CN104602680A - 使用支化型两亲性嵌段聚合物的分子聚集体及药物输送系统 - Google Patents

使用支化型两亲性嵌段聚合物的分子聚集体及药物输送系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供根据内含的标记试剂、药剂的种类、目的而调整了在目标部位的保持时间的分子聚集体，此外，提供能抑制ABC现象、且能在短时间内多次给药的分子聚集体。一种分子聚集体，其包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F，所述支化型两亲性嵌段聚合物A具有包含肌氨酸的支化的亲水性嵌段和具有聚乳酸链的疏水性嵌段，所述功能性物质F具有功能性部位和聚乳酸链，构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由L-乳酸单元构成、前述功能性物质F中包含的聚乳酸链由D-乳酸单元构成，或者，构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由D-乳酸单元构成、前述功能性物质F中包含的聚乳酸链由L-乳酸单元构成。

Description

使用支化型两亲性嵌段聚合物的分子聚集体及药物输送系统
技术领域
本发明属于超分子化学、医学/工学/药学交叉领域及纳米医药领域。本发明涉及作为分子成像用分子探针的纳米载体，药物输送用纳米载体及疏水性化合物的分散剂。更具体而言，本发明涉及使用了支化型两亲性嵌段聚合物的分子聚集体及药物输送系统。
背景技术
在国际公开第2009/148121号小册子(专利文献1)及生物材料(Biomaterials)，2009年，第30卷，第5156-5160页(非专利文献1)中公开了：疏水性嵌段为聚乳酸链、亲水性嵌段为聚肌氨酸链的直链型两亲性嵌段聚合物在水溶液中自组装，形成粒径为30nm以上的高分子胶束(Lactosome)。已知Lactosome具有较高的血中滞留性，而且与迄今为止已经开发出的高分子胶束相比，其在肝脏中的集聚量明显减少。该Lactosome通过利用在血中滞留的粒径为几十～几百纳米的纳米颗粒易在癌症中滞留这样的性质(增强渗透滞留效应；Enhanced Permeation and Retention effect(EPR效应))，从而可以用作以癌症部位作为靶的分子成像或药物输送用纳米载体。
控制释放杂志(Journal of Controlled Release)，第161卷，第3期，2012年8月10日，第821-825页(非专利文献2)中公开了：在由上述疏水性嵌段为聚L-乳酸(PLLA)链、亲水性嵌段为聚肌氨酸链的直链型两亲性嵌段聚合物形成的高分子胶束(Lactosome)中分别包含立体化学不同的3种ICG(吲哚菁绿)标记的聚乳酸(ICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLA)，制备了3种Lactosome，公开了生物体内的ICG标记聚乳酸的立体化学所涉及的行为。Lactosome的粒径为35nm以上。
针对由合成高分子构成的高分子胶束，已知有如下的现象：在生物体内给药一次，免疫系统就被活化，再次给药相同的高分子胶束时，由于免疫系统的工作而向肝脏中集聚的现象，即加速血液清除(Accelerated BloodClearance(ABC))现象。尚不清楚出现该ABC现象的机理的详细情况。在日本药学会杂志(薬学会誌)，2009年，第129卷，第12号，第1445-1451页(非专利文献3)中报道了，粒径达到30nm以下时，抑制了ABC现象的发生。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/148121号小册子
非专利文献
非专利文献1：生物材料(Biomaterials)，2009年，第30卷，第5156-5160页
非专利文献2：控制释放杂志(Journal of Controlled Release)，第161卷，第3期，2012年8月10日，第821-825页
非专利文献3：日本药学会杂志(薬学会誌)，2009年，第129卷，第12号，第1445-1451页
发明内容
发明要解决的问题
专利文献1以及非专利文献1、2公开的Lactosome如上所述具有较高的血中滞留性，而且与迄今为止已经开发出的高分子胶束相比，向肝脏的集聚量显著地减少。另外，通过EPR效应，可以用作以肿瘤、炎症部位为靶的分子成像或药剂输送用的纳米载体。
但是，上述Lactosome的粒径为30nm以上。从向更细的毛细血管的流通、以及自毛细血管向较小的癌等疾病部位的侵入、更高EPR效应的观点考虑，期望开发具有更小粒径的分子聚集体。
另外，根据分子聚集体中内含的标记试剂(信号剂)、药剂的种类、目的，送达到靶部位之后，有希望在较短时间内排泄的情况，也有希望在靶部位的保持时间长的情况。
进而，在上述Lactosome中也(与由合成高分子构成的高分子胶束的情况同样地)观察到ABC现象。因此，直至免疫学的记忆效应降低为止的期间内，存在不能多次给药Lactosome的问题。
因此，本发明的目的在于提供根据内含的标记试剂、药剂的种类、目的而调整了在靶部位的保持时间的分子聚集体(高分子胶束制剂)。另外，本发明的目的在于提供能抑制ABC现象且能在短时间内多次给药的分子聚集体(高分子胶束制剂)。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过对两亲性嵌段聚合物进行分子设计，使得亲水性嵌段中具有由多条肌氨酸链构成的支链结构，进而将构成前述两亲性嵌段聚合物的疏水性嵌段的聚乳酸链与分子聚集体中要内含的含标记试剂和/或药剂的聚乳酸链的乳酸单元的立体化学设为特定，从而达成上述本发明的目的，由此完成了本发明。
本发明包含以下的发明。
(1)一种分子聚集体，其包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F，所述支化型两亲性嵌段聚合物A具有包含肌氨酸的支化的亲水性嵌段和具有聚乳酸链的疏水性嵌段，所述功能性物质F具有功能性部位与聚乳酸链，
构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由L-乳酸单元构成、前述功能性物质F中包含的聚乳酸链由D-乳酸单元构成，或者，
构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由D-乳酸单元构成、前述功能性物质F中包含的聚乳酸链由L-乳酸单元构成。
通过使构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体化学与前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)的立体化学不同，从而在目标部位的分子聚集体的保持时间变长。
(2)根据上述(1)所述的分子聚集体，其中，前述亲水性嵌段中包含的肌氨酸单元的总计为2～200个。
(3)根据上述(1)或(2)所述的分子聚集体，其中，前述亲水性嵌段的支链数为3。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的分子聚集体，其中，构成聚乳酸链的乳酸单元为10～400个，所述聚乳酸链为构成前述疏水性嵌段的聚乳酸链。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的分子聚集体，其中，前述疏水性嵌段未支化。
(6)根据上述(5)所述的分子聚集体，其中，前述多个亲水性嵌段从前述疏水性嵌段中的包含前述聚乳酸链的分子链中的1个碳原子支化。
(7)根据上述(6)所述的分子聚集体，其中，所述两亲性嵌段聚合物A具有下述式(I)所示的结构：
(式中，n1、n2以及n3表示它们的总和为3～200的数，m表示15～60的数，R表示氢原子或有机基团。)。
(8)根据上述(1)～(7)中任一项所述的分子聚集体，其中，在前述两亲性嵌段聚合物A中，前述亲水性嵌段中包含的肌氨酸单元数的总和与前述疏水性嵌段中包含的乳酸单元数的总和之比为0.05以上且不足1.8。
(9)根据上述(1)～(8)中任一项所述的分子聚集体，其中，前述功能性物质F中的功能性部位为选自由信号剂以及药剂组成的组中的部位。
(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的分子聚集体，其中，以前述两亲性嵌段聚合物A为基准，以20mol％以下的量包含前述功能性物质F。
(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的分子聚集体，其粒径为10～30nm。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备在有机溶剂中包含前述支化型两亲性嵌段聚合物A和前述功能性物质F的溶液的工序；
从前述溶液中去除前述有机溶剂，在前述容器的内壁上得到包含前述支化型两亲性嵌段聚合物A和前述功能性物质F的薄膜的工序；以及
向前述容器中加入水或者水溶液，进行超声波处理，将前述薄膜转化为分子聚集体，得到分子聚集体的分散液的工序。
(13)根据上述(1)～(11)中任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备在有机溶剂中包含前述支化型两亲性嵌段聚合物A以及前述功能性物质F的溶液的工序；
使前述溶液在水或水溶液中分散的工序；以及
去除前述有机溶剂的工序。
(14)一种药剂输送系统，其包括：将上述(1)～(13)中任一项所述的分子聚集体作为分子探针向非人动物体内给药。
(15)一种分子聚集体，其包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F，所述支化型两亲性嵌段聚合物A具有包含肌氨酸的支化的亲水性嵌段和具有聚乳酸链的疏水性嵌段，所述功能性物质F具有功能性部位与聚乳酸链，
构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由L-乳酸单元构成、前述功能性物质F中所含的聚乳酸链由DL-乳酸单元构成，或者，
构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由D-乳酸单元构成、前述功能性物质F中包含的聚乳酸链由DL-乳酸单元构成。
对于构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体化学，使前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)由DL-乳酸单元构成，从而在靶部位的分子聚集体的保持时间变短，向体外的排泄变快。
上述(2)～(13)中任一项中记载的技术特征同样适用于上述(15)的分子聚集体。另外，针对上述(14)所述的药剂输送系统，也同样适用于上述(15)的分子聚集体。
发明的效果
根据本发明，通过亲水性嵌段中的支链结构，提供现有的Lactosome中不能制备的具有小粒径(例如30nm以下的粒径)的分子聚集体(即，高分子胶束；Lactosome)。本发明的分子聚集体的粒径小，也容易向更细的毛细血管中流通，从毛细血管向较小的癌等疾病部位的侵入更容易，能够利用更高EPR效应来加速分子聚集体向癌部位的集聚速度。
通过使构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链(称其为“A-PLA”)的立体化学不同于前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(称其为“F-PLA”)的立体化学，从而分子聚集体所内含的标记试剂(信号剂)、药剂可以在送达到靶癌部位之后在目标部位长时间地保持。认为这是由于，前述聚乳酸链(A-PLA)与前述聚乳酸链(F-PLA)彼此形成立体配合物，虽然为小粒径，却能保持分子聚集体的稳定性。另外，认为前述聚乳酸链(A-PLA)与前述聚乳酸链(F-PLA)采用彼此不同的螺旋结构，认为键合于前述聚乳酸链(F-PLA)的疏水性功能性部位易于保持在核/壳结构的分子聚集体的疏水性内部，进一步增加稳定性。
另一方面，相对于构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体化学，使前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)由DL-乳酸单元构成，从而在靶部位的分子聚集体的保持时间变短，向体外的排泄变快。认为这是由于，没有发生如上所述那样的前述聚乳酸链(A-PLA)与前述聚乳酸链(F-PLA)之间的立体配合物的形成，得不到通过形成立体配合物而带来的分子聚集体的稳定性效果。进而认为，键合于前述聚乳酸链(F-PLA)的疏水性的功能性部位保持在核/壳结构的分子聚集体的疏水性内部的效果也较弱。
另外，根据本发明的分子聚集体，在上述任意的立体化学的情况下均促进向更细的血管的分布而分布到全身，从而能够降低背景的信号。即，能提高肿瘤部位与背景的对比度。由此，变得能在短时间内进行成像。
另外，根据本发明的分子聚集体，通过亲水性嵌段的支链结构而在表面具有肌氨酸链稠密的聚合物刷结构，因此无论其粒径是否小于30nm，均能抑制ABC现象的产生。
根据本发明，提供根据内含的标记试剂、药剂的种类、目的而调整在目标部位的保持时间的分子聚集体(高分子胶束制剂)。另外，提供能抑制ABC现象、能在短时间内多次给药的分子聚集体(高分子胶束制剂)。
附图说明
图1为合成例1中合成的支化型两亲性嵌段聚合物的1H NMR谱图。
图2为表示在实验例2中由聚L-乳酸PLLA引起的Lactosome的粒径变化的图。
图3为表示在实验例2中由聚D-乳酸PDLA引起的Lactosome的粒径变化的图。
图4示出实验例3中使用各ICG标记聚乳酸(ICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLA)内含Lactosome颗粒的荷瘤小鼠的活体(in vivo)荧光成像结果。
图5为示出实验例3中荷瘤小鼠的荧光成像中的肿瘤(Tumor)处的荧光强度的经时变化的图。
图6为示出实验例3中荷瘤小鼠的荧光成像中的背部(背景；Background)处的荧光强度的经时变化的图。
图7为示出实验例3中荷瘤小鼠的荧光成像中的肝脏(Liver)处的荧光强度的经时变化的图。
图8为分析实验例3中荷瘤小鼠的荧光成像中的肿瘤(Tumor)与背部(Background)的荧光强度比(Tumor/Background)而得到的图。
具体实施方式
[1.支化型两亲性嵌段聚合物A]
本发明的两亲性嵌段聚合物A具有：包含肌氨酸的支化的亲水性嵌段和具有聚乳酸的疏水性嵌段。亲水性嵌段和疏水性嵌段是介由连接部结合的。
[1-1.亲水性嵌段]
本发明中，作为支化型两亲性嵌段聚合物A的亲水性嵌段所具有的所谓“亲水性”的物性的具体水平，没有特别限定，是指至少亲水性嵌段的整体的亲水性相对地强于后述作为疏水性嵌段的聚乳酸链的性质。或者是指，通过亲水性嵌段与疏水性嵌段形成共聚物而能够作为共聚物分子整体实现两亲性的水平的亲水性。再或者是指，两亲性嵌段聚合物A能够在溶剂中自组装而形成自组装体、特别是颗粒状自组装体的水平的亲水性。
本发明的两亲性嵌段聚合物A具有在亲水性嵌段中进行支化的结构。亲水性嵌段的各个支链分别含有肌氨酸。
在亲水性嵌段中，结构单元的种类及比率由本领域技术人员适当确定，以使嵌段整体成为上述那样的亲水性。具体而言，全部支链中所含的肌氨酸单元的总计例如可以为2～200、2～100或2～10个。或者，全部多个亲水性嵌段中所含的肌氨酸单元的总计例如可以为30～200或50～100个。每一个支链中的肌氨酸单元数的平均值例如可以为1～60、1～30、1～10或1～6。即，各个亲水性嵌段可以分别含有肌氨酸或聚肌氨酸链而构成。
若结构单元数超过上述范围，则在形成分子聚集体时，存在所形成的分子聚集体欠缺稳定性的倾向。低于上述范围时，存在不会形成作为两亲性嵌段聚合物的主体、或者分子聚集体的形成本身变得困难的倾向。
亲水性嵌段中的支链只要为2以上即可，从形成分子聚集体时有效地得到颗粒形状的胶束的观点考虑，优选为3以上。对亲水性嵌段中的支链数的上限没有特别限定，例如为27。在本发明中，亲水性嵌段的支链数特别优选为3。
肌氨酸(即N-甲基甘氨酸)的水溶性高，而且肌氨酸的聚合物具有N取代酰胺，所以与普通的酰胺基相比，可以进行顺反异构化，进而Cα碳周围的位阻小，所以具有高柔软性。使用这种结构作为构成嵌段时，从对该嵌段赋予高亲水性的基本特性或兼具高亲水性和高柔软性的基本特性的方面考虑，是非常有用的。
进而，亲水性嵌段优选在末端(即与连接部相反的一侧的末端)具有亲水性基团(例如以羟基为代表)。
需要说明的是，聚肌氨酸链中，全部的肌氨酸单元可以是连续的，也可以是非连续的，优选以作为该多肽链整体不破坏上述基本特性的方式进行分子设计。
[1-2.疏水性嵌段]
本发明中，作为疏水性嵌段所具有的所谓“疏水性”的物性的具体水平，没有特别限定，至少疏水性嵌段为疏水性相对地强于上述亲水性嵌段整体的区域，通过与该亲水性嵌段形成共聚物，从而具有作为共聚物分子整体能够实现两亲性的水平的疏水性即可。或者，具有该两亲性嵌段聚合物A能够在溶剂中自组装而形成自组装体、优选形成颗粒状的自组装体的水平的疏水性即可。
在一条两亲性嵌段聚合物A中存在的疏水性嵌段可以未支化，也可以支化。但是，认为疏水性嵌段未支化时，相对于疏水性核部，亲水性支化型壳部的稠密度增加，因此易于形成更小粒径的稳定的核/壳型分子聚集体。
本发明中，疏水性嵌段包含聚乳酸链(A-PLA)。疏水性嵌段中，结构单元的种类及比率由本领域技术人员适当确定，以使嵌段整体成为上述那样的疏水性。具体而言，例如疏水性嵌段未支化的情况下，乳酸单元的数量例如可以为5～100、15～60个或25～45个。疏水性嵌段支化的情况下，全部支链中所含的乳酸单元数的总计例如可以为10～400个，优选为20～200个。该情况下，每一个支链中的乳酸单元数的平均值例如为5～100个，优选为10～100个。
结构单元数超出上述范围时，形成分子聚集体的情况下，存在该形成的分子聚集体欠缺稳定性的倾向。结构单元数低于上述范围时，存在分子聚集体的形成本身变困难的倾向。
疏水性嵌段支化的情况下，对支链的数量没有特别限定，从形成分子聚集体时有效地得到颗粒形状的胶束的观点考虑，例如可以设为亲水性嵌段中的支链数以下。
聚乳酸具有以下基本特性。
聚乳酸具有优异的生物适应性及稳定性。因此，由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到的分子聚集体从对生物体、特别是对人体的应用性的方面考虑是非常有用的。
另外，聚乳酸具有优异的生物降解性，所以代谢快，在生物体内向癌组织以外的组织中的集聚性低。因此，由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到的分子聚集体从向癌组织中的特异性的集聚性的方面考虑是非常有用的。
而且，聚乳酸在低沸点溶剂中的溶解性优异，所以由以这种聚乳酸作为构成嵌段的两亲性物质得到分子聚集体时，可以避免使用有害的高沸点溶剂。因此，这种分子聚集体从对生物体的安全性的方面考虑是非常有用的。
需要说明的是，构成疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)中，全部乳酸单元可以是连续的，也可以是非连续的，优选以作为多肽链整体不破坏上述基本特性的方式进行分子设计。
为了与后述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)的立体相互作用，构成疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)为由L-乳酸单元构成的聚L-乳酸链(A-PLLA)，或者为由D-乳酸单元构成的聚D-乳酸链(A-PDLA)。
此处，由L-乳酸单元构成的聚L-乳酸链(A-PLLA)指的是，以构成聚乳酸链(A-PLA)的全部乳酸单元为基准，90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、特别优选100％为L-乳酸单元。通过这样的构成，期待其与功能性物质F中包含的聚D-乳酸链(F-PDLA)形成立体配合物。
由D-乳酸单元构成的聚D-乳酸链(A-PDLA)指的是，以构成聚乳酸链(A-PLA)的全部乳酸单元作为基准，90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、特别优选100％为D-乳酸单元。通过这样的构成，期待其与功能性物质F中包含的聚L-乳酸链(F-PLLA)形成立体配合物。
[1-3.肌氨酸单元数与乳酸单元数之比]
两亲性嵌段聚合物A中，将肌氨酸单元数(即，亲水性嵌段的全部支链中所含的肌氨酸单元数的总计)设为NS，将聚乳酸单元数(即，疏水性嵌段中所含的乳酸单元数、或疏水性嵌段支化了的情况下全部支链中所含的乳酸单元数的总计)设为NL时，它们的比NS/NL例如可以为0.05～5或0.05～4。
NS/NL进一步优选为0.05以上且小于1.8，例如可以为0.05以上且1.7以下，0.05以上且1.67以下，0.1以上且1.7以下，或0.1以上且1.67以下。
[1-4.支链结构]
连接亲水性嵌段和疏水性嵌段的连接部位的结构只要为在化学上可接受的结构即可，没有特别限定。
例如亲水性嵌段侧的支链数为2时，2条含有聚肌氨酸链的分子链可以从位于含有聚乳酸链的分子链的连接部位的一个N原子支化。换言之，与聚乳酸链直接或间接地结合的N原子可以直接或间接地与2条聚肌氨酸链结合。
另外，例如亲水性嵌段侧的支链数为3时，3条含有聚肌氨酸链的分子链可以从位于含有聚乳酸链的分子链的连接部位的一个C原子支化。换言之，与聚乳酸链直接或间接地结合的C原子可以直接或间接地与3条聚肌氨酸链结合。从位于连接部位的一个P原子、Si原子支化的情况，或两亲性嵌段聚合物分子整体形成季铵分子的情况也是同样的。
亲水性嵌段侧的支链数超过3时，可以以支链具有进一步的支链结构的方式进行分子设计。
疏水性嵌段侧也支化了的情况下，也可以按上述同样的观点考虑而进行分子设计。
下述式(I)示出亲水性嵌段侧的支链数为3、疏水性嵌段侧没有支链时的支化型两亲性嵌段聚合物的优选结构。
式(I)中，n1、n2及n3表示它们的总和为3～200的数，m表示5～100的数，R表示氢原子或有机基团。有机基团的碳数可以为1～20。具体而言，可列举出烷基、烷基羰基等。
下述式(II)示出亲水性嵌段侧的支链数为3、疏水性嵌段侧的支链为2时的支化型两亲性嵌段聚合物的优选结构。
式(II)中，n1、n2及n3以及R与式(I)中的情况相同。m1及m2表示它们的总和为10～400的数。
[1-5.支化型两亲性嵌段聚合物A的合成法]
支化型两亲性嵌段聚合物的合成中进行疏水性嵌段部(聚乳酸部)的合成、亲水性嵌段部(肌氨酸部或聚肌氨酸部)的合成、以及连接这些嵌段的连接部的合成。
例如，合成使肌氨酸或聚肌氨酸链与聚乳酸链相连接的连接试剂，将其作为引发剂，通过肌氨酸部位的加成或聚肌氨酸部位的聚合反应而延长，以及通过聚乳酸部位的聚合反应而延长，从而能够合成支化型两亲性嵌段聚合物。
另外例如，肌氨酸与连接试剂加成后、或者预先通过聚合反应制备聚肌氨酸链作为亲水性嵌段并与连接试剂加成后，通过使聚乳酸链延长，能够合成支化型两亲性嵌段聚合物。
进而例如，预先准备肌氨酸或聚肌氨酸链及聚乳酸链这两者分别作为亲水性嵌段及疏水性嵌段，使用另行合成的连接试剂将这些嵌段连接，从而可以合成支化型两亲性嵌段聚合物。
连接试剂的结构可以具有一个或仅相当于期望的疏水性嵌段侧支链数的数量的能够与乳酸单体(乳酸、丙交酯)或聚乳酸链键合的官能团(例如羟基、氨基等)，且具有仅相当于期望的亲水性嵌段侧支链数的数量的能够与肌氨酸单体(例如肌氨酸、N-羧基肌氨酸酐)或聚肌氨酸键合的官能团(例如氨基)。该情况下，本领域技术人员对连接试剂进行适当分子设计，使得连接试剂中的能够与肌氨酸单体或聚肌氨酸键合的各个官能团具有尽可能同样的反应性。
能够与乳酸单体或聚乳酸链键合的官能团和能够与肌氨酸单体或聚肌氨酸键合的官能团可以分别被保护基保护。该情况下，作为各自的保护基，本领域技术人员根据需要适当选择能够选择性地离去的保护基。
例如合成亲水性嵌段侧支链数为3的支化型两亲性嵌段聚合物时的连接试剂例如能够以三羟甲基氨基甲烷(Tris)结构作为基础进行制备。
进而，使疏水性嵌段侧支化时，例如能够以在上述三羟甲基氨基甲烷结构中进一步增加支化点而得到的结构作为基础进行制备。进一步增加支化点而得到的结构可以如下得到：对三羟甲基氨基甲烷加成在侧链具有例如氨基作为能够与聚乳酸链键合的官能团的氨基酸(作为具体例，可列举出赖氨酸及鸟氨酸)的、全部氨基被保护起来的氨基酸衍生物，然后脱保护，从而得到。通过对脱保护而变为游离的氨基进一步加成同样的氨基酸衍生物，从而可以增加支化点。
聚肌氨酸链及聚乳酸链的合成方法可以根据连接试剂中的官能团由本领域技术人员适当确定，也可以从公知的肽合成法及聚酯合成法中选择。
肽合成例如优选将连接试剂中的氨基等碱性基团作为引发剂，使N-羧基肌氨酸酐(肌氨酸NCA)开环聚合等来进行。
聚酯合成例如优选将连接试剂中的氨基等碱性基团作为引发剂，使丙交酯开环聚合等来进行。
需要说明的是，合成支链数与上述具体例不同的支化型两亲性嵌段聚合物时，从有机化学的观点考虑，可以通过本领域技术人员适当加以各种变更来制备。
聚肌氨酸链及聚乳酸链的链长的调节可以通过调节聚合反应中的引发剂与单体的投料比来进行。另外，链长例如可以通过1HNMR确认。
[2.具有功能性部位和聚乳酸链的功能性物质F]
本发明的分子聚集体包含具有功能性部位和聚乳酸链的功能性物质F。功能性物质F为疏水性化合物，位于分子聚集体的疏水核部，从而内含于分子聚集体。由此，本发明的分子聚集体成为作为分子成像中的探针或作为药剂输送系统中的制剂而有用的结构体。
[2-1.功能性部位]
功能性物质F中的功能性部位为选自由标记试剂(信号剂)和药剂组成的组中的部位(基团)。
作为信号剂，能够使用具有以下信号基团的分子。信号基团为具有能通过检测而成像的特性的物质即可。例如可以举出荧光基团、含放射性元素基团、磁性基团等。检测这些基团的手段是由本领域技术人员适当选择的。
作为荧光基团，没有特别的限定，可以举出源自荧光素系色素、吲哚菁色素等花青系色素、若丹明系色素、量子点等的基团。本发明中，优选使用近红外荧光基团(例如源自花青系色素、量子点等的基团)。
近红外区域(700～1300nm)中，虽然存在具有氢键的各取代基的吸收，但是其吸收较小。因此，近红外光具有易于透过生物体组织的特性。如果利用这种近红外光的特性，则可以说能够得到体内的信息而不对身体造成不必要的负担。特别是将测定对象特定为小动物、接近于身体表面的部位时，近红外荧光可以提供有用的信息。
作为近红外荧光基团的更具体的例子，可列举出源自ICG(吲哚菁绿)等吲哚菁系色素、Cy7、DY776、DY750、Alexa790、Alexa750等的基团。例如以癌作为靶使用本发明的分子聚集体时，从向癌的集聚性的观点考虑，有时优选使用源自ICG等吲哚菁系色素的基团。
作为含放射性元素基团，没有特别限定，可列举出用18F等的放射性同位素标记了的源自糖、氨基酸、核酸等的基团。作为含放射性元素基团的导入方法的具体例之一，可列举出利用下述工序进行的方法：使用单Fmoc(9-芴基甲基氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl))乙二胺进行丙交酯的聚合的工序；将末端OH用甲硅烷基保护基保护的工序；通过哌啶处理使Fmoc基离去的工序；进行肌氨酸-N-羧基酸酐(SarNCA)的聚合，将聚合物末端进行末端终止的工序；脱去甲硅烷基保护基，转化为磺酸酯(例如三氟甲磺酸酯、对甲苯磺酸酯等)的工序；以及，导入含放射性元素基团的工序。进而，该具体例可以由本领域技术人员适当变更。
作为磁性基团，没有特别限定，可列举出具有铁色素(ferrichrome)等的磁性体的基团，被视为铁氧体纳米颗粒、纳米磁性颗粒等的基团。
这其中，本发明中，有时优选吲哚菁绿系色素等近红外荧光物质、用18F等放射性同位素标记了的糖、氨基酸、核酸等含放射性元素物质。这些标记试剂可以单独使用或组合多种来使用。
作为药剂，由本领域技术人员适当选择适于作为对象的疾患的药剂。具体地说，可以举出抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗炎症剂、免疫抑制剂、类固醇剂、激素剂、抗血管生成剂等。这些药剂分子可以单独使用或组合多种来使用。
[2-2.聚乳酸链]
关于内含于分子聚集体的功能性物质F，选自由上述标记试剂(信号剂)和药剂组成的组中的部位(基团)与聚乳酸链(F-PLA)(基团)相结合。
为了与前述构成疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体相互作用，构成功能性物质F的聚乳酸链(F-PLA)为由D-乳酸单元构成的聚D-乳酸链(F-PDLA)或由L-乳酸单元构成的聚L-乳酸链(F-PLLA)。
此处，由D-乳酸单元构成的聚D-乳酸链(F-PDLA)指的是，以构成聚乳酸链(F-PLA)的全部乳酸单元为基准，90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、特别优选100％为D-乳酸单元。通过这样的构成，期待与构成疏水性嵌段的聚L-乳酸链(A-PLLA)形成立体配合物。
此处，由L-乳酸单元构成的聚L-乳酸链(F-PLLA)指的是，以构成聚乳酸链(F-PLA)的全部乳酸单元为基准，90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、特别优选100％为L-乳酸单元。通过这样的构成，期待与构成疏水性嵌段的聚D-乳酸链(A-PDLA)形成立体配合物。
构成功能性物质F的聚乳酸链的乳酸单元数为15～60个，优选为25～45个。在此范围内，以聚乳酸结合功能性物质F整体的长度不超过上述两亲性嵌段聚合物A的长度的方式进行分子设计。优选以不超过两亲性嵌段聚合物A中疏水性嵌段的2倍的长度的方式进行分子设计。若结构单元数超过上述范围，则在形成分子聚集体时存在形成的分子聚集体欠缺稳定性的倾向。结构单元数低于上述范围时，存在功能性物质F与两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的亲和性、特别是立体配合物的形成变弱的倾向。
作为功能性物质F的内含量，没有特别限定，例如，以前述两亲性嵌段聚合物A为基准，例如以20mol％以下、优选0.5～20mol％、更优选1.0～20mol％的量包含前述功能性物质F。超过20mol％时，存在分子聚集体的粒径变得大于30nm、或分子聚集体的一次颗粒发生聚集的倾向。
[3.分子聚集体]
[3-1.分子聚集体]
本发明的分子聚集体(Lactosome)为通过上述支化型两亲性聚合物A的聚集或自组装取向而形成的结构体。本发明从实用性的观点考虑，优选的是以内侧(核部)为疏水性嵌段、外侧(壳部)为亲水性嵌段构成的胶束形状的分子聚集体。本发明的分子聚集体通过具备适宜的功能性结构(具有功能性部位和聚乳酸链的功能性物质F)，从而成为作为分子成像中的探针或药剂输送系统中的制剂而有用的结构体。
支化型两亲性嵌段聚合物A通过存在作为支链的多个聚肌氨酸链，从而，与直链型两亲性嵌段聚合物相比，亲水性部位的分子截面积变大。因此，对于由支化型两亲性嵌段聚合物形成的分子聚集体，作为颗粒的稳定性优异。进而该颗粒能够具有较大的曲率。由此，本发明的分子聚集体具有如后述那样能够实现颗粒的小型化这样的基本特征。
另外，由支化型两亲性嵌段聚合物A构成的分子聚集体通过存在多个作为支链的聚肌氨酸链，从而具有与现有的Lactosome相比表面亲水性基团的密度高、疏水性部位的露出少这样的基本特征。
需要说明的是，本发明中的分子聚集体中，除支化型两亲性嵌段聚合物A之外，也可以在不损害本发明的目的的范围内少量组合使用亲水性嵌段不为支化型的直链型的两亲性嵌段聚合物。但是要注意，使用直链型两亲性嵌段聚合物时，存在分子聚集体的粒径变大的倾向。支化型两亲性嵌段聚合物与直链型两亲性嵌段聚合物的混合比以摩尔基准计可以设定为50:50～100:0，优选设为67:33～100:0，更优选设为95:5～100:0。该情况下，构成疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体化学也如上所述地设定。
[3-2.粒径]
本发明的分子聚集体的粒径例如可以为10～30nm。该范围中包含的上限值也可以是28nm、25nm或23nm。另外，下限值也可以为15nm。本发明中，通过将支化型两亲性嵌段聚合物A的链长调整得较短，也可以得到比上述范围的下限值更小的分子聚集体。此处“粒径”是指，颗粒分布中出现频率最高的粒径、即所谓的中心粒径。本发明的分子聚集体如上所述通过两亲性嵌段聚合物的亲水性嵌段的支链结构，存在基本上与现有的分子聚集体相比粒径小的倾向。
超过上述范围的情况时，与由直链型两亲性嵌段聚合物形成的分子聚集体的粒径(国际公开第2009/148121号：30nm以上)没有太大差别，在作为分子探针向生物体内给药时，变得难以获得优选的EPR效应。
作为调节粒径的方法，例如可以举出：通过调短分子聚集体的支化型两亲性嵌段聚合物A的链长而调整为更小的粒径；通过不使用直链型两亲性嵌段聚合物或尽量减少其配混量而调整为更小的粒径；通过减少前述功能性物质F的量而调整为更小的粒径等。
用于测定本发明的分子聚集体的尺寸的方法没有特别限定，由本领域技术人员适当选择。例如，可以举出利用透射型电子显微镜(TransmissionElectron Microscope；TEM)或原子力显微镜(Atomic Force Microscope；AFM)的观察法、动态光散射(Dynamic Light Scattering；DLS)法等。DLS法中，测定溶液中进行布朗运动的颗粒的移动扩散系数。
[3-3.分子聚集体的制作]
分子聚集体的制作法没有特别限定，可以由本领域技术人员根据所期望的分子聚集体的尺寸、特性，要负载的功能性结构的种类、性质、含量等而适当选择。也可以根据需要在如下所述形成分子聚集体之后通过公知的方法对得到的分子聚集体进行表面修饰。需要说明的是，对于形成了颗粒的确认，通过电子显微镜进行观察是较好的。
[3-3-1.薄膜法]
本发明中的支化型两亲性嵌段聚合物A具有在低沸点溶剂中的溶解性，所以可以使用薄膜法进行分子聚集体的制备。
薄膜法包括以下工序。即，可以包括：在容器(例如玻璃容器)中准备在有机溶剂中包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F的溶液的工序；
从前述溶液中去除有机溶剂，在容器的内壁上得到包含前述支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F的薄膜的工序；以及，
在前述容器中加入水或水溶液，进行超声波处理或加热处理，将薄膜状物质转化为分子聚集体(例如内含功能性物质F的分子聚集体)，得到分子聚集体的分散液的工序。
进而，薄膜法也可以包括将分子聚集体的分散液供给于冷冻干燥处理的工序。
在有机溶剂中包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F的溶液也可以如下进行制备：仅将支化型两亲性嵌段聚合物A预先以薄膜的状态储存，在制备纳米颗粒时，加入含有功能性物质F的溶液，将薄膜溶解，从而制备。
作为薄膜法中使用的有机溶剂，优选使用低沸点溶剂。本发明中的所谓低沸点溶剂是指在一个大气压下的沸点为100℃以下、优选为90℃以下的溶剂。具体而言，可列举出氯仿、乙醚、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷等。
通过使用这种低沸点溶剂，去除溶剂变得非常简单。作为去除溶剂的方法，没有特别限定，可以根据所使用的有机溶剂的沸点等由本领域技术人员适当确定。例如可以进行在减压下的溶剂去除，也可以利用自然干燥来进行溶剂去除。
去除有机溶剂后，在容器内壁上形成包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F的薄膜。在粘附有该薄膜的容器中加入水或水溶液。作为水或水溶液，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当选择生物化学、药学上可接受的液体。例如可列举出注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
加入水或水溶液后进行加热处理。在通过加热将薄膜从容器内壁上剥离的过程中形成分子聚集体。加热处理例如可以在70～100℃，5～60分钟的条件下进行。加热处理结束时，在容器中制备分子聚集体(内含有功能性物质F的形态的分子聚集体)分散于前述水或水溶液中而成的分散液。另外，剥离薄膜时，也可以根据需要同时进行超声波处理。
所得分散液可以直接给药于生物体。即，可以不在无溶剂的分子聚集体本身的状态下进行保存。
另一方面，可以对所得分散液进行冷冻干燥处理。作为冷冻干燥处理的方法，可以没有特别限定地使用公知的方法。例如可以如下进行：用液氮等将如上所述地得到的分子聚集体的分散液冷冻，在减压下使其升华。由此，可以得到分子聚集体的冷冻干燥处理物。即，可以将分子聚集体以冷冻干燥处理物的形式保存。根据需要，在该冷冻干燥物中加入水或水溶液，得到分子聚集体的分散液，从而可以将分子聚集体供给于使用。作为水或水溶液，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当选择生物化学、药学上可接受的液体。例如可列举出注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
[3-3-2.注射法]
注射法包括以下工序。即，进行以下工序：在容器(例如试管等)中准备在有机溶剂中包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F的溶液的工序；
使前述溶液分散于水或水溶液中的工序；以及，
去除有机溶剂的工序。进而，注射法可以在去除有机溶剂的工序之前适当进行纯化处理工序。
作为注射法中使用的有机溶剂，例如可以使用三氟乙醇、乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等。作为水或水溶液，可以使用注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。
作为纯化处理，例如可以进行凝胶过滤层析、过滤、超速离心等处理。
[4.药物输送系统/分子成像]
[4-1.分子聚集体的给药对象]
本发明的药物输送系统及分子成像包括将上述分子聚集体给药至生物体内。作为给药分子聚集体的生物体，没有特别限定，可以为人或非人动物。作为非人动物，没有特别限定，可列举出人以外的哺乳类，更具体而言，可列举出灵长类、啮齿类(小鼠、大鼠等)、兔、犬、猫、猪、牛、羊及马等。
本发明的方法中使用的分子聚集体向血管病变部位(例如恶性肿瘤部位、炎症部位、动脉硬化部位、血管新生部位等)的特异性的集聚性优异。本发明分子聚集体由于利用EPR(增强渗透滞留)效应向这些部位的组织中集聚，所以其集聚性不依赖于血管病变部位的组织种类。作为本发明的荧光探针的给药靶，优选为癌。可以作为给药靶的癌多种多样。例如可列举出肝癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、大肠癌等。
[4-2.给药]
作为向生物体内给药的方法，没有特别限定，可以由本领域技术人员适当确定。因此，作为给药的方法，全身给药及局部给药均可。即，分子探针的给药可以通过注射(有针型、无针型)、内服、外用中的任意方法来进行。
本发明的分子聚集体通过作为必需构成要素的支化型两亲性嵌段聚合物A的支链结构而在颗粒表面具有肌氨酸链稠密的聚合物刷结构。因此，可以认为，与现有Lactosome相比，颗粒的疏水性部位向外部环境的露出变少，由颗粒外部环境引起的异物识别受到抑制。本发明的分子聚集体可以减弱被视为由此导致的ABC现象。由此，本发明的分子聚集体可以多次给药。例如可以对同一个体进行2次以上的必要次数(例如2～10次)。另外，给药间隔例如可以设为1～60天。
对于本发明的分子聚集体，使构成前述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链(A-PLA)的立体化学与前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)的立体化学不同。由此，前述聚乳酸链(A-PLA)与前述聚乳酸链(F-PLA)彼此形成立体配合物，虽然为不足30nm的小粒径，却能保持分子聚集体的稳定性。另外，认为前述聚乳酸链(A-PLA)与前述聚乳酸链(F-PLA)形成互不相同的螺旋结构，结合于前述聚乳酸链(F-PLA)的疏水性功能性部位易于保持在核/壳结构的分子聚集体的疏水性内部，进而稳定性增加。通过这样的作用，在分子聚集体被送达至靶部位之后，分子聚集体内含的标记试剂(信号剂)、药剂得以长时间地保持在目标部位。因此，能够到达较小的病变部位，并且能够期待更长的药剂效果。
[4-3.分子聚集体的检测]
本发明的分子成像中，包括检测源自给药的分子聚集体的信号的工序。通过检测给药的分子聚集体，能够从体外观测给药靶的状况(特别是癌等组织的位置/尺寸)。
作为检测方法，可以使用能使给药的分子聚集体可视化的所有手段。作为该手段，本领域技术人员可以根据分子聚集体所具有的信号基团或信号物质的种类而适当确定。
对于从给药到开始检测为止的时间，分子聚集体的粒径与现有方法中同样的情况下，可以由本领域技术人员根据给药的分子聚集体所具有的功能性物质F的种类及给药靶的种类而适当确定。例如可以设为给药后1～24小时。小于上述范围时，信号过强，存在无法明确地区分给药靶与其它部位(背景)的倾向。另外，超过上述范围时，存在分子聚集体从给药靶被排泄出的倾向。
另一方面，本发明的分子聚集体通过作为必需构成要素的支化型两亲性嵌段聚合物A的支链结构以及前述支化型两亲性嵌段聚合物A的聚乳酸链(A-PLA)与前述功能性物质F中包含的聚乳酸链(F-PLA)的立体化学的特定组合，从而作为颗粒的稳定性优异，可以制备以往不可能制备的小粒径的分子聚集体。将粒径小的分子聚集体给药于生物体时，由EPR效应引起的分子聚集体向靶组织中的集聚速度的加速化、以及利用肾脏将分子聚集体对外排出的加速化成为可能。因此，分子聚集体的粒径小于现有方法中的粒径时，可以使从给药到开始检测为止的时间短于现有方法。例如可以设为1～24小时，优选为1～9小时。本发明中，由于能使分子聚集体的粒径小型化，所以可以在血中给药后短时间内提高肿瘤部位与背景的对比度，使短时间内的癌症部位选择性成像成为可能。
需要说明的是，从准确性的观点考虑，分子聚集体的检测优选通过从生物体的多个方向而不是从一个方向的测定来进行。具体而言，可以从至少3个方向，更优选至少从5个方向进行测定。从5个方向进行测定时，例如可以从左右两腹侧、从左右两体侧、以及从背侧进行测定。
实施例
以下为了更详细地说明本发明而列举实施例，但本发明不受这些实施例的任何限定。
[合成例1：支化型两亲性嵌段聚合物的合成]
本实施例中，进行在1条聚乳酸(L-聚乳酸；PLLA)链上键合有3条聚肌氨酸(PSar)链的支化型两亲性嵌段聚合物的合成。
作为概述，首先进行连接试剂的合成。连接试剂由三羟甲基氨基甲烷(Tris)1合成，所述三羟甲基氨基甲烷(Tris)1具有一个作为PLLA聚合的引发剂的氨基和3个作为用于肌氨酸部位的NCA(N-羧基酸酐(N-carboxyanhydride))聚合法的引发剂的羟基。进而，加成合适的保护基，使得能够根据需要使Tris1的氨基及羟基脱保护。具体而言，在2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)的存在下，使用N-叔丁氧基羰基甘氨酸(Boc-Gly-OH)，得到由具有Boc基的保护基保护了氨基的化合物2，进而，在二氯二氰基苯醌(DDQ)及二甲基氨基吡啶(DMAP)的存在下，使用苄氧基羰基肌氨酸(Cbz-Sar-OH)，得到由具有Cbz基的保护基保护了羟基的化合物3作为连接试剂。使用HCl-二噁烷，仅将连接试剂3的Boc基选择性地脱保护时，得到含氨基化合物4。
具体的合成顺序如以下所述。
[化合物2]
向1.9g(0.016mol)三(羟甲基)氨基甲烷的EtOH溶液(75mL)中加入2.5g(0.014mol)Boc-甘氨酸和6.0g(0.024mol)EEDQ，一边回流(95℃)一边搅拌4.5小时。反应结束后，用滤纸去除沉淀物，将EtOH减压蒸馏去除后，用硅胶柱层析法进行纯化(洗脱液依次使用CHCl3/MeOH混合比(v/v)为1/0、40/1及10/1的洗脱液)。所得产物2的重量为3.2g(0.012mol)，产率为82％。
[化合物3]
向化合物2(278mg，1.0mmol)、Cbz-Sar-OH(804mg，3.6mmol)、DCC(887mg，4.3mmol)及DMAP(26mg，0.21mmol)的混合物中加入经冰冷却的10mL二氯甲烷后，在室温下搅拌一夜。反应结束后，用乙酸乙酯清洗，去除白色沉淀(尿素)后，用硅胶层析法进行纯化(洗脱液依次使用正己烷/乙酸乙酯混合比(v/v)为2/1、1/1及1/2的洗脱液)。由此，以产率84％得到目标化合物3(719mg)。
[化合物4]
向经冰冷却的化合物3(710mg)中加入4mol/L HCl/二噁烷(7.0mL)使其溶解后，在室温下搅拌5分钟。然后，从反应溶液中减压蒸馏去除溶剂，用硅胶层析法进行纯化(洗脱液使用CHCl3/MeOH混合比(v/v)为10/0的洗脱液)。
使所得白色沉淀溶解于氯仿，用1N NaOH水溶液进行分液操作，由此进行末端氨基的HCl盐的脱盐操作。接着，用无水硫酸镁脱水，通过硅藻土过滤去除硫酸镁，由此得到化合物4。
接着，将含氨基化合物4作为引发剂，将丙交酯5供给于聚合反应，由此进行PLLA链的合成，得到化合物6。将化合物6的残留保护基即Cbz基用HBr-AcOH脱保护，同时将PLLA末端的羟基用乙酰基保护起来。将化合物7中的3个氨基作为引发剂，将肌氨酸-NCA供给于N-羧基酸酐聚合反应，由此进行PS链的合成，得到化合物8。进而，向化合物8中加入乙醇酸、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)及N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)，导入羧基，得到支化型两亲性嵌段聚合物9。需要说明的是，式中省略聚合数的表示。
具体的合成顺序如以下所述。
[化合物6]
在溶解有引发剂4(485mg，0.61mmol)的DMF溶液(2mL)中加入相对于引发剂为15当量(1.32g，9.2mmol)的L-丙交酯(5)和DMAP(75mg，0.61mmol)后，在氩气气氛中，在55℃下搅拌一夜(约15小时)。通过减压蒸馏去除在一定程度上去除作为反应溶剂的DMF，浓缩后，滴加到冷MeOH中。将所得白色沉淀通过离心分离来回收，由此得到化合物6。
[化合物7]
使化合物6溶解于10mL二氯甲烷，将反应溶液冷却至0℃后，加入20mL25％HBr-AcOH。在室温下搅拌一夜后，减压蒸馏去除溶剂，对所得白色沉淀进行NMR测定来确认Cbz基的脱保护结束。
通过使所得白色沉淀溶解于氯仿，用1N NaOH水溶液进行分液操作，由此进行末端氨基的HBr盐的脱盐操作。接着，用无水硫酸镁脱水，利用硅藻土过滤去除硫酸镁，由此得到化合物7。
[化合物8和9]
将化合物7作为微引发剂(microinitiator)，进行亲水性部位的聚合反应。向化合物7的DMF溶液中加入相对于引发剂为40或60当量的Sar-NCA后，进行调节使Sar-NCA浓度为0.50M。在室温下搅拌24小时得到化合物8后，分别加入乙醇酸和HATU及DIEA，进一步搅拌24小时。反应结束后，使用尺寸排阻色谱(Sephadex LH20，洗脱液：DMF)将浓缩得到的反应溶液纯化，得到目标两亲性嵌段聚合物9。
将所得两亲性嵌段聚合物9的1H NMR测定结果示于图1。根据图1，测定了该合成中得到的支化型两亲性嵌段聚合物的组成为：PLLA链为30个乳酸单元，每一条PSar链中的肌氨酸单元为34个。该两亲性嵌段聚合物表示为PLLA30-(Psar34)3。其中，为平均聚合度。
[合成例2：Z聚L-乳酸(Z-PLLA)的合成]
使用L-丙交酯(11)与N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐(12)，合成了Z聚L-乳酸(Z-PLLA)。
向作为聚合引发剂的N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐(12)(400mg,2.06mmol)中添加使辛酸锡(22.25mg)在甲苯(1.0mL)中扩散而成的溶液。将甲苯减压蒸馏去除后，添加L-丙交酯(11)(4.45g,30.9mmol)，在Ar气氛下，在120℃进行聚合反应。8小时后，将反应容器空气冷却至室温。将得到的黄白色固体溶解于少量的二甲基甲酰胺(10mL左右)，用LH20柱进行纯化。回收270nm具有吸收的级分并浓缩，将浓缩液溶解于氯仿。通过将氯仿溶液滴加到冷甲醇(100mL)中而得到白色沉淀。得到的白色沉淀通过离心分离来回收，并进行减压干燥，从而得到Z聚L-乳酸Z-PLLA30。
[合成例3：Z聚D-乳酸(Z-PDLA)的合成]
除了用D-丙交酯(10)来代替L-丙交酯(11)以外，通过与上述Z-PLLA的合成相同的方法，得到Z聚D-乳酸(Z-PDLA30)。
[合成例4：氨基化聚L-乳酸(a-PLLA)的合成]
使用L-丙交酯(11)与N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐(12)，合成了氨基化聚L-乳酸(a-PLLA)。
向作为聚合引发剂的N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐(12)(310mg，1.60mmol)中加入使辛酸锡(6.91mg)在甲苯(1.0mL)中扩散而成的溶液。减压蒸馏去除甲苯后，加入L-丙交酯(11)(3.45g，24mmol)，在Ar气氛下，在120℃下进行聚合反应。12小时后，将反应容器空气冷却至室温。使所得黄白色固体溶解于少量氯仿(10mL左右)。通过将氯仿滴加到冷甲醇(100mL)中而得到白色沉淀。所得白色沉淀通过离心分离来回收，并进行减压干燥。
向所得白色沉淀(500mg)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入25v/v％溴化氢/乙酸(2.0mL)，在遮光、干燥空气条件下搅拌2小时。反应结束后，将反应溶液滴加到冷甲醇(100mL)中，通过离心分离回收析出的沉淀。使所得白色沉淀溶解于氯仿后，用饱和NaHCO3水溶液清洗，用无水MgSO4进行脱水操作。通过硅藻土(R)过滤去除MgSO4后，进行真空干燥，由此得到白色的无定形状粉末的a-PLLA(440mg)。需要说明的是，乳酸单元数为平均聚合度。
[合成例5：ICG标记聚L-乳酸(ICG-PLLA)的合成]
对氨基化聚L-乳酸(a-PLLA)进行ICG标记，得到ICG标记聚L-乳酸(ICG-PLLA)。具体地说，在含有1.9mg(1.0eq)a-PLLA的DMF溶液中添加溶有1mg(1.3eq)吲哚菁绿衍生物(ICG-sulfo-OSu)的DMF溶液，在室温下搅拌约20小时。之后，减压蒸馏去除溶剂，用LH20柱进行纯化，得到ICG标记聚L-乳酸ICG-PLLA。
[合成例6：氨基化聚D-乳酸(a-PDLA)的合成]
除了用D-丙交酯来代替合成例4中的L-丙交酯(11)以外，与合成例4进行同样的操作，合成了氨基化聚D-乳酸(a-PDLA)。
[合成例7：ICG标记聚D-乳酸(ICG-PDLA)的合成]
除了用氨基化聚D-乳酸(a-PDLA)来代替合成例5中的氨基化聚L-乳酸(a-PLLA)以外，与合成例5进行同样的操作，得到ICG标记聚D-乳酸ICG-PDLA。
[合成例8：氨基化聚DL-乳酸(a-PDLLA)的合成]
除了用DL-丙交酯(内消旋丙交酯)来代替合成例4中的L-丙交酯(11)以外，与合成例4进行同样的操作，合成了氨基化聚DL-乳酸(a-PDLLA)。
[合成例9：ICG标记聚DL-乳酸(ICG-PDLLA)的合成]
除了用氨基化聚DL-乳酸(a-PDLLA)来代替合成例5中的氨基化聚L-乳酸(a-PLLA)以外，与合成例5进行相同的操作，得到ICG标记聚DL-乳酸ICG-PDLLA。
[实验例1：分子聚集体Lactosome的制备法]
作为支化型两亲性嵌段聚合物，使用了PLLA链为30个乳酸单元、平均每条Psar链中的肌氨酸单元为23个的聚合物[PLLA30-(Psar23)3]。
在玻璃试管中称量PLLA30-(Psar23)3(MW＝7405)2～3mg，溶解于0.5ml氯仿，将溶剂在减压下蒸馏去除，使玻璃壁表面上形成薄膜。向得到的薄膜加入超纯水2ml，在85℃的热水浴中进行20分钟的加热处理，从而进行颗粒化。由此，得到仅由支化型两亲性嵌段聚合物PLLA30-(Psar23)3形成的Lactosome颗粒的分散液。
[实验例2：由添加聚乳酸引起的Lactosome的粒径变化]
除了与支化型两亲性嵌段聚合物PLLA30-(Psar23)3一起将规定量的Z聚L-乳酸(Z-PLLA30)或Z聚D-乳酸(Z-PDLA30)溶解在氯仿中以外，进行与上述实验例1同样的颗粒化。由此，得到各立体化学不同的Z聚乳酸添加Lactosome颗粒的分散液。
相对于支化型两亲性嵌段聚合物PLLA30-(Psar23)3，将Z聚L-乳酸(Z-PLLA30)的添加量分别设为0、15、25、50、75、100、125或150mol％。使用动态光散射测定装置(Malvern Instruments公司制造，Zetasizer Nano)，通过动态光散射法(DLS)测定所得到的各Lactosome颗粒的粒径。在图2中示出所得Lactosome颗粒的粒径。图2中，纵轴表示粒径[(直径(nm)]，横轴表示Z-PLLA30的添加量(mol％)。相对于PLLA30-(Psar23)3，添加具有相同立体化学的Z-PLLA30时，随着添加量的增大，粒径也变大。Z-PLLA30的添加量超过100mol％时，粒径变得超过30nm。
相对于支化型两亲性嵌段聚合物PLLA30-(Psar23)3，将Z聚D-乳酸(Z-PDLA30)的添加量设为0、2.5、5、10、15、20mol％。在图3中示出所得Lactosome颗粒的粒径。图3中，纵轴表示粒径[(直径(nm)]，横轴表示Z-PDLA30的添加量(mol％)。相对于PLLA30-(Psar23)3，即使将具有不同立体化学的Z-PDLA30添加至20mol％，随着添加量的增大，粒径也不过变大至23nm为止。如此可知维持了较小的粒径。
[实验例3：利用添加ICG标记聚乳酸而进行的Lactosome的体内动态评价]
除了与支化型两亲性嵌段聚合物PLLA30-(Psar23)3一起将相对于PLLA30-(Psar23)3为1.5mol％的上述各ICG标记聚乳酸(ICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLA)溶解在氯仿中以外，进行与上述实验例1同样的颗粒化。所得Lactosome分散液通过凝胶过滤(PD-10柱，GE healthcare)置换为生理盐水。由此，制备了立体化学不同的各ICG标记聚乳酸内含Lactosome颗粒的分散液。任意的Lactosome颗粒的粒径均为22nm。
使用本实验例所得到的各ICG标记聚乳酸内含Lactosome颗粒，进行荷瘤小鼠(右下肢，皮下移植)的活体(in vivo)荧光成像。
动物使用7周龄的Balb/c nu/nu小鼠(CLEA)，将人类胰腺癌细胞(Suit2)以5×105个/0.02ml皮下移植到小鼠的右下肢。在2周后癌组织成长到3～7mm时，将小鼠供给于下述造影试验。
用异氟烷麻酔上述荷瘤小鼠，对每只荷瘤小鼠给药以ICG浓度计0.2nmol的各ICG标记聚乳酸(ICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLA)内含Lactosome颗粒，经时地观察ICG的荧光强度。摄影从5个方向、即从小鼠的左腹、左体侧、背侧、右体侧以及右腹的全部的方向对全身进行。荧光剂在785nm激发，经时地测定845nm附近的荧光。
将其结果所得的图像示于图4中。图像从上到下依次表示自ICG标记Lactosome给药后1小时至168小时后的测定结果，从左到右依次表示相对于Lactosome分别内含ICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLA的ICG标记Lactosome的测定结果。图4中，以色调的变化表示荧光强度的差别(强弱)。
从测定的结果观察到全部的ICG标记Lactosome向右下肢的肿瘤的集聚。将分析肿瘤(Tumor)、背部(Background)以及肝脏(Liver)的荧光强度(Fluorescence intensity)的经时变化而得到的结果示于图5、6、7中。各图中，纵轴表示荧光强度(Fluorescence intensity)，横轴表示时间(时间(小时))。关于向肿瘤的集聚最大的时间，内含ICG-PLLA或ICG-PDLLA的情况为给药9小时后，另一方面，内含ICG-PDLA的情况下，向肿瘤的集聚最大的时间为24小时后。根据该结果，可以认为，内含ICG-PDLA的情况下，在肿瘤的保持时间变长。另外，背景的荧光强度在自给药2小时后至48小时后的期间内内含ICG-PDLLA的情况下的荧光强度低于内含ICG-PLLA或ICG-PDLA的情况，肝脏的荧光强度在自给药6小时后至168小时后的期间内同样地内含ICG-PDLLA的情况下的荧光强度较低。根据该结果，可以认为，内含ICG-PDLLA的情况下，向体外的排泄速度变快。ICG-PDLLA适合于短时间内的成像。
将分析肿瘤与背景的荧光强度比(Tumor/Background)而得到的结果示于图8中。图8中，纵轴表示荧光强度比(肿瘤/背景的荧光强度比；Fluorescenceintensity ratio of Tumor/Background)，横轴表示时间(时间(小时))。根据该结果，ICG标记Lactosome给药24小时后，内含ICG-PDLLA的情况下的T/B值最高为5.9。另外，ICG标记Lactosome给药72小时后，内含ICG-PDLA的情况下的T/B值最高为5.5。内含ICG-PDLA的情况下，结果在较长时间后T/B对比度较高。

Claims (14)

1.一种分子聚集体，其包含支化型两亲性嵌段聚合物A和功能性物质F，所述支化型两亲性嵌段聚合物A具有包含肌氨酸的支化的亲水性嵌段和具有聚乳酸链的疏水性嵌段，所述功能性物质F具有功能性部位和聚乳酸链，
构成所述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由L-乳酸单元构成、所述功能性物质F中包含的聚乳酸链由D-乳酸单元构成，或者，
构成所述两亲性嵌段聚合物A的疏水性嵌段的聚乳酸链由D-乳酸单元构成、所述功能性物质F中包含的聚乳酸链由L-乳酸单元构成。
2.根据权利要求1所述的分子聚集体，其中，所述亲水性嵌段中包含的肌氨酸单元的总计为2～200个。
3.根据权利要求1或2所述的分子聚集体，其中，所述亲水性嵌段的支链数为3。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分子聚集体，其中，构成聚乳酸链的乳酸单元为10～400个，所述聚乳酸链为构成所述疏水性嵌段的聚乳酸链。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的分子聚集体，其中，所述疏水性嵌段未支化。
6.根据权利要求5所述的分子聚集体，其中，所述多个亲水性嵌段从所述疏水性嵌段中的包含所述聚乳酸链的分子链中的1个碳原子支化。
7.根据权利要求6所述的分子聚集体，其中，所述两亲性嵌段聚合物A具有下述式(I)所示的结构：
式中，n1、n2以及n3表示它们的总和为3～200的数，m表示15～60的数，R表示氢原子或有机基团。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的分子聚集体，其中，在所述两亲性嵌段聚合物A中，所述亲水性嵌段中包含的肌氨酸单元数的总和与所述疏水性嵌段中包含乳酸单元数的总和之比为0.05以上且不足1.8。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的分子聚集体，其中，所述功能性物质F中的功能性部位为选自由信号剂和药剂组成的组中的部位。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的分子聚集体，其中，以所述两亲性嵌段聚合物A为基准，以20mol％以下的量包含所述功能性物质F。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的分子聚集体，其粒径为10～30nm。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备在有机溶剂中包含所述支化型两亲性嵌段聚合物A和所述功能性物质F的溶液的工序；
从所述溶液中去除所述有机溶剂，在所述容器的内壁上得到包含所述支化型两亲性嵌段聚合物A和所述功能性物质F的薄膜的工序；以及
向所述容器中加入水或者水溶液，进行超声波处理，将所述薄膜转化为分子聚集体，得到分子聚集体的分散液的工序。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的分子聚集体，其是通过包括以下工序的制备方法而得到的：
在容器中准备在有机溶剂中包含所述支化型两亲性嵌段聚合物A和所述功能性物质F的溶液的工序；
使所述溶液在水或水溶液中分散的工序；以及
去除所述有机溶剂的工序。
14.一种药剂输送系统，其包括：将权利要求1～13中任一项所述的分子聚集体作为分子探针向非人动物体内给药。
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