CN103627006A - 可降解tpgs-pei接枝聚合物、制备方法及在基因药物传递中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药用高分子材料研究领域，具体涉及一种能传输基因药物的可降解d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亚胺(TPGS-PEI)接枝聚合物、制备方法和及其在基因传递中的应用。将偶联剂二异氰酸酯与d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)溶于有机溶剂中，制备活化的TPGS单端基异氰酸酯。将溶有聚乙烯亚胺(PEI)的有机溶液加入到活化后的TPGS单端基异氰酸酯溶液中，形成接枝聚合物。所述的聚合物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺(PEI)和TPGS的优点，其中d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯分子量为500-3000，聚乙烯亚胺段的分子量为600-25000。所述的聚合物转染效率高，细胞毒性小，细胞存活率80％以上。
Description
技术领域
本发明属于药用高分子材料研究领域，具体涉及可降解d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亚胺(TPGS-PEI)接枝聚合物、制备方法及其在基因传递中的应用。
背景技术
随着基因治疗的不断深入，非病毒基因载体的研究近年来取得了很大进展。聚乙烯亚胺(po lyethylenimine，PEI)是目前研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体。1995年，Boussif等人首先成功报道了PEI作为非病毒基因载体，该聚合物具有独特的“质子海绵效应，，能够实现高效的基因传递。(Proceedings of the National Academy of Sciences92(16)，7297-7301，1995)。
PEI高效的转染效率原因有两方面：一方面是由于其较高的电荷密度。PEI主链3个原子中就含有一个N原子，氨基质子化后有利于压缩DNA，在低氮磷比(N／P)比即获得最佳最佳转染效率；另一方面得益于它具有较好的质子缓冲能力，能够从内涵体中逃逸出来。在生理pH值条件下，PEI中大约有80％的氨基没有质子化，随着pH的降低，PEI上未质子化的氨基会逐步质子化，进而破坏内涵体和溶酶体的膜结构，使复合物迅速逃离进入细胞质中(CHIMIA：International Journal for Chemistry51(1-2)，34-36，1997；Journal ofGene Medicine7(5)，657-663，2005)
从目前的研究结果来看，PEI的转染性能强烈依赖于分子量，高分子量的PEI具有较好的转染效率，但由于PEI强的渗透作用，破坏细胞的溶酶体膜，显出细胞毒性；而低分子量PEI毒性虽小，但却转染效率低下(Journal of Gene Medicine7(8)，992-1009，2005)。作为金标准的PEI25k(Mn=2.5×104Da)虽然具有较高的转染效率，但细胞毒性及其不可降解性大大限制了其应用。
为了解决此困难，科学研究者做了大量的PEI修饰和改性的工作。近年来已有研究证实，对PEI进行聚乙二醇(PEG)修饰后可明显提高PEI-DNA的溶解性，屏蔽复合物表面的正电荷，降低细胞毒性，延长体内循环时间(Macromolecules35(18)，6867-6874，2002)。但采用聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol1000succinate，TPGS)修饰PEI的接枝聚合物则未见文献报道。
TPGS是天然维生素E的水溶性衍生物，由维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)的羧基与聚乙二醇1000(polyethylene glycol1000，PEG1000)酯化而成。因此，在用作各种药物载体的过程中，同时具有PEG及维生素E的优点，包括：可以延长药物在血浆中的半衰期，提高药物的细胞摄取率等。TPGS的两亲性质和较大的分子表面积，使其成为出色的非离子表面活性剂。被FDA批准用作制剂中的增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂等。另外，TPGS可以抑制P-糖蛋白的外排作用，提高受P-糖蛋白阻滞的药物的生物利用度，并能有效克服肿瘤细胞的多药耐药性(multidrugresistance，MDR)(Biomaterials2012，33(19)，4889-4906.)
本领域目前需要得到具有较高的转染效率，细胞毒性低且可以降解的修饰改性的聚乙烯亚胺(PEI)作为基因药物载体材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种d-alpha-生育酚琥珀酸聚7二醇酯接枝聚乙烯亚胺(TPGS-PEI)聚合物、制备方法及其在基因传递中的应用。所合成的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亚胺(TPGS-PEI)接枝聚合物为可降解阳离子聚合物，未见文献报道。
TPGS-PEI接枝聚合物兼具了PEI与TPGS的优点，其分子电荷密度较高，对基因物质负载能力强，具有良好的生物相容性，克服了PEI均聚物高毒性、不可降解性的缺点。同时，本发明中的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)-聚乙烯亚胺(PEI)接枝聚合物(TPGS-PEI)具有两亲性质，带有一个小的疏水的头部(VE)(约5％)，亲水性的聚乙二醇链(PEG)(15～20％)及聚乙烯亚胺(PEI)(70～80％)部分。因此新形成的接枝聚合物(TPGS-PEI)具有自乳化功能，在溶液中可以形成自组装颗粒。以其作为基因药物载体可以实现药物的pH响应快速释放及其TPGS对P-糖蛋白抑制的协同作用，从而显著地提高细胞毒性，尤其对癌症治疗过程中的多药耐药(MDR)的细胞。
所述的TPGS-PEI接枝聚合物的结构式如下：
其中，X为偶联剂，其为二异氰酸酯类；PEI为聚乙烯亚胺；TPGS为d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯；聚合度a大于或者等于1。
所述的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)分子量为500-3000，其结构式如下图所示：
所述的聚乙烯亚胺结构为线型或者支化，其结构式如下图所示：
其中，聚合度b，c，d均大于或者等于1。
所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1)d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)的异氰酸酯活化(TPGS-NCO)
将TPGS先冷冻干燥脱水处理4h，按照TPGS的质量e，与有机溶剂的体积(mL)的配比1～5：10～20，将TPGS用有机溶剂溶解并投料到反应容器中，其中有机溶剂选择氯仿或二氯甲烷；再按照TPGS与偶联剂二异氰酸酯的摩尔配比为1～5：10～20将二异氰酸酯也加入到反应容器中，控温0～70℃搅拌反应至少16小时，反应完后所得产物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重复多次直至将过量的偶联剂二异氰酸酯去除干挣，真空干燥，得异氰酸酯活化的TPGS(TPGS-NCO)。
(2)按照异氰酸酯活化的TPGS(TPGS-NCO)的质量e，与有机溶剂的体积(mL)的配比1～5：10～50，将TPGS-NCO用有机溶剂溶解并投料到反应容器中，其中有机溶剂选择氧仿或二氯甲烷；按照TPGS-NCO中的异氰酸酯基与聚乙烯亚胺的摩尔配比为2：1～30：1，取聚乙烯亚胺(PEI)于另一干燥反应器中，并按照聚乙烯亚胺的质量f与有机溶剂的体积mL的配比1：10～1：100，加入无水有机溶剂溶解，并将溶解均匀的聚乙烯亚胺的溶液移至恒压滴液漏斗中；将滴液漏斗中的聚乙烯亚胺的反应液直接滴加到含TPGS-NCO的溶液中，至少30分钟滴加完毕，滴加过程中反应器保持冰浴并搅拌，滴加完毕后，控温反应0～60℃继续搅拌反应2～24小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，得到TPGS-PEI接枝聚合物。
可降解TPGS-PEI接枝聚合物在体外转染中作为基因传递载体。其用法的步骤和条件如下：
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养；
(2)体外转染
体外转染转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μl，继续培养24小时；
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；
(4)细胞毒性测试
采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80～90％，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷酸盐缓冲液，混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample／Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每绢实验重复三次。
可降解TPGS-PEI接枝聚合物在体内转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于，步骤和条件如下：
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5μg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100μl，第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μl荧光素酶底物，10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。
有益效果：所制备的可降解TPGS-PEI接枝聚合物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺和TPGS各自的优点，转染效率高，其在同等条件下对非洲绿猴肾细胞细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为美国Invitrogen生物公司商业转染试剂LipofectamineTM2000的21倍，细胞毒性小，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80％以上。
本发明所制备的可降解TPGS-PEI接枝聚合物具有低毒并可生物降解性，因为其所选用的TPGS骨架具有良好的生物相容性，在生理条件下可自行降解和代谢，进而被生物体吸收或排出体外，对人体无毒副作用。
因此，本发明所合成的TPGS接枝聚乙烯亚胺聚合物在基因传递上有很高的使用价值，有广泛的应用前景。
附图说明
图1为各种TPGS-PEI接枝聚合物材料的细胞毒性图。
具体实施方式
实例1：d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇(1000)酯(TPGS)中羟基的异氰酸酯活化(TPGS-NCO)
将TPGS(PEG1000)先冷冻干燥脱水处理4h，按照TPGS的质量与有机溶剂的体积(mL)的配比1：4，将TPGS用二氯甲烷溶解并投料到反应容器中；再按照TPGS与偶联剂六亚甲基-1，6-二异氰酸酯(HMDI)的摩尔配比为1：10，将六亚甲基-1，6-二异氰酸酯也加入到反应容器中，控温0～70℃搅拌反应至少16小时，反应完后所得产物在石油醚中沉淀，沉淀进一步用沉淀用石油醚洗涤；然后用二氯甲烷溶解，再用石油醚沉淀，此操作重复多次直至将过量的偶联剂二异氰酸酯去除干净，真空干燥，得到异氰酸酯活化的TPGS。使用红外(IR)及核磁共振(NMR)分析异氰酸酯活化的TPGS的结构。
按照异氰酸酯活化的TPGS(TPGS-NCO)的质量与有机溶剂的体积(mL)的配比1：60，将TPGS-NCO用二氯甲烷溶解并投料到反应容器中；按照表1所示，分别取TPGS-NCO中的异氰酸酯基与支链聚乙烯亚胺(PEI10KDa)(1.0g，0.1mmol)的不同摩尔配比投料，将PEI溶解于另一干燥反应器中，并按照聚乙烯亚胺的质量与有机溶剂的体积(mL)的配比1：100，加入无水氯仿(100mL)溶解，并将溶解均匀的聚乙烯亚胺的溶液移至恒压滴液漏斗中；将滴液漏斗中的聚乙烯亚胺的反应液直接滴加到含TPGS-NCO的溶液中，至少30分钟滴加完毕，滴加过程中反应器保持冰浴并搅拌，滴加完毕后，控温反应60℃继续搅拌反应24小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，得到TPGS-PEI接枝聚合物。采用核磁共振(NMR)和凝胶渗透色谱分析PEI接枝率及产物数均分子量，结果见表1。
表1采用不同摩尔比合成PEI(10K)-TPGS接枝聚合物
实施例2：TPGS-PEI接枝聚合物介导荧光素酶质粒对非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)的体外转染
1、Cos-7细胞的培养取Cos-7细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
2、体外转染 转染前24小时内，取对数生长期Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔I X104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，更换200μL／孔含有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养液，再选用荧光素酶质粒(pGL3)为报告基因，分别加入PEI(10K)-TPGS(1K)5／pGL3、PEI(10K)-TPGS(1K)9／pGL3、PEI(10K)-TPGS(1K)19／pGL3、PEI(10K)-TPGS(1K)28／pGL3、PEI(25K)／pGL3以及商业化转染试剂LipofectamineTM2000／pGL3的复合物颗粒进行转染对比，继续培养24小时。
3、体外转染效率的测定取出培养板，吸弃培养液，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，使用照度计测定转染效率，表示为每毫克蛋白的发光单元数(RLU／mg Protein)
表2介导荧光素酶质粒的体外转染效率
| 序号 | 载体材料 | 最佳转染效率(RLU／mg Protein) |
| 1 | PEI25K | 9.324×108 |
| 2 | LipofectamineTM2000 | 1.083×109 |
| 3 | PEI(10K)-TPGS(1K)5 | 5.517×109 |
| 4 | PEI(10K)-TPGS(1K)9 | 9.117×109 |
| 5 | PEI(10K)-TPGS(1K)19 | 8.315×108 |
| 6 | PEI(10K)-TPGS(1K)28 | 6.457×108 |
本发明中的TPGS-PEI接枝聚合物是一种非常高效的基因传递载体材料。表2分别给出了体外转染实验中PEI(10K)-TPGS(1K)5、PEI(10K)-TPGS(1K)9、PEI(10K)-TPGS(1K)19、PEI(10K)-TPGS(1K)28、PEI(25K)与Lipofectamine TM2000的最佳转染效率，通过对比可以看出本发明中PEI(10K)-TPGS(1K)5、PEI(10K)-TPGS(1K)9所代表的TPGS-PEI接枝聚合物具有更高的转染效率。
实施例3：TPGS-PEI接枝聚合物的细胞毒性测试
1、Cos-7细胞的培养
取Cos-7细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
2、毒性测试
采用MTT的方法比较评价不同浓度PEI(10K)-TPGS(1K)5、PEI(10K)-TPGS(1K)9、PEI(10K)-TPGS(1K)19、PEI(10K)-TPGS(1K)28、PEI25k和商业转染试剂LipofectamineTM2000的材料细胞毒性。实验前24小时内，取对数生长期的Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μL含质量分数为0.5％MTT的PBS溶液。混合物在37℃继续作用4小时，加入200μL二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)=(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次，测试结果见图1。
通过图1我们可以看出不同浓度下各种载体材料处理后的细胞存活率。相对于PEI25k和LipofectamineTM2000，本发明中PEI(10K)-TPGS(1K)5、PEI(10K)-TPGS(1K)9、PEI(10K)-TPGS(1K)19、PEI(10K)-TPGS(1K)28所代表的TPGS-PEI接枝聚合物材料是一种对细胞毒性很小的转染试剂。
实施例4：TPGS-PEI接枝聚合物介导体内转染实验
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5yg荧光素酶质粒(pGL3)的PEI(10K)-TPGS(1K)5／pGL3、PEi(10K)-TPGS(1K)9／pGL3、PEI(10K)-TPGS(1K)19／pGL3、PEI(10K)-TPGS(1K)28／pGL3与LipofectamineTM2000／pGL3复合物颗粒溶液100μlo第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果。在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μI荧光素酶底物。10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。结果表明PEI(10K)-TPGS(1K)5、PEI(10K)-TPGS(1K)9、PEI(10K)-TPGS(1K)19、PEI(10K)-TPGS(1K)28所代表的TPGS-PEI接枝聚合物比LipofectamineTM2000具有更高的转染效率。
Claims (6)
1.可降解TPGS-PEI接枝聚合物，其特征在于：由d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)偶联聚乙烯亚胺(PEI)而得到的接枝聚合物，该聚合物的结构式如下：
其中，X为偶联剂，其为二异氰酸酯类；PEI为聚乙烯亚胺；TPGS为d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯；聚合度a大于或者等于1；
所述的聚乙烯亚胺结构为线型或者支化，其结构式如下图所示：
其中，聚合度b，c，d均大于或者等于1；
所述的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)分子量为500-3000，其结构式如下图所示：
2.权利要求1所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1)d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)的异氰酸酯活化
将TPGS先冷冻干燥脱水处理4h，按照TPGS的质量e，与有机溶剂的体积(mL)的配比1～5：10～20，将TPGS用有机溶剂溶解并投料到反应容器中，搅拌溶解，其中有机溶剂选择氯仿或二氯甲烷；再按照TPGS与偶联剂二异氰酸酯的摩尔配比为1～5：10～20将二异氰酸酯也加入到反应容器中，控温0～70℃搅拌反应至少16小时，反应完后所得产物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重复多次直至将过量的偶联剂二异氰酸酯去除干净，真空干燥，得异氰酸酯活化的TPGS；
(2)按照异氰酸酯活化的TPGS(TPGS-NCO)的质量e，与有机溶剂的体积(mL)的配比1～5：10～50，将TPGS-NCO用有机溶剂溶解并投料到反应容器中，其中有机溶剂选择氯仿或二氯甲烷；按照TPGS中的羟基与聚乙烯亚胺的摩尔配比为2：1～30：1，取聚乙烯亚胺(PEI)于另一干燥反应器中，并按照聚乙烯亚胺的质量f与有机溶剂的体积mL的配比1：10～1：100，加入无水有机溶剂溶解，并将溶解均匀的聚乙烯亚胺的溶液移至恒压滴液漏斗中；将恒压滴液漏斗中的聚乙烯亚胺的反应液直接滴加到含TPGS-NCO的溶液中，至少30分钟滴加完毕，滴加过程中反应器保持冰浴并搅拌，滴加完毕后，控温反应0～60℃继续搅拌反应2～72小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，得到TPGS-PEI接枝聚合物。
3.权利要求1所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因传递中的应用，其特征在于：可降解TPGS-PEI接枝聚合物在体外转染中作为基因传递载体。
4.根据权利要求3中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因传递中的应用，其特征在于，其用法的步骤和条件如下：’
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养；
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μl，继续培养24小时；
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；
(4)细胞毒性测试
采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80～90％，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷酸盐缓冲液，混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)=(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。
5.权利要求1中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因传递中的应用，其特征在于，可降解TPGS-PEI接枝聚合物在体内转染中作为基因传递载体。
6.根据权利要求5中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在在基因传递中的应用，其特征在于，其用法的步骤和条件如下：
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5μg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100μl，第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μl荧光素酶底物，10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。
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-
2013
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| CN104151559B (zh) * | 2014-07-16 | 2016-08-17 | 浙江大学 | 聚丙烯酰胺-丙烯腈-聚乙二醇及合成方法和应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140312 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |