理条件下での安定性が十分でない場合も存在する。このため、確実に目的部位へ到達するまでまたは到達した後、一定期間解離せず安定に存在するように、 P I Cミセルの性質を改変する必要がある。このような P I Cミセルの性質を改変する手段として、例えば、上記の P E G — block—ポリ（ L一リシン）のポリ（ L—リシン）セグメントにおける一定の割合の L—リシン単位のアミノ基にメルカプ卜アルキル基を導入し、該基間でジスルフィド結合を形成することにより、 P I Cミセルの安定性を向上させることが提案されている（例えば、特許文献 2参眧） _n

また、新たなタイプのものとして、 P E G— block—ポリ（y8 —ベンジルァスパルテート）のべンジルを、例えば N， N—ジメチルエチレンジァミン等でエステル一アミド交換した共重合体も提案されている（例えば、非特許文献 2参照。）。

ポリカチオンと D N Aによって形成されるミセルにおいてポリカチォンブロックの果たす役割は D N Aとの静電相互作用部としての役割が主であるが、それ以外の機能も付与することが原理的に可能である。その機能の一つとして、プロトンスポンジ効果が考えられる。プロトンスポンジ効果とは、プロトン化度の低いポリアミンがェンドソーム内に取り込まれた際に、 V型 A T P a s eによリエンドソーム内に供給される水素イオンを次々と吸収し、エンドソーム内の P Hの低下を妨げ、その翁果ェンドソーム内の浸透圧の上昇に伴う水の浸入でェンドソー厶が膨張し、結果的にエンドソームの破壊を誘起することを指す。この効果によリ、 D N Aの細胞質への移行が促進され、遺伝子発現効率が高まることが期待される。この効果は、バッファ一能を有しているカチオンにおいて見られる効果であり、そのためには p K aの低いカチオンを使用する必要がある。

一方で、遺伝子発現効率には P I Cミセルの安定性や、内包されたり N Aの凝縮状態等も影響を与えると考えられ、これらの要因もポリカチオンの性質に依存すると考えられる。しかし、前述の通り、これまではポリカチオンの種類が限られており、また二種類以上のポリカチオンを同時に導入し、役割を分担させるという発想もなかつたため、これらの要因をコントロールすることは極めて困難であった。

引用文献のリスト

特許文献 1 ：国際公開第 9 8Z46 655号パンフレット（第 20 〜 2 1 頁、実施例 1 0および 1 1参照。）

特許文献 2 ：特開 200 1 — 1 46 556号公報

非特許文献 1 ： Harada and Kataoka, Macromo I ecu I es, 1 9 9

5 , 28, 5 294 - 529 9

非特許文献 2 ： Po I ymer Prepr ints, Japan Voに 5 1 ， N o . 5 ( 2002)

発明の開示例えば、上記の特許文献 2および非特許文献 2に記載されている P E G - b l ock—ポリ力.チオンは安定に D N Aを内包したポリイオンコンプレックスミセル（P I Cミセル）を形成するが、 D N A等の生理活性物質を送達すべき生体の標的の環境または該環境下での生理活性物質の P I Cミセルからの最適な放出速度の多様性を考慮すると、さらなる新たな特性を示す P I Cを提供する必要があろう。

本発明者らは、 P E G— b l ock—ポリカチオン共重合体のポリカチォンセグメントを P K aの低い嵩高い側鎖を有するポリカチオンセグメントとすることで、例えば、非特許文献 2に記載された共重合体では P I Cミセルに D N Aがかなリ凝縮された状態で内包されるのに対し、 D N Aが、ほぼフリーの状態で内包されることを見出した。また、このようにフリーの状態で内包された D N Aは、例えば、それを送達すべき標的細胞と生理的条件で接触した場合には、凝縮された状態で内包されたものに対して、有意に遅く放出されることも見出した。

また、ポリカチオン中に一級ァミンと二級または三級ァミンの両方を含む場合、 D N Aとの会合体の形成には一級ァミンが主として関与し. 二級または三級アミンは殆ど関与していないことも見出し、さらに鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（ 1 ) ポリエチレングリコールまたはその誘導体からなる Aセグメントと、ポリアミノ酸またはその誘導体もしくはそれらの塩からなる Bセグメン卜とを有するポリエチレングリコール一ポリカチオンブロック共重合体であって、 Bセグメント中に、 p K a値が 7 . 4以下の嵩高いアミンを含むか、あるいは一級ァミンと二級ァミン. 三級ァミンまたは四級アンモニゥム塩との両方を含—むことを特徴とする共重合体；特定の態様として、（2) ブロック共重合体の構造が一般式 ( I ) または（ I I ) またはそれらの塩である上記（ 1 ) 記載の共重合体：

(式中、 R ¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C — ^アルキル基を表し、 L ¹、 L ²は連結基を表し、 R² はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R ⁴は R ⁵と同一であるかまたは開始剤残基であり、 R⁵はそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H 一 (C H ₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して p K a値が 7. 4以下の嵩高いァミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩の内一種類または二種類以上を含むァミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり . aは 1〜5の整数であり、 mは 5 ~ 20, 000の整数であり、 nは 2 〜5, 000の整数であり、 Xは 0〜5, 000の整数であるが、 xは nより大きくないとする。）；特定の態様として、（3) ブロック共重合体の構造が一般式（ I I I ) または（ I V) またはそれらの塩である上記（ 1 ) 記載の共重合体：

)

(式中、 R¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の 2アルキル基を表し、 L ¹、し²は連結基を表し、 R² はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R ⁴は R ⁵と同一であるかまたは開始剤残基であり、 R⁵はそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H 一 (C H ₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して p K a値が 7. 4以下の嵩高いァミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級ァミンまたは四級アンモニゥム塩の内一種類または二種類以上を含むァミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり、 aは 1 〜 5の整数であり、 R ⁶はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等であり、 m は 5〜 20, 000の整数であり、 nは 2〜 5 , 000の整数であり、 yは 0〜4， 99 9の整数であり、 zは "！〜 4 , 99 9の整数であるが. zは nより小さく、 y + zは nより大きくないとする。）；

より一層の特定の態様として、（4) R¹がメチル基である上記

(2) または（3 ) 記載の共重合体；

さらに、よリー層の特定の態様として、（5) R¹が置換された直鎖もしくは分枝 C ― ₂アルキル基を表し、ここで置換基がァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 —₆アルコキシカルボニル基、 C_{2 7}ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリー C， eアルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である上記（2) または（3) 記載の共重合体.；

さらに、より一層の特定の態様として、（6) L ¹が一（C H ₂) _b— N H—であり、 bが 1 〜 5の整数である上記（ 2) 〜（5) のいずれかに記載の共重合体、（7 ) L²が一（C H ₂) 。一 CO—であり、 cが 1 〜 5の整数である上記（ 2) ；

さらに、よリー層の特定の態様として、（3) 〜（5) のいずれかに記載の共重合体；

さらに、よリー層の特定の態様として、（8) R²がメチレン基である上記（ 2) 〜（7 ) のいずれかに記載の共重合体；さらにより特定の態様として、（9) Xが下記の A、 B、 C、 Dまたは E群に示す式で表される基である上記（2) 〜（8) のいずれかに記載の共重合体： A群：

N 、

ノ N ノ N、

、

ノ 0' 、Ν'

X²

H₃C

B群

,N、

または ― (NR⁷(CH₂)d)_e - NH₂

X³

C群

— (CH₂)广 NH₂

D群

-(NR⁷(CH₂)_d)e-NHR⁸ 、 - N(CH₃)₂ または - N(CH₂CH₃)₂

E群

-(CH₂)_gCH₃ または

(式中、 X²は水素原子または ^—eアルキル基であり、 X³はァミノ〇，— ₆アルキル基を表し、 R⁷は水素原子またはメチル基を表し、 dは 1 〜 5の整数を表し、 eは 1 〜 5の整数を表し、 f は 0〜 1 5の整数を表し、 R⁸は保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等を表し、 gは 0〜 1 5の整数を表す。）；

さらに、よリー層の特定の態様として、（ 1 0) R³がァセチル基、ァクリロイル基またはメタクリロイル基である上記（ 2) ~ (9) のいずれかに記載の共重合体；

さらによリー層の特定の態様として、（ 1 1 ) R⁴が一 N H— R⁹であり、ここで R ⁹は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C，― ₂₀アルキル基を表す上記（2) 〜（ 1 0) のいずれかに記載の共重合体；

別の態様として、（ 1 2) 上記（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質を含んでなるポリイオンコンプレックス；より特定の別の態様として、（ 1 3) コア部に核酸または陰イオン性タンパク質を担持し、そしてシェル部にポリエチレングリコールセグメン卜が主として存在するポリマーミセルの形態にある上記（ 1 2) 記載のポリイオンコンプレックス、に関する。

発明の効果

本発明により、 P I Cミセル中の遺伝子の凝縮状態、ミセルからの遺伝子の放出速度、プロトンスポンジ効果、ミセルの安定性といった遺伝子導入効率に影響を与える要因のコントロールが可能となる。本発明により高い遺伝子導入効率を有する P I cミセルの提供が可能となる。本発明により有用な非ウィルス性遺伝子ベクターの提供が可能となる。図面の簡単な説明

図 1は、 M e O— P EG— MO P Aと p— D N Aの種々の NZ P比で混和した溶液の電気泳動の結果（それぞれ、左から、 NZP比： 0、 1 0、 5、 4、 3、 2、 1 、 0) を示す図に代わる写真である（なお、 N /P = 0とは、 p— D N Aのみを泳動したレーンを指す。）。

図 2は、 M e O— P EG— D E Tと p— D N Aの種々の NZ P比で混和した溶液の電気泳動の結果（それぞれ、左から.、 NZP比： 1 0、 5. 3、 2、 1 、 0. 5、 0. 25、 0) を示す図に代わる写真である（なお、 NZP- 0とは、 p— D N Aのみを泳動したレーンを指す。）。図 3は、動的光散乱（D L S) により測定された M e O— P E G— M O P Aと p— D N Aからなる会合体の粒度分布を示すグラフである。図 4は、 M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aからなる会合体の粒径の Nノ P比依存性の測定結果を示すグラフである。

図 5は、動的光散乱（D L S) により測定された M e O— P E G— D E Tと p— D N Aからなる会合体の粒度分布を示すグラフである。

図 6は、 M e O— P E G— D E Tと p— D N Aからなる会合体の粒径の N P比依存性の測定結果を示すグラフである。

図 7は、 M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aからなる会合体のゼータ電位測定結果を示すグラフである。

図 8は、 M e O— P EG— D E Tと p— D N Aからなる会合体のゼータ電位測定結果を示すグラフである。図 9は、 M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aからなる会合体のェチジゥムブロマイドアッセィの結果（ 1 0mM T r i s— H C I 緩衝液、 p H = 7. 4) を示すグラフである。

図 1 0は、生理塩濃度条件下における M e O— P E G— MO P Aと p 一 D N Aからなる会合体のェチジゥムブロマイドアツセィの結果（ 1 0 mM T r i s - H C I 緩衝液 + 1 50 mM N a C I 、 p H = 7. 4) を示すグラフである。

図 1 1 は、 M e O— P E G— D E Tと p— D N Aからなる会合体のェチジゥムブロマイドアッセィの結果（ 1 OmM T r i s— H C I 緩衝液、 p H = 7. 4) を示すグラフである。

図 1 2は、 M e O— P E G—MO P Aと p— D N Aからなる会合体ミセル（N/P = 5) の 293 T細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである（それぞれ、 4時間および 24時間インキュベーションによる。） < 図 1 3は、 M e O— P EG— D E丁、 M e O— P E G— DMA P Aまたは M e O— P EG— DA Pと p— D N Aからなる会合体ミセル（N P = 1 0 ) の 293 T細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである（ 2 4時間インキュベーションによる。）。

発明を実施するための最良の形態

一般式（ I ) 、（ 1 1 ) 、（ I I I ) または（ I V) において、 R ¹ は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C， ₂アルキル基を表すが、 C ―， ₂アルキルとしては、メチル、ェチル、 n—プロピル、 ί s o—プロピル、 n—ブチル、 s e c—ブチル、 t e r t —プチル、 n—ペンチル、 n—へキシル、デシル、ゥンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 0, - 6アルコキシカルポニル基、 C₂— ₇ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリ一 C — ₆アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がァセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（一 C HO ：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、またはカルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、本発明に従う共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質とのポリイオンコンプレックスミセルのシェル部に存在することができ、これらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（ F (ab') 2、 F (ab)、等）およびその他の機能性もしくは標的指向性を該ミセルに付与し得るタンパク質等を該ミセルに共有結合するのに利用できる。このような官能基を片末端に有する P EG セグメントは、例えば、 WO 96 32434、 WO 96/332 33、 WO 97 06202に記載のブロック共重合体の P E Gセグメント部の製造法によって、都合よく形成できる。

こうして形成される P E Gセグメント部分とポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分とは、一般式（ I ) 、（ 1 1 ) 、（ I I I ) または（ I V) の共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。

製造方法は特に限定され.るものではないが、一つの方法として、末端にアミノ基を有する P E G誘導体を用いて、そのアミノ末端から、 β — ベンジル一 Lーァスバルテ一ト、 Ν ε— Ζ— L—リシン等の保護ァミノ酸の Ν—力ルボン酸無水物（N CA) を重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖を変換することにより、本発明の共重合体を得る方法が挙げられる。この場合共重合体の構造は一般式（ I ) または（ I I I ) となり、連結基 L ¹は用いた P E G誘導体の末端構造に由来する構造となるが、好ましくは一（C H ₂) _b— N H—であり、かつ bは 1 ~ 5の整数である。

また、ポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、 P E Gセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（ I I ) または（ I V) の構造となることもあり、連結基 L²は特に限定されるものではないが、好ましくは一（C H ₂) _c— CO—であり、かつ cは "！〜 5の整数である。

一般式（ I ) 、（ I I ) 、（ I I I ) または（ I V) 中の R⁵はそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H— ( C H ₂) _a— X基であることができるが、大部分（一般的には、 8 5%以上、好ましくは 9 50/₀以上、より好ましくは 9 8 %以上、特に好ましくは 1 00 %) が - N H - (C H ₂) _a— X基であることが好ましい。また一般式（ I I I ) または（ I V) 中の R⁶はそれぞれ独立して水素原子または保護基であることができるが、大部分が水素原子であることが好ましい。ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c 基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等のことである。

Xは共重合体が本発明の条件を満たす（または本発明の目的に沿う）限り特に制限されないが、 5つの群に分類される残基の中から選ばれる, すなわち、 A群： _P K a値が 7 . 4以下の嵩高いァミン化合物残基

X²

； B群：一級ァミンと二級ァミン、三級ァミンまたは四級アンモニゥム塩の両方を含むァミン化合物残基：

または - (NR⁷(CH₂)_d)_e - NH₂

； c群：一級アミンのみを含むアミン化合物残基：

- (CH₂)厂 NH₂

； D群：二級ァミン、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩のみを含むァミン化合物残基で A群に含まれないもの：

-(NR⁷(CH₂)_d)e-NHR⁸ 、 -N(CH₃)₂ または - N(CH₂CH₃)₂

； E群：ァミンでない化合物残基： -(CH₂)_gCH₃ または

である。

一般式（ I ) または（ I I ) の共重合体の場合、 A群および B群の残基から選ばれるいずれか一つの残基のみを含むのでもよく、 C群は A 群および D群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならず、 D群は B群および C群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならない。また E群は共重合体の物性を変化させるために含ませることができるが、 E群を除いた部分で上記の条件を満たしていなければならない。一般式（ I I I ) または（ I V) の共重合体の場合、 R⁶の少なくとも 1個以上が水素原子であるならば. A群、 B群および D群の残基から選ばれるいずれか一つの残基のみを含むのでもよい。 C群および E群は上記の条件と同じである。

それぞれの群について好ましい残基の例を式で示す。式中、 A群で X ²は水素原子またはアルキル基であり、 B群で X³はアミノ ◦ — ₆ アルキル基であり、 R ⁷は水素原子またはメチル基であり、 d、 eはともに 1 〜 5の整数であり、 C群で f は 0から 1 5の整数であり、 D群で d、 eはともに 1 〜 5の整数であり、 R⁸は Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等の保護基であり、 E群で gは 0〜 1 5の整数であることができる。

ポリアミノ酸構造の側鎖にこれらの残基を導入する方法であるが、特にポリアスパラギン酸構造の場合には、例えば、特許第 27 7 7 5 30 号公報に記載されているようなポリ（yS—ベンジル一 Lーァスパルテート）部分のアミノリシスによるエステルからアミドへの交換反応によつて都合よく製造できる。別法としてはべンジルエステルを接触還元、酸. アル力リ等により加水分解しポリァスパラギン酸またはポリグルタミン酸に変換した後、縮合剤等を用いてこれらの残基を有する化合物を結合させるという方法でも製造できる。

これらのカチオン側鎖は塩になっていてもよく、この場合塩を形成する対イオンとしては C l _、 B r―、 I —、 ( 1 / 2 S O ₄) N 0₃一.

( 1 / 2 C O ₃) _、 ( 1 / 3 P O ₄) 一、 C H₃ COOヽ C F₃COO一. C H 3 S O 3 -> C F ₃ S O ₃—等が挙げられる。

—般式（ I ) 、（ I I ) 、（ I I I ) または（ I V) における R²はメチレン基またはエチレン基を表すが、メチレン基の場合はポリ（ァスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、 R²がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、ァスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在ずるか、あるいはランダムに存在できる。

一般式（ I ) または（ I I I ) における R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表すが、保護基としては ^— ₆アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはァセチル基である。疎水性基としてはべンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としてはメタクリロイル基、ァクリロイ.ル基が挙げられ、かような重合性基を一般式（ I ) または（ I I I ) の共重合体が有する場合には、これらの共重合体は、所謂、マクロマーとして使用でき、例えば. P I cミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。

これらの保護基、疎水性基、重合性基を共重合体の末端に導入する方法としては、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられている手法が挙げられる。

一般式（ I I ) または（ I V) における R⁴は R⁵と同じく水酸基、ォキシベンジル基、一 N H— ( C H ₂) _a— X基であることができるが, 低分子の開始剤を用いて保護ァミノ酸の N C Aを重合させてポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントを合成してから P E Gセグメントと結合させる方法でブロック共重合体を製造する場合には、使用した開始剤に由来する構造をとることもできる。すなわち一 N H— R⁹であり、 R ⁹が未置換または置換された直鎖もしくは分枝の C，― ₂。アルキル基である。

P E Gセグメントの鎖長およびポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメン卜の鎖長を規定する、 mおよび nは、それぞれ 5〜 20, 000 の整数、好ましくは 1 0〜5, 000、特に好ましくは 40〜500、および 2〜5, 000、より好ましくは 5〜1， 000、特に好ましくは 1 0〜 200であるが、一般式（ I ) 、（ 1 1 ) 、（ I I I ) または ( I V) の共重合体が、核酸または陰イオン性タンパク質と P I Cミセルを形成するものであれば、限定されるものではない。したがって、本明細書では便宜上、ポリエチレングリコール、ポリカチオン等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」に.分類されるものも包合される概念として用いている。また、ポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの構成割合を規定する、 x、 y、 zは、それぞれ 0〜5, 000の整数（ただし nより大きくない。〉、 0〜4, 99 9の整数、 1〜4， 99 9の整数（ただし zは nより小さく、 y + zは nより大きくない。）であるが、 zは 1 0~ n— 1 0の範囲であることがより好ましい。また各構成成分はランダムに分布していることもブロック状に分布していることもどちらも可肯 gである。

一般式（ I ) 、（ 1 1 ) 、（ I I I ) または（ I V) で表される共重合体は、核酸、例えば、公知の遺伝子治療等に用いられる遺伝子または治療用必要なタンパク質をコードする遺伝子、かような遺伝子を含むプラスミド等の D N A断片、 R N A断片、アンチセンス D N A等、あるいは陰イオン性（特に、生理的 p Hにおいてァニオンに荷電しうる）タンパク質（またはペプチド）と水性媒体（水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい。）中、室温下に攪拌することにより、共重合体のポリカチォン部と例えば、核酸とのポリイオンコンプレックスをコア部とし、 P E G層をシェル部とする P I Cミセルを、都合よく形成できる。本発明によれば、かような P I Cまたは P I Cミセルそれ自体も提供される。以下、具体例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらの例は、説明の目的にのみ向けられるものと、理解されている。

実施例 1 ：ポリエチレングリコ一ルーポリ（jS—べンジルー Lーァスパルテート）一 A cブロック共重合体の合成

片末端メトキシ、片末端アミノプロピルで平均分子量が 1 2, 000 のポリエチレングリコール（M e O— P E G— N H ₂) を塩化メチレンに溶解し、 β一ベンジル一 Lーァスパルテート一 Ν—力ルポン酸無水物 (B L A-N C A) を N， N—ジメチルホルムアミド（DM F) と塩化メチレンの混合溶媒に溶解して加え、 40°Cで 2日間反応させて、ポリエチレングリコール一ポリ（ーべンジルー Lーァスパルテート）プロック共重合体（M e O— P E G— P B L A) を得、さらに無水酢酸によリ N末端のァセチル化を行い、 M e O— P E G— P B L A— A cを得た, ¹ H— N M Rによる解析から、 P B L A部分の平均分子量は 1 4 , 00 0、重合度は 68であった。実施例 2 ：モルホリノプロピルァミンによるアミノリシスでのポリェチレンダリコール一ポリカチオンブロック共重合体の製造

CH30-(CH₂CH₂0)_m-CH₂CH₂CH₂NH-(COCHNH)„-COCH₃

CH₂

C=0

NH

R

[上式中、 R

実施例 1で得られた M e O— P E G— P B L A— A cをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またモルホリノプロピルアミンを、水素化カルシゥムを乾燥剤として減圧蒸留した。

M e O— P E G— P B LA— A cを乾燥 D M Fに溶解し、 P B L Aュニッ卜に対し 1 0倍量のモルホリノプロピルァミンを加え、アルゴン雰囲気下、 40°Cで 24時間攪拌した。 24時間後、反応溶液を 1 0%酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量 3， 500の透析膜で 0. 0 1 N 一塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（M e O— P E G— MO P A) を得た。得られたポリマーの構造は、 ¹ H— NMRにより確認を行った。

その結果、 M e O— P E G— P B L A— A cのべンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。

実施例 3 ：ジエチレン卜リアミンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール一ポリカチオンプロック共重合体の製造

H

〔上式中、

実施例 1で得られた M e O— P E G— P B L A— A cをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またジエチレントリアミンを、水素化カルシゥムを乾燥剤として減圧蒸留した。

M e O— P E G— P B LA— A cを乾燥 D M Fに溶解し、 P B L Aュニッ卜に対し 50倍量のジエチレントリアミンを加え、アルゴン雰囲気下、 40°Cで 24時間攪拌した。 24時間後、反応溶液を 1 0%酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量 3, 500の透析膜で 0. 0 1 N—塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物（M e O— P E G— D E T) を得た。

得られたポリマーの構造は、 ¹ H— NM Rによリ確認を行った。

その結果、 M e O— P E G— P B L A— A cのべンジル基に帰属されるピークが完全消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。比較例 1

N , Ν—ジメチルプロピルァミンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール一ポリカチオンプロック共重合体の製造

〔上式中、

実施例 1 で得られた M e O— P E G— P B L A— A cをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。また N， N—ジメチルプロピルアミンを、水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。

M e O— P E G— P B LA— A cを乾燥 D M Fに溶解し、 P B L Aュニッ卜に対し 1 0倍量の N, N—ジメチルプロピルアミンを加え、アルゴン雰囲気下、 40°Cで 24時間攪拌した。 24時間後、反応溶液を 1 0%酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量 3 , 500の透析膜で 0. 0 1 N—塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（M e O— P E G— DMA P A) を得た。

得られたポリマーの構造は、 ¹ H— N M Rにより確認を行った。

その結果、 M e O— P EG— P Bし A— A cのべンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。

比較例 2

ジァミノプロパンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール一ポリカチオンブロック共重合体の製造〔上式中、 R= ^^^^^NH₂ ^ 実施例 1で得られた M e O— P E G— P B L A— A cをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またジァミノプロパンを、水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。

M e O— P E G P B L A— A cを乾燥 D M Fに溶解し、 P B L Aュニッ卜に対し 5 0倍量のジァミノプロパンを加え、アルゴン雰囲気下、 4 0 °Cで 2 4時間攪拌した。 2 4時間後、反応溶液を 1 0 %酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量 3 , 5 0 0の透析膜で 0. 0 1 N—塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（M e O— P E G— D A P ) を得た。

得られたポリマーの構造は、 ¹ H— N M Rによリ確認を行った。

実施例 4 ：ブロック共重合体とプラスミド D N Aによる P I Cミセルの調製

ルシフェラーゼをコードしたプラスミド D N A ( p— D N A, p G L 3 - L u c ) はキアゲン社、 M a x i k i tにより精製し、 5 0 μ g m I となるように卜リス一塩酸緩衝液（ 1 0 mM p H = 7. 4 ) で溶液調製したものを使用した。実施例 2、実施例 3、比較例 1 または比較例 2で作製した共重合体溶液（トリスー塩酸緩衝液（ 1 0 mM p H = 7. 4 ) ) と p D N A溶液を各 N Z P比を満たすように混和し、この溶液を室温暗所でー晚静置した。溶液は透明であり、凝集体、沈殿の生成は確認されなかった。なお NZP比とは [ブロック共重合体中の力チオン残基の濃度] / [ p— D N A中のリン酸基濃度] であるが、実施例 3で作製した M e O— P E G— D E Tに限り一級ァミノ基のみの濃度で計算している。

実施例 5 ：電気泳動によるキャラクタリゼーション

0. 9 w t %のァガロースゲルを調整し、 p— D N A濃度 = 0. 1 7 μ \ a n e、泳動バッファ一はトリスー塩酸緩衝液（3. 3 mM、 p H = 7. 4) を用い、引加電圧 50 V、泳動時間 2時間の条件で泳動を行った。終了後、ェチジゥムブロマイド溶液（0. 5 m gZ I ) で 1 時間染色を行った。

図 1 に M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aの混合溶液の結果、図 2に M e O— P EG— D E Tと p— D N Aの混合溶液の結果を示す。共に NZP比 > 1 においてフリーの p— D N Aに起因するバンドは消失しており、 P I Cミセルの形成が示唆された。また NZP比の定義の仕方から考えて、 M e O— P E G— D E Tでは会合体の形成にはプロック共重合体中の一級ァミンが主として関与し、二級アミンは殆ど関与していないことが示唆された。会合体中では二級ァミンが脱プロトン状態で系中に残留しており、バッファ一能を維持していると考えることができる, 実施例 6 ：動的光散乱法 (D L S) によるキャラクタリゼーシヨン粒径測定を動的光散乱によって行った。結果を図 3〜 6に示す。図 3. 4は M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aの混合溶液についての結果であり、図 5、 6は M e O— P E G— D E Tと p— D N Aの混合溶液についての結果である。図 3、 5は NZP比が 1の時の粒度分布の図であリ、図 4、 6は種々の NZP比における粒径測定の結果である。これらの結果から、どちらの系も粒径が 80〜 1 00ナノメータの単峰性の会合体粒子を形成しており、 N P比にかかわらずほぼ一定の粒径の値を示すことがわかる。

実施例 7 ：ゼータ電位測定によるキャラクタリゼーション

ゼータ電位測定の結果を図 7、 8に示す。図 7は M e O— P E G— M O P Aと p— D N Aの混合溶液についての結果であり、図 8は M e O— P E G— D E Tと p— D N Aの混合溶液についての結果である。どちらの系も、 NZP比の上昇に伴い若干正の電荷を帯びる傾向が見られるものの、絶対値は非常に小さく、ほぼ OmVに近いゼ一タ電位を示した。このことは形成された会合体粒子の表面が電気的に中性に近いということであり、表面に P E G層を有し、内核にポリイオンコンプレックスを有するコアーシェル型のミセル構造であることを示唆するものである, 実施例 8 ：ェチジゥムブ口マイドアッセィによるキャラクタリゼ一ション

P I Cミセル内部の p— D N Aの凝縮の程度を、ェチジゥムブ口マイドアッセィにより評価した。 590 n mの蛍光強度は、ミセル内部の p 一 D N Aの凝縮の度合いを反映している。すなわち、蛍光強度が高いほど p— D N Aは緩和された（フリーな）状態であり、蛍光強度が低いほど凝縮した状態にあると言える。なお、プロットにおいては、所定の濃度の p— D N Aにェチジゥムブ口マイドを加えた時の 5 90 n mの蛍光強度を 1 00と規格化し、それに対する相対強度としてプロットしている。 M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aからなるミセルについての測定結果を図 9に示す。 NZP比の上昇に伴い蛍光強度が若干減少していく傾向は見られるが、 NZP= 1 0においても約 70という値を示した, 従来研究されてきたプロック共重合体と比べて、この値は非常に高い値である（通常、ポリリシンなどの D N Aを効率よく凝縮させるポリカチオンを用いた場合には、相対蛍光強度は NZP > 1で 5程度まで減少する。）。

また、生理的濃度（ 1 50mM) の食塩を添加した系で同様に測定を行った結果を図 1 0に示す。相対蛍光強度はさらに 1 00に近づき、ミセル内の p— D N Aがフリ一の p— D N Aとほぼ同じ程度まで緩和状態であることがわかる。実際に培養細胞、生体内にミセルを投与する場合には図 9よりも図 1 0に示す結果の状態の方がより近い条件であると考えられる。

M e O— P E G— D E Tと p— D N Aからなるミセルについての測定結果を図 1 1 に示す。 NZ P比が 0〜 2までの間は、 NZP比の上昇に伴い急激な蛍光強度の減少が見られ、 NZP比が 2〜 1 0の間においても、緩やかに蛍光強度が減少していく傾向が見られた。

実施例 9 ：遺伝子導入効率の評価

NZP = 5で M e O— P E G— MO P Aと p— D N Aのミセルを調製し、これを培養細胞（293 T細胞）と一定時間接触させた後、培地交換を行い、さらに 24時間培養した後、ルシフェラ一ゼアツセィ、タンパク質の定量によって遺伝子導入効率を評価した。結果を図 1 2に示す ₍ ミセルと細胞の接触時間が 4時間の場合と 24時間の場合を比較すると. 接触時間の延長により飛躍的に遺伝子導入効率が向上しているのがわかる。これは、ミセル中に内包された遺伝子のリリース速度の変化に起因するものであると考えられる。

M e O— P E G— D E Tについては、比較例 1、 2で作製した M e O 一 P E G— DMA P Aおよび M e O— P E G— D A Pを比較対照試料として評価を行った。 M e O— P E G— D E Tは一級ァミンと二級ァミンを同時に有するもの、 M e O— P E G— DMA P Aは三級ァミンのみを有するもの、 M e O— P E G— D A Pは一級ァミンのみを有するものである。三種類の共重合体それぞれと p— D N Aのミセルを NZP = 1 0 で調製し、これらを培養細胞（ 29 3 T細胞）と 24時間接触させた後. 培地交換を行い、さらに 24時間培養した後、ルシフェラーゼアツセィ. タンパク質の定量によって遺伝子発現効率を評価した。結果を図 1 3に示す。 M e O— P E G— D E Tは他の二種類の共重合体に比べ高い遺伝子導入効率を示した。これはコンプレックス形成に関与するァミン（一級）とバッファ一能を発揮することが期待されるァミン（二級）とを、一つの共重合体中に導入することによって、細胞内に取り込まれた P I Cミセルに内包された P— D N Aの細胞質への移行が、プロトンスポンジ効果によって促進されたことに起因するものと考えられる。

産業上の利用可能性

本発明に従えば、高い遺伝子導入効率を有する P I Cミセルの提供が可能となる。また、本発明により有用な非ウィルス性遺伝子ベクターの提供も可能となる。したがって、本発明は、医療産業で利用可能である。

Claims

請求の範囲

1. ポリエチレングリコールまたはその誘導体からなる Aセグメントと、ポリアミノ酸またはその誘導体もしくはそれらの塩からなる B セグメン卜とを有するポリエチレンダリコール一ポリカチオンプロック共重合体であって、 Bセグメント中に、 p K a値が 7. 4以下の嵩高いアミンを含むか、あるいは一級ァミンと二級ァミン、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩との両方を含むことを特徴とする共重合体。

2. ブロック共重合体が、一般式（ I ) または（ I I ) :

RiO-(CH₂CH₂0)_m-U-(CO

RiO-(CH₂CH₂0)_m-LKN

式中、 R ¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C，—， ₂アルキル基を表し、

L ¹、 L²は連結基を表し、

R ²はメチレン基またはエチレン基を表し、

R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、

R ⁴は R ⁵と同一であるかまたは開始剤残基であリ、 R ⁵はそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H— （C H ₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して p K a値が 7. 4以下の嵩高いァミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり、 aは 1 ~ 5の整数であり、

mは 5~ 20， 000の整数であり、そして nは 2〜 5 , 000の整数であり、 Xは 0〜 5， 000の整数であるが、但し、 Xは nょリ大きくないことを前提とする、

で表される共重合体またはそれらの塩である請求項 1記載の共重合体。

3. ブロック共重合体が、一般式（ I I I ) または（ I V) :

RiO— (CH₂CH₂0)_m - U - (COCHNH)_n— _y— _z-(COR2(j)HNH)厂 (GO(pHNH)_z— R3

RiO-(CH₂CH₂0)_m- 1_2- (NH

式中、 R ¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C ,—， ₂アルキル基を表し、

L ¹、 L²は連結基を表し、

R ²はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、

R ⁴は R ⁵と同一であるかまたは開始剤残基であり、

R⁵はそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H— (C H

₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して p K a値が 7. 4以下の嵩高いァミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり、 aは

1〜 5の整数であり、

R ⁶はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等であり、 mは 5〜 20 , 000の整数であり、

nは 2〜5, 000の整数であり、 yは 0〜4, 9 99の整数であリ、そして zは 1〜4, 9 9 9の整数であるが、但し、 zは nより小さく、 y + zは nょリ大きくないことを前提とする、

4. R ¹がメチル基である請求項 2または 3記載の共重合体。

5. R ¹が置換された直鎖もしくは分枝 C ， ₂アルキル基を表し. ここで置換基がァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 C，—₆アルコキシカルポニル基、 C_{2 7}ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリ一（ —6アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルァミノ基である請求項 2または 3記載の共重合体。

6. L ¹が一（C H₂) _b— N H—であり、 bが 1〜5の整数である請求項 2〜 5のいずれかの一項に記載の共重合体。

7. L²がー（C H ₂) 。一 CO—であり、 cが 1 〜 5の整数である請求項 2〜 5のいずれかの一項に記載の共重合体.。

8. R²がメチレン基である請求項 2〜 7のいずれかの一項に記載の共重合体。

9. Xが下記の A、 B、 C、 Dおよび E ：

A群：凡 N、凡

N-

、Ν'

X²

H₃C

B群

または -(NR⁷(CH₂)d)e-NH₂

c群

D群：

-(NR⁷(CH₂)_d)e-NHR⁸ 、 - N(CH₃)₂ または - N(CH₂CH₃)₂

-(CH₂)_gCH₃ または

上式中、 X²は水素原子または ^ eアルキル基であり、

X ³はァミノ c ₆アルキル基を表し、

R ⁷は水素原子またはメチル基を表し、

dは 1 〜 5の整数を表し、

eは "！〜 5の整数を表し、

f は 0〜 1 5の整数を表し、

R ⁸は保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等を表し、そして

gは 0〜 1 5の整数を表す、

に示される式で表される基から成る群より選ばれる、請求項 2〜 8のいずれかの一項に記載の共重体。

1 0. R ³がァセチル基、ァクリロイル基またはメタクリロイル基である請求項 2 ~ 9のいずれかの一項に記載の共重合体。

1 1 . R⁴が一 N H— R⁹であり、ここで R ⁹は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C，― ₂₀アルキル基を表す請求項 2〜 1 0のいずれかに記載の共重合体。

1 2 . 請求項 1 〜 1 1のいずれかの一項に記載の共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質を含んでなるポリイオンコンプレックス。

1 3 . コア部に核酸または陰イオン性タンパク質を担持し、そしてシェル部にポリエチレンダリコールセグメン卜が主として存在するポリマーミセルの形態にある請求項 1 2記載のポリイオンコンプレックス ₍