CN105418931A - 聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子聚合物领域，特别涉及一种聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物，所述嵌段聚合物的重均分子量为56400-78000Da，该化合物是由活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与聚乙烯亚胺-胆固醇反应得到的，该化合物的生物相容性效果好，生物降解性好，毒性低，作为非病毒基因载体材料具有转基因效率高的特点，同时还具有稳定性好，体内循环时间长，细胞摄取强等优点。
Description
技术领域
本发明属于高分子聚合物领域，尤其涉及聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物及制备方法。
背景技术
聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)是由维生素E琥珀酸酯的羧基与聚乙二醇(PEG)1000的羟基酯化而成，是经FDA认证的安全高分子材料，且TPGS已经载入《美国药典》。聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯分子结构有亲水基团和亲油基团而有表面活性，且因其独特的性质，被用作增溶剂、乳化剂、吸收促进剂等。因TPGS具有两亲性及良好的水溶性，对水难溶性和亲脂性药物来说是个很理想的非离子性表面活性剂。美国Eastman是最早开发TPGS并上市的公司，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯现在在药物制剂研究中已经得到了广泛的应用。聚乙二醇(PEG)作为药物载体，具有体内长循环、延长半衰期、提高药物的细胞摄取等优点。TPGS除了拥有PEG的优点外，在药物传递系统的应用中还具有更大的优势：首先，TPGS可以显著提高药物包封率，从而能增强药物的细胞摄取，增加癌细胞的死亡率；其二，与其他表面活性剂相比，TPGS具有生育酚酯的结构，从而有一定的抗氧化性，这有助于增加制剂的稳定性；其三，可应用于前药设计，提高生物利用度；其四，有很多报道声称，TPGS是一种P-糖蛋白抑制剂，它通过与P-糖蛋白上非转运活性位点结合，导致P-糖蛋白构象改变，进而丧失转运功能。转运受P-糖蛋白阻滞的药物，如阿霉素、紫杉醇、长春碱、秋水仙碱等，与TPGS合用后，都能明显增加药物在胃肠道内的吸收，提高其生物利用度。
聚乙烯亚胺(PEI)，为富含氮原子的阳离子高分子材料，分子量范围宽，多为1KDa到1000KDa之间，结构骨架(-CH2-CH2-NH-)中每3个原子含有一个氨基，与聚赖氨酸(PLL)及树枝状高分子(PAMAM)具有类似性质。聚乙烯亚胺(PEI)是转染效率较高的阳离子聚合物之一，被广泛用作DNA、寡核苷酸和siRNA等基因药物的阳离子聚合物载体系统。它分为线状和分枝状两种分子结构，均可在生理条件下发生质子化，使得PEI具有较高的正电荷密度，其带正电荷的氨基基团与核酸带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用而发生电性中和，能够有效地压缩带有负电荷的DNA，形成稳定的纳米-核酸复合物，保护DNA免受血装中DNA酶的降解，表面电荷呈中性或弱阳性，与表面带负电荷的细胞膜相互作用而进入细胞内，具有较高的靶向性和转染效率。PEI的作用机制是当其携带DNA进入细胞后，在酸性内涵体内发生质子化，导致离子内流，使得内涵体膨胀而破裂，即“质子海绵效应”，从而释放出PEI/DNA复合物，促进DNA向细胞核内转运，实现基因转染。理想的非病毒载体基因递送系统能够有效地规避网状内皮系统的吞噬和血浆中DNA酶的降解，穿透细胞膜，实现内涵体的逃逸，从而成功地将DNA带入细胞核。聚乙烯亚胺(PEI)是一种广泛研究的用于基因递送的非病毒载体，其主要优势具有良好的体外转染效果。然而随着PEI分子量的增加，其潜在的细胞毒性也明显增大，尤其是平均分子量为25000的PEI。其次PEI体内稳定性差，容易和血浆蛋白结合，从而被快速消除。由于这些缺点的存在，限制了PEI的应用。据文献报道，将亲水性的多聚物如PEG修饰在PEI上，能够显著改善其PEI的药代动力学性质。PEG化后的PEI/DNA复合物降低了表面正电荷，从而降低了PEI与血浆蛋白的作用，延长了在血液中循环的时间，同时也降低了毒性。
胆固醇(cholesterol)，又名胆甾醇，分子式为C27H46O，它以醇或脂肪酸酯的形式存在于所有动物的细胞中，尤其存在于脑和脊髓中。胆固醇为具有旋光性的白色结晶固体。胆固醇是一切动物细胞作为细胞膜构造物的物质，使细胞膜能够“识别”并对通透细胞膜的物质进行选择，让代谢废物透出膜外，而将维持细胞生命的有益物质保持。这些功能都基于胆固醇特殊的化学结构、构型以及电荷分布。胆固醇作为生物膜的重要组成部分，能调节生物膜的流动性，在相变温度以下增加生物膜的流动性；在相变温度以上能减小生物膜的流动性。此外，胆固醇还具有增加生物膜机械强度和减小生物膜渗透性的功能。生物分子胆固醇作为哺乳动物细胞重要组成部分之一，已被誉为“生物学中最具装饰性的小分子”。胆固醇分子由于其高度的疏水性甾醇骨架，良好的生物降解性和生物相容性，使得其是许多水溶性聚合物疏水改性的最佳选择之一。胆固醇疏水改性的两亲性聚合物的自组装体系在药物递送的应用方面近年来也受到越来越多的关注。
基因治疗是将人正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的缺陷或错误，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗的目的。在基因治疗的实施中，有四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的有效安全的转基因载体体系，三是选择合适有效的转基因途径，四是如何使治疗基因在靶细胞中特异性表达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因载体体系是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。目前基因治疗使用最多的转基因载体是腺病毒和逆转录病毒载体，约占治疗使用载体总数的50％。病毒载体具有很高的转基因效率，但使用病毒载体有许多缺点，主要包括病毒载体有较强的免疫原性，大量使用会产生较强的免疫反应。此外病毒载体的应用还有出现插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体有限的携带DNA能力，不利于大规模的生产也是限制其应用的主要缺点。非病毒载体与病毒载体相比，其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原性，不具备插入突变的能力，易于大规模生产和生产成本较低。但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。理想的非病毒转基因载体应该是可以降解的，毒性很低的，有较高转基因效率，并且具备靶向到目标细胞或是组织的能力，使治疗基因在靶细胞或组织中发挥作用。
因此，研究同时具有转基因效率高、可降解、毒性低的两亲性嵌段聚合物非病毒转基因载体具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种转基因效率高、可降解、毒性低的具有两亲性的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物。
本发明的第二个目的是提供聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物在非病毒转基因载体中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种非病毒转基因载体。
一种聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物，其具有式(1)所述的结构式：
其中，n为116-348的整数，X为20-25，Y为3。
本发明所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物生物相容性效果好，生物降解性好，毒性低。
所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均分子量优选为56400-78000Da，此种重均分子量的聚合物具有良好的溶解性，稳定性，适宜的Zeta电位值。
一种制备聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的方法，主要包括如下步骤：
(a)聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化试剂反应，得到活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯；
(b)聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应，得到聚乙烯亚胺-胆固醇；
(c)所述活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与所述聚乙烯亚胺-胆固醇反应，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
其中，步骤(a)中，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的端羟基在酰化剂的作用下发生酰化反应。所述酰化试剂为对硝基苯基氯甲酸酯、丁二酸酐中的一种，优选为对硝基苯基氯甲酸酯。
步骤(a)的操作优选为：按照聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化剂的摩尔比为1：(1-2)使二者反应，得到粗产品溶液；向所述粗产品溶液中加入有机溶剂沉淀得到化合物粗品，洗涤并干燥所述粗品，即得活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
由于酰化反应速率缓慢，因此，优选在反应体系中加入催化剂加快反应进程，所述催化剂优选为二甲基氨基吡啶(DMAP)、吡啶中的一种或两种。
步骤(a)的一种具体反应历程为：
具体操作为：按照聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯：对硝基苯基氯甲酸酯：DMAP＝1：(1-2)：1计，将三者溶解在三氯甲烷中，加入吡啶，在-5℃-5℃反应6个小时左右，然后升温至20-30℃继续反应，得到粗产品溶液；向所述粗产品溶液中加入乙醚沉淀得到化合物粗品，洗涤并干燥所述粗品，即得活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯，其结构式如式(2)所示：
步骤(b)的具体反应历程为：
步骤(b)的具体操作为：按照聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1：(5-20)使二者反应，反应12-24小时，透析反应液，冷冻并干燥即得聚乙烯亚胺-胆固醇，结构式如式(3)所示：
优选反应的溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中的一种。
所述透析优选使用水为透析溶剂。
采用步骤(b)所述的方法，优选得到重均分子量为35000-50000Da的聚乙烯亚胺-胆固醇。
步骤(c)的具体反应历程为：
步骤(c)的具体操作为：按照活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与聚乙烯亚胺-胆固醇1：(2-4)的质量比，使二者在20-30℃，避光条件下反应，得到粗产品溶液，向所述粗产品溶液中加入有机溶剂沉淀得到式化合物粗品，洗涤并干燥所述粗品即得聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
该反应的反应溶剂优选为三氯甲烷，二氯甲烷，二甲基亚砜中的一种。
沉淀步骤采用的溶剂优选为乙醚、石油醚，正己烷，丙酮中的一种或多种。
本发明同时提供一种采用上述任意一种方法制备得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
本发明涉及到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物同时具有亲水和疏水两部分组成，亲水部分为聚乙烯亚胺-胆固醇部分，疏水部分为聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯部分。这种两亲性衍生物在水溶液中可以自组装成聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的纳米胶束，亲水片段形成外壳，疏水片段形成内核，构成独特的核-壳结构。
本发明提供的非病毒转基因载体是将聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物制备成纳米粒子得到的。该非病毒基因载体材料具有转基因效率高，同时具有稳定性好，体内循环时间长，细胞摄取强等优点。
所述纳米粒子的粒径优选为190-260nm。
本发明同时提供了一种制备上述纳米粒子的优选方法：将聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物溶于有机溶剂中，加入蒸馏水，超声处理得到油包水的初乳，再向初乳中加入聚乙烯醇和嵌段式聚醚F-68混合溶液，超声处理得到水包油包水复乳。除去所得乳液中的溶剂得到带蓝光的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子。
所述有机溶剂优选为二氯甲烷。
附图说明
图1为实施例4中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子的透射电镜图；
图2为实施例4中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子光散射示意图的粒径分布图；
图3为实施例4中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子光散射示意图的Zeta电位分布图；
图4为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的红外谱图；
图5为实施例1中的活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的红外谱图；
图6为实施例1中的聚乙烯亚胺的红外谱图；
图7为实施例1中的胆固醇氯甲酸酯的红外谱图；
图8为实施例1中的聚乙烯亚胺-胆固醇的红外谱图；
图9为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的红外谱图；
图10为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的核磁共振氢谱图；
图11为实施例1中的胆固醇氯甲酸酯的核磁共振氢谱图；
图12为实施例1中的聚乙烯亚胺-胆固醇的核磁共振氢谱图；
图13为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中的重均分子量是通过美国沃特斯515+2410的凝胶渗透色谱(GPC)测得的，溶剂为四氢呋喃。
对以下实施例中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、聚乙烯亚胺、胆固醇氯甲酸酯、聚乙烯亚胺-胆固醇、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物进行红外光谱检测，检测条件包括：样品与KBr质量比为1:50，混匀后，研磨成透明薄片，通过红外光谱仪(美国珀金-埃尔默公司，型号为Spectrumone)进行检测。
对以下实施例中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、聚乙烯亚胺、胆固醇氯甲酸酯、聚乙烯亚胺-胆固醇、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物进行核磁共振氢谱(瑞士，布鲁克公司，型号为AV400)检测，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的核磁共振氢谱的检测条件包括：三氯甲烷为内标，所用溶剂为氘代三氯甲烷；活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的核磁共振氢谱的检测条件包括：三氯甲烷为内标，所用溶剂为氘代三氯甲烷，聚乙烯亚胺的核磁共振氢谱的检测条件包括：二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，胆固醇氯甲酸酯的核磁共振氢谱的检测条件包括：三氯甲烷为内标，所用溶剂为氘代三氯甲烷，聚乙烯亚胺-胆固醇的核磁共振氢谱的检测条件包括：三氯甲烷为内标，所用溶剂为氘代三氯甲烷，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的核磁共振氢谱的检测条件包括：三氯甲烷为内标，所用溶剂为氘代三氯甲烷。
对以下实施例中所得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子进行动态光散射(ZetasizerNanoZS)、透射电镜(美国FEI,TecnaiG220S-TWIN，200kV)。
实施例1制备嵌段聚合物
(a)将0.462g的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(SIGMA公司)溶于5mL三氯甲烷中，将0.09g对硝基苯基氯甲酸酯(AlfarAesar公司，97％)和0.03g4-二甲基氨基吡啶(AlfarAesar公司，99％)溶于3mL三氯甲烷中，然后将上述两种溶液混合，加入500μL吡啶(北京化工厂，分析纯)，温度为0℃，反应6小时，之后升温至25℃，反应12小时，得到活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯粗产品溶液。将粗产物溶液用60mL乙醚在4℃下进行沉淀，甲醇/乙醚(3：7)混合溶液清洗(50mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到白色微粘固体产物活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯0.402g。
(b)将0.5g聚乙烯亚胺(ALDRICH公司，25000Da)加入到20mL二甲基亚砜中，加入0.8mL的三乙胺(西陇化工股份有限公司，分析纯)，作为催化剂，制备聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液；将0.09g的胆固醇氯甲酸酯(AlfarAesar公司)加入到10mL三氯甲烷中，制备胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液；将上述聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液用0℃的冰水浴进行冷却，剧烈搅拌作用下，将上述胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液缓慢滴加到聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液中，0℃冰水浴下反应6小时，而后室温下反应12小时，得到聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液。将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液用旋转蒸发仪去除三氯甲烷，而后将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液加入到透析袋(8000-14000Da)中，在蒸馏水中透析72h，去除二甲基亚砜及杂质，得到聚乙烯亚胺-胆固醇水溶液。将上述产物水溶液置于-80℃中冷冻4小时，而后在冷冻干燥机中干燥32小时，得到干燥的无色微粘固体产物聚乙烯亚胺-胆固醇0.507g。
(c)将0.1705g活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入到10mL三氯甲烷中，制备活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯三氯甲烷溶液；将0.4425g聚乙烯亚胺-胆固醇加入到20mL三氯甲烷中，制备聚乙烯亚胺-胆固醇的三氯甲烷溶液；将上述两种溶液混合，室温下，避光搅拌反应12小时，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的粗产物溶液。将粗产物溶液用300mL乙醚在4℃下沉淀，得到纯化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物，25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物0.5142g。
经检测，所得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均分子量为67400Da。
图4为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的红外光谱图。图5为实施例1中的活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的红外光谱图。图6为实施例1中的聚乙烯亚胺的红外光谱图。图7为实施例1中的胆固醇氯甲酸酯的红外光谱图。图8为实施例1中的聚乙烯亚胺-胆固醇的红外光谱图。图9为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的红外光谱图。
与图4相比，图5在1594和1335cm-1附近出现两个新的吸收峰，这是活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯中生成的苯环和C-NO2的特征峰；；与图6和7相比较，图8在1694和1580cm-1附近出现两个新的吸收峰，是聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应生成的酰胺键，其中，1694cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1580cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这说明聚乙烯亚胺-胆固醇中聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯是通过酰胺键连接在一起的；与图5和8相比较，图9的3395cm-1为聚乙烯亚胺氨基的伸缩振动峰，2940、2867、1460和1308cm-1为胆固醇结构中甲基和亚甲基的对称伸缩振动和变形振动的特征吸收峰，1746cm-1和1103cm-1分别为聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯中酯键和醚键的特征吸收峰，1694cm-1和1572cm-1为聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应生成的酰胺键、聚乙烯亚胺与聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯反应生成的酰胺键的特征峰，其中1694cm-1对应酰胺Ⅰ峰，1572cm-1对应酰胺Ⅱ峰，这些都说明聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、聚乙烯亚胺和胆固醇氯甲酸酯生成聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备可以得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
图10为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的核磁共振氢谱。图11为实施例1中的胆固醇氯甲酸酯的核磁共振氢谱。图12为实施例1中的聚乙烯亚胺-胆固醇的核磁共振氢谱。图13为实施例1中的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的核磁共振氢谱。
同图11相比较，图12中在～0.65ppm、～0.88ppm和～0.91ppm处的信号分别对应于胆固醇结构中角甲基–CH3上的质子吸收峰，在～2.53ppm和～2.60ppm处的信号分别对应于聚乙烯亚胺单体中–CH2–上的质子吸收峰，这些说明了聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应生成了聚乙烯亚胺-胆固醇。
同图10、图12相比较，图13中在～0.65ppm、～0.88ppm和～0.91ppm处的信号分别对应于胆固醇结构中角甲基–CH3上的质子吸收峰，在～2-3.1ppm处的信号对应于聚乙烯亚胺单体中–CH2–上的质子吸收峰，在～3.6ppm和～4.3ppm处的信号对应于聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯分子中聚乙二醇单体中–CH2–上的质子吸收峰，这些说明了活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与聚乙烯亚胺-胆固醇反应生成了聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备得到了目标化合物聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
实施例2制备嵌段聚合物
(a)将0.341g的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(SIGMA公司)溶于5mL三氯甲烷中，将0.09g对硝基苯基氯甲酸酯(AlfarAesar公司，97％)和0.03g4-二甲基氨基吡啶(AlfarAesar公司，99％)溶于3mL三氯甲烷中，然后将上述两种溶液混合，加入500μL吡啶(北京化工厂，分析纯)，温度为0℃，反应6小时，之后升温至25℃，反应12小时，得到活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯粗产品溶液。将粗产物溶液用60mL乙醚在4℃下进行沉淀，甲醇/乙醚(3：7)混合溶液清洗(50mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到白色微粘固体产物活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯0.322g。
(b)将0.4425g聚乙烯亚胺(ALDRICH公司，25000Da)加入到20mL二甲基亚砜中，加入0.8mL的三乙胺(西陇化工股份有限公司，分析纯)，作为催化剂，制备聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液；将0.18g的胆固醇氯甲酸酯(AlfarAesar公司)加入到20mL三氯甲烷中，制备胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液；将上述聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液用0℃的冰水浴进行冷却，剧烈搅拌作用下，将上述胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液缓慢滴加到聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液中，0℃冰水浴下反应6小时，而后室温下反应12小时，得到聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液。将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液用旋转蒸发仪去除三氯甲烷，而后将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液加入到透析袋(8000-14000Da)中，在蒸馏水中透析72h，去除二甲基亚砜及杂质，得到聚乙烯亚胺-胆固醇水溶液。将上述产物水溶液置于-80℃中冷冻4小时，而后在冷冻干燥机中干燥32小时，得到干燥的无色微粘固体产物聚乙烯亚胺-胆固醇0.4227g。
(c)将0.1700g活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入到10mL三氯甲烷中，制备活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯三氯甲烷溶液；将0.4260g聚乙烯亚胺-胆固醇加入到20mL三氯甲烷中，制备聚乙烯亚胺-胆固醇的三氯甲烷溶液；将上述两种溶液混合，室温下，避光搅拌反应12小时，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的粗产物溶液。将粗产物溶液用300mL乙醚在4℃下沉淀，得到纯化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物，25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物0.5242g。
经检测，所得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均分子量为78000Da。
实施例3制备嵌段聚合物
(a)将0.462g的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(SIGMA公司)溶于5mL三氯甲烷中，将0.09g对硝基苯基氯甲酸酯(AlfarAesar公司，97％)和0.03g4-二甲基氨基吡啶(AlfarAesar公司，99％)溶于3mL三氯甲烷中，然后将上述两种溶液混合，加入500μL吡啶(北京化工厂，分析纯)，温度为0℃，反应6小时，之后升温至25℃，反应12小时，得到活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯粗产品溶液。将粗产物溶液用60mL乙醚在4℃下进行沉淀，甲醇/乙醚(3：7)混合溶液清洗(50mL×3次)，在25℃真空烘箱箱中干燥36小时，得到白色微粘固体产物活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯0.402g。
(b)将0.5g聚乙烯亚胺(ALDRICH公司，25000Da)加入到20mL二甲基亚砜中，加入0.8mL的三乙胺(西陇化工股份有限公司，分析纯)，作为催化剂，制备聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液；将0.045g的胆固醇氯甲酸酯(AlfarAesar公司)加入到5mL三氯甲烷中，制备胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液；将上述聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液用0℃的冰水浴进行冷却，剧烈搅拌作用下，将上述胆固醇氯甲酸酯的三氯甲烷溶液缓慢滴加到聚乙烯亚胺二甲基亚砜溶液中，0℃冰水浴下反应6小时，而后室温下反应12小时，得到聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液。将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液用旋转蒸发仪去除三氯甲烷，而后将所得聚乙烯亚胺-胆固醇的粗产物溶液加入到透析袋(8000-14000Da)中，在蒸馏水中透析72h，去除二甲基亚砜及杂质，得到聚乙烯亚胺-胆固醇水溶液。将上述产物水溶液置于-80℃中冷冻4小时，而后在冷冻干燥机中干燥32小时，得到干燥的无色微粘固体产物聚乙烯亚胺-胆固醇0.4860g。
(c)将0.1705g活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯加入到10mL三氯甲烷中，制备活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯三氯甲烷溶液；将0.4425g聚乙烯亚胺-胆固醇加入到20mL三氯甲烷中，制备聚乙烯亚胺-胆固醇的三氯甲烷溶液；将上述两种溶液混合，室温下，避光搅拌反应12小时，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的粗产物溶液。将粗产物溶液用300mL乙醚在4℃下沉淀，得到纯化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物，25℃真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物0.5092g。
经检测，所得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均分子量为56400Da。
实施例4将实施例1的嵌段聚合物制备成嵌段聚合物纳米粒子
取10mg聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子。
图1为本实施例中聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子的透射电镜图。从该图1可以看出，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子具有规整的圆球形结构，粒径在200nm左右；同时可以看出典型的核壳结构，内核是疏水的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯，外壳为亲水的聚乙烯亚胺-胆固醇。
图2为本实施例中聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的粒径分布图，其中平均粒径210nm，分散系数0.110。与图1相比，粒径较电镜图中的粒径大，这是由于投射电子显微镜样品制备过程中胶束壳层的塌陷收缩，在真空环境下使得胶束缩小，而动态光散射测定的是具有核壳结构的胶束在溶液中完全舒展时的水合力学直径，在水中存在亲水性外壳溶胀。
图3为本实施例中聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的电位分布图，从图3可以看出，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子表面带一定的正电荷，平均Zeta电位为24.0mV。纳米粒子表面带一定的电荷有利于粒子的稳定性，防止粒子之间相互团聚，同时，有利于基因的装载。
实施例5以实施例2的嵌段聚合物制备嵌段聚合物纳米粒子
取10mg聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子。
经检测，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在220±8nm，分散系数为0.173±0.023，平均Zeta电位为21.9±2.1mV。
实施例6以实施例3的嵌段聚合物制备嵌段聚合物纳米粒子
取10mg聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物溶于1mL的二氯甲烷中，加入200μL蒸馏水，在超声细胞粉碎机中用5％的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4mL聚乙烯醇(1％，Wt％)和嵌段式聚醚F-68(1％,Wt％)混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25％的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子。
经检测，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在190±4nm，分散系数为0.125±0.053，平均Zeta电位为25.3±4.2mV。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇三嵌段聚合物，其特征在于，其具有式(1)所述的结构式：
其中，n为116-348的整数，X为20-25，Y为3。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于：所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的重均分子量为56400-78000Da。
3.一种制备聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化试剂反应，得到活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯；
(b)聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯反应，得到聚乙烯亚胺-胆固醇；
(c)所述活化的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与所述聚乙烯亚胺-胆固醇反应，得到聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酰化试剂为对硝基苯基氯甲酸酯、丁二酸酐中的一种，优选为对硝基苯基氯甲酸酯；步骤(a)的操作优选为：按照聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与酰化剂的摩尔比为1：(1-2)使二者反应，反应12-24小时，得到粗产品溶液；向所述粗产品溶液中加入有机溶剂沉淀得到化合物粗品，洗涤并干燥所述粗品，即得活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(b)的具体操作为：按照聚乙烯亚胺与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1：(5-20)使二者反应，反应12-24小时，透析反应液，冷冻并干燥即得聚乙烯亚胺-胆固醇。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺-胆固醇的重均分子量为35000-50000Da。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：步骤(c)的具体操作为：按照活化聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与聚乙烯亚胺-胆固醇1：(2-4)的质量比，使二者在20-30℃，避光条件下反应，得到粗产品溶液，向所述粗产品溶液中加入有机溶剂沉淀得到式化合物粗品，洗涤并干燥所述粗品即得聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物。
8.根据权利要求1-2任一所述的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物，或权利要求3-7任一所述的方法制备得到的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯-聚乙烯亚胺-胆固醇嵌段聚合物在非病毒转基因载体中的应用。
9.一种非病毒转基因载体，其特征在于：所述非病毒转基因载体是将权利要求1或2所述的嵌段聚合物或权利要求3-7任一所述方法制备得到的嵌段聚合物制备成纳米粒子得到的，优选所述纳米粒子的粒径为190-260nm。
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