CN110234753A - 细胞培养用凝胶组合物及其制造方法、细胞培养方法以及细胞培养用基板 - Google Patents

细胞培养用凝胶组合物及其制造方法、细胞培养方法以及细胞培养用基板 Download PDF

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Abstract

凝胶组合物含有具有亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物。通过将两亲性嵌段聚合物与有机溶剂混合，从而得到有机凝胶，通过从有机凝胶中去除有机溶剂，从而形成干凝胶。通过将干凝胶与水或水溶液混合而形成水凝胶。也可以通过在干凝胶中混合细胞培养液等包含培养对象的细胞的水溶液，从而形成内含细胞的水凝胶。

Description

细胞培养用凝胶组合物及其制造方法、细胞培养方法以及细 胞培养用基板
技术领域
本发明涉及动植物的细胞培养所使用的凝胶组合物及其制造方法、以及细胞培养方法。
动植物的细胞培养中广泛使用聚苯乙烯制的培养板。细胞借助吸附于板表面的粘接分子、细胞自身分泌的粘接分子而粘接在板上。在细胞表面存在与这些粘接分子结合的受体，借助该受体来输入用于维持细胞的生存、促进增殖的信号。
在再生医学中将细胞向生物体中移植的情况下，必须使细胞的功能提高至接近生物体的状态。然而，板上的二维培养往往构建具有不完整功能的细胞。与在板上单层培养细胞的二维培养相对地，开发了具有纵向厚度地培养细胞的三维培养技术。三维培养中，细胞在多方向上相互作用，更准确地模拟体内(in vivo)的状态，因此显然细胞容易表现出原本的功能。
三维培养技术中，使用用于三维培养细胞的支架基材(三维支架)。专利文献1中提出了以聚苯乙烯、聚乙烯等聚合物材料形成的三维多孔支柱作为三维支架的三维培养技术。
使用水凝胶作为三维培养基质的技术也已投入实用。基于动物来源的细胞外基质(ECM)的水凝胶以“Matrigel”的商品名销售，有关于使用Matrigel的三维培养的许多报道。专利文献2中公开了利用通过具有特定序列的肽的自组装而形成的水凝胶作为三维培养基材的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/101001号小册子
专利文献2：WO2007/059491号小册子
发明内容
发明要解决的问题
由微小结构体构成的三维支架难以处理，很难说适合于大量培养。另外，由于材料不具有生物降解性，因此不适于向生物体内移植，培养后的细胞的回收也不容易。Matrigel等基于动物来源的ECM的水凝胶在批次间存在偏差，在包含动物来源的增殖因子等的情况下有可能对细胞的增殖造成影响。因此，从品质稳定性、安全性等观点出发，基于动物来源的ECM的水凝胶缺乏在以向生物体移植为目的的再生医学等中应用的可行性，用途被限定于体外(invitro)的实验用。
专利文献2等中公开的基于合成肽的水凝胶在批次间的差异较少，也不存在由动物性蛋白质造成的不良影响。该水凝胶通过pH、离子强度、温度等的变化而分解，因此能够回收以水凝胶为支架而培养的细胞。然而，以在细胞培养时不分解、向生物体移植时分解的方式制备凝胶并不容易，有时培养细胞的回收伴有困难。另外，凝胶容易变形，因此必须冷藏或冷冻保管直至使用时为止，管理复杂。
如上所述，现有的三维培养基材大多存在由批次间偏差导致的不稳定性、缺乏生物降解性、培养细胞的回收困难、培养基材的保管复杂等问题。鉴于此，本发明的目的在于提供能用作三维培养基材的新型的细胞培养用凝胶组合物。
用于解决问题的方案
本发明人等发现，基于两亲性嵌段聚合物的凝胶组合物作为三维培养基材具有优异的特性。本发明涉及具备具有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段聚合物的细胞培养用凝胶组合物及其制造方法、以及使用凝胶组合物的细胞培养方法。
作为两亲性嵌段聚合物，例如可列举出亲水性嵌段具有20个以上的肌氨酸单元、且疏水性嵌段链具有10个以上的乳酸单元的聚肌氨酸-聚乳酸嵌段聚合物。
本发明的凝胶组合物可以为实质上不含分散介质的干凝胶，也可以为含有水作为分散介质的水凝胶。通过将两亲性嵌段聚合物与有机溶剂混合，从而得到有机凝胶，通过从有机凝胶中去除有机溶剂，从而形成干凝胶。作为有机溶剂，例如使用碳数1～6的醇。通过将干凝胶与水或水溶液混合，从而形成水凝胶。水凝胶优选含有10重量％以上的两亲性嵌段聚合物。
也可以通过在干凝胶中混合细胞培养液等包含培养对象的细胞的水溶液，从而形成内含细胞的水凝胶。例如，可以通过在孔板等细胞培养用基板上从有机凝胶中去除有机溶剂，从而形成干凝胶，通过在形成有干凝胶的培养用基板上添加包含细胞的水溶液，从而形成内含细胞的水凝胶。在基板上具备干凝胶的细胞培养用基板能够在室温下保管，通过现用现制备而在干凝胶上加入水或水溶液，从而得到水凝胶。
水凝胶中培养后的细胞可以通过添加水或水溶液而使凝胶溶解来回收，也可以在细胞内含于水凝胶的状态下直接向生物体中移植。
发明的效果
本发明的凝胶组合物基于具有生物降解性的合成聚合物，因此品质稳定性优异。本发明的凝胶组合物能够保持为不含溶剂(分散介质)的干凝胶的形态，能够在常温下保管。通过在使用时添加细胞培养液等，能够现用现制备成为细胞培养的支架的水凝胶，因此容易处理。细胞培养后，通过添加水溶液等来调整浓度，从而使凝胶分解，因此培养后的细胞的取出也容易。本发明的凝胶组合物作为三维细胞培养的支架物质是有用的。
附图说明
图1为实验例1-2的显微镜观察照片。
图2为使用由Psar-PLLA构成的水凝胶培养的细胞的z方向的显微镜观察照片。
图3为实验例1-3中的CYP3A4基因表达量的测定结果。
图4为实验例2的显微镜观察照片。
图5为实验例2中的CYP3A4基因表达量的测定结果。
具体实施方式
本发明的凝胶组合物包含具有亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物。通过将两亲性聚合物与醇等有机溶剂混合，从而得到有机凝胶，通过从有机凝胶中去除作为分散介质的有机溶剂，从而得到干凝胶。通过将干凝胶与水或水溶液混合，从而得到水凝胶。
[两亲性嵌段聚合物]
本发明的凝胶组合物是以具有亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物作为主要构成要素的组合物。作为亲水性嵌段链的单体单元，可列举出环氧烷、肌氨酸等。作为疏水性嵌段链的单体单元，可列举出乙醇酸、乳酸、羟基异丁酸等羟基酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸甲酯、谷氨酸苄酯、天冬氨酸甲酯、天冬氨酸乙酯、天冬氨酸苄酯等疏水性氨基酸或氨基酸衍生物。
上述例示的两亲性嵌段聚合物中，亲水性嵌段链具有肌氨酸单元、且疏水性嵌段链具有乳酸单元的两亲性嵌段聚合物容易形成适于细胞培养的凝胶。
(疏水性嵌段链)
疏水性嵌段链优选包含10个以上的乳酸单元。聚乳酸具有优异的生物相容性和稳定性。另外，聚乳酸具有优异的生物降解性，因此代谢快，在生物体内的积聚性低。因此，以聚乳酸为构成嵌段的两亲性聚合物在向生物体、尤其是人体的应用中有用。另外，聚乳酸为结晶性，因此即使在疏水性嵌段链短的情况下，在醇等的溶剂中疏水性嵌段链也发生聚集，容易形成物理凝胶。
疏水性嵌段链中的乳酸单元数的上限没有特别限制，从使结构稳定化的观点出发，优选为1000个以下。疏水性嵌段中的乳酸单元数优选为10～1000个、更优选为15～500个、进一步优选为20～100个。
构成疏水性嵌段链的乳酸单元可以为L-乳酸，也可以为D-乳酸。另外，也可以混合存在有L-乳酸和D-乳酸。疏水性嵌段链可以是全部乳酸单元连续，也可以是乳酸单元不连续。疏水性嵌段链中所含的乳酸以外的单体单元没有特别限定，例如可列举出乙醇酸、羟基异丁酸等羟基酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸甲酯、谷氨酸苄酯、天冬氨酸甲酯、天冬氨酸乙酯、天冬氨酸苄酯等疏水性氨基酸或氨基酸衍生物。
(亲水性嵌段链)
亲水性嵌段链优选包含20个以上的肌氨酸单元(N-甲基甘氨酸单元)。肌氨酸的水溶性高。另外，聚肌氨酸由于具有N取代的酰胺，因此能够顺反异构化，并且，由于α碳周围的位阻少，因此具有高柔软性。因此，通过使用聚肌氨酸链作为构成单元，可形成兼具高亲水性和柔软性的亲水性嵌段链。
亲水性嵌段链的肌氨酸单元为20个以上时，相邻存在的嵌段聚合物的亲水性嵌段彼此容易聚集，因此变得容易形成吸收有水、醇等亲水性的分散介质的凝胶。亲水性嵌段链中的肌氨酸单元数的上限没有特别限制。从使相邻存在的嵌段聚合物的两亲性聚合物的疏水性嵌段彼此聚集而使凝胶的结构稳定化的观点出发，亲水性嵌段链中的肌氨酸单元数优选为300个以下。肌氨酸单元数更优选为25～200个、进一步优选为30～150个。
亲水性嵌段链可以是全部肌氨酸单元连续，在不损害上述聚肌氨酸的特性的范围内，肌氨酸单元也可以不连续。亲水性嵌段链具有肌氨酸以外的单体单元的情况下，肌氨酸以外的单体单元没有特别限定，例如可列举出亲水性氨基酸或氨基酸衍生物。氨基酸包括α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸，优选为α-氨基酸。作为亲水性的α-氨基酸，可列举出丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等。另外，亲水性嵌段可以具有糖链、聚醚等。亲水性嵌段优选在末端(与疏水性嵌段的连接基团部相反侧的末端)具有羟基等亲水性基团。
(两亲性嵌段聚合物的结构和合成方法)
两亲性聚合物是使亲水性嵌段链与疏水性嵌段链键合而成的。亲水性嵌段链与疏水性嵌段链可以借由连接基团来键合。作为连接基团，优选使用具有可与作为疏水性嵌段链的结构单元的乳酸单体(乳酸、丙交酯)或聚乳酸链键合的官能团(例如，羟基、氨基等)、以及可与作为亲水性嵌段的结构单元的肌氨酸单体(例如肌氨酸、N-羧基肌氨酸酐)或聚肌氨酸键合的官能团(例如氨基)的连接基团。通过适宜选择连接基团，能够控制亲水性嵌段链、疏水性嵌段链的分支结构。
两亲性嵌段聚合物的合成法没有特别限定，可以使用公知的肽合成法、聚酯合成法、缩肽合成法等。详细而言，可以参照WO2009/148121号等来合成两亲性嵌段聚合物。
为了调整凝胶的硬度、稳定性、分解性(溶解性)等，优选调整疏水性嵌段链的链长(乳酸单元数)、疏水性嵌段链与亲水性嵌段链的链长之比(乳酸单元数与肌氨酸单元数之比)。为了容易控制疏水性嵌段链的链长，优选的是，在两亲性嵌段聚合物的合成时，先合成在一端导入有连接基团的疏水性嵌段链(例如聚乳酸)，然后导入亲水性嵌段链(例如聚肌氨酸)。通过调整聚合反应中的引发剂与单体的投料比、反应时间、温度等条件，能够调整疏水性嵌段链和亲水性嵌段链的链长。亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的链长(两亲性嵌段聚合物的分子量)例如可以通过利用1H-NMR来确认。从提高两亲性聚合物的生物降解性的观点出发，重均分子量优选为10000以下、更优选为9000以下。本发明中使用的两亲性聚合物也可以为了促进凝胶形成、提高凝胶稳定性等目的而在分子间形成化学交联。
[凝胶组合物的制备]
通过将上述两亲性聚合物与溶剂混合而得到凝胶。为了形成稳定性高的凝胶，优选的是，将两亲性聚合物与有机溶剂混合来制作有机凝胶，从有机凝胶中去除溶剂来制作实质上不含溶剂的干凝胶。通过在干凝胶中混合水或水溶液，得到适于细胞培养的水凝胶。
作为用于形成有机凝胶的有机溶剂，优选容易溶解两亲性聚合物的亲水性嵌段链、难以溶解疏水性嵌段链的溶剂。例如，对于包含聚乳酸作为疏水性嵌段链、包含聚肌氨酸作为亲水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物，优选使用溶解聚肌氨酸且不溶解聚乳酸的有机溶剂。通过使用这种有机溶剂，在两亲性聚合物与有机溶剂的混合下，两亲性聚合物的疏水嵌段部分聚集，容易形成物理交联的基质。另外，若使用这种有机溶剂来形成有机凝胶，则去除有机溶剂后的干凝胶也容易采取疏水性嵌段部分聚集的结构。因此，可以认为，在使干凝胶与水或水溶液接触时，水容易渗透至亲水性嵌段链部分，变得容易形成维持与有机凝胶同样的聚合物基质结构的水凝胶。
作为有机凝胶的形成中使用的有机溶剂，优选碳数1～6的醇。其中，从亲水性嵌段链的溶解性高、容易通过去除有机溶剂而形成干凝胶的方面出发，优选碳数1～4的醇。作为优选的有机溶剂的具体例，可列举出甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、丁醇、2-丁醇等。
有机溶剂可以混合使用2种以上。可以通过混合使用2种以上有机溶剂来调整疏水性嵌段链、亲水性嵌段链的溶解性。另外，通过在使用溶解性高的有机溶剂将两亲性聚合物溶解后，添加对疏水性嵌段链的溶解性低的有机溶剂，也可以促进由疏水性嵌段的聚集带来的物理交联，形成凝胶的基质。使用2种以上有机溶剂的情况下，优选至少1种为上述醇。也可以使用2种以上的醇。有机溶剂为2种以上有机溶剂的混合溶剂的情况下，优选有机溶剂总量的50重量％以上为上述醇。相对于有机溶剂总量的醇量更优选为60重量％以上、进一步优选为70重量％以上。
两亲性聚合物与有机溶剂之比没有特别限定，根据两亲性聚合物的分子量、有机溶剂的种类等，在能使两亲性聚合物溶解或溶胀的范围内设定即可。从适当保持相邻的两亲性聚合物的距离、抑制凝胶形成的观点出发，有机溶剂的量相对于两亲性聚合物100重量份优选为100～1500重量份、更优选为200～1000重量份。有机凝胶组合物中的两亲性嵌段聚合物的含量优选为10重量％以上。
有机凝胶的形成中，优选的是，在加热下使两亲性聚合物与有机溶剂共存，从而使两亲性嵌段聚合物在有机溶剂中溶解或溶胀，来制备具有流动性的粘性液体。由于通过加热而使聚合物的分子运动活化，因此促进由有机溶剂带来的两亲性聚合物的的溶胀/溶解。加热温度为溶剂的沸点以下的范围即可，例如为50～95℃左右、优选为60～90℃左右。当两亲性嵌段聚合物的溶液或溶胀物冷却而达到胶凝温度以下时，促进疏水性嵌段链形成物理交联，能得到流动性低的(或不具有流动性的)有机凝胶。
通过从有机凝胶中去除作为分散介质的有机溶剂，能得到干凝胶(干燥凝胶)。从有机凝胶中去除有机溶剂的方法没有特别限定，包括：通过与非溶剂接触而使凝胶沉淀的方法、利用氮气等气体的干燥、真空干燥、加热干燥、加热真空干燥、冷冻干燥、超临界干燥等。出于促进有机溶剂的去除等目的，也可以在将有机凝胶粉碎并颗粒化后，进行溶剂的去除。另外，也可以边去除溶剂边粉碎凝胶。
有机溶剂的去除的程度没有特别限定，优选去除溶剂直至成为不具有润湿性的固体状。干凝胶优选实质上不含有分散介质。干凝胶中的分散介质的含量相对于凝胶组合物总量优选为20重量％以下、更优选为10重量％以下、进一步优选为5重量％以下。在由有机凝胶形成干凝胶时，通过充分去除有机溶剂，能够减少由干凝胶形成的水凝胶中的有机溶剂的含量，降低对细胞的毒性，并且提高生物安全性。
通过将干凝胶与水或水溶液混合，能得到水凝胶。将干凝胶与水或水溶液并使其湿润的方法由于容易形成水凝胶、并且能够减少残留有机溶剂，故而优选。另外，在从有机凝胶中去除溶剂而得到的干凝胶中容易维持有机凝胶形成时的物理交联结构，在使干凝胶与水或水溶液接触并使其湿润而成的水凝胶中也容易维持物理交联结构，因此凝胶的稳定性优异。
作为由干凝胶形成水凝胶时使用的水溶液，优选使用注射用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等在生物化学上、在药学上可允许的水溶液。也可以将细胞悬浮液等包含细胞的水溶液添加到干凝胶中来形成水凝胶。使用包含细胞的水溶液而形成的水凝胶可以直接用于细胞培养。此时，能够在凝胶中使细胞分散而无需向凝胶中移植细胞，因此操作性优异。
凝胶组合物中可以包含细胞培养所使用的各种物质。作为细胞培养所使用的物质，可列举出各种的无机盐类、碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸、脂类、蛋白质、肽等。另外，可以在凝胶组合物中含有细胞粘附表位、受体激动剂、受体拮抗剂、配体、细胞外基质成分等。可以利用具有这些功能的官能团修饰两亲性聚合物。凝胶组合物中可以包含防腐剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、渗透压调节剂、等张度剂等。
水凝胶的制备中，两亲性聚合物与水之比没有特别限定，根据两亲性聚合物的分子量、质量等，在能使凝胶润湿的范围内设定即可。从适当保持相邻的两亲性嵌段聚合物的分子间距离、维持凝胶强度的观点出发，水凝胶中的水量相对于两亲性聚合物100重量份优选为50～1500重量份、更优选为100～1000重量份。水凝胶组合物中的两亲性嵌段聚合物的含量优选为10重量％以上。
可以在形成水凝胶后，去除水而形成干凝胶。例如，在凝胶组合物中包含不溶于有机溶剂的物质、容易被有机溶剂分解的物质等的情况下，通过在水凝胶中混合这些物质后，去除水，从而能得到含有这些物质的干凝胶。通过将得到的干凝胶再次用水或水溶液进行湿润，从而能得到水凝胶。
从降低对生物体的毒性、刺激性的观点出发，水凝胶优选有机溶剂的含量尽量少。水在水凝胶的分散介质总体中所占的比例优选为80重量％以上、更优选为90重量％以上、进一步优选为95重量％以上、特别优选为98重量％以上。为了减少有机溶剂的含量，优选提高由有机凝胶形成干凝胶时的有机溶剂的去除率。另外，如上所述，在由有机凝胶形成干凝胶后，通过重复进行水凝胶形成和通过去除分散介质进行的干凝胶形成，也能够减少有机溶剂的含量。
若在孔板等基板上从有机凝胶中去除有机溶剂，则能得到在基板上具备干凝胶的细胞培养用基板。例如，将两亲性聚合物溶解于有机溶剂，在具有流动性的状态下滴加在孔上后去除溶剂即可。另外，也可以在基板上从水凝胶中去除水而形成干凝胶。通过在基板上去除溶剂，成为干凝胶固定于基板表面的状态，因此培养用基板的保管和处理变得容易。通过在形成有干凝胶的培养用基板上添加包含细胞的水溶液，能够形成内含细胞的水凝胶。
干凝胶在室温下也能够保管，不需要通过冷藏、冷冻来管理。因此，在基板上具备干凝胶的细胞培养用基板也能在室温下保管。该形态下，通过现用现制备而在干凝胶上添加水或水溶液，从而得到水凝胶，因此试样的处理容易。另外，若在基板上的干凝胶中添加细胞培养液等包含培养对象的细胞的水溶液，则能得到内含细胞的水凝胶，因此能够期待操作性的飞跃性提高。
[凝胶组合物的用途]
本发明的细胞培养用凝胶组合物能用于各种细胞的培养。本发明的细胞培养方法中，以使成为培养对象的细胞内含在水凝胶中的状态进行细胞培养。作为使细胞内含在水凝胶中的方法，可列举出在水凝胶中注入细胞悬浮液等包含培养对象细胞的溶液的方法。如前所述，可以将干凝胶与细胞悬浮液等包含细胞的水溶液混合，来形成内含细胞的水凝胶。该方法无需向水凝胶中注入细胞的操作，操作性优异。另外，能够使细胞均匀分散于水凝胶中。
细胞的种类没有特别限定，能够应用非人类动物细胞、人类细胞、干细胞、成骨细胞、成纤维细胞等。使用凝胶组合物的细胞培养可以为二维培养和三维培养中的任意者。若利用本发明的凝胶组合物作为三维培养的支架基材，则细胞球体在更接近生物体的环境中生长，能实现培养细胞的高功能化。另外，本发明的凝胶组合物基于生物降解性的合成聚合物，不利用动物来源材料，因此品质稳定性和安全性优异，也能应用于人类等生物体，可期待在包括再生医学在内的细胞培养领域中的应用。
细胞的培养条件没有特别限定，可以应用通常的细胞培养条件。培养后的细胞可以在内含于凝胶组合物的状态下向生物体移植，也可以将凝胶分解并回收培养后的细胞。如上所述，作为凝胶组合物的基础的两亲性嵌段聚合物具有生物降解性，即使在移植到生物体中的情况下也不易表现出毒性。若使用本发明的凝胶组合物，则能够将通过三维培养形成的细胞球体以内含于凝胶中的状态直接向生物体中移植，因此能够期待细胞在生物体内的存活率提高。
关于本发明的凝胶组合物，若两亲性聚合物的浓度降低，则相邻的聚合物间的相互作用减弱，凝胶变得容易分解。若将内含细胞的凝胶组合物移植到生物体内，则因生物体内的水分而使凝胶组合物中的聚合物浓度降低，因此凝胶分解，能够期待促进细胞存活。
在将培养后的细胞回收的情况下，也在凝胶中添加水或水溶液而使浓度降低，从而凝胶容易分解，因此细胞的回收容易。例如，在水凝胶内培养细胞后，将培养基等水分添加到水凝胶中、或者通过移液等将凝胶溶解后，进行离心分离，从而能够回收细胞。
实施例
以下，示出实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限定于这些例子。
[干凝胶的制作]
参照WO2009/148121号中记载的方法，将肌氨酸酐和氨基化聚L-乳酸作为单体成分，使用乙醇酸、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，合成具有由108个肌氨酸单元构成的亲水性嵌段和由32个L-乳酸单元构成的疏水性嵌段的直链状的两亲性嵌段聚合物(PLA32-PSar108)。
在上述得到的聚合物中添加以重量比计为5倍量的乙醇，在70℃下加温，结果聚合物溶解，得到乳白色的溶液。在24孔板的1孔中逐个添加该溶液600mg(聚合物量100mg)，在安全柜内风干一夜来去除溶剂，得到干燥凝胶(干凝胶)。
[实验例1：HePG2细胞的培养]
实验例1中，以上述凝胶物质作为培养基材进行HepG2细胞的培养，进行培养细胞的观察和基因表达量的定量。
[实验例1-1：HepG2培养细胞的RNA的定量]
在上述得到的孔上的干凝胶中、每1孔中添加2.5×104个/500μL的HepG2细胞悬浮液，结果凝胶吸水而得到半透明的水凝胶。作为比较对象，在1孔中装入250μL以自组装肽为构成成分的水凝胶(3D Matrix公司“PuraMatrix”)，每1孔中添加2.5×104个/500μL的HepG2细胞悬浮液。
这些试样在37℃、5％CO2环境下培养，2天后，在由两亲性嵌段聚合物得到的水凝胶的孔和PuraMatrix的孔中分别添加磷酸缓冲生理盐水(PBS)500μL，在孔上通过移液进行混合后，将全部量转移至1.5mL的微型管。进行离心分离，回收沉淀物，用QIAGEN RNeasyKit回收RNA，通过荧光测定(赛默飞世尔科技公司“Qbit”)测定总RNA浓度。对于自培养开始起3天和7天的试样，也通过同样的操作测定总RNA浓度。
由两亲性嵌段聚合物(PSar-PLLA)得到的水凝胶的孔中，2天后、3天后和7天后的RNA浓度分别为5.0ng/μL、11.6ng/μL和92.6ng/μL，随着天数经过而回收RNA量增加。由该结果确认了，本发明的凝胶组合物中细胞增殖。
另一方面，PuraMatrix的孔中，2天后、3天后和7天后的RNA浓度均为检测限以下。可以认为，本发明的凝胶组合物通过与PBS的添加相伴的聚合物浓度降低而使凝胶分解(溶解)，能够回收内含在凝胶中的细胞，而PuraMatrix中即使降低浓度也保持肽的自聚集力，因此凝胶难以分解，无法取出凝胶中的细胞。
[实验例1-2：HepG2培养细胞的观察]
与实验例1-1同样地，在孔上制作两亲性聚合物的干凝胶，添加HepG2细胞悬浮液后，在37℃、5％CO2环境下培养，在2天后和7天后利用倒置型显微镜进行观察。作为比较对象，在相同条件下培养如下试样，利用倒置显微镜进行观察：在1孔中装入250μL基于动物来源的ECM的水凝胶(Corning公司“Matrigel”的10倍稀释液)，在其上添加HepG2细胞悬浮液，从而得到的试样；以及，在聚苯乙烯制的平面培养基板上添加HepG2细胞悬浮液而得到的试样。
将各个试样的自培养开始起2天后和7天后的显微镜观察图像示于图1。平面培养(2D)中，观察到细胞以平面方式逐渐增殖的状况，而在Matrigel上进行培养的试样中，观察到一部分细胞形成块的状况。在两亲性聚合物(PSar-PLLA)的凝胶上进行培养的试样中，在自培养开始起2天后(2天)观察到多个细胞的块(球体)，在7天后(7天)细胞的块变大。在z方向上改变倒置显微镜的观察位置来观察7天后的试样的白箭头所示的细胞，结果如图2所示确认到在凝胶中细胞立体增殖。
[实验例1-3：HepG2培养细胞的CYP3A4基因表达量]
与实验例1-2同样地，利用两亲性聚合物(PSar-PLLA)的凝胶、Matrigel和平面培养基板进行2天的培养后，与实验例1-1同样地通过QIAGEN RNeasyKit回收RNA。按照以下的步骤，调查回收的RNA中的编码CYP3A4的mRNA的表达量。从回收的RNA中采集50ng，通过cDNAReverse Transcription Kit(赛默飞世尔科技公司)进行逆转录，制备cDNA。使用特异性扩增CYP3A4的cDNA的引物和与CYP3A4基因特异性结合的探针，通过TaqManPCR法实施实时PCR。作为内部对照，求出GAPDH的基因表达量，求出相对于GAPDH的mRNA表达量的、CYP3A4的mRNA表达量的相对值。对于两亲性聚合物(PSar-PLLA)的凝胶、Matrigel和平面培养基板分别求出N＝3的平均值。将结果示于图3。
如图3所示，使用两亲性聚合物的凝胶的培养组中，与平面培养组相比，CYP3A4基因的表达提高了约60倍，与使用Matrigel的培养组相比也观察到CYP3A4基因的表达量的提高。
[实验例2：原代培养干细胞的观察和CYP3A4基因表达量]
实验例2中，代替HepG2细胞，将作为肝特异性功能表达模型的、更接近生物体的人类来源的原代培养肝细胞作为培养对象，进行与上述实验例1-2和1-3同样的实验。
与实验例1同样地，在孔上制作两亲性聚合物的干凝胶，每1孔中添加2×105个/500μL的原代培养肝细胞悬浮液，结果凝胶吸水而得到半透明的水凝胶。在37℃、5％CO2环境下培养，在1天后、3天后和7天后，利用倒置型显微镜进行观察。另外，与实验例1-3同样地，从自培养开始起1天后、2天后和3天后的培养细胞中分别提取RNA，求出相对于GAPDH的mRNA表达量的、CYP3A4的mRNA表达量的相对值。
作为比较对象，在相同条件下培养如下样品，进行利用倒置显微镜的观察和基因表达量的定量：在1孔中装入250μL Matrigel的10倍稀释液，在其上添加原代培养肝细胞悬浮液而得到的样品；在市售的三维球体形成用微型板(Corning公司产品编号4515)上添加原代培养肝细胞悬浮液而得到的样品；以及，在聚苯乙烯制的平面培养基板上添加原代培养肝细胞悬浮液而得到的样品。
将实验例2的显微镜观察图像示于图4，将相对于GAPDH的mRNA表达量的、CYP3A4的mRNA表达量的相对值(N＝3的平均值)示于图5。
如图4所示，各培养试样均观察到细胞随着天数经过而增殖的状况。在自培养开始起1天后(1天)，在两亲性聚合物(PSar-PLLA)的凝胶上进行培养的试样观察到200μm以上的球体，而其它培养试样未观察到球体。使用球体形成用微型板(Corning#4515)的试样在自培养开始起3天后(3天)观察到不足100μm的球体，在7天后(7天)球体的尺寸达到100μm以上。在Matrigel上进行培养的试样在自培养开始起7天后观察到细胞粘接于板底面的状况。在两亲性聚合物的凝胶上进行培养的试样在自培养开始起7天后观察到球体分裂的状况。
在图5中，在自培养开始起1天后，4个培养组未见明显差异，但在2天后，使用两亲性聚合物的凝胶的培养组的CYP3A4基因的表达量与平面培养组相比约为5倍、与使用Matrigel的培养组相比约为4.5倍、与使用球体形成用微型板的培养组相比约为7倍，在风险率5％下观察到显著差异。在自培养开始起3天后，使用两亲性聚合物的凝胶的培养组的CYP3A4基因的表达量大致与使用Matrigel的培养组相等。
由以上的结果可知，以两亲性嵌段聚合物为构成要素的凝胶作为各种细胞的三维培养用基材是有用的。可知，以两亲性嵌段聚合物为构成要素的凝胶与以往的三维培养基材相比，细胞在短时间内三维地形成球体，能得到具有与生物体内的细胞同等功能的高功能的培养细胞。

Claims (15)

1.一种细胞培养用凝胶组合物，其含有具有亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用凝胶组合物，其中，所述两亲性嵌段聚合物中，所述亲水性嵌段具有20个以上的肌氨酸单元，所述疏水性嵌段链具有10个以上的乳酸单元。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用凝胶组合物，其为实质上不含分散介质的干凝胶。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养用凝胶组合物，其为含有水作为分散介质的水凝胶。
5.根据权利要求4所述的细胞培养用凝胶组合物，其含有10重量％以上的所述两亲性嵌段聚合物。
6.一种细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其通过将具有亲水性嵌段链和疏水性嵌段链的两亲性嵌段聚合物与有机溶剂混合，从而制备有机凝胶，
通过从所述有机凝胶中去除有机溶剂，从而形成干凝胶。
7.根据权利要求6所述的细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其中，所述有机溶剂包含碳数1～6的醇。
8.根据权利要求6所述的细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其中，通过在细胞培养用基板上从所述有机凝胶中去除有机溶剂，从而在细胞培养用基板上形成所述干凝胶。
9.一种细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其中，通过权利要求6～8中任一项所述的方法形成干凝胶，将所述干凝胶与水或水溶液混合，从而形成水凝胶。
10.根据权利要求9所述的细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其中，所述水溶液包含培养对象的细胞，将所述干凝胶与所述水溶液混合，从而形成内含细胞的水凝胶。
11.根据权利要求6～8中任一项所述的细胞培养用凝胶组合物的制造方法，其中，所述两亲性嵌段聚合物中，所述亲水性嵌段具有20个以上的肌氨酸单元，所述疏水性嵌段链具有10个以上的乳酸单元。
12.一种细胞培养方法，其中，在权利要求4所述的凝胶组合物中培养细胞。
13.一种细胞培养方法，其中，在通过权利要求12所述的方法培养细胞后，在内含细胞的水凝胶中添加水或水溶液，从而将凝胶溶解，回收培养后的细胞。
14.一种细胞培养用基板，其在基板上具备权利要求3所述的干凝胶。
15.根据权利要求14所述的细胞培养用基板，其在所述基板上固定有所述干凝胶。
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