KR102464432B1 - 방출 제어가 가능한 항체 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방출 제어가 가능한 항체 전달체에 관한 것으로, 상기 항체 전달체는 페닐보론산이 결합된 친수성 고분자를 포함하고 친수성 고분자 내 페닐보론산 모이어티가 항체 외부에 노출된 다당류와 페닐보론에스테르 결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 항체 전달체를 활용한 항체 나노복합체는 항체를 외부로부터 효과적으로 보호하고, 종양 또는 염증성 환경과 같은 산성 조건에서 항체를 선별적으로 방출할 수 있으므로, 면역항암요법 또는 염증성 질환 치료용 항체 제제 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

방출 제어가 가능한 항체 전달체{Release-controllable antibody delivery system}
본 발명은 방출 제어가 가능한 항체 전달체에 관한 것이다.
현대 인류의 대표적인 사망 원인으로 꼽히는 난치성 질환인 암을 치료하기 위한 방법으로는 방사선치료 및 항암제 치료가 많이 이용되지만, 암세포 이외의 일부 정상 세포도 공격하는 등 치료 효율이 떨어지고 여러 부작용을 가지고 있다.
이를 해결하기 위해 외부에서 인위적으로 세포 살상 물질을 주입하거나 조사하는 대신 인체 내 면역체계를 활용하는 면역 치료가 주목받고 있다. 일반적인 암세포는 인체의 면역 기작을 회피한다고 알려져 있는데, 예를 들어 암세포의 표면에 발현하는 PD-L1이나 CD80과 같은 단백질은 암세포를 공격하는 T세포의 '면역 체크포인트'작용을 나타내 공격을 억제하도록 설계되어있다. 이러한 면역 체크포인트의 기능을 저해할 수 있도록, 최근 면역 체크포인트와 결합하는 항체를 이용한 치료법인 면역 체크포인트 억제법이 새로운 항암 치료법으로서 대두되고 있다. 이는 면역체계를 이용해 암세포를 직접 공격할 수 있도록 회복시켜 정상세포의 손상을 최소화 할 수 있는 장점을 가지고 있다.
하지만 체내로 투여한 항체의 경우 종양으로 전달되는 효율이 낮고 체외로 빠르게 배출된다는 단점을 가지고 있다. 이를 해결하기 위해 항체를 개질화하거나 인간화하는 방법들이 개발되었으나, 복잡한 합성법과 높은 비용이 요구된다는 단점을 가지고 있다.
따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 항체를 종양으로 전달하는 효율을 높일 수 있는 간단한 방법이 필요하며, 항체의 화학적 개질화 없이 항체 그대로를 전달할 수 있는 지능성 약물 전달 시스템 개발이 필요한 실정이다.
한국 공개특허 제 10-2017-0129463호 한국 공개특허 제 10-2019-0075389호 한국 공개특허 제 10-2019-0081507호
본 발명의 목적은 항체를 보호하고, 산성 조건에서 항체를 선별적으로 방출할 수 있는 항체 전달체 및 고분자-항체 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복잡한 합성 과정 없이 단순 혼합만으로 제조될 수 있는 항체 전달체 및 고분자-항체 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 환경 또는 염증성 환경에서 치료 효과를 개선할 수 있는 항체 제제를 제공하는 것이다.
본 발명자는, 페닐보론산이 결합된 친수성 고분자 형태의 항체 전달체를 제조하고, 상기 항체 전달체가 본 발명의 목적을 효과적으로 달성할 수 있는 고분자-항체 나노복합체로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
일 구현예에서, 본 발명은 페닐보론산이 결합된 친수성 고분자를 포함하고, 상기 친수성 고분자 내 페닐보론산 모이어티는 항체 외부에 노출된 다당류와 페닐보론에스테르 결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 전달체를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 항체와 상술한 항체 전달체를 포함하고, 상기 항체 외부에 노출된 다당류와 상기 항체 전달체 내 페닐보론산 모이어티가 페닐보론에스테르 결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 고분자-항체 나노복합체를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 (i) 친수성 고분자에 페닐보론산을 결합시켜 중합체를 형성하는 단계 및 (ii) 상기 중합체의 페닐보론산 모이어티와 항체 외부에 노출된 다당류 사이에 페닐보론에스테르 결합을 형성하는 단계를 포함하는 고분자-항체 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 상술한 고분자-항체 나노복합체를 포함하는 항체 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 항체 전달체를 활용한 항체 나노복합체는 간편한 공정으로 제조되어 항체를 외부로부터 효과적으로 보호하고, 종양 또는 염증성 환경과 같은 산성 조건에서 항체를 선별적으로 방출할 수 있으므로, 면역항암요법 또는 염증성 질환 치료용 항체 제제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 형성 및 산성 조건에서 항체를 방출하는 반응을 모사한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체 중 고분자의 합성 반응도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체 중 고분자의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 항체:고분자 비율에 따른 복합체의 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 형성을 FRET을 통해 관찰한 형광 분석 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 TEM 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 pH에 따른 방출 거동을 ELISA로 분석한 방출 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체가 소화 효소에 의한 활성 저하를 막는지 여부를 관찰한 형광 현미경 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 세포 독성 평가 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 용혈도 시험 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 종양 축적 정도를 생체 형광 영상으로 촬영하고 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 생체 동역학 결과를 ELISA로 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 종양 억제능을 평가한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자-항체 나노복합체의 투여 후 생쥐의 체중 변화를 평가한 결과이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 발명에 대한 설명 및 도면에서는 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재를 생략할 수 있고, 본 발명을 이해를 돕기 위해 도면 구성의 일부는 과장 또는 생략될 수 있으며, 본 명세서에서 따로 정의하지 않는 용어에 대하여는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해할 수 있는 의미로 해석되어야 할 것이다. 이하, 본 발명을 항체 전달체, 이를 포함하는 고분자-항체 나노복합체 및 이를 활용한 항체 제제로 구분하여 각각 상세히 설명한다.
항체 전달체
본 발명의 일 구현예는 페닐보론산(phenylboronic acid, PBA)이 결합된 친수성 고분자를 포함하는 항체 전달체이다. 상기 친수성 고분자 내 페닐보론산 모이어티가 항체 외부에 노출된 다당류와 페닐보론에스테르 결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 페닐보론산이 결합되는 친수성 고분자는 가수분해 후 수용성이고 석신산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 친수성 고분자는 말레산 무수물 중합체이며, 예컨대 폴리(메틸비닐에테르-말레산 무수물) (Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)이다. 상기 친수성 고분자는 페닐보론산과 공중합체를 형성할 수 있다(도 1).
본 발명에서 페닐보론산이 결합되는 친수성 고분자의 분자량은 2kDa 내지 1000kDa, 구체적으로 10kDa 내지 500kDa, 예컨대 50 내지 100 kDa일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 분자량 80kDa의 친수성 고분자(구체적으로, pMAnh)를 페닐보론산과 결합하여 항체 전달체를 제조하였다 (실시예 1-1; 도 2).
본 발명의 항체 전달체에서, 친수성 고분자가 말레산 무수물 중합체일 경우 페닐보론산 모이어티의 몰 비율은 말레산 무수물 중합체 내 말레산 모이어티 기준으로 20 내지 40%일 수 있으며, 바람직하게는 약 30%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 말레산 무수물 중합체에 말레산 모이어티 기준 약 30%의 페른보론산 모이어티가 결합된 항체 전달체를 제조하였다(실시예 1-1; 도 3).
말레산 무수물 중합체를 친수성 고분자로 사용하는 본 발명의 항체 전달체에서, 말레산 무수물 중합체와 페닐보론산은 아마이드 결합을 통해 연결될 수 있다. 예컨대, 말레산 무수물 중합체와 아미노페닐보론산을 상온에서 반응시켜 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 폴리(메틸비닐에테르-말레산 무수물)(pMAnh)과 3-아미노페닐보론산을 상온에서 자발적 반응을 통해 결합시켜 하기 [화학식 1]의 중합체를 형성하였다.
[화학식 1]
Figure 112020094533099-pat00001
본 발명의 항체 전달체에서, 친수성 고분자에 결합된 페닐보론산은 항체에 노출된 당류의 다이올(diol)과 쉽게 결합할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 항체 전달체는 항체에 담지되어 후술하는 고분자-항체 나노복합체를 형성할 수 있다. 이때 당-페닐보론산 사이에 형성되는 결합인 페닐보론에스테르 결합은 산성 pH에 민감하게 분리되는 성질이 있어 본 발명의 항체-전달체에 pH 감응성을 부여한다. 이에 따라 본 발명의 항체 전달체는 종양 또는 염증 환경과 같은 조직 내 산성 환경에서 항체를 선별적으로 방출하기 위한 전달체로 유용하게 활용될 수 있다.
고분자-항체 나노복합체
본 발명의 일 구현예는 상술한 항체 전달체를 활용한 고분자-항체 나노복합체이다. 상기 나노복합체는 항체 및 상술한 항체 전달체를 포함하고, 상기 항체 외부에 노출된 다당류와 상기 항체 전달체 내 페닐보론산 모이어티가 페닐보론에스테르 결합으로 연결된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항체는 탈당화(deglycosylation) 과정을 거치지 않은 항체인 것이 바람직하다. 상기 항체의 종류는 체내 산성 환경에서 방출됨으로써 치료적 효과를 달성할 수 있는 항체라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-HER2, 항-CD20, 항-EGFR 및 항-VEGF 중에서 선택되는 1종 이상의 면역항암요법용 항체, 및/또는 항-TNF-a, 항-IL-6 및 항-IL-12 중에서 선택되는 1종 이상의 염증질환 치료용 항체일 수 있다.
본 발명의 고분자-항체 나노복합체는 바람직하게는 200 내지 400 nm의 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 고분자-항체 나노복합체가 약 300 nm의 크기로 형성됨을 확인하였다(실시예 1-2). 본 발명의 나노복합체의 특정 크기로 인해 항체를 포함하는 나노복합체가 치료가 필요한 조직(종양 주변 등)에 쉽게 축적될 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 고분자-항체 나노복합체에서, 페닐보론에스테르 결합은 항체 다당류 내 다이올기와 페닐보론산 모이어티 사이에 형성될 수 있다. 여기서 다이올기와 페닐보론산 모이어티의 몰비는 1:20 내지 1:200일 수 있고, 바람직하게는 1:50 내지 1:150일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1:80 내지 1:120일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 고분자-항체 나노복합체의 항체 다이올 당량을 기준으로 말레산 무수물 중합체의 양을 늘려 전달체로서 적합한 나노복합체를 동적광산란 (Dynamic light scattering) 및 형광 공명 에너지 전이 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 분석으로 확보한 결과, 1:100 몰 비율이 가장 바람직하다는 점을 확인하였다(실시예 1-2; 도 4 및 5).
본 발명의 나노복합체는 산성 조건에서 항체가 효과적으로 방출되는 것을 특징으로 한다. 상기 산성 조건은 pH 4.0 내지 6.5일 수 있고, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 6.0일 수 있다. 암 또는 염증이 일어나는 조직 미세환경은 정상 환경보다 산성을 띄는 것을 특징으로 하며, 따라서 본 발명의 나노복합체는 조직 내 산성 환경에서 항체를 선별적으로 방출할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 나노복합체는 나노구조체 상에 강한 음전하를 띄고, 외부 환경으로부터 항체를 효과적으로 보호할 수 있어 생체 동력학이 우수한 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 고분자-항체 나노복합체가 pH 8에서는 구형의 형태로 항체를 방출하지 않는 반면, pH 6의 산성 조건에서는 불규칙한 형태로 붕괴되어 그 안에 담지된 항체를 단기간 내에 대부분 방출한다는 점을 확인하였다(실시예 1-2, 1-3; 도 6, 7). 또한, 본 발명의 고분자-항체 나노복합체는 트립신 처리시 항체 분해를 효과적으로 방지함으로써 체내 투여시 외부 환경으로부터 항체를 보호할 수 있는 높은 안정성을 가짐을 확인하였다(실시예 1-4; 도 8).
본 발명의 나노복합체는 복잡한 합성 과정 없이 반응물의 단순 혼합만으로 제조될 수 있는 장점이 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 고분자-항체 나노복합체는 (i) 친수성 고분자에 페닐보론산을 결합시켜 중합체를 형성하는 단계 및 (ii) 상기 중합체의 페닐보론산 모이어티와 항체 외부에 노출된 다당류 사이에 페닐보론에스테르 결합을 형성하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다. 상기 제조방법은 중합체와 항체간 소수성 상호작용으로 인해 자가조립(self-assembly)으로 형성되는 특징이 있다.
본 발명의 나노복합체는 독성 용매나 촉매와 같은 복잡한 반응 없이 반응물을 혼합하는 것만으로 형성될 수 있어 안전성과 간편성에 대한 수요를 모두 충족시키는 장점이 있다. 또한, 상기 나노복합체는 항체의 개질화 없이 그대로 형성될 수 있어, 항체의 약리적 기능에 부정적인 영향을 미치지 않는 장점이 있다.
항체 제제
본 발명의 일 구현예는 상술한 고분자-항체 나노복합체를 포함하는 항체 제제이다. 상술한 것처럼, 본 발명의 고분자-항체 나노복합체는 중성 조건에서는 항체를 안정적으로 보호하면서 산성 조건에서 항체를 효과적으로 방출하는 특징이 있으므로, 이를 포함하는 항체 제제는 암 또는 염증성 환경과 같은 산성 조건에서 치료용 항체를 효과적으로 방출할 수 있다.
본 발명의 항체 제제는 독성이 낮고 생체 적합도가 우수한 특징이 있다. 본 발명의 일 실시예에서 항체 제제의 독성을 세포 및 동물 모델에서 확인한 결과, 나노복합체를 사용하지 않은 대조군 항체(항-PD-L1 항체)와 동등한 수준으로 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(실시예 2; 도 9, 10).
본 발명의 항체 제제는 종양 또는 염증성 환경과 같이 체내 병태를 나타내는 조직에 효과적으로 축적될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 항체 제제를 종양 유발 동물에 복강 주사한 결과, 나노복합체를 사용하지 않은 대조군 항체(PD-L1항체) 대비 항체의 종양 부위 축적이 월등히 개선됨을 확인하였다(실시예 3-1; 도 11).
본 발명의 항체 제제는 혈액 내 반감기가 개선되어, 표적 조직에 항체를 효과적으로 축적할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 항체 제제를 동물에 복강 주사 후 혈액 내 항체의 양을 정량화한 결과, 대조군 항체(항-PD-L1 항체)에 비해 더 오랜 시간 동안 혈액 내에 순환되어 종양 축적에 유리한 효과를 나타낸다는 점을 확인하였다(실시예 3-1; 도 12).
본 발명의 항체 제제에서 항체의 종류는 체내 산성 환경에서 방출됨으로써 치료적 효과를 달성할 수 있는 항체라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-HER2, 항-CD20, 항-EGFR 및 항-VEGF 중에서 선택되는 1종 이상의 면역항암요법용 항체, 및/또는 항-TNF-a, 항-IL-6 및 항-IL-12 중에서 선택되는 1종 이상의 염증질환 치료용 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 면역항암요법용 항체인 항-PD-L1 항체를 사용한 항체 제제를 종양 유발 동물에 복강 주사한 결과, 나노복합체로 담지되지 않은 대조군 항체 대비 종양 억제 효과가 현저히 개선됨을 확인하였다(실시예 3-2; 도 13).
따라서, 본 발명의 항체 제제는 조직 내 산성 조건(종양 또는 염증성 환경)에서 치료용 항체를 효과적으로 방출함으로써 면역항암요법 또는 염증성 질환 치료용 항체 제제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 예시에 해당하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항체 전달체 및 나노복합체의 제조
실시예 1-1. 페닐보론산(PBA)이 결합된 항체 전달체의 합성
페닐보론산(PBA)이 컨쥬게이션된 고분자를 합성하기 위해 DMSO에 분자량 80 kDa인 폴리(메틸비닐에테르-말레산 무수물)(poly(methyl vinyl ether-maleic anhydride; pMAnh)을 녹이고, 말레산:PBA의 몰비율이 30%가 되도록 3-아미노페닐보론산을 넣어 실온에서 24시간 반응을 진행하였다 (도 2). 잔여 무수산을 분해하기 위해 2 M NaOH을 이용하여 가수분해 시킨 후 투석(MWCO 10 kDa) 및 동결 건조를 통해 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 최종 생성물 pPBA를 얻었다. 최종 생성물인 pPBA 내 PBA의 양을 정량하기 위해 1H NMR을 이용하여 분석한 결과 30% PBA 당량을 확인하였다 (도 3). FRET 분석 및 생체 영상 분석을 위해 FCR675-NH2를 말레산 무수물 대비 1% 당량을 추가한 약물 전달체 또한 제조하였으며, 합성 과정은 상기와 동일하다.
실시예 1-2. 항체가 담지된 나노복합체 형성
항체가 담지된 나노복합체는 pPBA와 항체의 일정 비율 혼합을 통해 수득하였다. 우선 적절한 반응비를 찾고자 문헌상 보고된 항체당 다이올을 기준으로, pPBA 내 PBA의 몰비율을 1:20에서 1:200까지 증가시킨 각 그룹에 대해 DLS를 통해 크기 분포를 확인하였으며 (도 4), 그 결과 [diol]:[PBA] 비율이 1:100일 때 항체에 해당하는 10 nm 수준의 신호가 사라지고 복합체에 해당하는 신호만 나타나는 것을 통해 차후 실험에서 이 조건의 나노복합체를 선택하였다. 이때 해당 조건에서 나노복합체의 크기는 300 nm 부근임을 확인하였다 (도 4).
또한 항체와 PBA사이의 상호작용으로 나노복합체가 형성되는지 여부를 FRET을 이용해 분석하였다. 상기 실시예 1-1과 같이 합성한 Cy5.5에 해당하는 형광체가 달린 pPBA와 Cy5에 해당하는 형광체가 달린 항체를 섞어준 후, Cy5에 해당하는 빛 에너지를 조사하여 Cy5와 Cy5.5의 형광 세기의 변화를 분석하였다 (도 5). 그 결과 PBA의 몰비율이 증가할수록 Cy5에 해당하는 형광 세기는 감소하는 반면, Cy5.5에 해당하는 형광 세기가 증가하는 결과를 통해 FRET이 성공적으로 일어남을 확인하였다.
이러한 몰비율을 기반으로 [diol]:[PBA] 비율이 1:100인 고분자-항체 나노복합체를 형성하였으며, 이의 제조법은 다음과 같다. 우선 0.5 mg/mL 생쥐 PD-L1 항체 (랫트 생산) 10 ㎕와 10 mg/mL pPBA 3.8 ㎕를 섞고, pPBA를 중화하고자 1 M glycine-NaOH 완충용액 (pH 8.5) 5 ㎕를 넣은 후 증류수 31.2 ㎕를 넣어 최종 부피가 50 ㎕인 50 ㎍/mL 당량의 PD-L1 항체 나노복합체를 형성하였다. 이렇게 형성된 나노복합체의 형태를 TEM을 통해 분석한 결과, 제조 조건인 pH 8에서는 구형의 형태를 띄는 반면 pH 6에서는 불규칙하고 붕괴된 형태를 띄는 것을 확인하였다 (도 6).
<실시예 2> 고분자-항체 나노복합체의 pH에 따른 방출 거동 확인
나노복합체의 pH에 따른 항체 방출 거동을 확인하고자 다음과 같은 실험을 설계하였다. 나노복합체의 크기가 약 300 nm임을 이용해, 정해진 시간 간격으로 나노복합체와 방출된 항체를 0.2 ㎛ 필터로 분리한 후 ELISA를 통해 분석하였다. 예상과 같이 약산성 조건인 pH 6에서는 방출된 항체가 단순 항체 용액과 비슷한 수준으로 검출 되는 반면, 나노복합체 생성 조건인 pH 8에서는 거의 검출 되지 않아, 통해 산성 조건에서 항체 방출이 촉진됨을 확인하였다 (도 7).
<실시예 3> 고분자-항체 나노복합체의 안정성 확인
외부 공격으로부터 항체를 보호하는 pPBA의 기능 여부를 확인하고자, 대표적인 소화 효소인 트립신을 처리하여 분해 정도를 측정하였다. 이를 위해 나노복합체와 항체에 항체:트립신 질량비 10:1 수준으로 트립신을 3시간 처리하고, 이후 면역형광법을 이용해 세포 표면에 부착된 정도를 형광현미경으로 분석하였다 (도 8). 그 결과 트립신을 처리한 단순 항체는 효소 작용에 의해 분해되어 낮은 형광 세기를 나타내는 반면, 나노복합체의 경우 형광 세기가 유지되는 결과를 통해 pPBA가 성공적으로 항체를 외부로부터 보호한다는 결과를 확인하였다.
<실시예 4> 고분자-항체 나노복합체의 독성 확인
항암 효과 확인에 앞서 나노복합체 자체의 독성을 확인하고자, 농도에 따른 MC-38 암세포에 대한 독성을 MTT 분석법으로 정량하였다. 우선 MC-38 세포를 96-well 배양 플레이트에 5,000cell/well로 분주하고 하루밤 배양한 후, 배지를 교체하고 pPBA, PD-L1 항체, 또는 나노복합체를 농도별로 처리하여 24시간 후의 생존율을 MTT 분석법으로 정량하였다 (도 9). 그 결과 PD-L1항체 자체는 면역세포가 없는 경우 독성을 나타내지 않아야 하므로 농도에 따른 독성이 나타나지 않았으며, pPBA 또는 나노복합체의 경우에도 80% 이상의 생존율을 보임으로서 우수한 생체 적합도를 확인하였다.
덧붙여 동물 모델에 주사하기에 앞서 급성 독성을 확인하고자 용혈 시험을 진행하였다. 마우스 전혈 채취 후 적혈구를 분리하고, 이를 다시 PBS에 10배 희석하여 적혈구 용액을 확보하였다. 여기에 10 ㎍ 항체 당량에 해당하는 pPBA, 항체, 나노복합체, PBS 및 용혈 완충용액을 섞어 4시간 후 원심분리하여 상층액에 용해된 헤모글로빈을 540 nm 흡광으로 정량하였다. 이때 PBS는 0%, 용혈 완충용액을 100% 용혈도로 계산한 결과, 실험에 사용한 모든 시료에서 유의미한 용혈은 관찰되지 않았다 (도 10).
<실시예 5> 고분자-항체 나노복합체의 생체 분포도 확인
나노복합체의 종양 축적 정도를 생체 형광 이미지를 통해 확인하였다. 우선 암컷 C57BL/6 생쥐의 허벅지에 MC-38 세포를 1x106 cells/mouse로 피하 접종하였다. 종양 부피가 300 mm3에 도달한 후, Cy7 형광체가 달린 PD-L1 항체 (Ab-Cy7) 및 이를 이용한 나노복합체를 50 ㎍ 항체 당량만큼 복강 주사하여 4시간 및 24시간 후에 전신 형광 이미지를 측정하였다 (도 11). 종양 부위의 형광 세기를 기타 조직과 비교한 결과, 나노복합체가 단순 항체에 비해 더 높은 형광 세기를 나타낸 것을 통해 종양 부위로 잘 축적되었음을 확인하였다.
또한 항체와 나노복합체의 혈액 내 순환 정도를 비교하는 실험을 진행하였다. 항체와 나노복합체를 복강 주사 후(50 ㎍ 항체 당량), 10분, 6, 24, 48시간 후 미정맥 채혈하여 혈액 내 항체의 양을 ELISA를 이용해 정량하였다 (도 12). 그 결과 나노복합체가 극초반에는 복강에서 다 흡수되지 않아 낮은 농도를 나타내지만, 결과적으로는 더 오랜 시간 동안 혈액 내에 순환하는 것을 통해 종양 축적에 더 유리한 점을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 고분자-항체 나노복합체의 항암 효과 확인
면역항암제인 PD-L1 항체가 담지된 나노복합체의 항암 효과를 확인하는 실험을 진행하였다. 암컷 C57BL/6 생쥐의 허벅지에 MC-38 세포를 1x106 cells/mouse로 피하 접종하였다. 종양 부피가 70 mm3에 도달한 후, 1) 식염수, 2) 항체, 및 3) 나노복합체를 3일 간격으로 세 차례 복강 주사하였다(50 ㎍ 항체 당량). 이후 2일마다 종양의 크기 및 체중 변화를 측정하고, 이때 종양 부피는 종양 부피 = ab2/2(a는 길이, b는 폭) 공식에 따라 간주하였다 (도 13). 그 결과 항체 투여군에서도 일정 수준의 항암 효과는 보였으나, 나노복합체가 항체에 비해 더 우수한 종양 억제능을 나타냄. 또한 급격한 체중 변화는 없는 것을 통해 나노복합체의 전신 독성은 확인되지 않았다 (도 14).

Claims (16)

  1. 페닐보론산이 결합된 친수성 고분자를 포함하는 항체 전달체로서,
    상기 친수성 고분자 내 페닐보론산 모이어티는 항체 외부에 노출된 다당류와 페닐보론에스테르 결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 항체 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 친수성 고분자는 말레산 무수물 중합체인 항체 전달체.
  3. 제2항에 있어서, 말레산 무수물 중합체에 결합되는 페닐보론산 모이어티의 몰 비율이 말레산 무수물 중합체 내 말레산 모이어티 기준으로 20 내지 40%인 항체 전달체.
  4. 제2항에 있어서, 말레산 무수물 중합체와 페닐보론산은 아마이드 결합을 통해 연결된 것인 항체 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 하기 [화학식 1]의 구조를 가지는 것인 항체 전달체.
    [화학식 1]
    Figure 112020094533099-pat00002

    (상기 화학식 1에서 m은 5 내지 500의 정수이고, n는 10 내지 1000의 정수이다.)
  6. (i) 항체 및
    (ii) 제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항체 전달체
    를 포함하고, 상기 항체 외부에 노출된 다당류와 상기 항체 전달체 내 페닐보론산 모이어티가 페닐보론에스테르 결합으로 연결된 것인, 고분자-항체 나노복합체.
  7. 제6항에 있어서, 150 내지 600nm의 크기를 갖는 나노복합체.
  8. 제6항에 있어서, 페닐보론에스테르 결합은 항체 다당류 내 다이올기와 페닐보론산 모이어티 사이에 형성되고, 여기서 다이올기와 페닐보론산 모이어티의 몰비는 1:20 내지 1:200인 나노복합체.
  9. 제6항에 있어서, 산성 조건에서 항체가 방출되는 것인 나노복합체.
  10. 제9항에 있어서, 산성 조건은 pH 3.5 내지 6.5인 나노복합체.
  11. (i) 친수성 고분자에 페닐보론산을 결합시켜 중합체를 형성하는 단계;
    (ii) 상기 중합체의 페닐보론산 모이어티와 항체 외부에 노출된 다당류 사이에 페닐보론에스테르 결합을 형성하는 단계
    를 포함하는, 제6항의 고분자-항체 나노복합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 중합체와 항체간 반응은 소수성 상호작용으로 인해 자가조립(self-assembly)으로 형성되는 것인 제조방법.
  13. 제6항의 고분자-항체 나노복합체를 포함하는 항체 제제.
  14. 제13항에 있어서, 산성 환경 조직에서 항체를 방출하는 것을 특징으로 하는 항체 제제.
  15. 제14항에 있어서, 항체는 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-HER2, 항-CD20, 항-EGFR 및 항-VEGF 중에서 선택되는 1종 이상의 면역항암요법용 항체인 항암용 항체 제제.
  16. 제14항에 있어서, 항체는 항-TNF-a, 항-IL-6 및 항-IL-12 중에서 선택되는 1종 이상의 염증질환 치료용 항체인 항체 제제.
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