KR101711127B1 - 암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도 - Google Patents

암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 양상은
산화철 나노입자;
상기 산화철 나노입자 상에 결합된 EGF 단편: 및
상기 산화철 나노입자 상에 pH 민감성 링커를 경유하여 결합된 항암제를 포함하는, 산화철 나노입자 복합체, 상기 복합체를 포함하는 암 진단용 MRI 조영제, 상기 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 및 상기 복합체의 제조방법을 제공한다.

Description

암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도{Cancer-targeted anticancer agent-bound iron oxide nanoparticle complex, a process for the preparation thereof, and a use thereof}
본 발명은 암 조직에 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 산화철 나노입자에 항암제를 결합함으로써 MRI 조영제로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 암 치료까지 가능하고, 암조직에 타겟팅되어 암에 대한 치료 및 진단을 보다 효율적으로 할 수 있는 산화철 나노입자, 그 제조방법, 및 그의 용도에 관한 것이다.
기존에 사용되는 항암제는 암세포 뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미쳐 심각한 부작용이 발견되고 있으며, 이러한 부작용은 항암제의 사용을 제한하는 요소로서 부작용을 감소시킨 항암제의 개발은 매우 중요하다. 최근에는 표적 지지향성 항암제를 개발하여 부작용을 줄이고 암세포에만 표적화되어 항암 효과를 극대화하고자 하는 노력이 진행 중이다. 암세포에 대한 표적화의 대표적인 예시로서 EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과에 의해 나노크기의 입자들이 종양 내로 선택적으로 침투하는 방법이 이용될 수 있다. 그러나 보다 효과적인 표적화를 위해, EPR과 같은 수동적 표적화가 아닌 능동적인 표적화를 도입할 필요가 있다.
능동적 표적화의 방법으로서, 암세포에 특이적으로 과발현하는 수용체들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 폐암 세포의 경우 표면성장인자 수용체 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)이 과발현되는데, 이러한 EGFR를 타겟으로 하는 방법이 가능하다.
한편, 산화철 나노입자는 T2 MRI 조영제로서 알려져 있다. T2 조영제로 사용되는 산화철 나노입자는, 선구물질인 FeL3(L= CO5, NO3, 아세틸아세토네이트(acetylacetonate) 등)를 열분해하여, 균일한 크기의 Fe3O4를 직접 합성하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 또한, 속이 비어 있는 산화철(hollow Fe3O4) 나노입자를 제조하는 방법으로서, 인산 또는 질산과 산화철의 치환반응을 통해, 산화철 나노입자 내부에 인 또는 질소를 도입한 다음, 이를 다시 녹여내는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 1).
이러한 산화철 나노입자는 MRI 조영제만으로 사용될 수도 있으나, 최근에는 항암제와 함께 마이셀 내에 함께 봉입시켜 암의 치료와 MRI 조영을 동시에 수행할 수 있는 조영제가 개발되었다 (특허문헌 1). 상기 특허문헌 1은 산화철 나노입자가 양친매성 화합물에 의해 둘러싸여 있고, 친수성 영역의 친수활성성분 결합영역이 조직 특이적 결합 성분과 결합되어 있으며, 상기 소수성 영역에 약제학적 활성성분이 결합 또는 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체에 관한 것으로서, MRI 조영제로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 타겟팅 물질 및 약제성분에 의해 다양한 질병의 동시 진단 및 치료에 사용 가능하다.
1. Nano Letters, 2008, 8, 4252-4258
1. 한국특허공개 2007-008839
본 발명의 목적은 암 조직에 대해 타겟팅되어 효과가 현저히 우수하면서 부작용이 낮은, 암에 대한 치료 및 MRI 조영을 모두 수행할 할 수 있는 산화철 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 산화철 나노입자 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 산화철 나노입자 복합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
산화철 나노입자;
상기 산화철 나노입자 상에 결합된 EGF 단편: 및
상기 산화철 나노입자 상에 pH 민감성 링커를 경유하여 결합된 항암제를 포함하는, 산화철 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 산화철 나노입자 복합체를 포함하는 암 진단용 MRI 조영제를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 산화철 나노입자 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은
산화철 나노입자(NMPs)에 APS를 반응시켜 APS-결합 산화철 나노입자(APS@MNPs)를 제조하는 단계;
상기 APS-결합 산화철 나노입자를 EGF 단편(EGFfr)과 반응시켜 EGFfr을 APS를 통해 결합시켜 EGFfr-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;
상기 EGFfr-결합 산화철 나노입자 및 pH 민감성 링커를 반응시켜 pH 민감성 링커가 APS를 통해 결합된 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;및
상기 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 항암제와 반응시켜 항암제를 pH 민감성 링커를 통해 산화철 나노입자에 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 양상에 따른 산화철 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 의도하는 비율대로 EGFfr 결합할 수 있으며, 적은 양의 EGFfr을 함유하여도 EGFfr 과발현 세포에 타겟팅 될 수 있어, 산화철 나노입자에 보다 많은 양의 항암제를 결합할 수 있어 높은 항암효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 산화철 나노입자 복합체에 pH 민감성 링커로 연결된 항암제는 암세포에 흡수된 다음 암세포 내의 pH 환경에서 비로소 방출되어 암세포 내에서 선택적으로 항암제의 효과가 발휘되도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 암 세포에 타겟팅 될 수 있으므로, 암세포에 대한 선택적인 MRI 조영제 역할을 수행할 수 있으며, 동시에 암세포에 대한 선택적인 항암제 전달을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 복합체 및 그 산화철 나노입자 복합체가 EGF 과발현 암세포의 세포막에 타겟팅 되는 원리의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 EGF 단편 및 독소루비신이 결합된 산화철 나노입자의 합성 반응식 이다.
도 3은 실시예 2에서 제조된 EGFfr1@MNPs 또는 EGFfr4@MNPs를 A549 세포 또는 CHO 세포 배양액에 분주하고 3시간 배양한 다음 세포 내 포함된 Fe 원소의 양을 ICP-OES(inductively coupled plasma optical emission spectrometry)를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 DOX@MNPs를 5 ml PBS (pH 7.2) 와 5ml 시트르산 (pH 5.4)에 첨가한 후, 37℃에서 교반하며 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 마다 방출된 DOX를 484nm에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 EGFfr1DOX9@MNPs를 A549 세포 또는 CHO 세포와 함께 3시간 동안 배양 후, DAPI 염색 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 실시예 2에서 제조된 DOX@MNPs, EGFfr1DOX9@MNPs, MNPs, 및 DOX를 각각 0 μM, 0.1μM, 1μM, 10μM, 25μM, 50μM, 또는 100μM로 A549 세포 또는 CHO 세포 배양액에 첨가하여 MTT 어세이한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명자들은 암세포에 대해 선택적이면서 MRI 조영제로서뿐만 아니라 동시에 암 치료에도 사용될 수 있는 산화철 나노입자를 연구하였으며, 그 결과 산화철 나노입자에 특정 암세포에서 과발현 되는 EGFR에 결합 가능한 EGF 단편(EGF fragment: EGFfr)을 결합시키고 항암제를 pH 민감성 링커를 통해 결합시킨 산화철 나노입자 복합체를 개발하였다.
본 발명은 일 양상에 있어서,
산화철 나노입자;
상기 산화철 나노입자 상에 결합된 EGF 단편: 및
상기 산화철 나노입자 상에 pH 민감성 링커를 경유하여 결합된 항암제 포함하는, 산화철 나노입자 복합체를 제공한다.
상기 산화철 나노입자는 MRI 조영제로서 사용될 수 있는 것으로 공지된 임의의 산화철 나노입자이며, 예를 들어 Fe2O3 나노입자 또는 Fe3O4 나노입자이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 산화철 나노입자는 당해 기술분야에 공지된 임의의 산화철 나노입자 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 선구물질인 FeL3(L= CO5, NO3, 아세틸아세토네이트(acetylacetonate) 등)를 열분해하여, 균일한 크기의 Fe3O4를 직접 합성하는 방법이 사용될 수 있다. 또한, 속이 비어 있는 산화철(hollow Fe3O4) 나노입자를 제조하는 방법으로서, 인산 또는 질산과 산화철의 치환반응을 통해, 산화철 나노입자 내부에 인 또는 질소를 도입한 다음, 이를 다시 녹여내는 방법이 알려져 있다(Irwan Nurdin, Mohd Rafie Johan, et al., Effect of Nitric Acid Concentrations on Synthesis and Stability of Magnetite Nanoparticles Suspension, the Scientific World Journal, volume 2014, article ID 589479, 6 pages).
상기 EGF 단편(EGFfr)은 특정 암세포에 존재하는 EGFR에 결합할 수 있는 EGF 단편이며, EGFR에 결합할 수 있으면서 산화철 나노입자상에 결합할 수 있는 임의의 EGF 단편이다.
일 구체예에서, 상기 EGF 단편은 MYIEALDKYAC의 아미노산 서열을 포함하는 EGF 단편이다. 일 구체예에서, 상기 EGF 단편은 MYIEALDKYAC 이다.
상기 EGF 단편은 화학 분야에 공지된 기술을 이용하여 통상의 기술자가 산화철 나노입자 상에 적절히 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 EGF 단편은 SPDP(N-Succinimidyl-3-(2-PyridylDithio)-Propionate) 를 링커로 하여 결합될 수 있으며, 구체적으로는 산화철 나노입자 상에 APS((3-Aminopropyl)triethoxysilane)를 공유 결합시킨 다음, 그 APS에 SPDP를 공유결합시키고, 그 SPDP에 EGF 단편을 공유결합 시킬 수 있다.
상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항암제는 pH 민감성 링커를 경유하여 산화철 나노입자에 결합될 수 있다. 상기 pH 민감성 링커는 암세포 내의 pH 조건인 pH 약 5.0 ~ 6.5 에서 분리 가능한 링커이다. 상기 pH 민감성 링커는 예를 들어 SANH (succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone), C6-succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone, 및 C6-succinimidyl 4-formylbenzoate로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 pH 민감성 링커는 SANH (상품명 S-hynic)이다.
상기 항암제는 화학 분야에 공지된 기술을 이용하여 통상의 기술자가 산화철 나노입자 상에 pH 민감성 링커를 경유하여 적절히 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항암제는 산화철 나노입자 상에 APS를 공유 결합시킨 다음, 그 APS에 pH 민감성 링커를 공유결합 시키고, 그 pH 민감성 링커에 항암제를 공유결합시킬 수 있다.
상기 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 EGF 단편을 먼저 산화철 나노입자 상에 결합시킨 다음 항암제를 결합시킬 수도 있고, 항암제를 먼저 산화철 나노입자 상에 결합시킨 다음 EGF 단편을 결합시켜 제조될 수도 있다.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 복합체 및 그 산화철 나노입자 복합체가 EGF 과발현 암세포의 세포막에 타겟팅 되는 원리의 모식도를 도 1에 나타내었다.
일 구체예에서, 상기 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 EGF 단편(EGFfr) 및 항암제가 4:6 이하, 바람직하게는 3:7 이하, 더욱 바람직하게는 2: 8 이하, 더욱 더 바람직하게는 1:9 이하 0.5:9.5 이상의 몰비로 결합된 산화철 나노입자 이다. 실험 결과, 산화철 나노입자(MNPs)의 노출된 아민기에 EGF 단편(EGFfr) 및 독소루비신(DOX)를 1:9 와 4:6의 몰비로 결합된 산화철 나노입자 복합체를 제작한 결과, EGFfr 와 DOX이 원하는 비율로 MNPs 표면에 결합될 수 있는 것으로 나타났다(시험예 1). 또한, EGFfr의 몰비가 낮아도 EGFR 과발현 세포에 대한 타겟팅 효과가 우수한 것으로 확인되었다(시험예 2 참조). 구체적으로는, EGFR를 과발현하는 A549 세포와 저발현하는 CHO세포에 대해 EGFfr 여부에 따른 세포 내 MNPs 흡수량을 평가한 결과, A549세포는 EGFfr1@MNPs(MNPs의 노출된 아민기의 약 10%가 EGFfr이 결합된 MNPs), EGFfr4@MNPs(MNPs의 노출된 아민기의 약 40%가 EGFfr이 결합된 MNPs) 모두 MNPs 보다 높은 세포 내 철의 양을 나타내었으며 EGFR를 과발현하는 A549세포에서 저발현하는 CHO 세포보다 세포 내 흡수되는 철의 양이 현저히 많은 것으로 평가되었다. 이는 MNPs표면에 결합된 EGFfr가 EGF 수용체와 결합하여 높은 세포 흡수를 가능하게 하는 것으로 보인다. 그러나, EGFfr1@MNPs 및 EGFfr4@MNPs는 흡수된 양의 차이가 거의 없는 것으로 나타났으며, 따라서 적은 양의 EGFfr로도 EGFR 과발현 세포에 대한 흡수량을 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다 (시험예 2).
상기 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 산화철 나노입자 자체의 MRI 조영 효과와 복합체의 암세포에 대한 선택성으로 인해 암 진단용 MRI 조영제로서 사용될 수도 있고, 산화철 나노입자 복합체 상에 암세포 내에서 분리될 수 있는 pH 민감성 링커를 경유해 결합된 항암제로 인해 암 치료에 사용될 수도 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 상기 암 진단용 MRI 조영제로서의 용도 및 암 치료 용도를 동시에 수행할 수도 있다.
시험 결과, 항암제인 독소루비신(DOX)를 SANH를 링커로 하여 결합한 DOX@MNPs에 대해 암세포의 엔도좀(endosome)의 낮은 pH인 pH 5.4 에서 DOX의 방출정도를 평가 하기 위해 DOX@MNPs를 각각 PBS(pH 7.2)와 시트르산 완충액 (pH 5.4) 에서 시간에 따른 DOX의 방출 정도를 평가 하였다. 그 결과, 처음 1 ~ 2 시간 이내에 pH 5.4에서 70% 이상의 DOX가 방출되는 것을 확인하였고 pH 7.2 에서는 20% 정도의 DOX만이 방출되는 것을 확인하였다. 따라서, DOX@MNPs는 정상 조직 중에서는 거의 방출이 이루어지 않으며 선택적으로 암세포 내부에서 1 ~ 2시간 이내에 방출이 가능할 것으로 기대되었다 (시험예 3).
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFfr 및 DOX가 1:9로 결합된 MNPs(EGFfr1DOX9@MNPs)를 실제 배양된 암세포 (CHO 세포 및 A549 세포)와 3시간 동안 배양 후, DAPI 염색 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과, EGFR 과발현 A549 세포의 경우 EGFfr1/DOX9@MNPs 가 DOX@MNPs 보다 세포 내 흡수량이 많아 더 붉은 DOX의 형광을 나타내었으며 EGFR 저발현 CHO 세포의 경우 EGFfr1/DOX9@MNPs 와 DOX@MNPs 가 세포 내 흡수된 양의 차이가 거의 없다는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 EGF 단편 및 항암제가 결합된 산화철 나노입자는 EGFR 과발현 암조직에 대한 타겟팅이 가능한 것으로 나타났다(시험예 4).
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFfr1DOX9@MNPs를 실제 배양된 암세포(CHO 세포 및 A549 세포)에 대한 세포독성 시험(MTT assay) 결과, MNPs, DOX, DOX@MNPs는 CHO 세포 생존율 및 A549 세포 생존율이 유사한 것으로 나타났으나, EGFfr1DOX9@MNPs는 EGFR 저발현 CHO 세포에 비해 EGFR 과발현 A549 세포에 대한 생존율이 현저히 더 낮은 것으로 나타났으며, 따라서 EGFR 과발현 암조직에 대한 타겟팅 효과가 실제로 우수한 것으로 더욱 확인되었다(시험예 5).
따라서, 본 발명에 따른 산화철 나노입자 복합체는 실제 EGFR 과발현 암세포에 대한 선택성이 우수할 뿐만 아니라, EGFR 과발현 암세포에 대한 선택적인 항암효과가 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 산화철 나노입자 복합체를 포함하는 암 진단용 MRI 조영제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 상기 산화철 나노입자 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 암 치료 및 암에 대한 MRI 조영을 동시에 수행할 수 있다. 따라서, 항암제로 항암요법을 수행함과 동시에 암의 진행상황을 모니터링할 수 있어 바람직하다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 특히 암세포가 EGFR을 과발현하는 암에 대해 선택적으로 타겟팅될 수 있으므로, EGFR 과발현 암에 대해 유효성 및 안전성이 우수한 조영제 및 항암제로서 사용될 수 있다.
상기 MRI 조영제 또는 약학 조성물은 상기 산화철 나노입자 복합체를 기준으로 성인에게 0.001 ~ 0.1 mmol Gd/kg 투여할 수 있으며, 산화철 나노입자에 결합된 항암제의 비율에 따라 적절히 조정할 수도 있다. 또한, 환자의 인종, 성별, 연령, 암의 진행 정도 등에 따라 전문가의 판단에 따라 적절히 가감할 수 있다.
상기 MRI 조영제 또는 약학 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 MRI 조영제는 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서,
산화철 나노입자(NMPs)에 APS를 반응시켜 APS-결합 산화철 나노입자(APS@MNPs)를 제조하는 단계;
상기 APS-결합 산화철 나노입자를 EGF 단편(EGFfr)과 반응시켜 EGFfr을 APS를 통해 결합시켜 EGFfr-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;
상기 EGFfr-결합 산화철 나노입자 및 pH 민감성 링커를 반응시켜 pH 민감성 링커가 APS를 통해 결합된 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;및
상기 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 항암제와 반응시켜 항암제를 pH 민감성 링커를 통해 산화철 나노입자에 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 양상에 따른 산화철 나노입자 복합체의 제조방법를 제공한다.
본 양상에 따른 산화철 나노입자 복합체의 제조방법의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 산화철 나노입자 복합체에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
상기 EGFfr은 SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 링커로 하여 상기 APS와 결합될 수 있다.
상기 본 발명의 일 양상에 따른 산화철 나노입자 복합체의 제조방법에서, EGFfr-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계 전에, pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및 항암제를 pH 민감성 링커를 통해 산화철 나노입자에 결합시키는 단계를 먼저 수행할 수도 있다. 그러나, EGFfr-결합 수율의 조정 측면에 있어서, 항암제 결합 전에 EGFfr-결합 산화철 나노입자를 제조하는 것이 바람직하다.
상기 산화철 나노입자 복합체의 제조방법의 일 실시예에 따른 EGF 단편 및 독소루비신이 결합된 산화철 나노입자 복합체의 합성 반응식을 도 2에 나타내었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[약어에 대한 설명]
SPDP : N-Succinimidyl-3-(2-PyridylDithio)-Propionate
APS : (3-Aminopropyl)triethoxysilane
SANH : Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone
EGFfr: EGF 단편
MNPs : 산화철 나노입자
DOX : 독소루비신
APS@MNPs : APS 결합 MNPs
SANH@MNPs : SANH 결합 MNPs
EGFfr@MNPs : EGFfr 결합된 MNPs
EGFfr1@MNPs : MNPs에 노출된 아민기의 약 10%가 EGFfr 결합된 MNPs
EGFfr4@MNPs : MNPs에 노출된 아민기의 약 40%가 EGFfr 결합된 MNPs
DOX@MNPs : 독소루비신 결합 MNPs
EGFfrDOX@MNPs : EGFfr 및 DOX가 결합된 MNPs
EGFfr1DOX9@MNPs : EGFfr 및 DOX가 1:9의 몰비로 결합된 MNPs
EGFfr4DOX6@MNPs : EGFfr 및 DOX가 4:6의 몰비로 결합된 MNPs
실시예 1: 산화철 나노입자의 제작
FeCl3·6H2O (1g) 및 FeCl2·4H2O(0.39g) (FeCl3·6H2O : FeCl2·4H2O = 2:1 몰비)를 120ml H2O에 넣고 교반하며 80℃로 중탕으로 30분동안 질소로 치환하였다. 30분 후 암모늄 용액 (4ml)을 첨가하여 산화철 나노입자(MNPs)를 제조하였다. 이 후 상온에서 냉각 후 에탄올로 세척하였다.
실시예 2: 다기능성 산화철 나노입자의 제작
상기 실시예 1에서 제조된 MNPs에 아민기(-NH2)를 표면에 노출시키기 위해 APS((3-Aminopropyl)triethoxysilane)를 결합시켰다. MNPs (10mg) 및 APS (5000 nmol, 1.17 ml)를 90% 메탄올 (in 10% H2O) 에 넣고 24시간 동안 교반하며 반응시켰다. 24시간 이후 원심분리(12000rpm, 10min)를 하여 반응하지 않은 APS를 얻은 후 fluorescamine 어세이를 통해 반응하지 않은 APS의 양을 정량하였다. APS가 결합된 APS@MNPs에는 EGFfr : DOX를 몰농도 비율 1:9 또는 4:6로 결합시켜 EGFfr1/DOX9@MNPs 및 EGFfr4/DOX6@MNPs를 형성시켰다.
우선 표적지향성 나노입자를 만들기 위해, APS:SPDP:EGFfr = 1: 0.1 :0.2 또는 1: 0.4: 0.8 몰비율로 반응시켜 EGFfr를 MNPs에 결합시키는 반응을 수행하였다. 먼저 APS@MNPs 및 무수DMSO에 녹인 SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 메탄올에서 2시간 동안 교반하며 반응 후 무수 메탄올로 3회 세척 후 무수 DMSO에 녹인 EGFfr를 첨가하여 24시간동안 교반하며 반응시켜 EGFfr1@MNPs 또는 EGFfr4@MNPs 를 생성시켰다.
24시간 이후 증류수(DW)로 세척하여 반응하지 않은 EGFfr는 BCA 어세이(Bicinchoninic Acid Protein Assay)를 통하여 정량 하였다. 그 후에 남아있는 아민기(-NH2)가 노출된 MNPs(EGFfr1@MNPs 또는 EGFfr4@MNPs)를 APS: SANH: DOX 1: 1.8: 1.2 몰비율로 반응시켜 pH민감성 링커인 SANH(succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)를 경유하여 DOX와 결합시켰다. 먼저 EGFfr1@MNPs및 무수 DMSO에 녹인SANH를 무수 메탄올에 첨가 후 6시간 동안 상온에서 교반하여, MNPs표면에 남아있는 아민기에SANH를 결합시켰다. 6시간 후 무수 메탄올로 3회 세척하여 반응하지 않은 SANH를 제거 후 무수 DMSO에 녹인 DOX와 SANH-결합 MNPs를 무수 메탄올에서 24시간 동안 교반하여 반응시킴으로써 EGFfr1DOX9@MNPs또는 EGFfr4DOX6@MNPs를 생성시켰다. 24시간 이후 DMSO로 3회 세척하며 반응하지 않은 DOX 상층액을 모아 484 nm에서 흡광을 측정하여 정량하였다.
BCA assay를 통하여 MNPs 표면에 결합된 EGFfr의 결합정도를 평가 하였고, 결합되지 않은 DOX는 484nm에서의 흡광을 측정함으로써MNPs 표면에 결합된 DOX의 양을 평가한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112015120763414-pat00001
MNPs 의 노출된 아민기에 결합된 EGFfr은 최소화하고 결합된 DOX는 최대로 할 경우 세포 내 흡수량 및 항암효과를 평가하기 위해 1:9 와 4:6의 결합비로 제작한 것이며, 상기 표 1의 결과에 따르면 MNPs표면에 노출된 아민기에 EGFfr 및 DOX를 1:9 와 4:6의 결합비로 결합하였을 때 기대했던 비율로 MNPs 표면에 결합된 것으로 확인되었다.
시험예 1: 세포 내 MNPs 흡수량 평가
EGFR를 과발현하는 A549 세포와 저발현하는 CHO세포를 통하여 EGFfr여부에 따른 세포 내 MNPs 흡수량을 평가였다.
A549 세포와 CHO 세포를 각각 1x105 cell/well 로 6 well plate에서 배양하였다. 이후 상기 실시예 2에서 제조된 EGFfr1@MNPs 또는 EGFfr4@MNPs를 RPMI 1640 배지에 녹인 후 각각 세포에 분주하며 3시간동안 배양하였다. 3시간 이후, 새 배지로 교환 후 Trypsin/EDTA 용액을 사용하여 (T/E) 세포를 때어냈다. 이 후 37% HCl로 세포를 융해시킨 후 3% HCl로 희석하였다. 용해된 세포는 ICP-OES(inductively coupled plasma optical emission spectrometry)를 통하여 세포 내 포함된 Fe원소의 양을 정량하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 실시예 2에서 제조된 EGFfr1@MNPs 또는 EGFfr4@MNPs를 A549 세포 또는 CHO 세포 배양액에 분주하고 3시간 배양한 다음 세포 내 포함된 Fe 원소의 양을 ICP-OES(inductively coupled plasma optical emission spectrometry)를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3에 따르면, EGFR를 과발현하는 A549세포는 EGFfr1@MNPs, EGFfr4@MNPs 모두 MNPs 보다 높은 세포 내 철의 양을 나타내었으며 EGFR를 과발현하는 A549세포에서 저발현하는 CHO 세포보다 세포 내 흡수되는 철의 양이 많은 것으로 평가되었다. 이는 MNPs표면에 결합된 EGFfr가EGF 수용체와 결합하여, 높은 세포 흡수를 나타낸 것으로 보인다. 하지만 EGFfr1@MNPs 및 EGFfr4@MNPs 는 동일한 세포에 대해 흡수된 양의 차이가 거의 없는 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명에 따른 산화철 나노입자는 적은 양의 EGFR을 결합시켜도 EGFR 과발현 세포에 흡수되는 양을 높일 수 있는 것으로 확인되었다.
시험예 2: DOX방출 평가
상기 실시예 2에서 제조된 DOX-MNPs (2mg)를 각각 5 ml PBS (pH 7.2) 와 5 ml 시트르산 (pH5.4)에 첨가하였다. 37℃에서 교반하며 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 마다 방출된 DOX를 484nm에서 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 DOX@MNPs를 5 ml PBS (pH 7.2) 와 5ml 시트르산 (pH 5.4)에 첨가한 후, 37℃에서 교반하며 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 마다 방출된 DOX를 484 nm에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4의 결과에 따르면, 처음 1~2시간 이내에 pH 5.4에서 70% 이상의 DOX가 방출되는 것을 확인하였고 pH 7.2 에서는 20% 정도의 DOX만이 방출되는 것을 확인하였다. 이러한 결과에 따르면, DOX@MNPs가 암세포 내부의 pH 환경에서 1~2시간 이내에 방출이 가능할 것으로 보인다.
시험예 3: 다기능 산화철 나노입자가 흡수된 세포 영상
A549 세포와 CHO 세포를 각각 RPMI 1640 (10%FBS) 배지에서 배양 후 3일 후 각 well에 cover-slip을 넣고 각각 1x105 cell/well 로 12 well plate 에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 50μg/well의 MNPs, DOX@MNPs, EGFfr1DOX9@MNPs를 RPMI 1640 배지에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 이후 PBS로 3번 세척 후 3% 포름알데히드 용액으로 10분 동안 고정하였다. 이후 PBS로 5번 세척하였다. 핵을 염색하기 위해 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색을 하였다. 각 well에 300 nM의 DAPI 염색액을 첨가 후 5분 동안 빛으로부터 보호하며 보관하였다. 이 후 염색액 제거 후 PBS로 3회 세척하였다. 그리고 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope) 으로 관찰하였다 (DAPI Ex/Em: 358nm/461nm, DOX: Ex/Em: 488 nm/565 ~630 nm).
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 EGFfr1DOX9@MNPs를 A549 세포 또는 CHO 세포와 함께 3시간 동안 배양 후, DAPI 염색 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 사진이다.
DAPI는 핵을 염색하여 파란색을 나타나며 DOX의 경우 붉은색을 나타낸다.
EGFR를 과발현하는 A549 세포에서는, EGFfr1DOX9@MNPs 가 DOX@MNPs 보다 세포 내 흡수량이 많아 더 붉은 DOX의 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는 상기 시험예 1의 세포 내 MNPs 흡수량 평가에서 EGFfr1@MNPs 가 MNPs 에 비해 EGF 수용체를 과발현하는 세포 내 흡수량이 많은 것과 같은 결과라고 할 수 있다. CHO 세포의 경우 EGFfr1DOX9@MNPs 와 DOX@MNPs 가 세포 내 흡수된 양의 차이가 거의 없는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 시험예 1의 세포 내 MNPs 흡수량 평가에서 CHO세포의 경우 EGFfr 의 결합 유무와 상관없이 세포 내 흡수되는 MNPs양은 비슷한 결과와 같은 결과로서, EGFfr 의 결합 유무에 상관 없이 세포 내 흡수되는 DOX의 양이 비슷한 형광을 나타낸다.
시험예 4: 세포독성 평가
A549 세포와 CHO 세포를 각각 RPMI 1640(10%FBS) 배지에서 배양하였다. 3일 후 각각의 세포를 1x104 cell/well 로 96 well plate에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 이후 DOX의 농도를 기준으로 상기 실시예 2에서 제조된 DOX-MNPs, EGFfr1/DOX9@MNPs, MNPs, DOX를 0μM, 0.1μM, 1μM, 10μM, 25μM, 50μM, 100μM 으로 첨가하였다. 24 시간 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척 후 MTT 용액(10ml, 5mg/ml)을 첨가 후 2 시간 동안 반응시켰다. 포르마잔 결정(Formazan crystal)이 형성된 것을 확인 후 배지를 걷어낸 후 DMSO (200 mL)를 각 well에 첨가하여 포르마잔 결정을 추출하였다. 이후 570 nm에서 흡광을 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 실시예 2에서 제조된 DOX@MNPs, EGFfr1DOX9@MNPs, MNPs, 및 DOX를 각각 0 μM, 0.1μM, 1μM, 10μM, 25μM, 50μM, 100μM 으로 A549 세포 또는 CHO 세포 배양액에 첨가하여 MTT 어세이한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6에 따르면, A549 세포에서는, MNPs 농도가 증가함에 따라 세포 독성은 나타나지 않으며 DOX@MNPs의 경우도 세포 내 흡수량이 적어 최고 농도인 100 mM에서도 60% 정도 생존하는 것을 보였다. 하지만 EGFfr1DOX9@MNPs 의 경우 농도가 높아짐에 따라 세포 생존율도 낮아지는 것을 보였으며, 이는 DOX만 처리한 것과 유사한 세포 생존율을 보였다.
CHO 세포에서는, MNPs, DOX, DOX@MNPs 는 A549세포와 유사한 양상을 보였다. 또한 A549 세포의 EGFfr1DOX9@MNPs 는 IC50값이 18mM의 농도를 보였으나 CHO 세포의 경우 이보다 약 4배가 낮은 75mM의 IC50값을 나타내었다. 이를 통해 제조된 EGFfr1DOX9@MNPs 가 EGF 수용체를 과발현하는 암세포에게서 높은 세포사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다.
상기 시험 결과에 따르면, MNPs에 EGF 단편(EGFfr) 및 독소루비신(DOX)가 의도하는 바와 같은 비율로 성공적으로 결합되었으며, 10%와 40%으로 각각 결합된 EGFfr1@MNPs 와 EGFfr4@MNPs 의 세포 내 흡수량을 비교하였을 때 EGFfr1@MNPs 와 EGFfr4@MNPs 이 유사한 암세포 흡수율을 나타내어, 적은 양의 EGFfr이 결합되어도 선택성이 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 산화철 나노입자에 적은 양의 EGFfr을 결합시키고 남은 표면에 더 많은 DOX를 결합할 수 있어 높은 항암효과를 나타낼 수 있다. pH 민감성 링커로 hydrazone결합으로 연결된 DOX@MNPs 의 경우 암세포의 엔도좀 의 pH범위에서 특이적으로 방출을 하는 것으로 확인되었으며 1 ~ 2시간 이내에 70% 이상이 방출되는 것으로 확인되었다. 이는 표적지향성을 가진 다기능성 항암제로서의 역할을 할 가능성이 확인된 것이다. EGFfr1/DOX9@MNPs 의 경우 DOX@MNPs 보다 A549세포 내 흡수량이 높아 DOX의 붉은색 형광이 높게 나타나는 이미지를 나타냈으며, 이를 통해 EGFfr에 의해 EGFR 과발현 암세포에 대한 타겟팅이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 세포 독성 평가 결과, MNPs의 경우 세포 독성이 없는 것으로 평가되며 EGFfr1/DOX9@MNPs 는 EGFR과발현 A549세포에서 DOX만 처리한 것과 매우 유사한 항암효과를 나타내었으며, 이를 통해 EGFfr가 EGFR에 특이적으로 결합함으로서 EGFR 과발현 세포에 타겟팅될 수 있을 뿐만 아니라, 암세포 내에서 약물이 방출되어 항암효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인 되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

  1. Fe2O3 나노입자 또는 Fe3O4 나노입자인 산화철 나노입자;
    상기 산화철 나노입자 상에 결합된 MYIEALDKYAC의 아미노산 서열을 포함하는 EGF 단편(Epidermal Growth Factor fragment): 및
    상기 산화철 나노입자 상에 pH 5.0 ~ 6.5 에서 분리 가능한 pH 민감성 링커를 경유하여 결합된 항암제 포함하는, 산화철 나노입자 복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 EGF 단편은 SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-PyridylDithio)-Propionate)를 링커로 하여 산화철 나노입자 상에 결합된 것인 산화철 나노입자 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항암제는독소루비신, 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 산화철 나노입자 복합체.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 pH 민감성 링커는 SANH (succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone), C6-succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone, 또는 C6-succinimidyl 4-formylbenzoate인 것인 산화철 나노입자 복합체.
  8. 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 복합체를 포함하는 암 진단용 MRI 조영제.
  9. 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 암 치료 및 암에 대한 MRI 조영을 동시에 수행할 수 있는 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 항암제로 항암요법을 수행함과 동시에 암의 진행상황을 모니터링할 수 있는 것인 약학 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서, 주사제인 약학 조성물.
  13. Fe2O3 나노입자 또는 Fe3O4 나노입자인 산화철 나노입자(NMPs)에 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 ((3-Aminopropyl)triethoxysilane: APS)를 반응시켜 APS-결합 산화철 나노입자(APS@MNPs)를 제조하는 단계;
    상기 APS-결합 산화철 나노입자를 MYIEALDKYAC의 아미노산 서열을 포함하는 EGF 단편(EGFfr)과 반응시켜 EGFfr을 APS를 통해 결합시켜 EGFfr-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;
    상기 EGFfr-결합 산화철 나노입자 및 pH 5.0 ~ 6.5 에서 분리 가능한 pH 민감성 링커를 반응시켜 pH 민감성 링커가 APS를 통해 결합된 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 제조하는 단계;및
    상기 pH 민감성 링커-결합 산화철 나노입자를 항암제와 반응시켜 항암제를 pH 민감성 링커를 통해 산화철 나노입자에 결합시키는 단계를 포함하는, 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 산화철 나노입자 복합체의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 EGFfr은 SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 링커로 하여 APS와 결합되는 것인 산화철 나노입자 복합체의 제조방법.
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