CN106397765A - 维生素e修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用。所述制备方法包括：向维生素E中引入羧基得到vitE‑COOH，用CDI将其活化后直接与PEI进行反应，反应产物水溶液pH值调至8‑9后透析、冷冻干燥，即得。实验证明，维生素E的修饰有利于pDNA质粒的释放，其毒性随着PEI上的维生素E饰数目的增加而降低，维生素E的修饰能够大大增加pDNA质粒的细胞摄取蛋白的表达。体内实验表明PEI衍生物可成功将pDNA质粒输送到小鼠的肝脏和肺脏中，该复合物(PEI/pDNA)能进入肝脏和肺脏细胞并进一步释放质粒DNA和基因表达。本发明聚乙烯亚胺衍生物作为基因输送载体具有毒性低、转染效率高等优点。

Description

维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及聚乙烯亚胺衍生物，尤其涉及维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法，本发明还涉及该维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为基因输送载体的应用，属于聚乙烯亚胺衍生物领域。
背景技术
基因治疗可用于治疗包括癌症、艾滋病、心血管病、传染性疾病等在内的各种获得性和遗传性疾病。基因治疗相对其它治疗方法有着若干优势，但在实际应用过程中也面临着一些挑战。因此，基因输送载体对于基因治疗来说是十分必要的。目前开发基因输送载体的策略主要分为病毒和非病毒介导的输送系统。病毒载体具有非常高的输送效率并且可以保证基因的长期表达，因此是目前临床上应用最多的载体。但病毒载体在临床使用过程中也暴露出了许多缺陷，这些缺陷大大限制了病毒载体的应用。为了克服病毒载体的诸多不足，近些年来非病毒载体得到了迅速发展。这其中就包括研究最广泛的非病毒载体聚乙烯亚胺。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种很常见的人工合成水溶性聚合物，它在废水处理和造纸业中有着非常广泛的应用。根据结构特点，PEI聚合物大致可以分为支链PEI和直链PEI。与直链PEI相比，多分支的PEI能够与DNA形成结合更紧密和颗粒更小的复合物。支链PEI与DNA的复合与直链高分子量PEI相比较对缓冲条件的依赖性更小，而直链高分子量PEI与DNA的复合很大程度上取决于缓冲条件。实验证明在高离子强度溶液中直链PEI(22kDa)与DNA复合可以形成较大尺寸的复合物(1μm)，而在5％葡萄糖中，观察到形成的复合物尺寸是30-60nm。PEI是最好的体外转染试剂之一并且已经被一些研究工作者当成聚合物类基因转染试剂的“金标准”。
PEI的转染效率和细胞毒性主要受其分子量、支化程度、表面电势和粒径的影响。随着分子量的升高，支链PEI转染效率升高；然而，细胞毒性也同时升高。为了消除或降低与PEI有关的细胞毒性，目前已经发展出了多种不同的策略。[49-51]这些策略主要包括使用直链高分子量PEI，用多糖、亲水性聚合物(如PEG)、二硫键连接臂、脂质基团等取代或连接高分子量和低分子量的支链PEI(Ko YT,Kale A,Hartner WC,Papahadjopoulos-SternbergB,Torchilin VP.J Control Release.2009；133:132-8.Godbey WT,Wu KK,Mikos AG.Sizematters:J Biomed Mater Res.1998；45:268-75.Grayson AC,Doody AM,Putnam D.PharmRes.2006；23:1868-76.)。目前PEI及其衍生物已经应用于体内的核酸输送并且在癌症治疗等领域取得了令人满意的结果。有若干研究资料都涉及到通过PEI衍生物向体内输送核酸来达到治疗目的。这些衍生物包括多糖连接的PEI或交联的PEI纳米粒。研究表明使用诸如硫酸软骨素、透明质酸或葡聚糖等多糖修饰支链PEI(MW 25kDa)可使聚合物毒性降低，从而改善其体内转染效率。基于直链PEI的转染试剂在市场上已经可以买到(例如ExGen500、jetPEI)。
市场上销售的PEI分子量范围非常广泛，从1000Da以下到1.6×103kDa都有。通常认为最适用于基因输送的PEI的分子量在5kDa和25kDa范围内。PEI的转染效率随着分子量的增加而升高，但毒性也随之增加。25kDa PEI与1.8kDa PEI相比转染效率高上百倍，但毒性也显著增加。有若干研究证明，通过用小分子化合物对低分子量的PEI进行修饰可以显著提高转染效率而保持较低的毒性。例如，用胆固醇、磷脂、脂肪酸和硫辛酸等疏水性小分子修饰的PEI转染效率都比修饰前的提高数十倍到数百倍，而毒性也有不同程度的降低。在科学家发现聚乙烯亚胺(PEI)的基因输送功能之后的几十年来，有大量的研究表明对PEI进行疏水性修饰可以很好的提高转染效率并且降低细胞毒性。原因是多方面的，其中的主要原因可能是疏水性修饰不仅可以使聚合物更好的压缩DNA，使DNA分子变得更致密紧凑同时还可以增强聚合物/DNA复合物与细胞表面的结合，从而促进内吞作用，使DNA更有效的进入细胞。目前文献中常见的修饰基团主要是一些天然小分子疏水化合物，如胆固醇、磷脂等。
维生素E是一种脂溶性化合物，它包括生育酚和生育三烯酚，其中α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富并且活性最高的维生素E形式。维生素E的生物功能除了最熟知的抗氧化功能之外，还涉及酶活性的调节、基因表达调控以及神经生物学功能等。通过消化道吸收进入血浆的维生素E经受体介导进入肝细胞，进入肝细胞的维生素E又在维生素E结合蛋白的运输下进入肝外组织。维生素E本身的疏水性质、丰富的生物调节功能以及其受体介导的肝细胞摄取方式都预示着用它来修饰PEI很可能取得意想不到的效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物，所得到的衍生物作为基因输送载体具有毒性低、转染效率高等优点。
本发明的目的之二是提供一种合成上述维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物的方法
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物：
其中，m或n为任意的整数；
优选的，m为1至60的任意整数，n为1至60的任意整数；
更优选的，m为4，n为2，4或6；或者m为54，n为10，20或40。
本发明的另外一个目的是提供一种合成上述式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物，该方法包括：(1)向维生素E中引入羧基得到vitE-COOH；(2)用CDI(N,N-羰基二咪唑)活化vitE-COOH得到活化酯；(3)活化酯直接与PEI进行反应，得到维生素E修饰的PEI衍生物。
优选的，步骤(1)向维生素E中引入羧基的方法包括：将维生素E(vitE)和2-溴乙醇进行取代反应合成vitE-OH；将vitE-OH与己二酸进行偶联，将羧基引入到维生素E上得到vitE-COOH。
优选的，步骤(2)中，在室温下，用CDI活化溶于无水DCM和TEA中的vitE-COOH得到活化活化酯；其中，所述的室温可以为15-30℃，优选为25℃。
步骤(3)中活化酯与PEI在室温下进行反应，所述的室温可以为15-30℃，优选为25；为了达到更好的效果，优选的，将反应产物旋蒸除去溶剂，将残余物溶于蒸馏水得到水溶液，将反应产物的水溶液pH值调节到8-9后进行透析并冷冻干燥，得到维生素E修饰的PEI衍生物。
为了在PEI上连接不同数目的维生素E，考虑向维生素E化学结构中引入羧基，最终通过该路线顺利合成出不同数目维生素E修饰的PEI衍生物。本发明最终在缀合反应之后用稀盐酸将所得PEI衍生物水溶液的pH调节到8-9，通过透析、冷冻干燥之后获得PEI衍生物的盐酸盐。
通过控制合成原料之间的比例(即vitE-COOH:PEI投料比)可得到不同数目维生素E修饰的PEI衍生物。本发明进一步通过核磁共振氢谱和元素分析对具体的维生素E数目进行了定量。
本发明通过1HNMR、FTIR和元素分析对所得维生素E修饰的PEI衍生物的结构进行了表征，确证所得产物即为目标产物。本发明进一步通过多种手段对合成得到的PEI衍生物的性能进行了表征，包括PEI衍生物的缓冲能力、PEI衍生物与DNA的结合能力、PEI衍生物在核酸酶环境和血清环境对DNA的保护作用、复合物粒径及表面电势等方面的表征。通过表征实验证明，在每个PEI上连接不同数目的维生素E没有明显影响PEI的缓冲能力以及与pDNA的结合，相反，维生素E的修饰还有利于pDNA的释放。细胞毒性实验显示这些PEI-vitEn随着PEI上的维生素E饰数目的增加而降低。本发明进一步对PEI衍生物的基因输送性能进行研究表明，维生素E的修饰能够大大增加DNA质粒的细胞摄取以及蛋白的表达。通过筛选发现，在这些PEI-vitEn当中，每个PEI1.8平均连接6.7个vitE的PEI-vitE6显示出最佳的质粒摄取和基因表达性能，基因表达效果大大超过PEI25对照并且接近Lipo 2000的转染水平。共定位和抑制剂实验结果证明，PEI-vitEn/pDNA的摄取机制是受体蛋白介导的。此外，本发明通过进一步的体内研究显示PEI-vitE6可以成功地将pDNA输送到小鼠的肝脏和肺脏中，并且PEI-vitE6/pDNA复合物能够进入肝脏和肺脏细胞，还能够进一步释放质粒DNA用于基因表达。以上实验证明，本发明所合成的维生素E修饰聚乙烯亚胺是一种低毒、高效、可用于体内转染的转染试剂。
附图说明
图1本发明维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物的合成路线图。
图2 PEI1.8、vitE-COOH和PEI-vitEn的1HNMR图谱；根据相应信号峰的积分面积可以计算出每个PEI上修饰的维生素E的数目。
图3 PEI25、vitE-COOH和PEI25-vitEn的1HNMR图谱。
图4利用酸碱滴定法测得的PEI25和PEI25-vitEn缓冲曲线；生理pH范围为5.1-7.4，通过这个范围内消耗的滴定剂体积可以计算出聚合物的缓冲容量。
图5 N/P比在0.25至3范围内进行的PEI25/pDNA和PEI25-vitEn/pDNA复合物的凝胶阻滞实验。
图6 DNA释放实验。在N/P比为2时形成PEI25-vitEn/pDNA复合物，与带负电的肝素孵育30min，重量比肝素/pDNA重量比分别为0、1、2、4、8和16。使用25kDa PEI作为对照。
图7通过动态光散射(DLS)测定的不同N/P比(1.25、5、10、15、20、25)的PEI25-vitEn/pDNA复合物的平均粒径(a)和表面电势(b)，未修饰的25kDa PEI作为对照。
图8利用酸碱滴定法测得的PEI1.8、PEI25和PEI-vitEn缓冲曲线；生理pH范围为5.1-7.4，通过这个范围内消耗的滴定剂体积可以计算出聚合物的缓冲容量，使用150mMNaCl作为空白对照。
图9 A:N/P比在0.25至3范围内进行的PEI1.8/pDNA和PEI-vitEn/pDNA复合物的凝胶阻滞实验；泳道0中仅加入裸pDNA作为对照；B:DNA释放实验；在N/P比为3时形成PEI-vitEn/pDNA复合物，与带负电的肝素孵育30min，重量比肝素/pDNA重量比分别为0、1、2、4、8和16；使用1.8kDa PEI作为对照。
图10 PEI-vitE6对核酸酶或血清的保护作用；泳道1：裸DNA；泳道2：PEI-vitE6/pDNA(N/P＝2)；泳道3：pDNA与核酸酶I或10％血清孵育2小时；泳道4：PEI-vitE6/pDNA与核酸酶I或10％血清孵育2小时；泳道5：PEI-vitE6/pDNA用肝素处理；泳道6：PEI-vitE6/pDNA与核酸酶或10％血清孵育2小时，接着在65℃孵育10min以灭活核酸酶并随后用肝素处理。
图11通过动态光散射(DLS)测定的不同N/P比(1.25、5、10、15、20、25)的PEI-vitEn/pDNA复合物的平均粒径(a)和表面电势(b)，未修饰的1.8kDa PEI作为对照；(c)N/P＝20的PEI-vitE6/pDNA复合物的粒径分布，(d)N/P＝20的PEI-vitE6/pDNA复合物的表面电势。
图12 N/P比为20的PEI-vitE6/pDNA复合物的AFM图片；(a)3D图像；(b)2D图像；(c)图像(b)中白线指示的横截面的高度图。
图13采用SRB实验考察PEI-vitEn聚合物对HEK-293A细胞的毒性，PEI1.8和PEI25作为对照。
图14通过高内涵成像的GFP基因表达；将HEK-293A细胞接种到6孔板中并且孵育24小时，在不同N/P比的条件下进行基因转染实验，使用Lipo 2000(2μL)作为对照。a)高内涵成像的GFP基因表达，标尺是200μm。b)通过流式细胞仪测量的GFP阳性细胞数目。
图15体外基因转染和表达实验：(A)PEI-vitEn(n＝2,4,6)携带的GFP基因在HEK-293A细胞中的转染效率(N/P＝20)，使用Lipo 2000、PEI1.8和PEI25(N/P＝10)作为对照，比例尺＝200μm.(B)以GFP阳性细胞数值采用流式细胞术对GFP基因的表达效率进行评价。当N/P＝10和20时，PEI-vitE和PEI1.8的基因转染实验结果；实验中使用Lipo 2000、和PEI25(N/P＝10)作为对照；(C)PEI25和PEI-vitE6在不同细胞系(A375、HepG2和HEK-293A)的细胞摄取实验结果。通过流式细胞仪测定的FITC的阳性细胞数量对转染效率进行检测。
图16小鼠体重变化曲线图；三组小鼠分别注射PBS、PEI25和PEI-vitE6。注射PEI25的小鼠在24h内全部死亡。
图17小鼠尾静脉注射实验结果；a)pDNA、b)TRITC-PEI25/pDNA和c)TRITC-PEI-vitE6/pDNA经过1小时之后不同器官的分布情况。
图18小鼠静脉注射实验结果；a)pDNA、b)PEI25/pDNA和c)PEI-vitE6/pDNA后不同组织中的转染及表达情况。
图19肝脏组织切片荧光图像；三只小鼠分别注射pDNA、PEI25/pDNA和PEI-vitE6/pDNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 PEI1.8-vitEn衍生物的合成及表征
1 实验方法
1.1 vitE-OH中间体的合成
按照文献方法(Chen W,Park SK,Yu W,Xiong A,Sanders BG,Kline K.Eur J MedChem.2012；58:72-83.)通过维生素E(vitE)和2-溴乙醇之间的取代反应合成vitE-OH，实际操作过程中有一些改进。具体来讲，首先在25mL无水DMF中混合vitE(5.0g,1.0eq)、2-溴乙醇(1.1mL,1.25eq)和NaOH(0.7g,1.5eq)并且在90℃下搅拌过夜。次日将混合物冷却至室温，倒入水(100mL)中，用甲基叔丁基醚(50mL×3)萃取所述溶液。合并有机层并且通过旋蒸除去溶剂，得到淡黄色残余物，所述残余物使用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)的混合物作为洗脱剂(PE:EA＝5:1)通过硅胶柱色谱法进一步纯化，得无色油状物。
产率：4.5g(81.7％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.04-3.93(t,2H,OCH2CH2OH),3.85-3.80(t,2H,OCH2CH2OH),2.61(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.35(brs,1H,OH),2.22(s,3H,CH3),2.18(s,3H,CH3),2.13(s,3H,CH3),1.80(m,2H,PhCH2CH2),1.68-1.02(m,24H),1.00-0.80(m,12H,4×CH3).13C NMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):147.9,147.6,127.7,125.7,123.0,117.6,74.8,73.7,67.9,62.4,40.1,39.4,37.44 32.7,31.2,28.0,25.6,24.8,24.4,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.7,11.8.MS:理论值:474.41,实验值:474.69[M]+,497.64[M+Na]+。
1.2 vitE-COOH中间体的合成
vitE-COOH是通过碳二亚胺化学方法将己二酸与vitE-OH偶联合成的。具体来讲，在0至5℃下，向vitE-OH(3.0g,1.0eq)和己二酸(2.8g,3.0eq)在45mL无水THF中的溶液中依次加入DCC(2.6g,2.0eq)、DMAP(8.0mg,0.1eq)，并且在室温下搅拌6小时。反应结束后将白色沉淀过滤掉,并且旋蒸除去溶剂。将残余物溶于EA(90mL)，用水洗涤(50mL×2)。有机层经无水Na2SO4干燥。过滤并且旋蒸除去溶剂，使用二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)的混合物作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化残余物(DCM:MeOH＝200:1,0.5％AcOH)。
产率：2.6g(68.3％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.51-4.36(t,2H,OCH2CH2OH),3.97-3.83(t,2H,OCH2CH2OH),2.59(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.53-2.36(m,4H,COCH2CH2),2.20(s,3H,CH3),2.16(s,3H,CH3),2.11(s,3H,CH3),1.89-1.01(m,28H),0.97-0.78(m,12H,4×CH3).13C NMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):179.0,173.3,148.0,147.6,127.7,125.7,122.9,117.6,74.8,70.4,63.7,40.0,39.3,37.4,33.8,33.6,32.7,31.2,28.0,24.8,24.4,24.1,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.6,11.7.MS:理论值:602.45,实验值:601.80[M-H]-。
1.3 PEI-vitEn缀合物的合成
PEI-vitEn(n＝2、4和6)缀合物是由1.8kDa PEI和不同当量的vitE-COOH合成的，每个PEI上修饰的vitE的数目通过合成过程中的vitE-COOH:PEI投料比来控制。具体来讲，在室温下，用CDI活化溶于无水DCM和TEA中的vitE-COOH，反应2小时后，将所述混合物逐滴滴加到1.8kDa PEI的无水DCM溶液中。在室温下将所述溶液搅拌3小时，并且旋蒸除去溶剂。随后将残余物溶于蒸馏水(10mL,pH用2M HCl调节至8-9)并且在1L烧杯中用蒸馏水透析(MWCO 2000Da)24小时纯化，期间换水2次。将透析液在冻干机上冷冻干燥得到最终产品，化学式表示为PEI-vitEn·xHCl，进一步通过1HNMR、FTIR和元素分析对具体组成进行确认。
产率(PEI-vitE2:0.45g,90.3％；PEI-vitE4:0.41g,93.9％；PEI-vitE6:0.44g,97.9％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,MeOD)4.36(PhOCH2CH2O),3.79(PhOCH2CH2O),3.21-2.63(CH2CH2NH),2.57(PhCH2CH2),2.49-2.23(COCH2CH2),2.21-1.94(PhCH3),1.86-0.98(vitE的特征峰),0.88(CH3)。
表1 PEI-vitEn(n＝2、4和6)的投料比
n vitE-COOH TEA CDI PEI1.8 DCM
2 0.20g,1.0eq 0.14mL,3.0eq 56.5mg,1.05eq 0.30g,0.5eq 16mL
4 0.25g,1.0eq 0.17mL,3.0eq 70.6mg,1.05eq 0.19g,0.25eq 12mL
6 0.30g,1.0eq 0.21mL,3.0eq 84.7mg,1.05eq 0.15g,0.17eq 11mL
1.4 PEI-vitE6和PEI25的荧光标记
用四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯(TRITC,Bridgen,λex＝543nm，λem＝571nm)或异硫氰酸荧光素(FITC,BBI,λex＝493nm，λem＝525nm)标记PEI-vitE6和PEI25，用于激光扫描共焦显微镜或体内图像。对于聚合物的FITC标记，将20mg PEI-vitE6(或PEI25)溶于4mL DMSO并且在室温下搅拌。向所述聚合物溶液中逐滴滴加FITC在DMSO中的溶液(5mg/mL，125μL)，并且在30℃下搅拌4小时。获得的产物用PBS透析(MWCO 2000Da)24小时纯化。将透析液稀释适当的使用浓度(500ng/μL)。TRITC的标记操作与上述相同。
2.实验结果
2.1 PEI-vitEn缀合物的确证及及表征
通过1HNMR波谱确认了vitE-COOH与PEI成功缀合。δ3.2-2.6ppm的峰对应于PEI1.8的-CH2CH2NH-基团，δ4.4-4.2ppm和δ4.0-3.7ppm归属于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-，δ2.5-2.2ppm峰对应于己二酸中的-CH2CO-，δ2.2-1.9ppm的峰归属于vitE苯环上的-CH3。在δ2.6-2.5ppm和δ1.8-0.7ppm范围出现的其它峰归属于vitE的特征峰。PEI-vitEn缀合物中存在PEI1.8是通过δ3.2-2.6ppm区域中的氢信号峰证明的。这些结果都可以表明vitE-COOH与PEI1.8成功连接。
还通过红外波谱(Thermo Fisher Nicolet-6700)和元素分析(Vario EL III)分别表征了PEI-vitEn的结构和组成。与vitE-COOH的IR波谱相比，在1645cm-1和1549cm-1处出现两个全新的吸收带，分别是最具特征性的C＝O(酰胺I带)和N-H(酰胺II带)。在vitE-COOH的波谱中，在1710cm-1处有COOH伸缩振动带，而在PEI-vitE波谱中这个带消失了，表明vitE-COOH的羧基与PEI1.8的胺基成功缀合。在3700-3200cm-1处的宽峰对应于PEI1.8的胺基，在PEI1.8和PEI-vitE波谱中都存在，进一步确认成功的缀合。PEI1.8骨架上修饰的vitE的数目以及总分子量是由元素分析结果计算得到的，进一步通过1H NMR基于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-(4.4-4.2ppm)和PEI1.8质子(3.2-2.6ppm)的积分比例对该结果进行了确认，两种不同方法得当的结果基本一致。
实施例2 PEI25-vitEn衍生物的合成及表征
1.实验方法
1.1 vitE-OH中间体的合成(同PEI1.8)
在25mL无水DMF中混合vitE(5.0g,1.0eq)、2-溴乙醇(1.1mL,1.25eq)和NaOH(0.7g,1.5eq)并且在90℃下搅拌过夜。次日将混合物冷却至室温，倒入水(100mL)中，用甲基叔丁基醚(50mL×3)萃取所述溶液。合并有机层并且减压旋蒸除去溶剂，得到淡黄色残余物，残余物使用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)的混合物作为洗脱剂(PE:EA＝5:1)通过硅胶柱色谱法纯化，得无色油状物。
产率：4.5g(81.7％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.04-3.93(t,2H,OCH2CH2OH),3.85-3.80(t,2H,OCH2CH2OH),2.61(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.35(brs,1H,OH),2.22(s,3H,CH3),2.18(s,3H,CH3),2.13(s,3H,CH3),1.80(m,2H,PhCH2CH2),1.68-1.02(m,24H),1.00-0.80(m,12H,4×CH3).13C NMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):147.9,147.6,127.7,125.7,123.0,117.6,74.8,73.7,67.9,62.4,40.1,39.4,37.44 32.7,31.2,28.0,25.6,24.8,24.4,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.7,11.8.MS:理论值:474.41,实验值:474.69[M]+,497.64[M+Na]+。
1.2 vitE-COOH中间体的合成(同PEI1.8)
在0至5℃下，向vitE-OH(3.0g,1.0eq)和己二酸(2.8g,3.0eq)在45mL无水THF中的溶液中依次加入DCC(2.6g,2.0eq)、DMAP(8.0mg,0.1eq)，并且在室温下搅拌6小时。反应结束后将白色沉淀过滤掉并且旋蒸除去溶剂。将残余物溶于EA(90mL)，用水洗涤(50mL×2)。有机层经无水Na2SO4干燥。过滤并且旋蒸除去溶剂，使用二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)的混合物作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化残余物(DCM:MeOH＝200:1,0.5％AcOH)，得无色油状物。
产率：2.6g(68.3％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.51-4.36(t,2H,OCH2CH2OH),3.97-3.83(t,2H,OCH2CH2OH),2.59(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.53-2.36(m,4H,COCH2CH2),2.20(s,3H,CH3),2.16(s,3H,CH3),2.11(s,3H,CH3),1.89-1.01(m,28H),0.97-0.78(m,12H,4×CH3).13C NMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):179.0,173.3,148.0,147.6,127.7,125.7,122.9,117.6,74.8,70.4,63.7,40.0,39.3,37.4,33.8,33.6,32.7,31.2,28.0,24.8,24.4,24.1,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.6,11.7.MS:理论值:602.45,实验值:601.80[M-H]-。
1.3 PEI25-vitEn缀合物的合成
PEI25-vitEn(n＝10、20和40)缀合物是由25kDa PEI和不同当量的vitE-COOH合成的，每个PEI上修饰的vitE的数目通过合成过程中的vitE-COOH:PEI25投料比来控制。具体来讲，在室温下，用CDI活化溶于无水DCM和TEA中的vitE-COOH，反应2小时后，将所述混合物逐滴滴加到25kDa PEI的无水DCM溶液中。在室温下将所述溶液搅拌3小时，并且旋蒸除去溶剂。随后将残余物溶于蒸馏水(10mL,pH用2M HCl调节至8-9)并且在1L烧杯中用蒸馏水透析(MWCO 8000-12000Da)24小时，期间换水2次。将透析液在冻干机上冷冻干燥得到最终产品，化学式表示为PEI25-vitEn·xHCl，进一步通过1HNMR、FTIR和元素分析对具体组成进行确认。
产率(PEI25-vitE10:0.36g,87.4％；PEI25-vitE20:0.32g,86.8％；PEI25-vitE40:0.35g,85.9％)。1H NMR(δ/ppm,400MHz,MeOD)4.36(PhOCH2CH2O),3.79(PhOCH2CH2O),3.21-2.63(CH2CH2NH),2.57(PhCH2CH2),2.49-2.23(COCH2CH2),2.21-1.94(PhCH3),1.86-0.98(vitE的特征峰),0.88(CH3)。
表2 PEI25-vitEn(n＝10、20和40)的投料比
n vitE-COOH TEA CDI PEI25 DCM
10 0.08g,1.0eq 0.06mL,3.0eq 22.6mg,1.05eq 0.33g,0.1eq 15mL
20 0.12g,1.0eq 0.08mL,3.0eq 33.9mg,1.05eq 0.25g,0.05eq 13mL
40 0.20g,1.0eq 0.14mL,3.0eq 56.5mg,1.05eq 0.21g,0.025eq 12mL
2、实验结果
2.1 PEI25-vitEn缀合物的确证及及表征
通过1HNMR确认了vitE-COOH与PEI成功缀合。如图3所示，δ3.2-2.6ppm的峰对应于PEI25的-CH2CH2NH-基团，δ4.4-4.2ppm和δ4.0-3.7ppm归属于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-，δ2.5-2.2ppm峰对应于己二酸中的-CH2CO-，δ2.2-1.9ppm的峰归属于vitE苯环上的-CH3。在δ2.6-2.5ppm和δ1.8-0.7ppm范围出现的其它峰归属于vitE的特征峰。PEI25-vitEn缀合物中存在PEI25是通过δ3.2-2.6ppm区域中的氢信号峰证明的。这些结果都可以表明vitE-COOH与PEI125成功连接。
还通过红外波谱(Thermo Fisher Nicolet-6700)和氢谱分别表征了PEI25-vitEn的结构和组成。与vitE-COOH的IR波谱相比，在1645cm-1和1549cm-1处出现两个全新的吸收带，他们分别是最具特征性的C＝O(酰胺I带)和N-H(酰胺II带)。在vitE-COOH的波谱中，在1710cm-1处有COOH伸缩振动带，而在PEI25-vitE波谱中这个带消失了，表明vitE-COOH的羧基与PEI25的胺基成功缀合。在3700-3200cm-1处的宽峰对应于PEI25的胺基，在PEI25和PEI-vitE波谱中都存在，进一步确认成功的缀合。PEI25骨架上修饰的vitE的数目以及分子量是由核磁共振氢谱的峰面积计算得到的。通过计算，n＝10、20和40的实际修饰数目分别为9.9、17.2和40.6。
2.2 PEI-vitEn缀合物缓冲能力的测定
PEI25-vitEn缀合物和对照PEI(25kDa)的缓冲能力是按照先前的文献报告使用酸碱滴定法测定的，所测pH值在2.0至11.0范围内，测定方法与文献方法相比稍有变化。具体来讲，首先分别在10mL NaCl溶液(150mM)中分别溶解一定量的修饰和未修饰的PEI(0.2mmol氮原子)。正式滴定前用0.1M HCl将PEI溶液调节至起始pH 2.0，随后用0.1M NaOH滴定，每次滴加50μL。使用pH计(Mettler Toledo FE20)监测上述溶液pH值的变化并记录。所测聚合物的缓冲能力按照以下公式计算：
缓冲能力(％)＝100×(ΔVNaOH×0.1M)/N mol
其中ΔVNaOH是将PEI溶液的pH值从5.1调节至7.4所需要的NaOH溶液(0.1M)的体积，N mol是所滴定的聚合物中的可质子化胺基的总摩尔数(0.2mmol)。
如图4所示，在生理pH范围内(pH 5.1到7.4)，PEI25的缓冲能力为8.0，PEI25-vitE10、PEI25-vitE20、PEI-vitE40的缓冲能力分别为12.5、8.5和10.5。PEI25-vitEn的缓冲能力与PEI25相比变化不大，表明用vitE对PEI25进行的疏水性修饰没有明显地影响其的质子化能力。
2.3 PEI25-vitEn/pDNA复合物的制备
PEI25-vitEn/pDNA复合物的制备是在PBS或20mM HEPES缓冲液中混合一定量的pDNA储备溶液和不同量的PEI25-vitEn缀合物完成的。具体来讲，首先向聚合物溶液中加入一定量的pDNA储备溶液(300ng/μL)，接着涡旋10秒，在室温下孵育30min即得复合物溶液。PEI25-vitEn/pDNA的比例是根据氮/磷(N/P)比计算的，并且在计算复合物中PEI25-vitEn缀合物的量时将连接在PEI骨架上的vitE的分子量计算在内。类似地，还制备了25kDa PEI/pDNA复合物作为对照。
2.4 琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳可用于研究PEI25-vitEn缀合物的DNA结合能力。实验中首先制备N/P比从0.25到3.0(0.25、0.5、1、2、3)并且含有300ng pDNA的PEI25-vitEn/pDNA复合物，最终体积为10μL。涡旋混合10秒，静置30分钟之后，将这些复合物各自与2μL 6×DNA上样缓冲液混合并且加载到预先制备的含有溴化乙锭(0.5mg/mL)的0.8％琼脂糖凝胶上，琼脂糖凝胶在80V下用Tris-醋酸盐(TAE)跑45min。跑好的凝胶在ChemiDoc XRS成像系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中观察DNA条带并且拍照。实验结果为图5所示，vitE修饰对PEI25的DNA结合能力影响很小，其中PEI25-vitE10、PEI25-vitE20和PEI25-vitE40分别在N/P比为1、2和2时完全阻滞DNA迁移，而未修饰的25kDa PEI完全抑制DNA迁移的N/P比是2。从图5中可以看出，维生素E的修饰对PEI25与DNA结合能力的影响比PEI1.8要小。
为了研究vitE修饰对DNA从复合物中释放的影响，用肝素进行复合物中DNA的竞争性置换。肝素是一种富含阴离子的聚合物，它可以将DNA从复合物中置换出来。对于本研究来说，按照如上所述的方法制备N/P比为2的PEI25-vitEn/pDNA复合物。向复合物中加入不同量的肝素(肝素/pDNA＝0、1、2、4、8和16，w/w)。在37℃孵育30min之后，将样品按照上述条件进行电泳并且进行成像。同时制备PEI25/pDNA作为对照。如图6所示，从图上可以看到未修饰的PEI25复合物随着肝素的增加有少量DNA释放，而所有维生素E修饰的复合物几乎没有DNA释放，这与此前维生素E修饰的PEI1.8的实验结果不同，有可能是因为PEI25的分子量比PEI1.8大得多而与DNA结合更为牢固的原因。
2.5 PEI25-vitE/pDNA复合物粒径和电势的测定
PEI25-vitEn/pDNA复合物的尺寸和表面电荷是两个重要因素，它们可以显著地影响复合物在不同细胞和组织中的摄取和分布以及细胞毒性、生物相容性和被动靶向作用。本实验中聚合物/pDNA复合物的粒径和表面电势是使用Zetasizer Nano ZS粒度仪(Malvern Instrument)在25℃下测量得到的。基于之前的凝胶阻滞实验，测量之前，按照如上所述的方法制备N/P比在1.25至25范围内(1.25、5、10、15、20、25)的聚合物/pDNA复合物溶液，每个样品中含pDNA约600ng，最终体积为100μL。将上述复合物样品分别在1.0mL的20mM HEPES缓冲液中稀释、震荡均匀并且尽快测量。测量时样品的最终浓度为1-20μg/mL。
从图7中的测量结果可以看到，在N/P比为2.5及以上的N/P比下，所有PEI25-vitEn缀合物都可以有效地将DNA凝聚成纳米粒。而随着N/P比的增加，PEI25-vitEn复合物的尺寸基本上相对恒定。在相同的N/P比下，维生素E修饰的复合物尺寸比25kDa PEI复合物小得多得多，说明维生素E修饰之后的衍生物与DNA结合紧密，形成更紧凑的颗粒。表面电势测量结果显示，随着N/P比的增加，PEI-vitEn/pDNA复合物的表面电荷也基本上相对恒定。在相同N/P比下，维生素E修饰的复合物的表面电势明显高于未修饰PEI25复合物的表面电势。
2.6 原子力显微镜和透射电子显微镜表征
为了对PEI25-vitE20/pDNA复合物(N/P＝20)的微观形貌有一个比较直观的认识，用原子力显微镜(AFM,Ntegra Solaris)和透射电子显微镜(TEM,JEM-1400)对复合物的形态进行了表征。对于原子力显微镜样品的制备，首先在新剥离的平整云母片上滴加10μL复合物溶液原液，使溶液在云母片是均匀散开并置于清洁环境中自然风干2小时，为了得到较好的样品，同时制备多个样品进行观察。对于透射电子显微镜样品的制备，首先向碳膜铜网上滴加15μL复合物原液，几分钟后用吸水纸将过量溶液吸干。然后向铜网上滴加一滴0.5％磷钨酸进行负染，室温过夜之后在电镜下观察。结果可见PEI25-vitE20可以将质粒DNA凝聚成直径为约100-200nm左右的球形纳米粒。
实验例1 PEI衍生物作为基因输送载体的性能实验
1 实验方法
1.1 PEI-vitEn缀合物缓冲能力的测定
PEI最大的特点之一就是缓冲能力很强，这是因为它的结构中含有很高比例的伯、仲和叔胺，这些氨基可以在一定的pH下发生质子化而起到缓冲作用。PEI的基因输送性能也与其缓冲能力有着密切的联系。由于对PEI进行修饰都需要通过氨基来实现，所以不可避免的会对缓冲能力产生一定影响。因此有必要对修饰之后的PEI的缓冲能力进行考察。
PEI-vitEn缀合物和对照PEI(1.8kDa和25kDa)的缓冲能力是按照先前的文献(Zheng M,Zhong Y,Meng F,Peng R,Zhong Z.Mol Pharm.2011；8:2434-43.)使用酸碱滴定法测定的，所测pH值在2.0至11.0范围内，本发明测定方法与文献方法相比稍有变化。具体来讲，首先分别在10mL NaCl溶液(150mM)中分别溶解一定量的修饰和未修饰的PEI(0.2mmol氮原子)。正式滴定前用0.1M HCl将PEI溶液调节至起始pH 2.0，随后用0.1M NaOH滴定，每次滴加50μL。使用pH计(Mettler Toledo FE20)监测上述溶液pH值的变化并记录。按同样方法滴定NaCl(150mM)作为空白对照。所测聚合物的缓冲能力按照以下公式计算：
缓冲能力(％)＝100×(ΔVNaOH×0.1M)/N mol
其中ΔVNaOH是将PEI溶液的pH值从5.1调节至7.4所需要的NaOH溶液(0.1M)的体积，N mol是所滴定的聚合物中的可质子化胺基的总摩尔数(0.2mmol)。
1.2 PEI-vitEn/pDNA复合物的制备
PEI-vitEn/pDNA复合物的制备是在PBS或20mM HEPES缓冲液中混合一定量的pDNA储备溶液和不同量的PEI-vitEn缀合物完成的。具体来讲，首先向聚合物溶液中加入一定量的pDNA储备溶液(300ng/μL)，接着涡旋10秒，在室温下孵育30min即得复合物溶液。PEI-vitEn/pDNA的比例是根据氮/磷(N/P)比计算的，并且在计算复合物中PEI-vitEn缀合物的量时将连接在PEI骨架上的vitE的分子量计算在内。类似地，还制备了1.8kDa或25kDa PEI/pDNA复合物作为对照复合物。
1.3 琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳可用于研究PEI-vitEn缀合物的DNA结合能力。实验中首先制备N/P比从0.25到3.0(0.25、0.5、1、2、3)并且含有300ng pDNA的PEI-vitEn/pDNA复合物，最终体积为10μL。涡旋混合10秒，静置30分钟之后，将这些复合物各自与2μL 6×DNA上样缓冲液混合并且加载到预先制备的含有溴化乙锭(0.5mg/mL)的0.8％琼脂糖凝胶上，琼脂糖凝胶在80V下用Tris-醋酸盐(TAE)跑45min。跑好的凝胶在ChemiDoc XRS成像系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中观察DNA条带并且拍照。
为了研究vitE修饰对DNA从复合物中释放的影响，用肝素进行复合物中DNA的竞争性置换。对于本发明来说，按照如上所述的方法制备N/P比为2的PEI-vitEn/pDNA复合物。向复合物中加入不同量的肝素(肝素/pDNA＝0、1、2、4、8和16，w/w)。在37℃孵育30min之后，将样品按照上述条件进行电泳并且进行成像。同时制备PEI1.8/pDNA作为对照。本发明还对PEI-vitEn缀合物包载的pDNA的抗血清和核酸酶降解效果做了评价。首先在37℃下将N/P比为2的PEI-vitEn/pDNA复合物与10％血清或6U DNase I/μg pDNA一起孵育2小时。同时用血清或DNase I处理和未处理的pDNA作为对照。随后在65℃下将混合物加热10min从而使DNase I失去活性，然后将混合物与肝素(肝素/pDNA＝16,w/w)进一步孵育0.5小时从而置换出pDNA。按照如上所述的相同电泳条件分析样品。
1.4 PEI-vitE/pDNA复合物粒径和电势的测定
复合物颗粒的粒径和表面电势对转染效率有重要影响，粒径的大小可以直接影响复合物在不同组织和器官中的分布，而电势则会对复合物进入细胞的难易程度以及进入细胞之后的行为有重要影响。本实验中聚合物/pDNA复合物的粒径和表面电势是使用Zetasizer Nano ZS粒度仪(Malvern Instrument)在25℃下测量得到的。测量之前，按照如上所述的方法制备N/P比在1.25至25范围内(1.25、5、10、15、20、25)的聚合物/pDNA复合物溶液，每个样品中含pDNA约600ng，最终体积为100μL。将上述复合物样品分别在1.0mL的20mM HEPES缓冲液中稀释、震荡均匀并且尽快测量。测量时样品的最终浓度为1-20μg/mL。所有实验均重复两次。
1.5 原子力显微镜和透射电子显微镜表征
为了对PEI-vitE6/pDNA复合物(N/P＝20)的微观形貌有一个比较直观的认识，用原子力显微镜(AFM,Ntegra Solaris)和透射电子显微镜(TEM,JEM-1400)对复合物的形态进行了表征。对于原子力显微镜样品的制备，首先在新剥离的平整云母片上滴加10μL复合物溶液原液，使溶液在云母片是均匀散开并置于清洁环境中自然风干2小时，为了得到较好的样品，同时制备多个样品进行观察。对于透射电子显微镜样品的制备，首先向碳膜铜网上滴加15μL复合物原液，几分钟后用吸水纸将过量溶液吸干。然后向铜网上滴加一滴0.5％磷钨酸进行负染，晾干20分钟之后在电镜下观察。
1.6 细胞培养
本评价实验中共涉及到三种细胞系，分别是HEK-293A细胞、A375细胞和HepG2细胞。实验中除明确说明外，细胞培养条件均是在37℃，5％CO2的细胞培养箱中进行。所用培养基为含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素-链霉素，10,000U/mL)DMEM培养基，培养基每两天更换一次。
1.7 细胞毒性的考察
在对所得PEI-vitEn聚合物进行一系列必要的表征之后，进一步使用HEK-293A细胞评价了聚合物的细胞毒性。首先，向96孔板中接种HEK-293A细胞(约6×103个/孔)。在37℃下培养24小时之后，向每个孔中加入预定浓度(0～80μg/mL)的PEI-vitEn缀合物和对照PEI(PEI25)，继续孵育48小时之后除去培养基，向每个孔中加入100μL冷的10％三氯乙酸，继续在4℃下孵育1小时。之后用去离子水冲洗四次并且晾干，随后添加100μL的SRB溶液(4mg/mL)并继续孵育。30min后除去SRB溶液并且用1％乙酸将板冲洗四到五次。将96孔板晾干并且向每个孔中加入100μL Tris碱(10mM,pH 10.5)。处理完毕后用FlexStation3Benchtop Multi-Mode酶标仪在540nm下检测多孔板的光强度。实验中使用PEI25和PEI1.8在相同条件下处理的细胞作为对照组。所有实验均重复三次。
1.8 细胞转染及条件筛选
在细胞转染实验中使用编码绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N2质粒作为报告基因。实验中首先在6孔板中接种HEK-293A细胞(浓度为3×105细胞/孔)并且在转染实验之前孵育24小时。之后用N/P比不同的PEI-vitEn/pDNA复合物处理细胞并且在不含FBS的1mL Opti-MEM(GIBCO)培养基中培养4小时。随后，将转染培养基换成新鲜的完全生长培养基并且继续培养细胞48小时。同时按照标准流程用PEI1.8/pDNA、PEI25/pDNA和Lipo 2000/pDNA复合物转染细胞作为对照组。培养结束后通过高内涵筛选系统(Perkin Elmer,Operetta)观察细胞中的GFP表达效果并拍照。另外通过流式细胞仪(Becton Dickinson and Company)对GFP阳性细胞百分比进行定量并计算转染效率。所有实验均重复三次。
1.9 不同细胞系对复合物摄取的考察
通过流式细胞术分析了PEI-vitEn/pDNA复合物的细胞摄取和表达。具体来讲，首先将细胞接种到6孔板(3×105细胞/孔)中并且继续培养24小时。随后在1mL不含FBS的Opti-MEM(GIBCO)培养基中用FITC标记的PEI-vitE6/pDNA(N/P＝20)处理细胞4小时，相同条件下用FITC标记的PEI25/pDNA复合物(N/P＝10)处理细胞作为对照组。随后，将转染培养基换成新鲜的完全生长培养基。孵育1小时之后，用1×PBS冲洗细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA收集细胞并且再悬浮在1×PBS中。通过流式细胞术对阳性细胞数进行定量，分析细胞摄取和表达。相同条件下使用未处理的细胞作为阴性对照。选择了三种不同的细胞系HEK-293A、A375和HepG2进行实验，所有实验均重复三次。
1.10 体内分布考察
所有动物实验均使用雌性Balb/c小鼠(6-8周,18±3g)完成并且在SPF条件下饲养小鼠。为了研究PEI-vitE6/pDNA复合物进入体内后在不同器官中的分布，在250μL无菌PBS中制备了TRITC-PEI-vitE6/pDNA、TRITC-PEI25/pDNA和裸pDNA溶液，分别对三组小鼠(n＝9，每组3只)进行尾静脉注射，剂量都是60μg TRITC-聚合物/小鼠。注射一小时后，将小鼠处死，切除主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)并且用冷的生理盐水冲洗。将取下的器官立即在小动物活体内成像系统(CRI Maestro)中观察并拍摄器官的荧光图像。
1.11 体内转染和表达效果考察
在250μL无菌PBS中制备PEI-vitE6/pDNA、PEI25/pDNA和裸pDNA的溶液，分别对三组雌性Balb/c小鼠(n＝9，每组3只)通过尾静脉注射，剂量都是30μg pDNA/小鼠。每隔两天注射一次，一共注射三次。最后一次注射之后第三天，将小鼠处死，切除主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)并且用冷的生理盐水冲洗。按照如上所述的方法拍摄这些器官的荧光图像以便观察绿色荧光蛋白的表达。随后进一步将肝脏置于包埋剂中冷冻并用冷冻切片机切成12μm的组织切片，使用倒置荧光显微镜(Olympus IX83)观察并拍摄照片。
1.12 体内毒性的考察
将9只Balb/c小鼠随机分成三组，每组3只。对其中两组分别通过尾静脉注射溶于250μL无菌PBS的PEI25和PEI-vitE6溶液，剂量为4mg/kg体重。另外一组尾静脉注射250μL无菌PBS溶液作为阴性对照。注射完毕后每隔几天监测并记录每只小鼠的体重变化，整个过程持续40天左右。实验结束之后计算体重平均值并且以注射天数为横坐标，以平均体重为纵坐标绘制体重变化曲线作为活体内毒性的指标。
2、实验结果
2.1 PEI-vitEn缀合物缓冲能力的测定
根据“质子海绵”假设，PEI较高的缓冲能力有助于内涵体的渗透膨胀和破裂，从而促进核酸复合物从内涵体中逃脱并且随后将包载的核酸释放到细胞液中。实验结果为表3和图8所示，在生理pH范围内(pH 5.1到7.4)，PEI1.8的缓冲能力为17.0，PEI-vitE2、PEI-vitE4、PEI-vitE6的缓冲能力分别为17.8、19.5和15.5。PEI-vitEn的缓冲能力与PEI1.8相当，表明用vitE对PEI进行的疏水性修饰没有明显地影响PEI的质子化能力。
表3 PEI-vitEn缀合物的表征数据
[a]Calculated by elemental analysis data.[b]Calculated by HNMR data.[c]Calculated by titration results.
2.2 琼脂糖凝胶电泳实验
为了考察PEI-vitEn缀合物与DNA的结合特性，进行了琼脂糖凝胶电泳、粒径和表面电势测量。凝胶阻滞实验的N/P比为0.25、0.5、1.0、2.0和3.0。实验结果为图9(A)所示，vitE缀合对PEI1.8的DNA结合能力有轻微地削弱，其中PEI-vitE2、PEI-vitE4和PEI-vitE6分别在N/P比为1、1和2时完全抑制DNA迁移，而未修饰的1.8kDa PEI完全抑制DNA迁移的N/P比是0.5。PEI-vitEn/DNA结合能力的降低可能是由于PEI-vitEn的电荷密度降低，因为vitE很可能通过伯胺基团与1.8kDa PEI连接。
为了研究vitE修饰对DNA释放的影响，用肝素进行复合物中包载的DNA的竞争性置换实验。肝素是一种富含阴离子的聚合物，它可以将DNA从复合物中置换出来。实验结果为图9(B)所示，含有PEI-vitE6的复合物在肝素/pDNA比例为1时开始解离并释放出来，而含有PEI-vitE2或PEI-vitE4的复合物在肝素/pDNA比例为4时开始解离并释放，表明更多的vitE修饰有助于DNA的释放。
为了研究PEI-vitE是否能够使DNA避免在核酸酶环境中被降解，进行了DNase I或10％血清对DNA的保护实验。实验结果为图10所示，在用DNase I或10％血清处理2小时之后，通道3中的裸pDNA发生降解，而与PEI-vitE6以N/P比为2复合的pDNA完整无损，因为添加肝素之后可以使包载的pDNA几乎完整的释放。在血清中可以使DNA避免降解可能是由于聚合物与DNA强烈的相互作用，这在DNA结合和肝素置换实验中已经检测到了。
2.3 PEI-vitE/pDNA复合物粒径和电势的测定
PEI-vitEn/pDNA复合物的尺寸和表面电荷是两个重要因素，他们可以显著地影响复合物在不同细胞和组织中的摄取和分布，以及细胞毒性、生物相容性和被动靶向作用。基于之前的凝胶阻滞实验，在N/P为1.25、5、10、15、20和25时测量了PEI-vitEn/pDNA复合物的粒径和表面电势。DLS测量结果显示，在N/P比为5及以上的N/P比下，所有PEI-vitEn缀合物都可以有效地将DNA凝聚成纳米粒。而随着N/P比的增加，PEI-vitEn复合物的尺寸基本上相对恒定(图11a)。在相同的N/P比下，复合物尺寸随n的增加而增加。例如，在N/P比为20形成的PEI-vitE2、PEI-vitE4和PEI-vitE6的复合物平均尺寸分别是大约200、212和283nm，他们都比未修饰的1.8kDa和25kDa PEI复合物大得多(分别是125nm和152nm)。表面电势测量结果显示，随着N/P比的增加，PEI-vitEn/pDNA复合物的表面电荷也基本上相对恒定(图11b)。对于PEI-vitE2和PEI-vitE4的复合物来说，在相同的N/P比下，表面电荷随着n的增加表面电荷略微增加(分别是29.0mV和30.2mV)，而PEI-vitE6与其他PEI缀合物相比有明显差别，在相同N/P比下，PEI-vitE6复合物的表面电势(40.7mV)比PEI-vitE2和PEI-vitE4复合物的表面电势大得多(图11b)。PEI-vitE6具备的这些独特性质与其在转染实验中突出的表现有很大关系。
2.4 原子力显微镜和透射电子显微镜表征
本发明进一步使用AFM和TEM对PEI-vitE6形成的复合物形态大小进行了表征，制备的复合物N/P比为20。实验结果如图12所示，PEI-vitE6可以将质粒DNA凝聚成直径为约200nm左右的球形纳米粒。使用AFM和TEM测量的复合物粒子尺寸比通过DLS测量的尺寸稍小。这可能是因为通过DLS测量的颗粒尺寸是在溶液中的水化状态下获得的，复合物颗粒在该状态下自由舒展，而通过AMF和TEM获得的颗粒尺寸是在支持基材上干燥之后获得的，复合物颗粒可能会由于干燥而收缩变小。
2.5 细胞毒性的考察
在对PEI衍生物和复合物的性质进行了充分的表征之后，评价了PEI25和PEI-vitEn缀合物在细胞和小鼠体内的毒性。实验中使用PEI25作为标准对照。实验结果为图13所示，PEI25在HEK-293A细胞中显示较高的毒性。在浓度为60μg/mL时几乎所有的细胞都被毒死。与PEI25相比，PEI-vitEn缀合物显示低得多的细胞毒性。随着每个PEI上标记的vitE数目的增加，毒性进一步下降，即使浓度增加到60μg/mL，PEI-vitE6组的细胞存活率仍然高达90％。显然维生素E的修饰降低了PEI的毒性。
2.6 细胞转染效果评价及最佳条件筛选
为了优化PEI-vitE缀合物介导的基因输送和GFP表达的N/P比例，首先使用FACS分析考察了不同N/P(5至25)的PEI-vitE6/DNA的转染效果。结果为图14所示，转染效率随N/P比的升高而增加，并且在N/P＝20时达到了最高水平。N/P进一步升高到25对GFP表达没有明显增强。随后研究了不同PEI-vitEn缀合物在N/P＝20时向细胞转染DNA的效果。由于毒性较高，PEI25的N/P选用10。结果为图15所示，用PEI1.8/pDNA复合物转染的细胞几乎没有观察到GFP表达，这是符合预期的。随着PEI1.8上标记的vitE数目增加，GFP表达水平明显增强。PEI-vitE6缀合物的pDNA输送效果最好，基因表达水平与Lipo 2000相当，并且达到PEI25/pDNA复合物的GFP表达水平的3.2倍。另外，对A375、HepG2和HEK-293A三种细胞系进行摄取效率考察发现，维生素E修饰后的细胞摄取率均显著高于PEI25对照组。
2.7 动物实验
实验结果如图16所示，进一步研究了PEI-vitE6在活体内的基因输送。与注射PBS的对照小鼠相似，在40天时间的观察期间，静脉注射PEI-vitE6(80μg/小鼠)对小鼠体重没有明显影响，表明vitE修饰的PEI没有引起明显的全身性毒性。然而，用PEI25(80μg/小鼠)注射的小鼠在注射后24小时之内全部死亡，表明PEI25具有较高的全身性毒性。
为了证明维生素E修饰的PEI衍生物在活体内的基因输送作用，进一步研究了PEI/pDNA复合物在小鼠中的组织分布。首先分别对三组小鼠通过尾静脉注射pDNA、TRITC-PEI25/pDNA复合物和TRITC-PEI-vitE6/pDNA复合物。随后在注射一小时后处死小鼠。将其主要器官切除并且在CRI Maestro成像系统中观察并拍摄照片。如图17a&17b所示，只注射pDNA的对照组小鼠的所有器官都没有检测到荧光，而注射TRITC-PEI25/pDNA复合物的小鼠仅在肝脏、肺脏和肾脏中检测到微弱的荧光。相比之下，在注射TRITC-PEI-vitE6/pDNA复合物的小鼠的肝脏和肺脏中观察到很强的荧光(图17c)。然而，在肾脏中没有观察到荧光。这些结果表明，与PEI25相比，PEI的vitE修饰不仅大大增强了pDNA在小鼠肝脏和肺脏中的分布，还降低了pDNA在肾脏中的分布。
随后评价了绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的转染和表达情况，以进一步探索PEI-vitE6/DNA复合物在体内基因转染中的潜在应用。首先分别对三组小鼠静脉注射pDNA、PEI25/pDNA和PEI-vitE6/pDNA，一共在9天内注射三次，每次注射相同质量的pDNA(30μg)。最后一次注射结束后第三天将小鼠处死。将小鼠的器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)切除。随后在CRI Maestro成像系统中观察这些器官的荧光强度。如图18所示，在注射pDNA的阴性对照组小鼠器官中基本未观察到荧光，表明没有绿色荧光蛋白表达。在注射PEI25/pDNA的阳性对照组小鼠的肝脏、肺脏和肾脏中观察到微弱的荧光，而在注射PEI-vitE6/DNA的实验组小鼠的肝脏和肺脏中观察到非常强烈的荧光，表明PEI-vitE6/DNA将绿色荧光蛋白基因有效输送到肝细胞和肺细胞中并且成功表达。将小鼠的肝脏包埋在OCT包埋剂中，在冷冻切片机中切出12μm的组织切片进行荧光成像。从图19中的结果可以看出，阴性对照组小鼠组织细胞没有摄取pDNA质粒，只观察到微弱的背景荧光。与pDNA输送结果相似，注射PEI25/pDNA的阳性对照组小鼠肝脏组织中仅仅观察到非常少的荧光点。而在注射PEI-vitE6/pDNA复合物的实验组小鼠肝脏组织中检测到强得多的绿色荧光。在小鼠中观察到的pDNA分布和基因表达结果表明PEI-vitE6能够将pDNA有效输送到肝脏和肺脏细胞中并且进一步释放包载的pDNA进行基因表达。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物：
其中，m或n为任意的整数。
2.按照权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，m为1至60的任意整数，n为1至60的任意整数。
3.按照权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，m为4，n为2，4或6；或者m为54，n为10，20或40。
4.一种合成权利要求1-3任何一项所述的聚乙烯亚胺衍生物的方法，其特征在于，该方法包括：(1)向维生素E中引入羧基得到vitE-COOH；(2)用N,N-羰基二咪唑活化vitE-COOH得到活化酯；(3)活化酯直接与聚乙烯亚胺进行反应，得到维生素E修饰的PEI衍生物。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)向维生素E中引入羧基的方法包括：将维生素E和2-溴乙醇进行取代反应合成vitE-OH；将vitE-OH与己二酸进行偶联得到vitE-COOH。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在室温下，用CDI活化溶于无水DCM和TEA中的vitE-COOH得到活化活化酯；其中，所述的室温优选为15-30℃，更优选为25℃。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中活化酯与聚乙烯亚胺在室温下进行反应，所述的室温优选为15-30℃，更优选为25℃。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将反应产物旋蒸除去溶剂，将残余物溶于蒸馏水得到水溶液；将水溶液pH值调节到8-9后进行透析并冷冻干燥，得到维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物。
9.权利要求1-3所述的聚乙烯亚胺衍生物作为基因输送载体的用途。
10.权利要求1-3所述的聚乙烯亚胺衍生物在制备体内转染试剂或药物中的用途。
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