JP5723074B2 - 分岐型両親媒性ブロックポリマーを用いた分子集合体及び薬剤搬送システム - Google Patents
分岐型両親媒性ブロックポリマーを用いた分子集合体及び薬剤搬送システム Download PDFInfo
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Description
(1) サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーA、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質F、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がL−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がD−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がD−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がL−乳酸単位から構成されている、分子集合体。
(7) 前記両親媒性ブロックポリマーAは、下記式(I):
で示される構造を有する、上記(6)に記載の分子集合体。
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記(1)〜(11)のいずれかに記載の分子集合体。
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記(1)〜(11)のいずれかに記載の分子集合体。
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質F、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がL−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がDL−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がD−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がDL−乳酸単位から構成されている、分子集合体。
本発明の両親媒性ブロックポリマーAは、サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、リンカー部を介して結合している。
本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーAの親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロックの全体が、後述の疎水性ブロックとしてのポリ乳酸鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロックが疎水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーAが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
さらに、親水性ブロックは、末端(すなわちリンカー部と反対側の末端)に親水性基(例えば水酸基に代表される)を有していることが好ましい。
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーAが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
両親媒性ブロックポリマーAにおいて、サルコシン単位数(すなわち、親水性ブロックの分岐全てに含まれるサルコシン単位の数の合計)をNSとし、ポリ乳酸単位数(すなわち、疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数、又は、疎水性ブロックが分岐している場合は分岐全てに含まれる乳酸単位数の合計)をNLとすると、それらの比NS/NLは、例えば0.05〜5又は0.05〜4でありうる。
さらに好ましくは、NS/NLは、0.05以上1.8未満、例えば0.05以上1.7以下、0.05以上1.67以下、0.1以上1.7以下、又は0.1以上1.67以下であってよい。
親水性ブロックと疎水性ブロックとを連結するリンカー部位の構造は、化学的に許容可能な構造であれば特に限定されるものではない。
例えば、親水性ブロック側の分枝の数が2である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある1つのN原子から、ポリサルコシン鎖を含む2本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているN原子が、直接的又は間接的に2本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。
親水性ブロック側の分枝の数が3を超える場合は、分枝がさらなる分岐構造を有するように分子設計されることができる。
疎水性ブロック側も分岐している場合についても、上記と同様の観点で分子設計されることができる。
分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成においては、疎水性ブロック部(ポリ乳酸部)の合成、親水性ブロック部(サルコシン部又はポリサルコシン部)の合成、及びそれらブロックを連結するリンカー部の合成がなされる。
例えば、親水性ブロック側分岐数が3である分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合のリンカー試薬は、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)構造を元に調製することができる。
ペプチド合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、N−カルボキシサルコシン無水物(サルコシンNCA)を開環重合することなどによって行うことが好ましい。
ポリエステル合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことが好ましい。
本発明の分子集合体は、機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Fを含んでいる。機能性物質Fは、疎水性化合物であり、分子集合体の疎水コア部に位置することによって分子集合体に内包される。これによって、本発明の分子集合体は、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
機能性物質Fにおける機能性部位は、標識剤(シグナル剤)及び薬剤からなる群から選ばれる部位(基)である。
分子集合体に内包されるべき機能性物質Fは、上記の標識剤(シグナル剤)及び薬剤からなる群から選ばれる部位(基)とポリ乳酸鎖(F−PLA)(基)とが結合されているものである。
[3−1.分子集合体]
本発明の分子集合体(ラクトソーム)は、上記の分岐型両親媒性ポリマーAの凝集により、或いは自己集合的な配向により成り立つ構造体である。本発明は、内側(コア部)が疎水性ブロック、外側(シェル部)が親水性ブロックとなるように構成されたミセル形状の分子集合体であることが実用性の観点から好ましい。本発明の分子集合体は、適切な機能性構造(機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質F)を具備することによって、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
本発明の分子集合体の粒子径は、例えば10〜30nmでありうる。この範囲に含まれる上限値は、28nm、25nm、又は23nmであってもよい。また、下限値は15nmであってもよい。本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーAの鎖長を短く調整することによって、上記範囲の下限値より小さい分子集合体を得ることも可能である。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。本発明の分子集合体は、既に述べたように、両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックの分岐構造により、基本的に、従来のものに比べて粒子径が小さい傾向にある。
分子集合体の作成法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる機能性構造の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
本発明における分岐型両親媒性ブロックポリマーAは低沸点溶媒への溶解性を有するため、フィルム法を用いた分子集合体の調製が可能である。
前記の溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを含むフィルムを得る工程;及び、
前記の容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、フィルム状物質を、分子集合体(機能性物質Fを内包する分子集合体)に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む。さらに、フィルム法は、分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
このような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
インジェクション法は、以下の工程を含む。すなわち、容器(例えば試験管など)中に、分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び機能性物質Fを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程、及び
有機溶媒を除去する工程が行われる。さらに、インジェクション法は、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
[4−1.分子集合体の投与対象]
本発明の薬剤搬送システム及び分子イメージングは、上記の分子集合体を生体内に投与することを含む。分子集合体を投与される生体としては特に限定されないが、ヒト又は非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類(マウス、ラットなど)、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射(針有型、針無型)、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
本発明の分子イメージングにおいては、投与された分子集合体に由来するシグナルを検出する工程を含む。投与された分子集合体を検出することによって、体外から投与ターゲットの様子(特にがんなどの組織の位置・大きさ)を観測することができる。
本実施例においては、1本のポリ乳酸(L−ポリ乳酸;PLLA)鎖に3本のポリサルコシン(PSar)鎖が結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。
具体的な合成手順は以下の通りである。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 1.9 g(0.016 mol)のEtOH溶液(75 mL)にBoc-glycine 2.5 g(0.014 mol)とEEDQ 6.0 g(0.024 mol)とを加え、リフラックス(95℃)しながら4.5時間撹拌した。反応終了後、濾紙で沈殿物を取り除き、EtOHを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、CHCl3/MeOH混合比(v/v)が1/0、40/1、及び10/1のものの順に用いた)。得られた生成物2の重量は3.2 g(0.012 mol)、収率82%であった。
化合物2(278 mg, 1.0 mmol)、Cbz-Sar-OH(804 mg, 3.6 mmol)、DCC(887 mg, 4.3mmol)、及びDMAP(26 mg, 0.21 mmol)の混合物に氷冷したジクロロメタンを10 mL加えた後、室温にて一晩撹拌した。反応終了後、酢酸エチルにて洗浄し、白色沈殿(ウレア)を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、n-ヘキサン/酢酸エチル混合比(v/v)が2/1、1/1、及び1/2のものの順に用いた)。これにより、目的とする化合物3(719 mg)を収率84%で得た。
氷冷した化合物3(710 mg)に4 mol/L HCl/Dioxane(7.0 mL)を加えて溶解させた後、室温で5分撹拌した。その後、反応溶液から溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、CHCl3/MeOH混合比(v/v)が10/0のものを用いた)。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHCl塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物4を得た。
具体的な合成手順は以下の通りである。
開始剤4(485 mg, 0.61 mmol)の溶解したDMF溶液(2 mL)に開始剤に対して15当量(1.32 g, 9.2 mmol)のL-lactide(5)とDMAP(75 mg, 0.61 mmol)とを加えた後、アルゴン雰囲気下中、55℃にて一晩(約15時間)撹拌した。減圧留去によって反応溶媒であるDMFをある程度除去、濃縮した後、冷MeOH中に滴下した。得られた白色沈殿を遠心分離することによって回収することで、化合物6を得た。
化合物6をジクロロメタン10 mLに溶解させ、反応溶液を0 ℃に冷却した後、25% HBr-AcOHを20 mL加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた白色沈殿についてNMR測定を行うことによって、Cbz基の脱保護が完了していることを確認した。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHBr塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物7を得た。
化合物7をマクロイニシエーターとして親水性部位の重合反応を行った。化合物7のDMF溶液に、開始剤に対して40又は60当量のSar-NCAを加えた後、Sar-NCA濃度が0.50 Mとなるように調整した。室温にて24時間撹拌し化合物8を得た後、グリコール酸とHATU及びDIEAとをそれぞれ加え、更に24時間撹拌した。反応終了後、サイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex LH20, 溶離液:DMF)を用いて濃縮した反応溶液を精製し、目的の両親媒性ブロックポリマー9を得た。
L−ラクチド(11)とN−カルボベンゾキシ−1,2−ジアミノエタン塩酸塩(12)とを用いて、ZポリL-乳酸(Z−PLLA)を合成した。
L−ラクチド(11)の代わりに、D−ラクチド(10)を用いたこと以外は、上記Z−PLLAの合成と同じ方法によって、ZポリD−乳酸(Z−PDLA30)を得た。
L−ラクチド(11)とN−カルボベンゾキシ−1,2−ジアミノエタン塩酸塩(12)とを用いて、アミノ化ポリL−乳酸(a−PLLA)を合成した。
アミノ化ポリL−乳酸(a−PLLA)にICG標識を行い、ICG標識ポリL−乳酸(ICG−PLLA)を得た。具体的には、a−PLLAを1.9 mg (1.0 eq)含むDMF溶液に、インドシアニングリーン誘導体(ICG-sulfo-OSu)1mg (1.3 eq)を溶かしたDMF溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、LH20カラムにて精製を行い、ICG標識ポリL−乳酸ICG−PLLAを得た。
合成例4におけるL−ラクチド(11)の代わりにD−ラクチドを用いた以外は合成例4と同様にして、アミノ化ポリD−乳酸(a−PDLA)を合成した。
合成例5におけるアミノ化ポリL−乳酸(a−PLLA)の代わりにアミノ化ポリD−乳酸(a−PDLA)を用いた以外は合成例5と同様にして、ICG標識ポリD−乳酸ICG−PDLAを得た。
合成例4におけるL−ラクチド(11)の代わりにDL−ラクチド(メソラクチド)を用いた以外は合成例4と同様にして、アミノ化ポリDL−乳酸(a−PDLLA)を合成した。
合成例5におけるアミノ化ポリL−乳酸(a−PLLA)の代わりにアミノ化ポリDL−乳酸(a−PDLLA)を用いた以外は合成例5と同様にして、ICG標識ポリDL−乳酸ICG−PDLLAを得た。
分岐型両親媒性ブロックポリマーとして、PLLA鎖が乳酸単位30個、Psar鎖一本あたりのサルコシン単位23個のもの [PLLA30-(Psar23)3] を用いた。
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3と共に、所定量のZポリL−乳酸 (Z−PLLA30) 、又はZポリD−乳酸 (Z−PDLA30) をクロロホルムに溶解した以外は、上記実験例1と同様にして粒子化を行った。このようにして、各立体化学の異なるZポリ乳酸添加ラクトソーム粒子の分散液を得た。
0 mol% 20nm
15 mol% 20nm
25 mol% 21nm
50 mol% 24nm
75 mol% 27nm
100 mol% 30nm
125 mol% 33nm
150 mol% 38nm
0 mol% 17nm
2.5 mol% 18nm
5 mol% 19nm
10 mol% 21nm
15 mol% 22nm
20 mol% 23nm
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3と共に、PLLA30-(Psar23)3に対して1.5mol%の上記各ICG標識ポリ乳酸(ICG−PLLA,ICG−PDLA,ICG−PDLLA)をクロロホルムに溶解した以外は、上記実験例1と同様にして粒子化を行った。得られたラクトソーム分散液はゲルろ過(PD−10カラム、GEヘルスケア)により生理食塩水に置換した。このようにして、立体化学の異なる各ICG標識ポリ乳酸内包ラクトソーム粒子の分散液を調製した。いずれのラクトソーム粒子の粒子径も22nmであった。
Claims (14)
- サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーA、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質F、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がL−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がD−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーAの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がD−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Fに含まれるポリ乳酸鎖がL−乳酸単位から構成されている、分子集合体。 - 前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が2〜200個である、請求項1に記載の分子集合体。
- 前記親水性ブロックの分岐数が3である、請求項1又は2に記載の分子集合体。
- 前記疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖を構成する乳酸単位が10〜400個である、請求項1〜3のいずれかに記載の分子集合体。
- 前記疎水性ブロックは分岐していない、請求項1〜4のいずれかに記載の分子集合体。
- 前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における1つの炭素原子から分岐している、請求項5に記載の分子集合体。
- 前記両親媒性ブロックポリマーAは、下記式(I):
で示される構造を有する、請求項6に記載の分子集合体。 - 前記両親媒性ブロックポリマーAにおいて、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、0.05以上1.8未満である、請求項1〜7のいずれかに記載の分子集合体。
- 前記機能性物質Fにおける機能性部位は、シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる部位である、請求項1〜8のいずれかに記載の分子集合体。
- 前記機能性物質Fは、前記両親媒性ブロックポリマーAを基準として、20mol%以下の量で含まれている、請求項1〜9のいずれかに記載の分子集合体。
- 粒子径が10〜30nmである、請求項1〜10のいずれかに記載の分子集合体。
- 以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項1〜11のいずれかに記載の分子集合体。 - 以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーA及び前記機能性物質Fを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項1〜11のいずれかに記載の分子集合体。 - 請求項1〜13のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送方法。
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