KR102317559B1

KR102317559B1 - 암을 치료하기 위한 신규 화합물, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102317559B1
Application number: KR1020210020774A
Authority: KR
Inventors: 이강파; 백수지
Original assignee: 주식회사 유머스트알엔디
Priority date: 2021-02-16
Filing date: 2021-02-16
Publication date: 2021-10-27

Abstract

본 발명은 신규한 AS-DK143 화합물에 관한 것이고, 암을 치료하기 위한, AS-DK143 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 담체로서 mPEG-PLA를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항암약물 DK-143이 난용성이므로, 이를 극복하기 위한 방안으로 DK-143에 아스피린을 결합시켜 새로운 화합물을 합성한 것인데, 이러한 화합물은 항암약물로서 시너지 효과를 가지고, 상기 화합물을 mPEG-PLA에 로딩하여 나노입자를 제조하면, 상기 화합물의 수용성 및 생체이용률이 향상되므로, 상기 화합물의 고형암에 대한 항암효과를 향상시킬 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 신규 화합물, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법{NOVEL COMPOUND FOR TREATMENT OF CANCERS, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 신규한 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

통계에 의하면 국내 암발생률은 1999년에 인구 10만명당 215.5명이었으나, 2017년에는 인구 10만명당 453.4명으로 증가추세를 나타낸다. 또한, 유방암, 전립선암, 췌장암, 신장암은 두드러지게 증가하고 있는 실정이다. 마찬가지로, 암에 의한 사망률은 꾸준히 증가추세에 있으며, 2018년의 암 사망률은 10만명당 154.3명으로 조사되고 있다. OECD가입회원국의 대부분에서는 유방암, 대장암의 발병률이 가장 높으며, 우리나라에서도 비만과 식생활의 서구화에 의해 암의 발생빈도는 점차 증가할 것으로 전망된다.

암 중에서 고형암은 암세포가 자라면서 덩어리를 이루는 암으로 보통 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 또는 피부암 등을 의미한다.

그 중에서 특히, 부인과 고형암(Gynecology solid cancer)의 대표적인 예로 자궁 경부암(CVC)이 있고, 이는 현재 전세계 여성의 사망의 주요 원인이며, 세계 보건기구의 2018년 세계 보건 보고서에 따르면 자궁 경부암에 대한 연령 보정 평균 발병률은 10만 명당 13.1명이었다.

이와 같은 자궁경부암의 사망률은 선진국보다 개발 도상국에서 더 높은 것으로 알려져 있다. 그 이유는 예방 접종을 통해 자궁 경부암 발병률을 줄일 수 있기 때문이라고 보고된다. 하지만, 이 질병은 완전히 예방할 수 있는 질병은 아니므로, 이러한 관점에서 여성의 건강을 여전히 위협하는 자궁 경부암을 치료하기 위한 연구가 반드시 필요하다.

이러한 자궁 경부암은 인간 유두종 바이러스(Human papillomavirus, HPV) 감염에 의한 종양 유전자(oncogene) 돌연변이와 관련이 있다. 인간 유두종 바이러스는 결과적으로 숙주 세포 증식을 유발하고, 특히, 인간 유두종 바이러스는 종양 억제 유전자와 p53, cyclin E, p21, p27과 같은 세포주기 체크 포인트 단백질을 돌연변이시키기 위해 E6 및 E7 유전자 표적과 같은 종양 단백질을 암호화한다.

자궁 경부암을 치료하기 위해 최근 자궁 경부암의 치료 방법에는 수술, 방사선 요법 및 화학 요법이 포함되고, 화학 요법의 경우 수술 전 크기 감소나 수술 후 재발 예방 및 전이 치료를 위해 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin)과 같은 약물 치료가 선호된다. 그러나 상기 약물 치료를 받은 일부 환자는 여전히 약물 요법의 부작용이나 내성으로 고통받고 있는 실정이므로 이를 개선한 약품이 필요하다.

이러한 목적을 달성하기 위해서, 항암약물은 세포의 자연사를 유발하는 것이 중요하다. 그 중 세포수준에서 미토콘드리아 매개 세포사멸은 암에 대한 화학 요법의 주요 작용 메커니즘 중 하나로 알려져 있다. 이러한 세포사멸에서는 활성화된 Bcl-2 분자에 의해 전세포사멸(pro-apoptotic) 신호가 활성화되고, 신호전달 단백질 BAX가 미토콘드리아에서 사이토크롬 C의 방출을 자극하여, 결과적으로 세포사멸을 유도한다.

특히, 산화 스트레스에 의한 세포사멸 경로에서 지질 축적과 관련된 미토콘드리아 분열이 촉진되는데, 독소루비신과 같은 항암 물질은 대장암, 림프종, 유방암 등 다양한 암에서 세포사멸 과정에 관여하는 지질 방울의 축적을 유도하는 것으로 보고된다. 따라서, 자궁 경부암을 치료하는 중요한 전략 중 하나는 미토콘드리아 기능을 조절하여 세포사멸을 유도하는 것과 관련이 있다.

한편, 식물에서 추출할 수 있는 플라보노이드(Flavonoid)의 한 종류인 칼콘은 항산화, 항균, 항암, 항알레르기 등 다양한 이로운 효과를 가지고 있다(D.K.Mahapatra, S.K.Bharti, V.Asati, Eur. J. Med. Chem. 95(2015) 69-114). 칼콘 유도체의 한 종류인 DK-143은 정상 조직 세포에는 영향을 주지 않으면서 종양 세포의 Caspase 경로를 활성화하여 세포 사멸을 유도하며, 세포 내에서 ROS의 생산을 유도하여 세포의 스트레스를 증가시키고, 전이암을 억제하는 효능이 있다. 또한 DNA repair 효소인 PARP를 절단하여 암세포의 사멸을 유도한다고 보고된 바 있다(D.H. Lee, Y.J. Jung, D.S. Koh, Y.H. Lim, Y.H. Lee, S.Y. Shin, Cancer Lett. 372(2016) 1-9).

그러나 DK-143은 비극성이기 때문에 생체이용률이 떨어진다는 단점이 있으므로, DK-143과 같은 비극성인 약물을 체내에 전달하기 위해서 많은 방법이 연구되어 왔고, 대표적으로 나노입자(Nanoparticle, NP), 고분자 마이셀(Polymeric micelle), 리포좀(Liposome) 등을 통해 비극성인 약물을 체내에 전달하는 방법이 존재하였다.

이렇게 마이셀을 생성시키는 고분자는 기본적으로 양친성을 가지고 있어야 하며, 대표적인 고분자로 mPEG-PLA(poly (D, L-lactic acid)-poly (ethylene glycol))가 있다. mPEG-PLA는 생체 친화성이 높으며 PEG의 스텔스(stealth) 기능으로 인해 혈장에서의 안정성이 뛰어나다는 장점이 있다.

이러한 장점에도 불구하고, DK-143은 분자 내의 -OH로 인해 mPEG-PLA에 대해 로딩효율이 낮아 mPEG-PLA를 활용하는데 제한이 있다. 그러나, 최근 연구에서 두 종류의 약물을 연결하여 고분자 폴리머에 대한 로딩효율을 높인 연구결과가 보고된 바 있다(Journal of Controlled Release 254 (2017) 23-33).

DK-143과 연결할 수 있는 약물을 탐색하던 중, cyclooxygenase-2 (COX-2)는 종양 성장에 필수적인 신생혈관의 생성을 유도하는 물질이므로, COX-2의 억제는 신생혈관 생성의 억제로 이어지게 되고, 이는 곧 종양의 성장을 억제할 수 있는 기전이 될 수 있는데, 아스피린은 COX-2를 억제함으로써 종양의 신생혈관 생성을 억제하는 효과를 가지고 있다는 점에서, DK-143과 연결할 수 있는 약물의 후보군이 될 수 있었다.

더욱이 아스피린은 프로스타글란딘을 억제하여 진통, 해열, 항염, 항혈전작용을 나타내는 약물로서 알려져 있다. 또한, 최근 아스피린에 대한 위암, 식도암, 대장암에 대한 예방효과가 발표되고 있고(L.J.Marnett, Cancer res. 52(1992) 5575-5589), 유방암의 전이를 억제하는 데 도움이 된다고 보고된다. 다만, 아스피린은 과량 투약되어야만 생체내에서 항암효능을 발휘할 수 있다.

등록특허공보 제10-0962301호

본 발명은 전술한 문제점에 착안하여 안출된 것으로서, 본 발명은 고형암 타겟 항암약물의 생체 이용율을 높일 수 있는 신규한 화합물을 합성하고, 합성 화합물의 난용성을 개선하기 위한 것이다.

생체효율면이나 독성을 고려하면, 기존의 DK-143은 독성이 있는 농도는 되어야 항암효능을 기대할 수 있어 기존의 DK-143보다 농도의존적 항암효능이 우수하고 암세포 내에서와 같이 pH가 낮은 곳에서도 방출되는 신규한 화합물을 제공하기 위한 것이다.

새로운 화합물을 합성하여, 항암약물의 시너지 효과를 유도하고, 합성한 화합물을 고분자 마이셀에 로딩하여 나노입자를 제조하고, 상기 화합물의 수용성 및 생체이용률을 높여 고형암의 항암효과를 증가시키기 위한 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기의 식 (Ⅰ)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 암을 치료하기 위한, 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 암이 고형암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물 을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 담체가 mPEG-PLA(poly (D, L-lactic acid)-poly (ethylene glycol))인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식 (Ⅰ)의 화합물을 함유하는 코어(core)를 형성하는 PLA 및 상기 코어를 감싸는 쉘(shell)을 형성하는 mPEG를 포함하는, 고분자 마이셀(Polymeric micelle)을 형성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 나노입자(Nanoparticle, NP)로 형성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식 (Ⅰ)의 화합물/상기 담체의 중량비가 1:4 이상 1:6 이하인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 나노입자의 크기가 10nm 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 아스피린(아세틸 살리실산) 및 DK-143을 유기용매에 용해하고, EDC·HCl, DMAP를 이용하여 상온에서 24시간 동안 교반하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 고분자 마이셀(Polymeric micelle), 나노입자(Nanoparticle), 리포좀(Liposome), 알부민(Albumin)과 같은 생체 고분자를 이용하여 난용성 약물을 가용화 하는 방법으로서, 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물과 mPEG-PLA 고분자를 유기용매에 용해하고, 감압 농축하여 유기용매를 제거한 후, 증류수에 다시 용해하여 난용성 약물을 고분자에 로딩하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 난용성 약물을 가용화 하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 고분자 마이셀을 이용하는 것을 특징으로 하는 난용성 약물을 가용화 하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 포유동물에게 제공하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 암을 치료하기 위한 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 이를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물, 및 이의 제조방법은 다음과 같은 효과들이 있다.

본 발명에서는 칼콘(Chalcone) 유도체의 한 종류인 DK-143(2'-hydroxy-2, 3, 5'-trimethoxychalcone)과 아세틸 살리실산(acetylsalicylic acid, 아스피린(aspirin), AS로 약칭)을 결합하여 신규한 화합물을 만들었는데, 이 화합물은 정상 조직 세포에는 영향을 주지 않으면서 종양 세포의 Caspase 경로를 활성화하여 세포사멸을 유도하며, 세포 내에서 ROS의 생산을 유도하여 세포의 스트레스를 증가시키고, 전이암을 억제하는 효능이 있다.

본 발명에서는 기존의 DK-143이 비극성이기 때문에 생체이용률이 떨어진다는 단점이 있으므로 고형암 타겟 항암약물인 AS-DK143을 합성하고, AS-DK143의 난용성을 마이셀(나노입자)을 활용하여 개선할 수 있다.

본 발명에서는 항암 약물의 생물학적 활성을 규명하여, DK-143의 히드록시기와 아스피린의 카복실기를 결합함으로써 항암 약물 AS-DK143의 고분자로의 로딩 효율을 향상시킬 수 있고, 그에 따라 효과적으로 항암 활성이 이루어질 수 있는, 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 합성한 화합물을 mPEG-PLA에 로딩하여 마이셀 나노입자를 제조하고, 상기 화합물의 수용성 및 생체이용률을 높여 고형암 표적의 항암효과를 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 AS-DK143은 ROS의 발생을 증가시켜 종양 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 AS-DK143은 미토콘드리아 기능을 조절하여 세포사멸을 유도함으로써 고형암을 치료할 수 있다.

또한, 본 발명은 고형암을 표적화하여 치료하는 목적으로 사용하는 AS-DK143 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 화학 요법의 항암 치료를 받은 환자에 대해 항암 치료의 부작용을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명은 나노입자가 형성될 수 있는 중량비의 AS-DK143과 mPEG-PLA를 포함하는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 기존의 DK-143보다 농도의존적 항암효능이 우수하고 암세포의 pH수준에서 약물방출이 우수하게 나타나는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 효과들은 이상에서 언급된 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 (A) AS-DK143의 화학적 합성의 순서와 구조 및 (B) AS-DK143이 mPEG-PLA에 로딩된 모습을 나타내는 그림이다.
도 2는 AS-DK143의 구조 규명을 위한 (A) NMR 그래프 및 (B) IR 그래프이다.
도 3은 AS-DK143 나노입자의 크기를 DLS(dynamic light scattering, 동적광산란)로 나타낸 사진이다.
도 4는 각각 pH 7.4, pH 5.5의 PBS buffer에서 AS-DK143 나노입자로부터 방출된 AS-DK143의 농도를 나타낸 것이다.
도 5는 (A) 아스피린(AS), (B) DK-143 및 (C) AS-DK143의 성능비교(세포독성)를 나타내는 그래프이다
도 6은 여러 종류의 고형암 세포에서 AS-DK143이 세포사멸을 유도하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 HeLa 세포에서 AS-DK143이 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 HeLa 세포에서 AS-DK143이 지질축적을 유도하여 세포사멸을 유도하는 것을 나타낸 것이다.
도 9는 xenograft 동물모델에서 AS-DK143 나노입자의 항발암물질(anticarcinogenic)로서의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 도 9에서 미처리(untreated) 군(G1)과 600 mpk 군(G4)의 종양 및 조직에서의 H&E 염색 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은 xenograft 동물모델에서 Cy5가 로딩된 비어있는 나노입자(G5 및 G7)와 Cy5가 로딩된 AS-DK143 나노입자(G6 및 G8)의 생체 분포(Bio-distribution)를 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 기술자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 명세서에서 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 유효 성분으로서 본 발명의 AS-DK143 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료 성분을 함유할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은, 무기 염기 또는 산 및 유기 염기 또는 산을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 비독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 나타낸다.

임의의 적절한 투여 경로가, 본 발명의 AS-DK143의 유효 복용량을, 포유동물, 특히 인간에게 제공하기 위하여 적용될 수 있다. 치료적 용도에서, 상기 조성물은 임의의 편리하고 적절하거나 또는 효과적인 경로에 의해 투여될 수 있다. 적절한 투여 경로는, 공지되어 있고, 경구, 정맥, 직장, 비경구, 국소, 눈, 비강, 구강 및 폐(흡입에 의해)를 포함한다.

약제학적 조성물은 임의의 적합한 제형을 취할 수 있으며, 예를 들어, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 서방형제, 액제, 현탁제, 또는 기타 적절한 형태를 취할 수 있다.

가장 적절한 복용량 레벨은, 임의의 공지된 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자를 위한 구체적인 용량은, 사용된 화합물의 활성, 환자의 연령, 체중, 식습관(diet), 일반적 건강 및 성별, 투여 시간, 투여경로, 분비율, 임의의 다른 약물의 사용 및 치료될 질환의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에서는 DK-143이 분자 내의 -OH로 인해 mPEG-PLA에 대한 로딩효율이 뛰어나지 않다는 점을 극복하고자, DK-143과 아스피린을 결합하여 고형암 항암효능이 있는 신규 화합물을 합성하였다.

따라서, 본 발명에서는 DK-143의 분자 내에 존재하는 -OH와 아스피린의 카복실산을 연결하여 고분자의 로딩 효율을 높이고, 아스피린이나 DK-143이 단독으로 해결하지 못한 생리학적 기능을 보완, 발전시켜 AS-DK143이 고형암 특이적 항암 작용 시너지 효과를 나타내도록 설계하였다.

즉, 본 발명에서는 신규한 AS-DK143 화합물을 합성하고, 상기 화합물이 마이셀로 생체내에서 전달되도록 하여 상기 화합물이 고형암을 표적화하는 항암표적화 물질이 되도록 설계하였다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 항암 치료에 있어서 그 응용성을 확대할 목적으로 설계되었다.

실시예 1: AS-DK143의 합성

아스피린 및 2'-hydroxy-2, 3, 5'-trimethoxychalcone (DK-143)은 Sigma-Aldrich로부터 구입되었다. 상기 아스피린 및 DK-143은 에탄올 내 NaOH, 2-hydroxyacetophenone 및 3, 5-dimethoxylbenzaldehyde로 구성된 용액과 혼합되었다. 상기 혼합물은 클로로포름에 첨가되었고, 실온에서 8시간 동안 교반되었다. EDC·HCl과 DMAP를 DK-143 및 아스피린의 클로로포름 교반 용액에 첨가하고 그 혼합물을 24h 동안 상온에서 교반하였다. 모든 반응들은 TLC를 사용하여 모니터하였다. 반응의 말에, 클로로포름을 감압농축하여 제거하였다. 그 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 AS-DK143을 분리하였다(도 1의 (A)). AS-DK143의 화학적 구조는 도 1의 (A)에, 그리고 약물 전달 시스템을 위한 나노입자는 도 1의 (B)에 나타나 있다. 상기 나노입자는 코어(core)와 쉘(shell)의 구조로 되어있다. AS-DK143은 상기 코어에 함유되어 있고, mPEG-PLA 중 PLA는 코어를 형성하고, mPEG는 상기 코어를 감싸는 쉘을 형성한다. 또한, AS-DK143의 구조의 규명은 NMR 및 IR을 통해 실시되었다(도 2).

실시예 2: AS-DK143의 mPEG-PLA 폴리머 나노입자 형성

AS-DK143/poly (D, L-lactic acid) - poly (ethylene glycol) (mPEG-PLA) 나노입자(NPs)는 박막 수화법(thin film hydration method)에 의해 합성되었다. 실험을 통해 AS-DK143과 mPEG-PLA의 중량비가 1:4 미만 1:6 초과인 경우에 나노입자가 형성되지 않는다는 점을 확인하였고 또한 해당 범위 내의 중량비의 고분자 나노입자의 분산도가 작고 캡슐화 효율이 높다는 점을 확인하였다. 그에 따라 다음과 같이 AS-DK143과 mPEG-PLA의 중량비를 1:5로 하여 고분자 나노입자 형성하였다. 10mg의 AS-DK143과 50mg의 mPEG-PLA(1:5)를 디클로로메탄에 녹인 뒤 60℃에서 감압농축하여 디클로로메탄을 제거하여 라운드 플라스크 벽면에 필름 코팅을 형성시켰다. 그 뒤 필름을 증류수 5ml에 녹여 DLS (Zetasizer Nano S90, Malvern)를 이용하여 입자 크기 및 PDI값(Polydispersity index)을 측정하였다(도 3).

실시예 3: AS-DK143 로딩된 나노입자의 약물 로딩 효율

AS-DK143이 로딩된 나노입자의 약물로딩 효율은 HPLC로 측정되었다. 필름코팅 생성 후 증류수에 용해시켜 얻은 나노입자를 동결건조하였다. 동결건조가 끝난 샘플 중 20mg을 메탄올 2ml에 용해시켜 HPLC (0.6 ml/min, C18 컬럼, 용매= 메탄올 : 물 : ACN (2:1:0.2))로 측정하여 AS-DK143의 양을 확인하였다. 그에 따라 본 발명의 AS-DK143과 mPEG-PLA 나노입자의 캡슐화 효율(EE) 및 약물로딩 효율(DL)은 각각 99% 및 16%였다. 나노입자의 캡슐화 효율 및 약물로딩 효율의 계산은 다음과 같다.

EE(캡슐화 효율, Encapsulation efficiency, %)= 검출된 AS-DK143의 양 / 넣어준 AS-DK143의 양 = (9.9mg / 10mg) X 100% = 99%

DL(약물로딩 효율, Drug Loading, %) = 검출된 AS-DK143의 양 / 전체 나노입자의 양 = (3.2mg / 20mg) X 100 % = 16%

실시예 4: 각 pH별 버퍼에 따른 AS-DK143의 방출량

동결건조가 끝난 나노입자 중 20mg을 정량하여 증류수 2ml에 용해시킨 뒤 dialysis bag (MW:3500)에 넣어 양쪽 끝을 밀봉하였다. PBS buffer(pH 7.4, contained 5% tween 80) 50ml에 dialysis bag을 넣고 37℃에서 교반하였다. 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간별로 2ml의 샘플을 채취하고 2ml의 새로운 buffer로 교체하였다. 채취한 샘플을 HPLC (0.6 ml/min, C18 컬럼, 용매 = 메탄올 : 물 :ACN (2:1:0.2))로 측정하여 AS-DK143의 방출량을 확인하였다. PBS buffer (pH 5.5)에서의 실험 역시 pH를 제외하고 같은 방법으로 실시되었다(도 4).

실시예 5: AS, DK-143 및 AS-DK143의 성능비교

도 5는 4T-1 유방암 세포를 96 well에 분주하고 24시간 배양 후 새로운 배양액에 아스피린(A), DK-143(B), 신규화합물인 AS-DK143(C)을 농도별로 첨가하였다. 이후 24시간이 지난 후, 세포들의 생존능력은 37 ℃에 2시간 동안 WST-1을 처리하여 450 nm에서 분광 광도계(iMARK, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 미처리군에 대한 생존능력과 상대정량하여 세포생존능력을 정의하였다. 또한, 세포의 50%가 생존하는 농도를 IC₅₀으로 정의하였다.

실시예 6: 다양한 고형암 세포에서 AS-DK143의 세포사멸성능평가

도 6에서, HepG2 (A), BXPC-3 (B), AGS (C), Hela (D) 세포들은 37 ℃에 95% air/5% CO₂의 대기에서 10%의 FBS 및 1%의 P/S를 가진 DMEM으로 배양되었다. 각 세포들(1 x 10⁴ cells/well)은 다양한 암 세포주(HepG2, BXPC-3, AGS 및 HeLa)로서, 각각 24 시간 동안 96 well-plate에서 분주되었고, 다양한 농도의 AS-DK143으로 24시간 동안 처리되었다. 24시간이 지난 후, 세포들의 생존능력은 37 ℃에 2시간 동안 WST-1을 처리하여 450 nm에서 분광 광도계(iMARK, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 미처리군에 대한 생존능력과 상대정량하여 세포생존능력을 정의하였다. 또한, 세포의 50%가 생존하는 농도를 IC₅₀으로 정의하였다. (E) 신규한 화합물 AS-DK143을 농도별로 처리하여 HeLa의 세포 사멸을 관찰한 결과는 도립 현미경(Nikon, Tokyo, Japan) 하에서 CCD 카메라로 촬영하여 기록되었다.

실시예 7: HeLa 세포에서 AS-DK143의 세포사멸 유도

도 7의 Tunnel assay 법을 활용한 세포사멸분석(A)에서는 HeLa 세포가 0.5 x 10⁴ cells/well으로 8 챔버 슬라이드(chamber slide)에 플레이팅(plate)되었고, 세포는 4%의 포름알데하이드(PFA)에 고정되었고, 실온(RT)에서 5분 동안 0.1%의 TritonX-100 용액에 퍼밍(perm)되었다. 세포들은 5분 동안 평형 버퍼(Equilibration buffer)에서 인큐베이팅되었고 1시간 동안 평형 버퍼, 비오티닐레이티드 뉴클레오티드 믹스(biotinylated nucleotide mix) 및 rTdT 효소로 구성된 rTdT 반응 용액으로 처리되었다. 세포는 2X SSC 버퍼(NaCl 및 소듐 시트레이트)에 담겼고 PBS로 세척되었다. 세포는 30분 동안 Streptavidin HRP로 인큐베이팅되었다. 세포는 DAB 용액(DAB chromogen 및 DAB substrate)으로 반응되었다. 세포는 광학 현미경을 사용하여 관측되었다. (B) Hoechst assay는 세포사멸시 응축되는 세포의 핵을 분석하는 것으로, 세포는 Hoechst 용액에 실온(RT)에서 20분 동안 인큐베이팅되었다. 형광은 Zeiss KSM 780 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관측되었다. (C)는 immunocytochemistry assay를 활용하여 분석한 결과로서, 세포사멸시, 증식인자 KI67이 감소하는 것을 근거로, KI67을 바이오마커로 선정하여 분석을 실시하였다. HeLa 세포는 30mm 디쉬에서 시딩되었고 24시간 동안 AS-DK143을 함유한 나노입자로 처리되었다. 세포는 10분 동안 4%의 포름알데하이드를 사용하여 고정되었고, 15분 동안 0.1%의 Triton-X 100을 사용하여 퍼밍되었다. 세포는 실온(RT)에서 1시간 동안 5%의 BSA를 사용하여 블록되었고, 그 후 세포는 4℃에서 24시간 동안 제1 항체(anti-KI67)로 인큐베이팅 후에, 형광 결합하는 제2 항체로 1시간 동안 인큐베이팅되었고, 형광현미경 하에서 분석되었다. (D) mRNA 수준에서 BAX, Bcl-2, p53의 발현분석을 실시하기 위해 리얼 타임 PCR을 수행한 결과이다. 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 분리되었고 클로로포름으로 혼합되었다. 상청액은 4℃에 20시간 동안 iso-propanol으로 인큐베이팅되었고 4℃에서 15분 동안 16,000 rpm으로 회전하는 원심분리기 내에서 분리되었다. 총 RNA의 양은 나노드롭(nanodrop)(Thermofisher)에 의해 정량화되었다. cDNA 합성에 대해, lug RNA 및 Superscript Ⅲ First Strand cDNA 합성 키트가 사용되었다. 정량 PCR(Quantitative PCR)은 SYBR master mix를 가진 Exicyler™ 96 (Bioneer, Chungchungbok-do, Korea)에서 수행되었다. PCR 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95℃에서 초기 변성; 95℃에서 10초동안 변성의 40 사이클, 30초 동안 60℃에서 어닐링; 72℃에서 30초 동안 신장(extension)을 포함한다. 프라이머 시퀀스(primer sequence)는 다음과 같다: ACC1 포워드 : 5'-TGA TGT CAA TCT CCC CGC AGC -3'; ACC1 리버스 : 5'- TTG CTT CTT CTC TGT TTT CTC CCC -3'; BAX 포워드 : 5'-GCG TCC ACC AAG AAG CTG AG -3'; BAX 리버스 : 5'- ACC ACCC TGG TCT TGG ATC C -3'; Bcl-2 포워드 : 5'- TGT GGC CTT CTT TGA GTT CG -3'; Bcl-2 리버스 : 5'-TCA CTT GTG GCC CAG ATA GG -3'; p53 포워드 : 5'- TGT GGA GTA TTT GGA TGA CA -3'; p53 리버스 : 5'- GAA CAT GAG TTT TTT ATG GC -3'; β-액틴 포워드 : 5'- GTG ATG GTG GGC ATG GGT C -3'; β-액틴 리버스 : 5'- ACG GCC AGA GGC GTA CAG GG -3'. 상대 mRNA 수준은 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었고 β-액틴으로 표준화되었다.

실시예 8: AS-DK143 처리에 따른 지질 축적 후 세포사멸현상 분석

도 8에서는 살아있는 세포에 신규화합물의 효과를 탐지하기 위해, HeLA 세포를 Tomodish (60mm)에 플레이팅하고 AS-DK143로 처리하였다. (A) 살아있는 세포의 3D 홀로토모그래피 이미지는 HT-1(Tomocube, Chunchungbok-do, Korea)을 사용하여 얻어졌다. 세포 구조는 디지털 마이크로미러 장치(micromirror device)를 사용하여 스캔되었고 3-D RI 토모그램을 사용하여 재구성되었다. 세포질의 질량과 지질 방울은 각각 0.135 mL/g 및 0.178 mL/g를 기초로 분석되었다. 물질처리 시간별 영상을 기록하였다. (B) 24시간 뒤의 지질축적량을 통계적으로 정리하였다. (C) 지방산 수송체인 CD36의 mRNA 발현을 리얼 타임 PCR로 확인하였다. PCR 확인시 사용된 CD36의 프라이머는 포워드 5' -GAT GAC GTG GCA AAG AAC AG- 3', 리버스 5' -TCC TCG GGG TCC TGA GTT AT -3'이다. (D) 세포사멸시 미토콘드리아는 분해되어 나타나는데, HeLa 세포는 1 x 10⁵ cells/well의 밀도에 30mm의 콘포컬 디쉬(confocal dish)에 플레이팅되었고, 세포는 24시간 동안 AS-DK143으로 처리되었다. 세포는 37 ℃에 30분 동안 500 nM MitoTracker™ Red (excitation: 579 nm, emission: 599 nm)에 로딩되었다. 세포는 새로운 배지로 대체되었고, 미토콘드리아 이미지는 Zeiss KSM 780를 사용하여 얻어졌다. 약물처리시 미토콘드리아의 소실이 분석되어진 것을 나타낸다.

실시예 9: 고형암 xenograft 동물모델에서 AS-DK143 나노입자의 투여에 따른 항암효능분석

도 9는 고형암 항암효능을 분석하기 위해 발광 4T-1(4T-1 luc)을 배양하고 있는 xenograft 동물모델을 활용하여, 동물모델에서 AS-DK143의 고형암 항암효능을 설명하기 위한 것으로, 4T-1 luc 세포를 주입하여 xenograft 동물모델을 만들어, 해당 동물의 종양의 크기가 100mm³에 달하게 하고 무작위적으로 시험군을 분리하였다. 분리된 시험군에 대해 미처리, 150 MPK NP-AS-DK143처리, 300MPK NP-AS-DK143처리, 600MPK NP-AS-DK143처리가 2일 간격으로 미정맥주사를 통해 14일간 수행되었고, 종양의 크기가 측정되었다. (A) 종양 크기 변화 측정시 생체영상장비(IVIS)를 통해 루시퍼라제의 발광 정도를 기록하고, 그래프화 하였다. (B) 일자별 발광정도의 차이는 사진으로 기록하였다.

도 10은 도 9에서 미처리(untreated) 그룹(G1)과 600 NP-AS-DK143처리 그룹(G4)의 종양 및 조직의 H&E 염색 이미지를 나타낸다. (A) 종양의 사멸 영역을 사진에서 붉은색 선으로 나타냈고, 이 영역의 면적을 그래프로 나타냈다. (B) 조직(심장, 폐, 간, 비장, 신장)을 H&E 염색하였고, 여기서 나노입자와 관련된 독성이 나타나지 않았다.

도 11은 xenograft 동물모델에서 Cy5가 로딩된 비어있는 나노입자(G5 및 G7)와 Cy5가 로딩된 AS-DK143 나노입자(G6 및 G8)의 생체 분포(Bio-distribution)를 나타낸 것이다. (A) 24 시간 후 종양에서 고강도 형광이 관찰되었으나, 폐, 간, 신장 및 비장 조직에서는 낮은 강도의 형광이 관찰되었다. (B) 48 시간 후, 종양과 간에서 형광이 관찰되었다. 이 결과는 나노입자가 종양에 대해 안정적이고 선택적이라는 것을 나타낸다.

결과

고형암 세포주에 대한 AS-DK143의 성능평가

먼저, 신규한 화합물 AS-DK143은 도 1의 (A)에서 제시한 바와 같이 합성하여, 클로로포름에 녹인 뒤 고형암 세포 4T-1를 대상으로 실시예 5와 같이 성능을 분석한 결과, 아스피린과 DK-143 처리시 IC₅₀은 각각 4,955μM 과 49.30μM 로 나타났다. 반면, 신규한 화합물 AS-DK143은 39.61μM의 세포사멸효능을 나타내었다(도 5).

AS-DK143을 함유하는 나노입자(NPs)의 제조와 항종양 효과 평가

AS-DK143은 mPEG-PLA에 내에 함유되고, AS-DK143이 포함된 mPEG-PLA는 나노입자로 형성되었다(도 1의 (B)). 확인된 나노입자의 크기는 생체내에 활용에 적정한 크기인 10nm~100nm 수준이었다(도 3). 이들이 생체내에서 방출될 수 있는지와 암을 타겟팅(target)하는 물질이 될 수 있는지를 분석하기 위해 pH 5.5 ~ 7.4 수준에서 분석하였다. 즉, 통상적으로 암 세포내에서 pH는 매우 낮은데, 본 발명의 결과에서와 같이, AS-DK143의 처리 후 12시간 내에서는 정상의 pH수준(pH 7.4) 보다 암세포의 pH수준(pH 5.5)에서 약물방출이 우수하게 나타내는 것으로 확인되었다(도 4). 본 발명자는 이에 그치지 않고, 고형암에 대한 항암효능을 연구하기 위해서 HepG2, BXPC-3, AGS 및 HeLa 와 같은 4개의 세포주에 대한 AS-DK143의 항종양 효과를 확인하기 위해, 세포 생존능력 어세이를 수행하였다. 여기서, 세포(1x10⁵ cells/ well)는 시딩되었고 DMEM(10%의 FBS 포함)에 인큐베이팅되었고, 그 후 세포는 24시간 동안 AS-DK143의 농도를 증가시키면서 처리되었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 억제하는 속도는 WST-1 어세이에 의해 결정되었다. 분석 결과, AS-DK143의 IC₅₀ 수치는 HepG2, BXPC-3, AGS 및 HeLA 세포에서 각각 18.54 μM, 35.74 μM, 9.282 μM 및 4.171 μM이었다. 특히, AS-DK143은 다른 세포에 비해 낮은 농도에서 HeLa 세포의 세포사멸을 유도하였다.

보다 상세하게, 도 7은 AS-DK143의 세포사멸 효과를 결정하기 위해, (A) Tunnel 어세이, (B) Hoechst 염색, (C) 면역세포화학 및 (D) 리얼 타임 PCR을 수행하였다. 비히클은 tunnel 용액에서 염색되지 않은 것으로 나타난다. 대조적으로, AS-DK143은 농도 의존적인 방식에서 양성적으로 tunnel 염색된 세포를 유도한다. 다음으로, Hoechst 및 KI67을 사용하여 면역세포화학법을 수행하였다. 막 투과성이 있는 Hoechst를 사용하여 뉴클레올러스의 형태를 확인할 수 있다. 세포의 사멸이 증가될 경우 핵이 응축되는 형태를 띄게 되는데, AS-DK143는 뉴클레올러스의 응축을 유도한다. 즉, 도 7의 (B)는 AS-DK143이 뉴클레올러스(nucleolus)의 통합 형태를 유도했다는 것을 나타내고 이는 곧 AS-DK143이 세포사멸을 유도했다는 것을 나타낸다. 도 7의 (C)는 AS-DK143에 의해 KI67의 발현이 하향 조절된다는 것을 나타내고, 이는 AS-DK143의 항암 효능을 증명하는 것이다. 다음으로, 세포사멸 신호를 확인하기 위해, p53, BAX 및 Bcl-2의 mRNA의 분석을 수행하였다. 도 7의 (D)에 나타난 바와 같이, AS-DK143은 p53, BAX 및 Bcl-2 같은 세포사멸 신호를 유의미하게 유도한다.

더욱이 도 8은 HeLa 세포의 세포사멸을 유도하는 AS-DK143이 암세포에 전달된 후 지질축적을 유도하여 세포사멸을 일으키는 것을 보여준다. 실시예 8의 방법을 통해서 AS-DK143이 지질의 축적을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 살아있는 세포 이미징(imaging)의 분석 및 홀로토모그래피 현미경을 사용하여 3D-홀로그래픽 이미징, 및 리얼 타임 PCR을 사용하여 CD36의 mRNA 발현의 측정을 각각 수행하였다. 처음으로, HeLa 세포는 2시간 동안 AS-DK143(10 μM)으로 처리되었다. 도 8의 (A)에 나타난 바와 같이 2D 이미지는 세포 형태를 나타낸다. 그리고 세포사멸체 형성은 시간 의존적인 방식으로 표현된다. 3D 이미지는 지질 방울(적색)을 나타낸다. 그리고 지질 축적은 시간 의존적인 방식으로 표현된다.

다음으로, 살아있는 세포에서 지질 질량을 테스트하기 위해, 3D-홀로그래픽 이미징 어세이를 수행하였다. HeLa 세포는 24시간 동안 AS-DK143(10 μM)으로 처리되었다. 비히클 조건에서는 지질의 축적이 변하지 않은데 반해, AS-DK143에서는 지질이 HeLa 세포에서 유의미하게 증가하였다. AS-DK143 조건의 지질 질량은 비히클과 비교해서 대략 6배 증가된 것을 나타내었다.

다만, 세포수준에서의 실험은 제한적일 수밖에 없으므로, 본 발명자들은 동물실험을 통해 AS-DK143의 항암 효능을 검증하고자, AS-DK143을 함유하는 나노입자(NPs)가 xenograft 동물모델에 미치는 영향을 추가적으로 분석하였다. 도 9를 참조하면, 종양이 몸에서 증식하고 있는 동물에 NPs를 처리하여 14일간 종양크기를 분석한 결과 AS-DK143은 농도 의존적으로 항암 효능을 나타내었다.

결론

고형암의 치료요법은 병변의 진행에 따라 외과적인 방법이 고려된다. 외과적인 방법을 적용하기 어려운 경우, 독소루비신과 같은 항암제가 자궁 경부암 및 다양한 암종(carcinomas)에 적용될 수 있다. 그러나 독소루비신과 같은 안트라사이클린계 항암제(anthracycline-based anticancer drugs)는 심장 세포에 독성 및 영구적인 손상을 유발한다고 보고되었다. 따라서 부작용을 줄이고 항암 효능을 나타내는 약물을 적용하기 위해, 그러한 효능을 가지는 화합물을 찾는 것이 항암 치료 전략의 중요한 요소이고, 상기 화합물로 항암 치료를 하여 환자의 생존율을 높이고, 항암치료의 부작용으로 인한 환자의 체력 저하로 진행하기 어려웠던 환자의 수술을 가능하게 할 수 있다.

항암제 후보물질이 될 수 있는 칼콘계 화합물을 항암물질로 활용하려는 많은 노력에도 불구하고, 칼콘계 화합물은 생체효율이 낮아 활용에 제한이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위해서 개발된, 본 발명의 AS-DK143은 칼콘계 화합물인 DK-143에 비해, 그 항암 효능이 향상되었을 뿐만 아니라, 마이셀을 형성하는 나노입자에 로딩이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 생체이용효율이 증대되었다. AS-DK143은 HepG2, BXPC-3 및 AGS와 같은 다양한 암 세포주에서도 효과가 있으며 특히, HeLa 세포에 강한 세포독성 효과를 나타낸다. AS-DK143이 HeLa 세포의 세포 사이클을 통제한다는 것은 이러한 결과들을 뒷받침한다.

또한, 미토콘드리아 기초 세포 신호에 의해 암세포의 세포사멸이 유도되는데, 이러한 세포사멸에서는 활성화된 Bcl-2 분자에 의해 전세포사멸(pro-apoptotic) 신호가 활성화되고, 신호전달 단백질 BAX가 미토콘드리아에서 사이토크롬 C의 방출을 자극하여, 결과적으로 세포사멸을 유도한다. 따라서, Bcl-2의 발현당 BAX의 비율이 증가하는 것은 항암제에 의한 세포사멸 신호가 양성적으로 유도되고 있다는 것을 나타낸다.

본 발명의 아스피린과 결합된 2'-hydroxy-2, 3, 5'-trimethoxychalcone (AS-DK143)이 나노입자로 제조되어, AS-DK143을 암세포에 처리하면 CD36의 발현을 증가시키고 지질 방울을 증가시킨다는 것이 관측되므로, AS-DK143이 지질 축적을 유도한다는 것이 확인되었다.

상기 실험의 결과는 본 발명의 AS-DK143이 지질 축적을 통해 세포사멸을 유도하는 것을 나타낸다. 또한, AS-DK143이 부작용 없이 고형암에 대항하여 잠재적인 후보군이 될 수 있다는 것을 나타낸다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 한다.

또한 이상 설명한 본 발명의 구성요소를 선택적으로 결합한 실시예 역시 본 발명의 권리범위에 속한다는 것은 당연하다.

Claims

하기의 식 (Ⅰ)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
[식 (Ⅰ)]

.
암을 치료하기 위한, 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 담체는 mPEG-PLA(poly (D, L-lactic acid)-poly (ethylene glycol))인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 식 (Ⅰ)의 화합물을 함유하는 코어(core)를 형성하는 PLA 및 상기 코어를 감싸는 쉘(shell)을 형성하는 mPEG를 포함하는, 고분자 마이셀(Polymeric micelle)을 형성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
나노입자(Nanoparticle, NP)로 형성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 식 (Ⅰ)의 화합물/상기 담체의 중량비는 1:4 이상 1:6 이하인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 나노입자의 크기는 10nm 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
아스피린(아세틸 살리실산) 및 DK-143을 유기용매에 용해하고, EDC·HCl, DMAP를 이용하여 상온에서 24시간 동안 교반하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물의 제조방법.
고분자 마이셀(Polymeric micelle), 나노입자(Nanoparticle), 리포좀(Liposome), 알부민(Albumin)과 같은 생체 고분자를 이용하여 난용성 약물을 가용화 하는 방법으로서, 제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물과 mPEG-PLA 고분자를 유기용매에 용해하고, 감압 농축하여 유기용매를 제거한 후, 증류수에 다시 용해하여 난용성 약물을 고분자에 로딩하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 난용성 약물을 가용화 하는 방법.
제10항에 있어서,
고분자 마이셀을 이용하는 것을 특징으로 하는 난용성 약물을 가용화 하는 방법.
제1항에 따른 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 포유동물에게 제공하는 단계를 포함하는 암의 치료방법.