CN103635514B - 支链型两亲性嵌段聚合物、使用其的分子聚集体及药物输送系统 - Google Patents

支链型两亲性嵌段聚合物、使用其的分子聚集体及药物输送系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能够提高Lactosome给药后短时间内的肿瘤部位与背景的反差比并抑制ABC现象，从而能够在短时间内多次给药的高分子胶束制剂。一种支链型两亲性嵌段聚合物，其具有：含有肌氨酸且多分支的亲水性嵌段和具有聚乳酸的疏水性嵌段。前述支链型两亲性嵌段聚合物中，前述亲水性嵌段的支链数为多个。一种分子聚集体，其具有前述支链型两亲性嵌段聚合物。前述分支聚集体还具有直链型两亲性嵌段聚合物。

Description

支链型两亲性嵌段聚合物、使用其的分子聚集体及药物输送系统
技术领域
本发明属于超分子化学、医学工程/药学相关领域及纳米医学领域。本发明涉及作为分子成像用分子探针的纳米载体、药物输送用纳米载体及疏水性化合物的分散剂。更具体而言，本发明涉及支链型两亲性嵌段聚合物、使用其的分子聚集体及药物输送系统。
背景技术
在国际公开第2009/148121号小册子（专利文献1）及生物材料（Biomaterials）、2009年、第30卷、p.5156-5160（非专利文献1）中公开了：疏水性嵌段为聚乳酸链、亲水性嵌段为聚肌氨酸链的直链型两亲性嵌段聚合物在水溶液中自组装，形成粒径为30nm以上的高分子胶束（Lactosome）。已知Lactosome具有较高的血中滞留性，此外与迄今为止已经开发出的高分子胶束相比，其在肝脏中的集聚量明显减少。该Lactosome通过利用在血中滞留的粒径为数十～数百nm的纳米颗粒易在癌症中滞留这样的性质（增强渗透滞留效应（EnhancedPermeationandRetentioneffect（EPR效应））），可以用作以癌症部位作为靶的分子成像或药物输送用纳米载体。
关于由合成高分子构成的高分子胶束，已知有如下的现象：在生物体内给药一次，免疫系统就被活化，再次给药相同的高分子胶束时，由于免疫系统的工作而向肝脏中集聚的现象，即加速血液清除（AcceleratedBloodClearance（ABC））现象。尚不清楚ABC现象表现的机理的详细情况。在药学会志（薬学会誌）、2009年、第129卷、第12号、p.1445-1451（非专利文献2）中报道了，粒径达到30nm以下时，ABC现象的表现受到抑制。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/148121号小册子
非专利文献
非专利文献1：生物材料（Biomaterials）、2009年、第30卷、p.5156-5160
非专利文献2：药学会志（薬学会誌）、2009年、第129卷、第12号、p.1445-1451
发明内容
发明要解决的问题
专利文献1及非专利文献1中记载的Lactosome显示出非常高的血中滞留性，因此直至背景信号降低为止需要时间。具体而言，癌症部位与背景的反差达到最大时为Lactosome给药24小时后。
因此，难以在短时间内进行成像。
特别是难以采用Lactosome作为使用18F-PET这样半衰期短（18F的半衰期为110分钟）的放射性核物种的成像（放射线诊断）的分子探针的纳米载体。
进而，对于上述Lactosome，（与由合成高分子构成的高分子胶束的情况同样）也确认到ABC现象。
因此存在直至免疫学的记忆效应降低的期间内无法多次给药Lactosome的问题。
因此，本发明的目的在于，发明出一种能够提高Lactosome给药后短时间内的肿瘤部位与背景的反差比并抑制ABC现象，从而在短时间内能够多次给药的高分子胶束制剂。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果发现：通过对两亲性嵌段聚合物进行分子设计使得亲水性嵌段中具有由多条肌氨酸链构成的支链结构，实现了上述本发明的目的，从而完成了本发明。
本发明包含以下技术方案。
（1）
一种支链型两亲性嵌段聚合物，其具有：含有肌氨酸的分支的亲水性嵌段和具有聚乳酸的疏水性嵌段。
（2）
根据（1）所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，前述亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元的总计为2～200个。
（3）
根据（1）或（2）所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，前述亲水性嵌段的支链数为3。
（4）
根据（1）～（3）中的任一项所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，构成前述聚乳酸的乳酸单元为10～400个。
（5）
根据（1）～（4）中的任一项所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，前述疏水性嵌段未分支。
（6）
根据（5）所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，多个前述亲水性嵌段从前述疏水性嵌段中的含有前述聚乳酸链的分子链中的一个碳原子分支。
（7）
根据（6）所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其具有下述式（I）所示的结构：
（式中，n1、n2及n3表示其总计为3～200的数，m表示15～60的数，R表示氢原子或有机基团。）。
（8）
根据（1）～（7）中的任一项所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，前述亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元数的总计相对于前述疏水性嵌段中所含的乳酸单元数的总计之比为0.05以上且小于1.8。
（9）
一种分子聚集体，其具有（1）～（8）中的任一项所述的支链型两亲性嵌段聚合物。
（10）
根据（9）所述的分子聚集体，其还具有直链型两亲性嵌段聚合物，所述直链型两亲性嵌段聚合物具有：作为亲水性嵌段的1条聚肌氨酸链和作为疏水性嵌段的1条聚乳酸链。
（11）
根据（9）或（10）所述的分子聚集体，其内含选自由信号剂及药物组成的组中的功能性物质。
（12）
根据（11）所述的分子聚集体，其中，前述物质具有聚乳酸链。
（13）
根据（9）或（10）所述的分子聚集体，其中，前述支链型两亲性嵌段聚合物具有选自由信号基团及配位基团组成的组中的功能性基团。
（14）
根据（9）～（13）中的任一项所述的分子聚集体，其粒径为10～50nm。
（15）
根据（9）～（14）中的任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备有机溶剂中含有前述支链型两亲性嵌段聚合物的溶液的工序；
从前述溶液中去除前述有机溶剂，在前述容器的内壁上得到含有前述支链型两亲性嵌段聚合物的薄膜的工序；及
在前述容器中加入水或水溶液，进行超声波处理，将前述薄膜转化为分子聚集体，得到分子聚集体的分散液的工序。
（16）
根据（9）～（14）中的任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备有机溶剂中含有前述支链型两亲性嵌段聚合物的溶液的工序；
使前述溶液分散于水或水溶液中的工序；及
去除前述有机溶剂的工序。
（17）
一种药物输送系统，其包括将（11）～（16）中的任一项所述的分子聚集体作为分子探针给药至非人动物体内。
发明的效果
根据本发明，通过亲水性嵌段中的支链结构，可以制备现有Lactosome中无法制备的具有小粒径（例如小于30nm的粒径）的Lactosome。由此，从位于癌细胞周边的血管壁的间隙漏出的Lactosome的数量增加，可以加快Lactosome向癌部位的集聚速度。另外，促进向更细的血管中的分布从而分布于全身，由此可以降低背景的信号。即，可以提高肿瘤部位与背景的反差比。由此，可以在短时间内进行成像。
另外，根据本发明，通过亲水性嵌段中的支链结构，可以制备表面具有肌氨酸链的稠密的聚合物刷结构的Lactosome，无论粒径是否小于30nm都可以抑制ABC现象的表现。
因此，根据本发明，可以发明出能够提高Lactosome给药后短时间内的肿瘤部位与背景的反差比并抑制ABC现象，从而能够在短时间内多次给药的高分子胶束制剂。
附图说明
图1是实施例1中合成的支链型两亲性嵌段聚合物的1HNMR谱图。
图2是实施例2中制备的、仅以支链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链单独系分子聚集体（高分子胶束；Lactosome）的DLS测定结果。
图3是实施例2中制备的、仅以支链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链单独系分子聚集体的TEM图像。
图4是实施例3中制备的、以支链型两亲性嵌段聚合物和直链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链/直链混合系分子聚集体的DLS测定结果。
图5是实施例3中制备的、以支链型两亲性嵌段聚合物和直链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链/直链混合系分子聚集体的TEM观察结果。
图6示出使用实施例4中得到的、经ICG修饰的支链单独系分子聚集体的荷瘤小鼠的近红外成像结果。
图7示出使用经ICG修饰的支链单独系分子聚集体的荷瘤小鼠的近红外成像中的肝脏、背景（背部）、肿瘤的荧光强度的经时变化。
图8示出实施例5中得到的、由支链单独系分子聚集体及直链单独系分子聚集体（比较用）的对荷瘤小鼠的再次给药而产生的近红外成像结果。
图9示出由支链单独系分子聚集体及直链单独系分子聚集体（比较用）的再次给药而产生的近红外成像中的肝脏、背景（背部）、肿瘤中的ROI的经时变化。
图10示出将支链单独系分子聚集体及直链单独系分子聚集体（比较用）给药一周后采集的小鼠血浆中的抗体量的ELISA结果。
图11是实施例7中制备的仅以支链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链单独系分子聚集体的DLS测定结果。
图12是实施例8中合成的支链型两亲性嵌段聚合物的1HNMR谱图。
图13是实施例9中制备的仅以支链型两亲性嵌段聚合物作为构成成分的支链单独系分子聚集体的DLS测定结果。
具体实施方式
[1.支链型两亲性嵌段聚合物]
本发明的两亲性嵌段聚合物具有：含有肌氨酸的分支的亲水性嵌段和具有聚乳酸的疏水性嵌段。亲水性嵌段和疏水性嵌段是指，介由连接部结合。
[1-1.亲水性嵌段]
本发明中，作为支链型两亲性嵌段聚合物的亲水性嵌段所具有的所谓“亲水性”的物性的具体水平，没有特别限定，是指亲水性嵌段的整体的亲水性至少相对地强于后述作为疏水性嵌段的聚乳酸链的性质。或者是指，通过亲水性嵌段与疏水性嵌段形成共聚物，作为共聚物分子整体能够实现两亲性的水平的亲水性。再或者是指，两亲性嵌段聚合物能够在溶剂中自组装而形成自组装体、特别是颗粒状自组装体的水平的亲水性。
本发明的两亲性嵌段聚合物的亲水性嵌段具有分支的结构。亲水性嵌段的各个支链分别含有肌氨酸。
亲水性嵌段中，结构单元的种类及比率由本领域技术人员适当确定，以使嵌段整体成为上述的亲水性。具体而言，全部支链中所含的肌氨酸单元的总计例如可以为2～200、2～100或2～10个。或者，全部多个亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元的总计例如可以为30～200或50～100个。每一个支链中的肌氨酸单元数的平均值例如可以为1～60、1～30、1～10或1～6。即，各个亲水性嵌段可以分别通过含有肌氨酸或聚肌氨酸链而构成。
结构单元数超过上述范围时，形成分子聚集体时，存在所形成的分子聚集体欠缺稳定性的倾向。低于上述范围时，存在不会形成作为两亲性嵌段聚合物的本体、或分子聚集体的形成本身变得困难的倾向。
亲水性嵌段中的支链只要为2以上即可，从形成分子聚集体时有效地得到颗粒形状的胶束的观点考虑，优选为3以上。对亲水性嵌段中的支链数的上限没有特别限定，例如为27。在本发明中，亲水性嵌段的支链数特别优选为3。
肌氨酸（即N-甲基甘氨酸）的水溶性高，而且肌氨酸的聚合物具有N取代酰胺，所以与普通的酰胺基相比，可以进行顺反异构化，进而Cα碳周围的位阻小，所以具有高柔软性。使用这种结构作为构成嵌段时，从对该嵌段赋予高亲水性的基本特性、或兼具高亲水性和高柔软性的基本特性的方面考虑，是非常有用的。
进而，亲水性嵌段优选在末端（即与连接部相反的一侧的末端）具有亲水性基团（例如以羟基为代表）。
需要说明的是，聚肌氨酸链中，全部的肌氨酸单元可以是连续的，也可以是非连续的，优选以作为该多肽链整体不破坏上述基本特性的方式进行分子设计。
[1-2.疏水性嵌段]
本发明中，作为疏水性嵌段所具有的所谓“疏水性”的物性的具体水平，没有特别限定，疏水性嵌段为疏水性至少相对地强于上述亲水性嵌段整体的区域，通过与该亲水性嵌段形成共聚物，具有作为共聚物分子整体能够实现两亲性的水平的疏水性即可。或者，具有该两亲性嵌段聚合物能够在溶剂中自组装而形成自组装体、优选形成颗粒状的自组装体的水平的疏水性即可。
存在于1条两亲性嵌段聚合物中的疏水性嵌段可以未分支，也可以分支了。
本发明中，疏水性嵌段含有聚乳酸链。疏水性嵌段中，结构单元的种类及比率由本领域技术人员适当确定，以使嵌段整体成为上述的疏水性。具体而言，例如疏水性嵌段未分支的情况下，乳酸单元的数量例如可以为5～100、15～60个或25～45个。疏水性嵌段分支了的情况下，全部支链中所含的乳酸单元数的总计例如可以为10～400、优选为20～200个。该情况下，每一个支链中的乳酸单元数的平均值例如为5～100、优选为10～100个。
结构单元数超过上述范围时，形成分子聚集体时，存在该形成的分子聚集体缺乏稳定性的倾向。结构单元数低于上述范围时，存在分子聚集体的形成本身变得困难的倾向。
疏水性嵌段分支的情况下，对支链的数量没有特别限定，从形成分子聚集体时有效地得到颗粒形状胶束的观点考虑，例如可以设为亲水性嵌段中的支链数以下。
聚乳酸具有以下基本特性。
聚乳酸具有优异的生物适应性及稳定性。因此，由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到的分子聚集体从对生物体、特别是对人体的应用性的方面考虑是非常有用的。
另外，聚乳酸具有优异的生物降解性，所以代谢快，在生物体内向癌组织以外的组织中的集聚性低。因此，由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到的分子聚集体从向癌组织中的特异性的集聚性的方面考虑是非常有用的。
另外，聚乳酸在低沸点溶剂中的溶解性优异，所以由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到分子聚集体时，可以避免使用有害的高沸点溶剂。因此，这种分子聚集体从对生物体的安全性的方面考虑是非常有用的。
需要说明的是，聚乳酸链中，全部乳酸单元可以是连续的，也可以是非连续的，优先以作为多肽链整体不破坏上述基本特性的方式进行分子设计。
从光学纯度的观点考虑，疏水性嵌段还可以具有以下变化。
例如疏水性嵌段中的该乳酸单元可以仅由L-乳酸单元构成，也可以仅由D-乳酸单元构成，还可以由L-乳酸单元和D-乳酸单元两者构成。疏水性嵌段可以单独使用从上述列举的物质中选择的一种，也可以组合多种使用。
该乳酸单元由L-乳酸单元和D-乳酸单元两者构成时，对L-乳酸单元和D-乳酸单元的聚合顺序没有限定。L-乳酸单元和D-乳酸单元可以每一个或两个交替地聚合，也可以无规地聚合，还可以嵌段聚合。
因此，该乳酸单元由L-乳酸单元和D-乳酸单元两者构成时，对各乳酸单元的含量没有特别限定。即，L-乳酸单元和D-乳酸单元可以以不同的量含有，L-乳酸单元和D-乳酸单元也可以以相同的量含有。该情况下，该10个以上的乳酸单元作为整体可以为光学纯度0%的消旋体。
[1-3.肌氨酸单元数相对于乳酸单元数之比]
本发明的两亲性嵌段聚合物中，将肌氨酸单元数（即，亲水性嵌段的全部支链中所含的肌氨酸单元数的总计）设为NS、将聚乳酸单元数（即，疏水性嵌段中所含的乳酸单元数、或疏水性嵌段分支了时全部支链中所含的乳酸单元数的总计）设为NL时，它们的比NS/NL例如可以为0.05～5或0.05～4。
NS/NL进一步优选为0.05以上且小于1.8，例如可以为0.05以上且1.7以下、0.05以上且1.67以下、0.1以上且1.7以下、或0.1以上且1.67以下。
[1-4.支链结构]
连接亲水性嵌段和疏水性嵌段的连接部位的结构只要为在化学上可接受的结构即可，没有特别限定。
例如亲水性嵌段侧的支链数为2时，2条含有聚肌氨酸链的分子链可以从位于含有聚乳酸链的分子链的连接部位的一个N原子分支。换言之，与聚乳酸链直接或间接地结合的N原子可以直接或间接地与2条聚肌氨酸链结合。
另外，例如亲水性嵌段侧的支链数为3时，3条含有聚肌氨酸链的分子链可以从位于含有聚乳酸链的分子链的连接部位的一个C原子分支。换言之，与聚乳酸链直接或间接地结合的C原子可以直接或间接地与3条聚肌氨酸链结合。从位于连接部位的一个P原子、Si原子分支的情况、两亲性嵌段聚合物分子整体形成季铵分子的情况也是同样的。
亲水性嵌段侧的支链数超过3时，可以对支链进行分子设计，使其具有进一步的支链结构。
疏水性嵌段侧也分支了的情况下，从与上述同样的观点考虑，也可以进行分子设计。
下述式（I）示出亲水性嵌段侧的支链数为3、疏水性嵌段侧没有支链时的支链型两亲性嵌段聚合物的优选结构。
式（I）中，n1、n2及n3表示其总计为3～200的数，m表示5～100的数，R表示氢原子或有机基团。有机基团的碳数可以为1～20。具体而言，可列举出烷基、烷基羰基等。
下述式（II）示出亲水性嵌段侧的支链数为3、疏水性嵌段侧的支链为2时的支链型两亲性嵌段聚合物的优选结构。
式（II）中，n1、n2及n3以及R与式（I）中的情况相同。m1及m2表示其总计为10～400的数。
[1-5.支链型两亲性嵌段聚合物合成法]
支链型两亲性嵌段聚合物的合成中，进行了疏水性嵌段部（聚乳酸部）的合成、亲水性嵌段部（肌氨酸部或聚肌氨酸部）的合成、及连接这些嵌段的连接部的合成。
例如合成连接肌氨酸或聚肌氨酸链和聚乳酸链的连接试剂，将其作为引发剂，通过利用肌氨酸部位的加成或聚肌氨酸部位的聚合反应进行延长及利用聚乳酸部位的聚合反应进行延长，从而可以合成支链型两亲性嵌段聚合物。
另外，例如使肌氨酸与连接试剂加成后，或将聚肌氨酸链作为亲水性嵌段预先利用聚合反应进行制备再与连接试剂加成后，使聚乳酸链延长，从而可以合成支链型两亲性嵌段聚合物。
进而，例如预先准备肌氨酸或聚肌氨酸链及聚乳酸链两者分别作为亲水性嵌段及疏水性嵌段，使用另外合成的连接试剂将这些嵌段连接，从而可以合成支链型两亲性嵌段聚合物。
连接试剂的结构可以具有一个或仅相当于期望的疏水性嵌段侧支链数的数量的能够与乳酸单体（乳酸、丙交酯）或聚乳酸链键合的官能团（例如羟基、氨基等），且可以具有仅相当于期望的亲水性嵌段侧支链数的数量的能够与肌氨酸单体（例如肌氨酸、N-羧基肌氨酸酐）或聚肌氨酸键合的官能团（例如氨基）。该情况下，本领域技术人员对连接试剂进行适当分子设计，使得连接试剂中的能够与肌氨酸单体或聚肌氨酸键合的各个官能团具有尽可能同样的反应性。
能够与乳酸单体或聚乳酸链键合的官能团和能够与肌氨酸单体或聚肌氨酸键合的官能团是指，可以分别被保护基保护。该情况下，作为各自的保护基，本领域技术人员根据需要适当选择能够选择性地离去的保护基。
例如合成亲水性嵌段侧支链数为3的支链型两亲性嵌段聚合物时的连接试剂例如可以以2,2,2-三乙醇胺（Tris）结构作为基础进行制备。
进而，使疏水性嵌段侧进行分支时，例如可以以在上述2,2,2-三乙醇胺结构中进一步增加分支点而得到的结构作为基础进行制备。进一步增加分支点而得到的结构可以如下得到：对2,2,2-三乙醇胺加成在侧链具有例如氨基作为能够与聚乳酸链键合的官能团的氨基酸（作为具体例，可列举出赖氨酸及鸟氨酸）的、全部氨基被保护起来的氨基酸衍生物，然后脱保护，从而得到。通过对脱保护而变为游离的氨基进一步加成同样的氨基酸衍生物，可以增加分支点。
聚肌氨酸链及聚乳酸链的合成方法可以根据连接试剂中的官能团由本领域技术人员适当确定，也可以从公知的肽合成法及聚酯合成法中选择。
肽合成例如优选如下进行：将连接试剂中的氨基等碱性基团作为引发剂，使N-羧基肌氨酸酐(肌氨酸NCA)开环聚合等。
聚酯合成例如优选如下进行：将连接试剂中的氨基等碱性基团作为引发剂，使丙交酯开环聚合等。
需要说明的是，合成支链数与上述具体例不同的支链型两亲性嵌段聚合物时，从有机化学的观点考虑，可以通过本领域技术人员适当加入各种变更来制备。
聚肌氨酸链及聚乳酸链的链长的调节可以通过调节聚合反应中的引发剂与单体的投料比来进行。另外，链长例如可以通过1HNMR确认。
[2.分子聚集体]
本发明的分子聚集体（Lactosome）是通过上述支链型两亲性聚合物的聚集、或通过自组装的取向而形成的结构体。从实用性的观点考虑，本发明优选如内侧（芯部）为疏水性嵌段、外侧为亲水性嵌段这样构成的胶束形状的分子聚集体。本发明的分子聚集体包括：由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体（单独系）、及由支链型两亲性嵌段聚合物和直链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体（混合系）。
另外，本发明的分子聚集体通过具有适当的功能性结构，从而成为作为分子成像中的探针、药物输送系统中的制剂而有用的结构体。
[2-1.单独系-由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体]
支链型两亲性嵌段聚合物由于作为支链的多个聚肌氨酸链的存在，所以与直链型两亲性嵌段聚合物相比，亲水性部位的分子截面面积更大。因此，由支链型两亲性嵌段聚合物形成的分子聚集体在颗粒形态下的稳定性优异。进而，该颗粒可以具有大的曲率。由此，本发明的分子聚集体具有如后述那样能够进行颗粒的小型化的基本特征。
另外，由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体由于作为支链的多个聚肌氨酸链的存在，所以具有如下的基本特征：与现有的Lactosome相比，表面的亲水性基团的密度高，疏水性部位的露出少。
[2-2.混合系-由支链型两亲性嵌段聚合物和直链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体]
作为在本发明的分子聚集体中除支链型两亲性嵌段聚合物之外所混合的直链型两亲性嵌段聚合物，可以为已经作为现有的Lactosome的构成要素使用的两亲性嵌段聚合物，也可以为未能成为现有的Lactosome的构成要素的两亲性嵌段聚合物。需要说明的是，已经作为现有的Lactosome的构成要素使用的两亲性嵌段聚合物是指，能够单独作为自组装体形成颗粒的聚合物。具体而言，有：将肌氨酸单元数设为NS、将聚乳酸单元数设为NL时，它们的比NS/NL例如为1.8以上（对该范围所包含的上限值没有特别限定，例如为5或4）的聚合物。另一方面，未能成为现有的Lactosome的构成要素的两亲性嵌段聚合物是指，虽然作为由亲水性嵌段及疏水性嵌段构成的共聚物分子整体呈两亲性、但是无法单独作为自组装体形成颗粒的聚合物。具体而言，有NS/NL例如小于1.8、例如为1.7以下或1.67以下（对该范围所包含的下限值没有特别限定，例如为0.05或0.1）的聚合物。
本发明中使用的直链型两亲性嵌段聚合物的结构基本上为直链结构，除此之外，从与本发明的支链型两亲性嵌段聚合物同样的观点考虑来进行分子设计是较好的。具体而言，作为直链型两亲性嵌段聚合物，可以使用由含有一个肌氨酸或1条聚肌氨酸链的亲水性嵌段和含有1条聚乳酸链的疏水性嵌段构成的聚合物。亲水性嵌段中的肌氨酸单元的数量例如为1～200、1～29、30～200个、或50～100个。疏水性嵌段中的乳酸单元的数量例如为5～100个、15～60个、或25～45个。
本发明的混合系分子聚集体（支链/直链混合系分子聚集体）具有上述本发明的单独系分子聚集体（支链单独系分子聚集体）的基本特征，并且由于被混合了的直链型两亲性嵌段聚合物的存在，所以可以具有在上述本发明的支链单独系分子聚集体的粒径与现有Lactosome（直链单独系分子聚集体）的粒径之间的粒径。
需要说明的是，混合系中，从控制粒径的观点考虑，优选的是，支链型两亲性嵌段聚合物及直链型两亲性嵌段聚合物各自的聚乳酸链的光学活性彼此相同。例如支链型两亲性嵌段聚合物中的聚乳酸链仅由L-乳酸单元构成时，优选直链型两亲性嵌段聚合物中的聚乳酸链也仅由L-乳酸单元构成。
混合系分子聚集体中，支链型两亲性嵌段聚合物与直链型两亲性嵌段聚合物的混合比例以摩尔基准计可以设为50:50～100:0、优选为67:33～100:0。直链型两亲性嵌段聚合物的比例超过上述范围时，存在难以获得由支链型两亲性嵌段聚合物得到的本发明的效果的倾向。
[2-3.粒径]
本发明的分子聚集体的粒径例如可以为10～50nm。该范围所包含的上限值也可以为35nm、30nm、25nm或20nm。此处“粒径”是指在颗粒分布中出现频率最高的粒径、即中心粒径。如上所述，本发明的分子聚集体由于两亲性嵌段聚合物中的亲水性嵌段的支链结构，所以存在基本上粒径小于现有分子聚集体的倾向。
在上述范围中，单独系分子聚集体的粒径存在比较小的倾向。具体而言，单独系分子聚集体的粒径例如可以为10～35nm。该范围所包含的上限值也可以为30nm、25nm或20nm。
另一方面，混合系分子聚集体的粒径存在比较大的倾向。具体而言，混合系分子聚集体的粒径例如可以为20～50nm。该范围所包含的下限值可以为25nm、30nm、25nm、30nm或35nm，上限值可以为35nm。
尽管如此，通过将支链型两亲性嵌段聚合物的链长调节得短，也可以得到小于上述范围的下限值的分子聚集体。超过上述范围时，例如将分子聚集体作为分子探针给药于生物体内的情况下，由于难以得到优选的EPR效果，所以存在短期成像变得困难的倾向。
作为调节粒径的方法，例如可列举出：通过缩短分子聚集体的构成聚合物的链长，从而调节为更小的粒径；通过减少直链型两亲性嵌段聚合物的配混量，从而调节为更小的粒径；通过减少内含物质的量，从而调节为更小的粒径等。
对用于测定本发明的分子聚集体的尺寸的方法没有特别限定，由本领域技术人员适当选择。例如可列举出利用透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope；TEM）的观察法、动态光散射（DynamicLightScattering；DLS）法等。DLS法中，测定在溶液中进行布朗运动的颗粒的移动扩散系数。
[2-4.具有功能性结构的形态]
本发明的分子聚集体可以具备能够使其具有在用于分子成像系统、药物输送系统时有用的形态、功能等的功能性结构。由此，本发明的分子聚集体形成为作为分子成像中的探针、作为药物输送系统中的制剂有用的结构体。
作为具有功能性结构的分子聚集体的具体形态，可列举出：选自由信号基团及配位基团组成的组中的功能性基团键合于构成分子聚集体的两亲性嵌段聚合物自身的形态；及分子聚集体内含选自由信号剂及药物组成的组中的功能性物质的形态。
[2-4-1.功能性基团的键合]
功能性基团例如为有机基团，根据分子聚集体的用途由本领域技术人员适当选择。作为功能性基团，可列举出信号基团及配位基团。
信号基团只要具有能够通过检测进行成像的特性即可。例如可列举出荧光基团、含放射性元素基团、磁性基团等。检测这些基团的方法由本领域技术人员适当选择。
作为荧光基团，没有特别限定，可列举出源自荧光素系色素、靛青色素等花青系色素、若丹明系色素、量子点等的基团。
本发明中，优选使用近红外荧光基团（例如源自花青系色素、量子点等的基团）。
近红外区域（700～1300nm）中，虽然存在具有氢键的各取代基的吸收，但是其吸收较小。因此，近红外光具有易于透过生物体组织的特性。如果利用这种近红外光的特性，则可以说也能够得到体内的信息而不对身体造成不必要的负荷。特别是将测定对象特定为小动物的接近于身体表面的部位时，近红外荧光可以提供有用的信息。
作为近红外荧光基团的更具体的例子，可列举出源自ICG（靛青绿）等靛青系色素、Cy7、DY776、DY750、Alexa790、Alexa750等的基团。例如以癌作为靶使用本发明的分子聚集体时，从向癌的集聚性的观点考虑，有时优选使用源自ICG等靛青系色素的基团。
作为含放射性元素基团，没有特别限定，可列举出用18F等的放射性同位素标记过的源自糖、氨基酸、核酸等的基团。作为含放射性元素基团的导入方法的具体例之一，可列举出利用下述工序进行的方法：使用单Fmoc（9-芴基甲基氧基羰基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl））乙二胺进行丙交酯的聚合的工序；将末端OH用甲硅烷基保护基保护的工序；通过哌啶处理使Fmoc离去的工序；进行肌氨酸-N-羧基酸酐（SarNCA）的聚合，将聚合物末端终止的工序；脱去甲硅烷基保护基转化为磺酸酯（例如三氟甲磺酸酯、对甲苯磺酸酯等）的工序；以及，导入含放射性元素基团的工序。进而，该具体例可以由本领域技术人员适当变更。
作为磁性基团，没有特别限定，可列举出具有铁色素等的磁性体的基团、被视为铁氧体纳米颗粒、纳米磁性颗粒等的基团。
配位基团只要通过与在靶细胞中表达的生物体分子结合，控制分子聚集体的指向性，从而可以提高分子聚集体的靶向性即可。例如可列举出抗体、细胞粘附肽、糖链、水溶性高分子等。
作为抗体的例子，可列举出对在靶部位的细胞中表达的抗原具有特异性结合能力的物质。
作为细胞粘附肽的例子，可列举出RGD（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）等粘附因子。
作为糖链的例子，可列举出羧甲基纤维素、直链淀粉等稳定剂、对在靶部位的细胞中表达的蛋白质具有特异性结合能力的物质。
作为水溶性高分子的例子，可列举出聚醚链、聚乙烯醇链等高分子。
这些基团可以键合于两亲性嵌段聚合物的优选亲水性嵌段侧的末端结构单元。由此，形成胶束时，可以具有颗粒将功能性基团保持在其表面的形态，即利用功能性基团进行表面修饰的形态。
[2-4-2.功能性物质的内含]
功能性物质选自由信号剂及药物组成的组中。该物质为疏水性化合物，通过位于分子聚集体的疏水芯部从而被内含。
作为信号剂，可以使用具有上述信号基团的分子。其中，在本发明中，有时优选靛青绿系色素等近红外荧光物质、由18F等放射性同位素标记过的糖、氨基酸、核酸等含放射性元素物质。
作为药物，由本领域技术人员适当选择适于对象疾病的药物。具体而言，可列举出抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、免疫抑制剂、类固醇剂、激素剂、抗血管生成剂等。这些药物分子可以单独使用或组合多种使用。
应被内含的功能性物质也可以键合有聚乳酸基。
聚乳酸基为以乳酸单元作为主要构成成分的基团。全部乳酸单元可以是连续的，也可以是非连续的。基本上聚乳酸基的结构、链长及光学纯度可以基于与上述疏水性嵌段的分子设计中的情况同样的观点来确定。由此，也可以获得分子聚集体中的功能性物质与两亲性嵌段聚合物的疏水性嵌段的亲合性优异的效果。
聚乳酸基的乳酸单元数为15～60个，优选为25～45个。在该范围内进行分子设计，使得聚乳酸结合功能性物质整体的长度不超过上述两亲性嵌段聚合物的长度。优选进行分子设计使其不超过两亲性嵌段聚合物中的疏水性嵌段的长度的2倍。结构单元数超过上述范围时，形成分子聚集体时，存在所形成的分子聚集体缺乏稳定性的倾向。结构单元数小于上述范围时，存在功能性物质与两亲性嵌段聚合物的疏水性嵌段的亲合性变弱的倾向。
需要说明的是，聚乳酸结合功能性物质中的聚乳酸链的光学活性优选与作为分子聚集体的构成要素的支链型两亲性嵌段聚合物、直链型两亲性嵌段聚合物同样。例如支链型两亲性嵌段聚合物、直链型两亲性嵌段聚合物中的聚乳酸链由L-乳酸单元形成时，优选聚乳酸结合功能性物质中的聚乳酸链也由L-乳酸单元形成。
作为功能性物质的内含量，没有特别限定，例如荧光物质的情况下，相对于两亲性嵌段聚合物及荧光色素的总计，荧光色素的量可以为0.5～50mol%，例如为0.5～1mol%或1～50mol%。作为其它功能性物质（作为一个例为放射性物质）的内含量，也可以设定得与上述相同。
[2-5.分子聚集体的制作]
对分子聚集体的制作法没有特别限定，可以根据期望的分子聚集体的尺寸、特性、所负载的功能性结构的种类、性质、含量等由本领域技术人员适当选择。也可以根据需要，如下所述地形成分子聚集体后，利用公知的方法对所得分子聚集体进行表面修饰。
需要说明的是，可以通过电子显微镜观察进行确认形成颗粒的情况。
[2-5-1.薄膜法]
本发明中的支链型两亲性嵌段聚合物具有在低沸点溶剂中的溶解性，所以可以使用薄膜法进行分子聚集体的制备。
薄膜法包括以下工序。即，包括：在容器（例如玻璃容器）中准备有机溶剂中含有支链型两亲性嵌段聚合物的溶液（例如在有机溶剂中含有支链型两亲性嵌段聚合物和功能性物质的溶液）的工序；从前述溶液中去除有机溶剂，在容器的内壁上得到含有支链型两亲性嵌段聚合物的薄膜（例如含有支链型两亲性嵌段聚合物和功能性物质的薄膜）的工序；以及，在前述容器中加入水或水溶液，进行超声波处理或加热处理，将薄膜状物质转化为分子聚集体（例如内含功能性物质的分子聚集体），得到分子聚集体的分散液的工序。进而，薄膜法也可以包括将分子聚集体的分散液供给于冷冻干燥处理的工序。
在有机溶剂中含有支链型两亲性嵌段聚合物和功能性物质的溶液也可以如下进行制备：预先仅将支链型两亲性嵌段聚合物以薄膜的状态储存，在制备纳米颗粒时，加入含有功能性物质的溶液，将薄膜溶解，从而制备。
制备混合系的分子聚集体时，可以在直链型两亲性嵌段聚合物与支链型两亲性嵌段聚合物混合的状态下进行各工序。
作为薄膜法中使用的有机溶剂，优选使用低沸点溶剂。本发明中的所谓低沸点溶剂是指在一个大气压下的沸点为100℃以下、优选为90℃以下的溶剂。具体而言，可列举出氯仿、乙醚、乙腈、乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷等。
通过使用这种低沸点溶剂，去除溶剂变得非常简单。作为去除溶剂的方法，没有特别限定，可以根据所使用的有机溶剂的沸点等由本领域技术人员适当确定。例如可以进行在减压下的溶剂去除也可以进行利用自然干燥的溶剂去除。
去除有机溶剂后，在容器内壁上形成含有支链型两亲性嵌段聚合物的薄膜。在粘贴有该薄膜的容器中加入水或水溶液。作为水或水溶液，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当选择生物化学、药学上可接受的物质。例如可列举出注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
加入水或水溶液后进行加热处理。通过加热将薄膜从容器内壁上剥离的过程中形成分子聚集体。加热处理例如可以在70～100℃、5～60分钟的条件下进行。加热处理结束时，在容器中制备分子聚集体（使用功能性物质的情况下，为内含有功能性物质的形态的分子聚集体）分散于前述水或水溶液中而形成的分散液。另外，剥离薄膜时，也可以根据需要同时进行超声波处理。
所得分散液可以直接给药于生物体。即，可以不在无溶剂的分子聚集体本身的状态下进行保存。
另一方面，可以对所得分散液进行冷冻干燥处理。作为冷冻干燥处理的方法，可以没有特别限定地使用公知的方法。例如可以如下进行：使如上所述地得到的分子聚集体的分散液用液氮等冷冻，在减压下使其升华。由此，可以得到分子聚集体的冷冻干燥处理物。即，可以将分子聚集体以冷冻干燥处理物的形式保存。根据需要，在该冷冻干燥物中加入水或水溶液，得到分子聚集体的分散液，从而可以将分子聚集体供给于使用。作为水或水溶液，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当选择生物化学、药学上可接受的物质。例如可列举出注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
[2-5-2.注射法]
注射法包括以下工序。即，进行在容器（例如试管等）中准备有机溶剂中含有支链型两亲性嵌段聚合物的溶液的工序；使前述溶液分散于水或水溶液中的工序；以及，去除有机溶剂的工序。进而，注射法可以在去除有机溶剂的工序之前适当进行纯化处理工序。
作为注射法中使用的有机溶剂，例如可以使用三氟乙醇、乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等。
作为水或水溶液，可以使用注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
作为纯化处理，例如可以进行凝胶过滤色谱、过滤、超速离心等处理。
[3.药物输送系统/分子成像]
[3-1.分子聚集体的给药对象]
本发明的药物输送系统及分子成像包括将上述分子聚集体给药至生物体内。作为给药分子聚集体的生物体，没有特别限定，可以为人或非人动物。作为非人动物，没有特别限定，可列举出人以外的哺乳类、更具体而言，可列举出灵长类、啮齿类（小鼠、大鼠等）、兔、犬、猫、猪、牛、羊及马等。
本发明的方法中使用的分子聚集体对血管病变部位（例如恶性肿瘤部位、炎症部位、动脉硬化部位、血管新生部位等）的特异性的集聚性优异。本发明分子聚集体由于利用EPR（enhancedpermeabilityandretention）效果而向这些部位的组织中集聚，所以其集聚性不依赖于血管病变部位的组织种类。作为本发明的荧光探针的给药靶，优选为癌。可以作为给药靶的癌多种多样。例如可列举出肝脏癌、胰脏癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、大肠癌等。
[3-2.给药]
作为向生物体内的给药方法，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当确定。因此，作为给药的方法，全身给药及局部给药均可。即，分子探针的给药可以通过注射（有针型、无针型）、内服、外用中的任意方法来进行。
本发明的分子聚集体通过作为必需构成要素的支链型两亲性嵌段聚合物的支链结构而在颗粒表面具有肌氨酸链的稠密的聚合物刷结构。因此，可以认为，与现有Lactosome相比，颗粒的疏水性部位向外部环境的露出变少，由颗粒外部环境引起的异物识别受到抑制。本发明的分子聚集体可以减弱被认为由此导致的ABC现象。由此，本发明的分子聚集体可以多次给药。例如可以对同一个体进行2次以上的必要次数（例如2～10次）。另外，给药间隔例如可以设为1～60天。
[3-3.分子聚集体的检测]
本发明的分子成像包括检测源自给药的分子聚集体的信号的工序。通过检测给药的分子聚集体，可以从体外观测到给药靶的样子（特别是癌等组织的位置/尺寸）。
作为检测方法，可以采用能使给药的分子聚集体可视化的任意方法。作为该方法，可以根据分子聚集体所具有的信号基团或信号物质的种类由本领域技术人员适当确定。
关于从给药到开始检测的时间，分子聚集体的粒径与现有方法中的粒径同样的情况下，可以根据给药的分子聚集体所具有的功能性结构的种类、及给药靶的种类由本领域技术人员适当确定。例如可以设为给药后1～24小时。小于上述范围时，信号过强，存在无法明确地区分给药靶与其它部位（背景）的倾向。另外，超过上述范围时，存在分子聚集体从给药靶被排泄出的倾向。
另一方面，本发明的分子聚集体由于作为必需构成要素的支链型两亲性嵌段聚合物的支链结构，在颗粒形态下的稳定性优异，可以制备目前不可能制备的小粒径的分子聚集体。将粒径小的分子聚集体给药于生物体时，由EPR效果引起的分子聚集体向靶组织中的集聚速度的加速化、及利用肾脏的分子聚集体的对外排出的加速化成为可能。因此，分子聚集体的粒径小于现有方法中的粒径时，可以使从给药到开始检测的时间短于现有方法。例如可以设为1～24小时、优选1～9小时。本发明中，由于能使分子聚集体的粒径小型化，所以可以在血中给药后短时间内提高肿瘤部位与背景的反差比，短时间内的癌症部位选择性成像成为可能。
需要说明的是，从准确性的观点考虑，分子聚集体的检测优选通过从生物体的多个方向而不是从一个方向的测定来进行。具体而言，可以从至少3个方向、更优选至少5个方向进行测定。从5个方向进行测定时，例如可以从左右两腹侧、从左右两体侧、及从背侧进行测定。
实施例
以下为了更详细地说明本发明而列举实施例，但本发明不受这些实施例的任何限定。
[实施例1：支链型两亲性嵌段聚合物的合成（1）]
本实施例中，进行在1条聚乳酸（L-聚乳酸；PLLA）链上键合有3条聚肌氨酸（PS）链的支链型两亲性嵌段聚合物的合成。
作为概述，首先进行连接试剂的合成。连接试剂由三羟甲基氨基甲烷（Tris）1合成，所述三羟甲基氨基甲烷（Tris）1具有一个作为PLLA聚合的引发剂的羟基和3个作为用于肌氨酸部位的NCA（N-羧基酸酐（N-carboxyanhydride））聚合法的引发剂的氨基。进而，加成合适的保护基，使得能够根据需要将Tris1的氨基及羟基脱保护。具体而言，在2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉（EEDQ）的存在下，使用N-叔丁氧基羰基甘氨酸（Boc-Gly-OH），得到由具有Boc基的保护基保护了氨基的化合物2，进而，在二氯二氰基苯醌（DDQ）及二甲基氨基吡啶（DMAP）的存在下，使用苄氧基羰基肌氨酸（Cbz-Sar-OH），得到由具有Cbz基的保护基保护了羟基的化合物3作为连接试剂。使用HCl-二噁烷，仅将连接试剂3的Boc基选择性地脱保护时，得到含氨基化合物4。
具体的合成顺序如以下所述。
[化合物2]
向1.9g（0.016mol）三（羟甲基）氨基甲烷的EtOH溶液（75mL）中加入2.5g（0.014mol）Boc-甘氨酸和6.0g（0.024mol）EEDQ，一边回流（95℃）一边搅拌4.5小时。反应结束后，用滤纸去除沉淀物，将EtOH减压蒸馏除去后，用硅胶柱层析法进行纯化（洗脱液依次使用CHCl3/MeOH混合比（v/v）为1/0、40/1及10/1的洗脱液）。所得产物2的重量为3.2g（0.012mol），产率为82%。
[化合物3]
向化合物2（278mg，1.0mmol）、Cbz-Sar-OH（804mg，3.6mmol）、DCC（887mg，4.3mmol）及DMAP（26mg，0.21mmol）的混合物中加入经冰冷却的10mL二氯甲烷后，在室温下搅拌一夜。反应结束后，用乙酸乙酯清洗，去除白色沉淀（尿素）后，用硅胶层析法进行纯化（洗脱液依次使用正己烷/乙酸乙酯混合比（v/v）为2/1、1/1及1/2的洗脱液）。由此，以产率为84%得到目标化合物3（719mg）。
[化合物4]
向经冰冷却的化合物3（710mg）中加入4mol/LHCl/二噁烷（7.0mL）使其溶解后，在室温下搅拌5分钟。然后，从反应溶液中减压蒸馏除去溶剂，用硅胶层析法进行纯化（洗脱液使用CHCl3/MeOH混合比（v/v）为10/0的洗脱液）。
使所得白色沉淀溶解于氯仿，用1NNaOH水溶液进行分液操作，由此进行末端氨基的HCl盐的脱盐操作。接着，用无水硫酸镁脱水，通过硅藻土过滤去除硫酸镁，由此得到化合物4。
接着，将含氨基化合物4作为引发剂，将丙交酯5供给于聚合反应，由此进行PLLA链的合成，得到化合物6。将化合物6的残留保护基即Cbz基用HBr-AcOH脱保护，同时将PLLA末端的羟基用乙酰基保护起来。将化合物7中的3个氨基作为引发剂，将肌氨酸-NCA供给于N-羧基酸酐聚合反应，由此进行PS链的合成，得到化合物8。进而，向化合物8中加入乙醇酸、O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）及N,N-二异丙基乙基胺（DIEA），导入羧基，得到支链型两亲性嵌段聚合物9。需要说明的是，式中省略聚合数的表示。
具体的合成顺序如以下所述。
[化合物6]
在溶解有引发剂4（485mg，0.61mmol）的DMF溶液（2mL）中加入相对于引发剂为15当量（1.32g，9.2mmol）的L-丙交酯（5）和DMAP（75mg，0.61mmol）后，在氩气气氛中、在55℃下搅拌一夜（约15小时）。通过减压蒸馏除去在一定程度上去除作为反应溶剂的DMF，浓缩后，滴加到冷MeOH中。将所得白色沉淀通过离心分离回收，由此得到化合物6。
[化合物7]
使化合物6溶解于10mL二氯甲烷，将反应溶液冷却至0℃后，加入20mL25%HBr-AcOH。在室温下搅拌一夜后，减压蒸馏除去溶剂，对所得白色沉淀进行NMR测定，由此确认Cbz基的脱保护结束。
通过使所得白色沉淀溶解于氯仿，用1NNaOH水溶液进行分液操作，由此进行末端氨基的HBr盐的脱盐操作。接着，用无水硫酸镁脱水，利用硅藻土过滤去除硫酸镁，由此得到化合物7。
[化合物8及9]
将化合物7作为微引发剂（microinitiator），进行亲水性部位的聚合反应。向化合物7的DMF溶液中加入相对于引发剂为40或60当量的Sar-NCA后，进行调节使Sar-NCA浓度为0.50M。在室温下搅拌24小时得到化合物8后，分别加入乙醇酸和HATU及DIEA，进一步搅拌24小时。反应结束后，使用尺寸排阻色谱（SephadexLH20，洗脱液：DMF）将浓缩得到的反应溶液纯化，得到目标两亲性嵌段聚合物9。
将所得两亲性嵌段聚合物9的1HNMR测定结果示于图1。根据图1，测定了本实施例中得到的支链型两亲性嵌段聚合物的组成为：PLLA链为30个乳酸单元，每一条PS链中的肌氨酸单元为34个。
[实施例2：支链单独系分子聚集体的制备（仅由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体的制备）（1）]
本实施例中，通过薄膜法由实施例1中得到的支链型两亲性嵌段聚合物9制备分子聚集体（高分子胶束；Lactosome）。
使1.0mg的支链型两亲性嵌段聚合物9溶解于适量的氯仿中后，减压蒸馏除去溶剂，由此在试管壁上形成聚合物薄膜。真空干燥一夜，向充分地去除了氯仿的薄膜上加入1.0mL生理盐水，在85℃的水浴中用浴式超声仪进行超声波处理5分钟，由此制备分子聚集体的分散液。
利用动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）对所得分散液进行观察。
图2示出DLS测定结果。根据图2的粒度分布(SizeDistribution)图，从由支链型两亲性嵌段聚合物制备的分散液中观察到峰(Peak)最高值为粒径(Diam.)20.26nm、Z-平均值(Z-Average)为19.99nm、峰宽(Width)为5.309nm的单分散的峰。
图3示出TEM观察结果。图3中示出比例尺不同的3种照片。根据图3，确认可以得到具有粒径为20nm左右的小粒径的高分子胶束（小粒径Lactosome）。
[比较例1：直链型两亲性嵌段聚合物的合成及由其形成的直链单独系分子聚集体的制备（1）]
进行在1条聚乳酸（L-聚乳酸；PLLA）链上键合有1条聚肌氨酸（PS）链的直链型两亲性嵌段聚合物的合成。
[氨基化聚L-乳酸（a-PLA）的合成]
使用L-丙交酯（11）和N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐（12），合成氨基化聚L-乳酸（a-PLA）。
向作为聚合引发剂的N-苄氧羰基-1，2-二氨基乙烷盐酸盐（12）（310mg，1.60mmol）中加入使辛酸锡（6.91mg）在甲苯（1.0mL）中扩散而成的溶液。减压蒸馏除去甲苯后，加入L-丙交酯（11）（3.45g，24mmol），在Ar气氛下、在120℃下进行聚合反应。12小时后，将反应容器空气冷却至室温。使所得黄白色固体溶解于少量氯仿（10mL左右）。通过将氯仿滴加到冷甲醇（100mL）中而得到白色沉淀。所得白色沉淀通过离心分离回收，进行减压干燥。
向所得白色沉淀（500mg）的二氯甲烷(1mL)溶液中加入25v/v%溴化氢/乙酸（2.0mL），在遮光、干燥空气条件下搅拌2小时。反应结束后，将反应溶液滴加到冷甲醇（100mL）中，通过离心分离回收析出的沉淀。使所得白色沉淀溶解于氯仿后，用饱和NaHCO3水溶液清洗，用无水MgSO4进行脱水操作。通过硅藻土(R)过滤去除MgSO4后，进行真空干燥，由此得到白色的无定形状粉末的a-PLA（440mg）。
[聚肌氨酸-聚L-乳酸（PSL1）的合成]
由肌氨酸-NCA（Sar-NCA）和氨基化聚L-乳酸（a-PLA）合成两亲性物质聚肌氨酸-聚L-乳酸（PSL1）。
在Ar气氛下，向a-PLA（383mg，0.17mmol）和肌氨酸-NCA(Sar-NCA)(3.21g,27.9mmol)中加入二甲基甲酰胺（DMF）（140mL），在室温下搅拌12小时。将反应溶液冷却至0℃后，加入乙醇酸（72mg，0.95mmol）、O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）（357mg，0.94mmol）及N,N-二异丙基乙基胺（DIEA）（245μL，1.4mmol），在室温下使其反应18小时。
利用旋转蒸发仪减压蒸馏除去DMF后，用LH20柱进行纯化。将在UV270nm处检测到峰的馏分（fraction）回收/浓缩。将所得浓缩溶液在0℃下滴加到乙醚中，进行再次沉淀，由此得到作为目标物的PSL1（1.7g）。
[肌氨酸-聚（亮氨酸-氨基异丁酸）（SLA）的合成]
由肌氨酸-NCA（Sar-NCA）和聚（亮氨酸-氨基异丁酸）（LAI）合成两亲性物质肌氨酸-聚（亮氨酸-氨基异丁酸）（SLA）。
在6.0mL三氟乙酸（TFA）和0.6mL苯甲醚的混合溶液中添加Boc-(Leu-Aib)8-OMe(600mg，0.349mmol)，进行Boc基的去除，得到TFA盐衍生物。将TFA盐衍生物用异丙醚清洗，在真空下干燥2小时。将其溶解于氯仿，用4wt%的碳酸氢钠水溶液中和，进行TFA基的去除。将氯仿溶液浓缩，得到420mg（0.259mmol）的聚（亮氨酸-氨基异丁酸）（LAI）（H-(Leu-Aib)8-OMe；LAI）。
将所得LAI溶解于8.0mL的DMF/HCl3的1/1(v/v)混合溶液中，添加到将Sar-NCA（1.11g，15.6mmol）溶解于6.0mL的DMF/HCl3的1/1(v/v)混合溶液中而得到的溶液中。Sar-NCA通过反应消失后，将反应溶液冷却至0℃，加入乙醇酸（98mg，1.30mmol）、HATU（492mg，1.30mmol）及DIEA（338μL，1.94mmol），在室温下搅拌10小时。向该反应溶液中进一步加入乙醇酸（40mg，0.52mmol）、HATU（198mg，0.52mmol）及DIEA（135μL，0.78mmol），搅拌12小时。反应结束后，将反应溶液浓缩，用SephadexLH-20进行凝胶过滤，由此将目标物SLA纯化（186mg）。
[使用直链型聚乳酸系两亲性嵌段聚合物的Lactosome纳米颗粒的制作]
制备上述直链型聚乳酸系两亲性嵌段聚合物的氯仿溶液（0.2mM）。然后，减压蒸馏除去溶剂，在玻璃容器的壁面上形成薄膜。进而，在形成有薄膜的玻璃容器内，使薄膜分散于水或缓冲液中，在温度60℃下进行超声波处理30分钟，由此得到分子聚集体的分散液。
另外，将所得分散液用液氮冷冻，在减压下使其升华，由此得到冷冻干燥物。在所得冷冻干燥物中再次加入水得到Lactosome。
仅以直链型两亲性嵌段聚合物作为构成要素的分子聚集体的粒径为35nm。
[实施例3：支链/直链混合系分子聚集体的制备（由支链型两亲性嵌段聚合物及直链型两亲性嵌段聚合物的混合物构成的分子聚集体的制备）]
本实施例中，通过薄膜法由实施例1中得到的支链型两亲性嵌段聚合物和比较例1中得到的直链型两亲性嵌段聚合物的混合物制备分子聚集体（高分子胶束；Lactosome）。
使支链型两亲性嵌段聚合物及直链型两亲性嵌段聚合物以任意比例溶解于适量的氯仿中，进行与实施例2同样的操作，由此制备分子聚集体的分散液，进行DLS测定及TEM观察。
图4示出DLS测定结果。图4中，横轴表示直链型两亲性嵌段聚合物的含量（AB(L)%的含量），纵轴表示粒径（尺寸/nm）。根据图4，对制备的聚集体溶液进行DLS测定，结果确认到根据两亲性嵌段聚合物的混合比率的不同而粒径发生变化。
图5示出TEM观察结果。图5中，将混合比率以支链型两亲性嵌段聚合物/直链型两亲性嵌段聚合物的形式表示。根据图5，确认到根据两亲性嵌段聚合物的混合比率的不同而形成粒径不同的均匀的高分子胶束（Lactosome）。
实施例2中制备的支链单独系分子聚集体的粒径为20nm，而本实施例中制备的支链/直链混合系分子聚集体的粒径为20～35nm。另一方面，如比较例1所示，直链单独系分子聚集体的粒径为35nm。即，表明在本实施例的支链/直链混合系分子聚集体的制备中，可以制备具有在直链单独系分子聚集体所具有的粒径与支链单独系分子聚集体所具有的粒径之间的任意粒径的分子聚集体。
[实施例4：使用ICG修饰支链单独系分子聚集体的体内动态评价]
[ICG标记聚L-乳酸（PLA-ICG）的合成]
对氨基化聚L-乳酸（a-PLA）进行ICG标记，得到ICG标记聚L-乳酸（PLA-ICG）。具体而言，在含有1.9mg(1.0eq)的a-PLA的DMF溶液中加入溶解有1mg(1.3eq)靛青绿衍生物（ICG-sulfo-OSu）的DMF溶液，在室温下搅拌约20小时。然后，减压蒸馏除去溶剂，用LH20柱进行纯化，得到化合物PLA-ICG。
[ICG修饰支链单独系分子聚集体的制备]
在支链型两亲性嵌段聚合物的氯仿溶液中进一步混合3wt%的ICG标记聚乳酸（ICG-PLLA），除此之外，与实施例2进行同样的操作。由此，制备ICG修饰支链单独系分子聚集体的分散液。使用本实施例中得到的ICG修饰支链单独系分子聚集体，进行荷瘤小鼠（右肩、皮下移植）的活体（invivo）荧光成像。
作为比较用，由比较例1中合成的直链型两亲性嵌段聚合物也通过同样的操作而制备ICG修饰直链单独系分子聚集体，进行活体荧光成像。
图6示出荧光成像结果。确认到支链单独系分子聚集体与比较用的直链单独系分子聚集体同样地向肝脏中的集聚少，利用EPR效果而向肿瘤（右肩）集聚。
图7示出右肩的肿瘤（Tumor）及背部（Back）的荧光强度的经时变化。图7中，纵轴表示荧光强度（Fluorescenceintensity），横轴表示时间（Time(H)）。对于在癌症部位的荧光强度峰，对于直链（linear）型，为给药后24小时左右，对于支链（branched）型，为给药Lactosome9小时后。对背部和癌症部位的荧光强度变化以及癌症部位/背景的反差经时变化进行评价，结果支链型Lactosome在6小时后反差变为最大。即，确认到利用本发明的分子聚集体可以在更短时间内进行成像。
[实施例5：ABC效果的评价]
本实施例中，对于支链单独系分子聚集体及直链单独系分子聚集体（比较用），从实施例4中进行的对小鼠的给药起8天后，再次进行给药，进行活体荧光成像。需要说明的是，作为支链单独系分子聚集体给药组及直链单独系分子聚集体给药组，分别各使用二只小鼠。
图8与图6同样地示出荧光成像结果。另外，图9示出初次给药（1st）及第二次（2nd）给药的肝脏（Liver）、背景（Background）及右肩的肿瘤（Tumor）的ROI经时变化。
直链单独系分子聚集体（比较用）的情况下，刚刚再次给药后基本全部量在肝脏集聚（未显示数据）。另一方面，支链单独系分子聚集体的情况下，刚刚再次给药后向肝脏中的集聚稍微增加，但是在6小时后观测到向癌症部位集聚。即，确认到在支链单独系分子聚集体的情况下，确保了用于对肿瘤部位进行荧光成像的充分的荧光强度。因此，显然，支链单独系分子聚集体的情况下，由ABC效果导致的向肿瘤部位的集聚抑制得到减轻，可以多次给药。
图10示出支链单独系分子聚集体及直链单独系分子聚集体（比较用）给药一周后采集的小鼠血浆中的抗体量的ELISA结果。N表示空白对照的结果，A3B表示支链单独系分子聚集体的结果，P表示直链单独系分子聚集体（比较用）的结果。如图10所示，确认到与直链单独系分子聚集体相比，给药了支链单独系分子聚集体的小鼠的抗体产生量减少到1/2～2/3左右。认为抗体产生量少时，有利于第二次给药时支链单独系分子聚集体也向癌集聚而不被肝脏捕获（即ABC效果的减弱）。
[实施例6：支链型两亲性嵌段聚合物的合成（2）]
本实施例中，使用与实施例1不同的连接试剂，进行在1条聚乳酸链的一端键合有3条聚肌氨酸链的支链型两亲性嵌段聚合物的合成。
利用与实施例1相同的方法合成化合物2。使用苄氧基羰基β丙氨酸（Cbz-β-Ala-OH）来代替苄氧基羰基肌氨酸（Cbz-Sar-OH），除此之外，进行与实施例1相同的操作，获得利用连接试剂13及选择性脱保护而得到的含氨基化合物14。
将含氨基化合物14作为引发剂，与实施例1同样地通过利用丙交酯的聚合反应进行的PLLA链的合成、Cbz基的脱保护、利用PLLA链末端的乙酰基进行的保护、利用肌氨酸-NCA的羧基酸酐聚合反应进行的PS链的合成、及羧基的导入，得到两亲性嵌段聚合物15。需要说明的是，式中，省略聚合数的表示。
[实施例7：支链单独系分子聚集体的制备（仅由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体的制备）（2）]
本实施例中，通过注射法及薄膜法由实施例6中得到的支链型两亲性嵌段聚合物15制备分子聚集体（高分子胶束；Lactosome）。
[注射法]
将2mg的支链型两亲性嵌段聚合物15放入玻璃试管中，溶解于0.1mL的DMF溶液。在另一个玻璃试管中加入1.9mL超纯水，浸泡在0℃的水浴中搅拌5分钟。将聚合物15的DMF溶液一边搅拌一边分散于超纯水中，进一步搅拌5分钟。将所得颗粒分散液恢复至室温后，供给于PD-10柱处理，去除有机溶剂，制备分子聚集体的分散液。
[薄膜法1（利用超声波处理）]
使用2.0mg支链型两亲性嵌段聚合物15、2.0mL生理盐水，除此之外，利用与实施例2相同的操作制备分子聚集体的分散液。
[薄膜法2（利用加热处理）]
在85℃的水浴中，将利用浴式超声仪的超声波处理改变为20分钟，除此之外，进行与上述薄膜法1同样的操作，制备分子聚集体的分散液。
[粒径评价]
将对所得分散液的粒径测定结果与粒度分布指数（PdI）一并示于表1。另外，将动态光散射（DLS）测定结果示于图11。图11中，（i）为通过注射法制作的颗粒的测定结果，（ii）为通过薄膜法1制作的颗粒的测定结果，及（iii）为通过薄膜法2制作的颗粒的测定结果。本实施例中，制作粒径为20nm～24nm的颗粒。
[表1]
[实施例8：支链型两亲性嵌段聚合物的合成（3）]
本实施例中，进行在1条聚乳酸链的一端键合有3个肌氨酸的支链型两亲性嵌段聚合物的合成。
首先，通过与实施例1相同的步骤合成化合物7。接着，向化合物7中分别加入乙醇酸和HATU及DIEA，在室温下搅拌24小时。反应结束后，利用尺寸排阻色谱（SephadexLH20，洗脱液：DMF）将浓缩得到的反应溶液纯化，得到目标两亲性嵌段聚合物16。需要说明的是，式中省略聚乳酸的聚合数的表示。
将所得两亲性嵌段聚合物16的1HNHR测定结果示于图12。根据图12，测定了本实施例中得到的支链型两亲性嵌段聚合物的组成为：PLLA链为30个乳酸单元数，每一个支链中的肌氨酸数为一个。
[实施例9：支链单独系分子聚集体的制备（仅由支链型两亲性嵌段聚合物构成的分子聚集体的制备）（3）]
本实施例中，通过注射法由实施例8中所得的支链型两亲性嵌段聚合物16制备分子聚集体（高分子胶束；Lactosome）。
除使用支链型两亲性嵌段聚合物16之外，进行与实施例7同样的操作。进而，针对颗粒制作温度为与实施例7同样的0℃的情况和代替该温度为60℃的情况这两种情况分别得到分散液。
对所得颗粒分散液测定粒径。然后，进行使用去除颗粒孔径为200nm的过滤器的过滤处理，再次测定粒径。将粒径测定结果与粒度分布指数（PdI）一并示于表2。另外，将DLS测定结果示于图13。图13中，（i）为0℃的温度条件下制作的颗粒的测定结果，（ii）为60℃的温度条件下制作的颗粒的测定结果。
[表2]
[比较例2：直链型两亲性嵌段聚合物的合成及由其形成的直链单独系分子聚集体的制备（2）]
将乳酸单元数（NL）及肌氨酸单元数（NS）进行各种改变而进行在1条聚乳酸（L-聚乳酸；PLLA）链上键合有1条聚肌氨酸（PS）链的直链型两亲性嵌段聚合物的合成。具体的合成法与比较例1同样。
表3中一并示出合成的直链型两亲性嵌段聚合物的乳酸单元数（NL）、肌氨酸单元数（NS）、它们的比（NS/NL）及粒径。需要说明的是，对于未形成颗粒的直链型两亲性嵌段聚合物，表示为“未形成颗粒”来代替粒径。另外，对于样品名称“Ref”的嵌段聚合物，摘录ChemistryLettersVol.36,No.10,1220-1221(2007)的Table1中Entry1的样品的数据。
[表3]
编号 样品名称 NL NS NS/NL 粒径(nm)
1 SA86-12-1 30 93 3.10 34.3
2 SA86-8-1 30 78 2.60 31.8
3 SA86-10-1 30 75 2.50 33.8
4 SA86-9-1 30 73 2.43 32.0
5 SA86-5-1 30 73 2.43 32.5
6 SA86-2-1 31 75 2.42 32.8
7 SA86-6-1 30 71 2.37 37.1
8 SA86-19-1 30 70 2.33 33.0
9 SA86-3-1 31 71 2.29 37.4
10 SA86-16-1 30 65 2.17 31.6
11 SA86-17-1 30 64 2.13 33.6
12 SA86-13-1 30 63 2.10 33.3
13 SA86-15-1 30 63 2.10 32.2
14 SA86-18-1 30 63 2.10 32.3
15 SA16-10-1 40 76 1.90 47.1
16 SA86-14-1 30 54 1.80 41.2
17 Ref 30 50 1.67 未形成颗粒
18 SA16-9-1 64 76 1.19 未形成颗粒
19 SA16-11-1 50 42 0.840 未形成颗粒
结果表明，为了从由聚肌氨酸和聚乳酸形成的直链型两亲性嵌段聚合物生成颗粒，必须为NS/NL为1.8以上的组成。
另一方面，由本发明的支链型两亲性嵌段聚合物(例如实施例8中合成的化合物16；NS/NL为0.1)，即使为本比较例中无法形成颗粒的小于1.8的NS/NL，也可以形成颗粒(实施例9)。

Claims (17)

1.一种支链型两亲性嵌段聚合物，其具有：含有肌氨酸的分支的亲水性嵌段和具有聚乳酸的疏水性嵌段；所述亲水性嵌段中具有由多条肌氨酸链构成的支链结构。
2.根据权利要求1所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，所述亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元的总计为2～200个。
3.根据权利要求1所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，所述亲水性嵌段的支链数为3。
4.根据权利要求1所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，构成所述聚乳酸的乳酸单元为10～400个。
5.根据权利要求1所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，所述疏水性嵌段未分支。
6.根据权利要求5所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，多个所述亲水性嵌段从所述疏水性嵌段中的含有所述聚乳酸链的分子链中的一个碳原子分支。
7.根据权利要求6所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其具有下述式(I)所示的结构：
式中，n1、n2及n3表示其总计为3～200的数，m表示15～60的数，R表示氢原子或有机基团。
8.根据权利要求1所述的支链型两亲性嵌段聚合物，其中，所述亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元数的总计相对于所述疏水性嵌段中所含的乳酸单元数的总计之比为0.05以上且小于1.8。
9.一种分子聚集体，其具有权利要求1～8中的任一项所述的支链型两亲性嵌段聚合物。
10.根据权利要求9所述的分子聚集体，其还具有直链型两亲性嵌段聚合物，所述直链型两亲性嵌段聚合物具有：作为亲水性嵌段的1条聚肌氨酸链和作为疏水性嵌段的1条聚乳酸链。
11.根据权利要求9所述的分子聚集体，其内含选自由信号剂及药物组成的组中的功能性物质。
12.根据权利要求11所述的分子聚集体，其中，所述功能性物质具有聚乳酸链。
13.根据权利要求9所述的分子聚集体，其中，所述支链型两亲性嵌段聚合物具有选自由信号基团及配位基团组成的组中的功能性基团。
14.根据权利要求9所述的分子聚集体，其粒径为10～50nm。
15.根据权利要求9所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备有机溶剂中含有所述支链型两亲性嵌段聚合物的溶液的工序；
从所述溶液中去除所述有机溶剂，在所述容器的内壁上得到含有所述支链型两亲性嵌段聚合物的薄膜的工序；及
在所述容器中加入水或水溶液，进行超声波处理，将所述薄膜转化为分子聚集体，得到分子聚集体的分散液的工序。
16.根据权利要求9所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备有机溶剂中含有所述支链型两亲性嵌段聚合物的溶液的工序；
使所述溶液分散于水或水溶液中的工序；及
去除所述有机溶剂的工序。
17.一种药物输送系统，其包括将权利要求11～16中的任一项所述的分子聚集体作为分子探针给药至非人动物体内。
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