KR102013041B1 - 항암제가 담지된 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암제가 담지된 나노구조체를 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합되어 형성된 중합체(pPBA)에 항암제를 담지한 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명의 나노구조체는 암, 특히 간암에서 종양 증식 억제 효과가 우수하고, 종양 부위로의 약물 전달 효과가 우수하며, 암 세포와 특이적으로 결합하므로 종양 표지자로 기능할 수 있으며, 생체에서 안정적으로 대사되므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

항암제가 담지된 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물 {Pharmaceutical composition comprising a nanostructure carrying an anticancer drug for treating liver cancer}
본 발명은 항암제가 담지된 나노구조체를 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
최근 의학분야에서는 질병의 질단(diagnosis) 및 치료(therapy)를 동시에 수행할 수 있는 나노메디컬시스템(nanomedical system)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이를 질병의 진단 및 치료를 동시에 수행한다는 의미에서 “테라노시스(Theranosis; Therapy+Diagnosis)”라 한다. 질병의 진단분야에 있어서는 단순한 병변에 대한 분석보다는 조기진단의 신뢰도 향상에 대한 필요성이 대두되고 있어, 나노기술이 바이오 및 의료기술과 접목된 다양한 나노메디슨(nanomedicine) 분야가 개발되고 있고, 질병의 치료분야에서는 현재까지 개발된 다양한 합성약물 및 바이오의약품(단백질, 핵산, 세포 등)을 질병부위에 선택적으로 전달함으로써, 부작용을 최소화할 수 있는 맞춤형 전달시스템에 대한 기술개발이 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, 한국 공개특허 제 2012-0089892 호나 제 2001-0010393 호와 같은 특허에서 소수성 약물 전달을 위한 고분자 전달체를 개시하고 있고, 한국 등록특허 제 10-1711127 호에서 암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체를 개시하고 있으나, 아직까지 간암 특이적인 표적 치료제로서의 나노구조체에 대한 개발은 미비한 실정이다.
한편, 페닐보론산(Phenylboronic acid)은 보론산의 R그룹이 벤젠그룹으로 치환된 분자로, cis-diol 혹은 catechol 구조를 가지는 분자와 중성에서 선택적인 가역적 공유결합을 형성할 수 있다. 말레산 무수물 중합체는 amine 이나 hydroxyl과 같은 친핵성 치환 반응을 유도하는 작용기와 손쉽게 반응하여, 다양한 단분자를 고분자의 주사슬에 도입할 수 있는 장점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합되어 형성된 중합체(pPBA)에 항암제를 담지한 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 나노구조체는 암, 특히 간암에서 종양 증식 억제 효과가 우수하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
한국 공개특허 제 2012-0089892 호 한국 공개특허 제 2001-0010393 호 한국 등록특허 제 10-1711127 호
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 항암제가 담지된 나노구조체를 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은 항암제가 담지된 나노구조체, 보다 바람직하게는 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 포함하는 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 타겟 암세포로 항암제를 효율적으로 전달하므로, 암세포 성장 억제 및 치료에 우수한 효과가 있다.
보다 구체적으로, 상기의 고분자는 석신산 무수물 모이어티(moiety)를 포함하고 있는 말레산 무수물 중합체가 바람직하며, 페닐보론산이 석신산 무수물 모이어티와 결합하여 약물 결합 부위를 형성할 수 있다.
본 발명에서 페닐보론산이 결합하는 고분자는 (Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)계열의 고분자가 바람직하나 가수분해 후 수용성이고 석신산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자라면 제한되지 않고 사용할 수 있다.
본 발명에서 페닐보론산이 결합하는 고분자의 분자량은 2kDa 내지 1000kDa, 10kDa 내지 1000kDa, 100kDa 내지 800kDa, 200kDa 내지 600kDa, 200kDa 내지 500kDa, 200kDa 내지 400kDa 바람직하게는 250kDa 내지 350kDa이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 아래 [화학식 1]로 표현되는 폴리 메틸 비닐 에터-알트-말레산 무수물(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)에 페닐보론산이 결합하여 중합체를 합성할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017127587316-pat00001
(n은 20 내지 5000이다.)
본 발명의 일 구체예에 따르면, 말레산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자에 페닐보론산을 결합하기 위해서 아민기가 결합된 아미노 페닐보론산(aminophenyboronic acid)을 사용할 수 있다. 아미노 페닐보론산은 아래 [화학식 2]로 표현되는 3-아미노 페닐보론산이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure 112017127587316-pat00002
아미노 페닐보론산의 아미노기와 고분자에 포함된 말레산 무수물 모이어티가 가수분해를 통한 고리열림 반응(ring opeing)으로 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 [화학식 1]의 말레산 무수물 중합체[화학식 2]의 아미노 페닐보론산의 결합에 의해 [화학식 3]의 폴리 페닐보론산-말레산 무수물 중합체(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)를 약물전달체에 포함되는 중합체로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중합체 합성은 상온에서 다이메틸설폭사이드(dimehyl sulfoxide, DMSO)나 아세톤(acetone)과 같은 용매 내에서 단순히 말레산 무수물 중합체와 아미노 페닐보론산의 혼합을 통해 이루어질 수 있기 때문에 매우 간단하며, 합성 효율도 우수하다.
[화학식 3]
Figure 112017127587316-pat00003
(상기 화학식 3에서 x는 20 내지 5000의 정수이고, y는 20 내지 5000의 정수이다.)
본 발명의 중합체는 페닐보론산이 결합되어 있어 다이올(diol) 또는 카테콜(catechol)을 포함하는 소수성 약물과 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 암이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고, 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되는 것이다. 학문적으로는 신생물(neoplasia)이라고도 불린다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며, 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분하기도 한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 적어도 80 내지 90%가 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 상기에 기술된 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다. 암은 그 발생 부위에 따라 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구분할 수 있다.
본 발명의 항암제가 담지된 나노구조체는 타겟 암세포로 항암제를 효율적으로 전달하여 항암제를 단독으로 투여하는 것보다 암 치료에 현저하며, 특히 간암에서 기타 암에 비하여 암세포의 성장 억제 및 암 치료 효과가 현저하다.
본 발명의 일 구체예에서 항암제란, 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭이다. 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로(代謝經路)에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하거나 항암활성(抗癌活性)을 나타내는 약제이다. 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 6개의 범주로 분류하고 있다.
(1) 알킬화제(alkylating agents): 어떤 화합물에 알킬기 R-CH2를 도입할 능력을 갖춘, 반응성이 대단히 높은 물질로 세포에 작용시키면 대부분은 DNA의 구아닌의 N7과 반응하여 DNA구조를 변형시키고, 사슬절단[鎖切斷]을 일으켜 항암효과 및 세포독효과를 나타낸다. 여기에 속하는 약물로는, ① 나이트로젠머스터드계(系): 나이트로젠 머스타드·클로람부실·멜팔란·사이클로포스파마이드 등 ② 에틸렌이민계: 싸이오테파 ③ 알킬설포네이트계: 부설판 ④ 트라이아진계·하이드라진계: DTIC(다카바진)·프로카바진 ⑤ 나이트로소요소계: BCNU, CCNU, 메틸-CCNU 등이 있다.
(2) 대사길항제(代謝拮抗劑: antimetabolites): 이 군(群)에 속하는 약물은 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 작용을 가진 것으로 ① 엽산유도체: 메소트렉세이트(MTX) ② 퓨린 유도체: 6-메르캅토퓨린(6-MP), 6-싸이오구아닌 ③ 피리미딘 유도체: 5-플루오로우라실, 시타라빈 등이 있다.
(3) 항생물질(抗生物質: antibiotics): 세균에서 생산되는 항생물질 가운데 항암작용을 나타내는 것으로는 아드리아마이신, 다우노루비신, 블레오마이신, 미토마이신-C, 악티노마이신-D 등이 있다.
(4) 유사분열억제제(有絲分裂抑制劑: vinca alkaloid): 이들 약물은 분열시기 특이성 약물로서 유사분열 시기 중 중기(metaphase)에서 세포분열을 중지시킨다. 빈크리스틴, 빈블라스틴, VP-16-213 및 VM-26이 있다.
(5) 호르몬제: 어떤 종류의 암은 호르몬을 투여함으로써 치료효과를 볼 수 있는데, 남성호르몬을 사용하는 경우는 유방암, 여성호르몬은 전립선암, 프로게스테론은 자궁내막암에 효과가 있으며, 부신피질호르몬은 급성림프성 백혈병이나 림프종(腫)의 치료에 사용하고 있고, 유방암에 대해서는 항여성 호르몬제인 타목시펜이 쓰이고 있다.
(6) 기타: 시스플라틴, L-아스파라지네이스, o,p-DDD 등이 있다. 이상과 같이 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 40여 종으로서 각각의 약제마다 그 항암범위에는 큰 차이가 있다.
본 발명의 항암제는 상기의 기재를 포함하는 광범위한 항암제이며, 바람직하게는 유사분열억제제이고, 더욱 바람직하게는 안트라사이클린계 또는 폴리페놀계 항암제이며, 더욱 바람직하게는 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(epirubicin) 또는 올레오루페인(oleuropein)이나, 1,2-cis-diol, 1,3-cis-diol, 및 카테콜(catechol) 모이어티(moiety)로부터 선택된 어느 하나 이상의 작용기(functional group)를 포함하는 약물이라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 특정한 계열에 한정하는 것은 아니다. 여기서, 안트라사이클린계 항암제로는 독소루비신 또는 에피루비신을 예로 들수 있다. 이러한 안트라사이클린계 항암제는 세포 분열에 필요한 RNA나 DNA 등을 손상시켜 세포 분열을 억제하는 방법으로 암세포를 사멸시킨다. 한편, 폴리페놀계 항암제의 예로는 올레오루페인이나, 페닐보론산과 가역적 결합이 가능한 약물이라면, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 항암제는 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체와 가역적 결합이 가능하므로, 외부자극 또는 환경변화를 주어 다른 기관에 영향을 주지 않으면서 간암 조직에 특이적으로 방출될 수 있다.
본 발명에 따르면, 페닐보론산에 소수성 약물이 결합한 고분자 중합체는 페닐보론산 및 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의한 자가-결합(self-assembly)으로 약물을 포함한 100 내지 150nm 크기의 나노구조체를 형성할 수 있다. 약물을 포함한 나노구조체는 산성 조건 및 ATP의 농도 변화에 의해 약물을 효율적으로 종양에 방출할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중성 pH나 저농도의 ATP에서는 적어도 48시간 동안은 나노구조체에서 약물이 거의 방출되지 않는 반면, 약산성 pH 및 고농도 ATP에서는 48시간 이내에 최소 70% 이상의 나노구조체가 해리되어 약물을 방출할 수 있다. 그리고, 나노구조체의 페닐보론산은 종양 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산(N-acetylnuraminic acid)을 특이적으로 인식하여 상호작용할 수 있어, 다른 기관에 영향을 주지 않고 종양 특이적으로 약물을 축적할 수 있다.
본 발명의 나노구조체는 pH 5.0이하, pH 3 내지 5, pH 4 내지 5의 산성 조건 및 10 내지 100 mM의 ATP 농도에서 해리되어 약물을 전달할 수 있다.
본 발명의 나노구조체는 페닐보론산이 결합된 고분자 중합체의 자가 결합으로 형성되어 소수성 약물이 포함되어 있어도 매우 용해도를 가질 수 있다. 일반적으로 소수성 약물은 수용성 용매에서 용해도가 낮아 소수성 약물을 용해하거나, 약물 전달을 위한 캐리어(carrier)에 담지할 때 유기 용매, 계면활성제를 사용한다. 유기 용매나 계면활성제는 소수성 약물을 용해시키는데 유용하나, 혈액적합도가 매우 낮아 적혈구의 용혈(hemolysis)을 유발할 수 있고, 독성 물질로 작용하여 신체 전반에 만성 독성도 유발할 수 있다. 그러나, 본 발명의 중합체는 소수성 약물과 결합하여 수용성 용매에서 쉽게 용해될 수 있어 생체 독성을 유발할 수 있는 용매를 사용하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폴리 메틸 비닐 에터-알트-말레산 무수물에 페닐보론산을 결합한 폴리 페닐보론산-말레산 무수물 중합체(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)로 인하여 소수성 항암제인 독소루비신이 수용성 용매에서도 쉽게 용해될 수 있다. 그리하여, 유기용매나 계면활성제를 사용하지 않아도 소수성 약물이 포함된 나노구조체를 형성할 수 있고, 용혈 현상이 거의 없어 혈액 적합성도 매우 높다.
본 발명의 나노구조체에 포함된 약물과 페닐보론산의 몰비(mole ratio)를 조절하여 약물 전달 효과를 더 상승시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노구조체에서 페닐보론산과 약물의 몰비가 1:1에 근접할수로 포함될수록 종양 특이적인 약물 전달 효과는 감소할 수 있다. 그러나, 나노구조체에 페닐보론산이 약물보다 더 많이 포함되고, 페닐보론산과 약물의 몰비가 변할수록 종양 특이적 약물 전달 효과가 보다 상승할 수 있다. 이는 나노구조체에서 약물과 결합하지 않은 페닐보론산이 증가할수록 종양 세포의 N-아세틸뉴라민산(N-acetylnuraminic acid)과 더 잘 상호작용할 수 있기 때문으로 여겨진다. 그러나, 페닐보론산이 더 많이 포함되는 경우 소수성 상호작용에 의한 나노구조체 형성이 어려울 수 있다.
본 발명의 나노구조체에서 페닐보론산과 약물의 몰비는 1:1 내지 10:1이고, 바람직하게는 1:1 내지 8:1이며, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 6:1이며, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 4:1이며, 더욱 바람직하게는 2:1 내지 4:1이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 약학조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 간암 치료 목적으로 사용되고, 항암제가 담지된 나노구조체인 것이며, 보다 바람직하게는 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여에 적절하도록 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 본 형태는 멸균될 수 있고, 액체일 수 있다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고 그리고 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 액체로 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 본 발명의 유효성분을 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함한다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물에 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함한다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학적 조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 화합물, 또는 폴리머일 수 있다. 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 또한 비경구용 제형은 멸균될 수 있다. 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 항암제가 담지된 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물의 경우, 비경구 투여가 바람직하다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성된 것인 간암 치료용 약학조성물을 제공한다.
이러한 경우에, 상기 항암제는 바람직하게는 1,2-cis-diol, 1,3-cis-diol, 및 카테콜(catechol) 모이어티(moiety)로부터 선택된 어느 하나 이상의 작용기(functional group)를 포함하는 안트라사이클린계 또는 폴리페놀계 항암제인 간암 치료용 약학조성물이고, 보다 바람직하게는 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 및 올레오루페인(oleuropein)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 항암제이다.
상기 간암은 간세포암종과 담관상피암종, 간모세포종, 간내 혈관육종, 및 간내 선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다.
상기의 치료는 암세포의 수적 증가를 억제시키거나, 암세포의 양적 증식을 억제시키거나, 암세포를 사멸시키거나, 암 조직의 크기를 유지시키거나, 암 조직의 크기를 감소시키거나, 암 조직 내의 신생혈관 발달을 억제하거나, 또는 암의 전이를 억제하는 것 중 어느 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 개체에 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 제 1 간암 개체에 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 단독 투여하는 단계; (b) 제 2 간암 개체에 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물과 간암 치료용 후보물질을 병용 투여하는 단계; (c) 제 1 개체와 제 2 개체의 간암 치료 효과를 비교하는 단계; 및 (d) 제 1 개체의 간암 치료 효과보다 제 2 개체의 효과가 좋을 경우, 상기 간암 치료용 후보물질을 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체의 병용 투여용 간암 치료 물질로 판단하는 단계를 포함하는 간암 치료용 병용 투여 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항암제가 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 포함하는 암 표지용 조성물을 제공하고, 상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성된 것인 암 표지용 조성물을 제공하며, 상기 중합체는 형광 프로브로 표지된 것인 암 표지용 조성물을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 항암제가 담지된 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합되어 형성된 중합체에 항암제를 담지한 나노구조체는 암, 특히 간암에서 종양 증식 억제 효과가 우수하고, 종양 부위로의 약물 전달 효과가 우수하며, 암 세포와 특이적으로 결합하므로 종양 표지자로 기능할 수 있으며, 생체에서 안정적으로 대사되므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체(pPBA)의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, pPBA의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, pPBA-DOX 나노구조체의 형성 및 파괴 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 페닐보론산과 독소루비신을 4:1의 몰비율로 포함하는 나노구조체의 투과전자현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 페닐보론산과 독소루비신 몰비에 따른 나노구조체(pPBA-DOX)의 세포 유입 형태를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 간암 세포주에서 pPBA-DOX의 세포독성 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 간암 마우스 모델에서 pPBA-DOX의 생체분포를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 간암 마우스 모델에서 약물 투여 후 40일까지의 종양 부피 및 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 간암 마우스 모델에서 약물 투여 40일 후 종양의 실체를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 간암 마우스 모델에서 약물 투여 40일 후 종양의 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 항암제가 담지된 나노구조체의 제조
실시예 1-1. 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 포함한 약물전달체의 합성
말레산 무수물(maleic anhydrate)로 분자량 80,000인 pMAnh(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride)와 아민기가 결합된 페닐보론산으로 3-아미노페닐보론산 수화물(3-aminophenylboronic acid monohydrate, PBA-NH2)을 준비하였다. 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 도 1과 같은 방법으로 합성하였다. 우선, pMAnh(3.2mmol 숙신산 무수물 포함) 500mg을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 수용액을 준비하였다. 이후, pMAnh를 용해시킨 수용액에 PBA-NH2(1mmol) 160mg을 첨가하고 실온에서 24시간 저어 주었다. 24시간 후, 0.1N NaOH 10㎖를 첨가하여 말레산 무수물 중합체의 미반응한 석신산 무수물 모이어티(moiety)의 가수분해를 촉진하고 반응을 종결하였다. 반응 종료 후, 이틀 간 투석한 후(분획분자량(MWCO = 10,000)) 동결 건조하여 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride))를 얻었다. 수득률은 91%였고, PBA의 컨쥬게이션 비율은 하기 표 1의 방법(1H-NMR)으로 계산하였다. 계산결과 pPBA 에서 PBA의 몰비는 513 반복단위(unit)당 156으로 나타났다. 상기 1H-NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다.
1H NMR (D2O, 300 MHz): 7.7-7.0 (m, Ph, 4xH); 3.8-3.5 (m, -CH-, 1H); 3.5-3.1 (m, -OCH3, 3H); 3.1-2.4 (m, CHCOO, 2H); 2.4-1.4 (m, -CH2-, 2H)
실시예 1-2. 항암제가 담지된 나노구조체 형성
실온에서 DMSO 수용액에 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) 및 약물(항암제)로 독소루비신(Doxorubicin; DOX)를 혼합하였다. 독소루비신과 pPBA의 페닐보론산의 결합을 통해 약물이 로딩되었다. pPBA의 페닐보론산과 독소루비신의 결합과 함께 페닐보론산과 독소루비신의 소수성 상호작용에 의해 pPBA들의 자가 결합이 일어났다. 자가 결합에 의해 독소루비신이 로딩된 나노 구조체가 형성된 것을 확인하였다. 상기 pPBA-DOX 나노구조체의 형성 및 파괴에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다. 나노구조체의 형성은 pPBA의 페닐보론산과 독소루비신의 1,3-디올 사이의 전하 공유, 및 보론산 에스테르 형성에 의해 이루어진다. 산성 pH 환경에서, 나노구조체의 파괴는 보론산 에스테르의 결합력 약화에 의해 유도되고, 그 결과로 독소루비신이 유리된다.
독소루비신 로딩 과정에서 pPBA와 독소루비신 각각의 첨가량을 조절하여, 로딩된 독소루비신의 농도 및 페닐보론산과 독소루비신의 몰비율을 조절할 수 있었다. 250 Mm 독소루비신 DMSO 용액 20㎕에 50 mM pPBA 수용액 100㎕를 첨가한 후, DPBS 880㎕를 첨가하여 독소루비신 최종농도가 5mM이고 페닐보론산과 독소루비신의 몰비율이 1:1인 나노구조체를 합성할 수 있었다. 페닐보론산과 독소루비신을 2:1의 몰비율, 또는 4:1의 몰비율로 포함하는 나노구조체를 100 mM pPBA를 사용한 동일한 방법으로 제조할 수 있었다.
페닐보론산과 독소루비신을 4:1 몰비율의 나노구조체를 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope; TEM, JEM-2210, JEOL)으로 확인하여 약 70nm 정도의 나노구조의 형성을 확인하였다. 이를 도 4에 나타내었다.
실시예 2. in vitro 에서 항암제가 담지된 나노구조체의 효과 확인
실시예 2-1. 항암제가 담지된 나노구조체의 세포 유입 형태 확인
항암제가 담지된 나노구조체의 세포내 흡수(intracellular uptake) 형태를 확인하기 위하여, MCF-7(인간 유방암 세포주) 또는 PC-3(인간 전립선암 세포주) 세포를 12 웰 플레이트에 1 X 105 cell/well로 분주하고 하루동안 배양하였다. 배양 후, 경쟁자 전처리로서 5mmol / L PBA-NH2를 함유하거나(w/) 함유하지 않는(w/o) 무혈청 배지로 30 분간 추가 배양하고, 배지를 페닐보론산과 독소루비신 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-DOX 1:1 complex), 2:1인 나노구조체(pPBA-DOX 2:1 complex), 또는 4:1인 나노구조체(pPBA-DOX 4:1 complex)를 포함하는 배지로 교체하여 4 시간 더 배양하였다. 독소루비신의 농도는 2 μmol/L 가 되도록 동일하게 조절하였다. 세포 내에서 pPBA의 위치를 확인하기 위해서 pPBA의 일부를 FCR648- 표지된 pPBA(FCR648-pPBA)로 대체하였다. 이후, 세포를 DPBS로 세척하고, 4 ℃ 에서 10% 중성 완충 포르말린으로 하루동안 고정시키고, 커버슬립상의 세포를 DAPI(4', 6-dDamamidine-2'-phenylindole dihydrochloride, Vector Labs)가 포함된 봉입제로 봉입하여 공초점 레이저스캐닝현미경으로 633/647 nm 및 488/530 nm 파장에서 관찰하였다. 상기 형광 이미지 결과를 도 5에 나타내었다.
실험 결과, 나노구조체는 세포막을 통과하여 세포질로 유입되며, 독소루비신에 비하여 페닐보론산의 몰비가 높은 나노구조체(예; pPBA-DOX 2:1 complex)의 경우, 나노구조체의 세포유입은 PBA-NH2을 전처리함으로써 조절할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. 항암제가 담지된 나노구조체의 간암 치료 효과 확인
FL83B(ATCC® CRL-2390™, 미국세포주은행), Hepa1-6(ATCC® CRL-1830™, 미국세포주은행), HepG2(ATCC® HB-8065™, 미국세포주은행), Huh7(Huh7, 한국세포주은행), SK-Hep1(ATCC® HTB-52™, 미국세포주은행), 및 HCCLM3(HCCLM3, 한국세포주은행) 세포를 96웰(well) 배양 플레이트에 8 X 103 cell/well로 분주하고 하루동안 배양하였다. 각 세포의 배양액 및 배양방법은 미국세포주은행 또는 한국세포주은행에서 제공하는 세포배양정보에 따라 수행하였다. 상기 6종 세포의 정보는 하기 표 2에 기재하였다.
세포명 생물명 기원 장기 질병 내역
FL83B 마우스
(Mus musculus ) 		간(liver) 정상(질병 없음)
Hepa1-6 마우스
(Mus musculus ) 		간(liver) 간세포암
(Hepatocellular carcinoma)
HepG2 인간
(Homo sapiens)		 간(liver) 간세포암
(Hepatocellular carcinoma)
Huh7 인간
(Homo sapiens)		 간(liver) 간세포암
(Hepatocellular carcinoma)
SK-Hep1 인간
(Homo sapiens)		 간(liver) 및 복수(ascites) 선암(adenocarcinoma)
HCCLM3 인간
(Homo sapiens)		 간(liver) 간세포암
(Hepatocellular carcinoma)
상기 FL83B, Hepa1-6, HepG2, Huh7, SK-Hep1, 및 HCCLM3 세포들을 하루 배양 후, 새 배지로 교체하고 pPBA, 독소루비신(DOX), 페닐보론산과 독소루비신 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-DOX 1:1 complex) 및 페닐보론산과 독소루비신 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-DOX 2:1 complex) 각각을 0.01 내지 100 μM 농도로 처리하고, 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, MTT 어세이를 통해 세포독성을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이 결과, 가수분해된 pMAnh의 생체적합성 및 강한 음전하로 인하여 pPBA 는 모든 세포에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 독소루비신만 처리했을 경우 질병 유무에 상관없이 모든 세포에서 농도가 증가할수록 세포독성이 나타났다. pPBA-DOX 1:1 complex와 pPBA-DOX 2:1 complex도 독소루비신과 마찬가지로 농도가 증가할수록 세포독성이 증가하는 경향을 나타냈는데, pPBA-DOX 1:1 complex와 pPBA-DOX 2:1 complex 간에는 유의미한 차이가 없었으나, 독소루비신에 비해서는 pPBA-DOX complex 들이 현저하게 암세포의 사멸 효과가 높은 것으로 확인되었다. 특히, Hepa1-6, HepG2, 및 Huh7 세포의 경우, 0.1 내지 10 μM 농도에서 독소루비신과의 암세포 사멸 효과 차이가 현저하였으며, SK-Hep1, 및 HCCLM3 세포의 경우에는 10 μM 농도에서 pPBA-DOX complex 들의 암세포 사멸 효과가 독소루비신보다 2 내지 3배 높은 것으로 나타났다. 이는 pPBA-DOX complex가 독소루비신 단독 사용시보다 적은 농도의 약물로 현저한 간암 치료 효과를 얻을 수 있다는 것을 의미하며, 간세포암(Hepatocellular carcinoma) 또는 간의 선암(adenocarcinoma)에 관계없이 모든 간암에서 치료 효과가 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. in vivo 에서 항암제가 담지된 나노구조체의 효과 확인
실시예 3-1. 간암 모델 마우스의 제조 및 약물 투여
본 발명의 동물 실험 일체는 포스텍 생명공학센터 윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다. C57/B6 마우스(수컷, 6-8주령)의 우측 대퇴부에 Hepa1-6 간암 세포주 1 X 106 cell/mouse를 피하 주사(subcutaneous injection)하고, 암조직의 평균 체적이 약 300 mm3에 도달한 시점에서 마우스를 무작위로 그룹핑(그룹당 n=7)하여 하기 표 3과 같이 약물을 복강주사(intrapenetorial injection; i.p. injection)하였으며, 이를 통하여 약물이 전신투여(systemic administration) 되었다.
그룹 비고
No-treat 비처리
Free DOX 독소루비신(DOX) 단독투여
Free PBA 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체(pPBA) 단독투여
pPBA-DOX pPBA와 독소루비신이 결합된 나노구조체 단독투여
독소루비신이 단독 또는 복합체 형태로 투여되는 경우에 농도는 3 mg/kg 가 되도록 조절하였고, Free PBA 또는 pPBA-DOX 그룹의 pPBA는 FCR648로 표지 pPBA, 또는 비표지 pPBA 를 사용하였다.
실시예 3-2. 항암제가 담지된 나노구조체의 생체분포 확인
실시예 3-1의 방법으로 간암 모델링되고 표 3과 같이 약물 투여된 마우스들을 약물 투여 1일, 3일, 또는 7일 되는 시점에서 IVIS 스펙트럼 소형동물 생체 내 이미징 시스템 (Califer Lifescience, Hopkinton, MA)으로 마우스 내 형광 위치, 및 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실험 결과, pPBA가 생체 내에서 종양 부위에 잘 결합되며, Free PBA 형태보다 항암제와 결합한 pPBA-DOX일 때 종양에 더 강하게 축적되는 것을 알 수 있었다. 또한 Free PBA와 pPBA-DOX 모두 정상적으로 대사되어, 약물 투여 후 7일 정도 후에는 거의 잔존하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이는 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체(pPBA) 및 pPBA와 독소루비신이 결합된 나노구조체가 생체대사 시스템 내에서 순응한다는 것으로, pPBA를 이용한 약물 개발 시 대사 안정성이 높음을 시사한다.
실시예 3-3. 항암제가 담지된 나노구조체의 간암 치료 효과 확인
실시예 3-1의 방법으로 간암 모델링되고 표 3과 같이 약물 투여된 마우스들을 약물 투여 후 40일까지 추적 분석하였다.
40일까지의 종양 부피 및 마우스의 체중 변화를 도 8에 나타내었다. 종양 부피는 종양 부피 = ab2/2(a는 길이, b는 폭) 공식에 따라 기록하였다. 실험 결과, No-treat, 또는 Free PBA를 투여한 마우스에서의 종양 부피는 시간이 지남에 따라 크게 증가한 것이 비하여, Free DOX, 또는 pPBA-DOX를 투여한 마우스에서의 종양 부피는 미비하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 동일 시점에서 종양 부피는 No-treat, Free PBA, Free DOX, 및 pPBA-DOX의 순으로 적은 것으로 나타나, pPBA-DOX가 가장 종양 성장억제 효과가 큰 것을 알 수 있었다.
약물 투여 40일 경과 후에, 마우스를 희생하여 종양을 분리 후 종양의 무게를 측정하였다. 상기 분리된 종양의 실체를 도 9에, 측정한 무게를 도 10에 나타내었다. 평균 종양의 무게는 No-treat, Free PBA, Free DOX, 및 pPBA-DOX의 순으로 적은 것으로 나타나, pPBA-DOX가 가장 종양 성장억제 효과가 큰 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 본 발명의 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체가 암세포 표지제로서 기능할 수 있다는 것과, 독소루비신 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 간암 치료에 이용할 경우, 독소루비신을 자유 형태로 투여하는 것보다 간암 치료 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

Claims (20)

  1. 독소루비신이 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) 이며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체와 독소루비신의 몰비는 2:1 내지 4:1이며,
    상기 페닐보론산은 종양 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산을 특이적으로 인식하여 상호작용하는 것인, 간암 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성된 것인, 간암 치료용 약학조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 간암은 간으로부터 발생하거나, 또는 간으로 전이된 암인, 간암 치료용 약학조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암종과 담관상피암종, 간모세포종, 간내 혈관육종, 및 간내 선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 간암 치료용 약학조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 치료는 암세포의 수적 증가를 억제시키거나, 암세포의 양적 증식을 억제시키거나, 암세포를 사멸시키거나, 암 조직의 크기를 유지시키거나, 암 조직의 크기를 감소시키거나, 암 조직 내의 신생혈관 발달을 억제하거나, 또는 암의 전이를 억제하는 것 중 어느 하나 이상인, 간암 치료용 약학조성물.
  8. 인간을 제외한 개체에 독소루비신이 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) 이며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체와 독소루비신의 몰비는 2:1 내지 4:1이며,
    상기 페닐보론산은 종양 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산을 특이적으로 인식하여 상호작용하는 것인, 간암 치료 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성된 것인, 간암 치료 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. (a) 인간을 제외한 제 1 간암 개체에 제 1항의 약학조성물을 단독 투여하는 단계;
    (b) 인간을 제외한 제 2 간암 개체에 제 1항의 약학조성물과 간암 치료용 후보물질을 병용 투여하는 단계;
    (c) 제 1 개체와 제 2 개체의 간암 치료 효과를 비교하는 단계; 및
    (d) 제 1 개체의 간암 치료 효과보다 제 2 개체의 효과가 좋을 경우, 상기 간암 치료용 후보물질을 제 1항의 약학조성물과 병용 투여용 간암 치료 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 간암 치료용 병용 투여 물질의 스크리닝 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 간암은 간으로부터 발생하거나, 또는 간으로 전이된 암인, 간암 치료용 병용 투여 물질의 스크리닝 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암종과 담관상피암종, 간모세포종, 간내 혈관육종, 및 간내 선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 간암 치료용 병용 투여 물질의 스크리닝 방법.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 치료는 암세포의 수적 증가를 억제시키거나, 암세포의 양적 증식을 억제시키거나, 암세포를 사멸시키거나, 암 조직의 크기를 유지시키거나, 암 조직의 크기를 감소시키거나, 암 조직 내의 신생혈관 발달을 억제하거나, 또는 암의 전이를 억제하는 것 중 어느 하나 이상인, 간암 치료용 병용 투여 물질의 스크리닝 방법.
  16. 독소루비신이 담지된 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체를 포함하며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) 이며,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체와 독소루비신의 몰비는 2:1 내지 4:1이며,
    상기 페닐보론산은 종양 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산을 특이적으로 인식하여 상호작용하는 것인, 간암 표지용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성된 것인, 간암 표지용 조성물.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 중합체는 형광 프로브로 표지된 것인, 간암 표지용 조성물.

  19. 삭제
  20. 삭제
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