JPWO2012176885A1 - 分岐型両親媒性ブロックポリマー、それを用いた分子集合体及び薬剤搬送システム - Google Patents
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Abstract
Description
このため、短時間の間にイメージングを行うことは困難であった。
とりわけ、18F-PETのような短半減期(18Fの半減期は110分)の放射線核種を用いたイメージング(放射線診断)の分子プローブのナノキャリアとしてラクトソームを適応することは困難であった。
このため、免疫学的メモリー効果が低下するまでの間、ラクトソームを複数回投与ができないといった問題があった。
(1)
サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する、分岐型両親媒性ブロックポリマー。
(2)
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が2〜200個である、(1)に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
(3)
前記親水性ブロックの分岐数が3である、(1)又は(2)に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
(4)
前記ポリ乳酸を構成する乳酸単位が10〜400個である、(1)〜(3)のいずれかに記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
(5)
前記疎水性ブロックが分岐していない、(1)〜(4)のいずれかに記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における1つの炭素原子から分岐している、(5)に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
下記式(I):
(式中、n1、n2及びn3は、それらの合計が3〜200となる数、mは15〜60の数を表し、Rは、水素原子又は有機基を表す。)
で示される構造を有する、(6)に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、0.05以上1.8未満である、(1)〜(7)のいずれかに記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
(1)〜(8)に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマーを有する分子集合体。
(10)
親水性ブロックとして1本のポリサルコシン鎖と、疎水性ブロックとして1本のポリ乳酸鎖とを有する直鎖型両親媒性ブロックポリマーをさらに有する、(9)に記載の分子集合体。
(11)
シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる機能性物質を内包する、(9)又は(10)に記載の分子集合体。
(12)
前記物質がポリ乳酸鎖を有するものである、(11)に記載の分子集合体。
(13)
前記分岐型両親媒性ブロックポリマーが、シグナル基及びリガンド基からなる群から選ばれる機能性基を有するものである、(9)又は(10)に記載の分子集合体。
(14)
粒子径が10〜50nmである、(9)〜(13)のいずれかに記載の分子集合体。
以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、(9)〜(14)のいずれかに記載の分子集合体。
以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、(9)〜(14)のいずれかに記載の分子集合体。
(11)〜(16)のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送システム。
本発明の両親媒性ブロックポリマーは、サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、リンカー部を介して結合している。
[1−1.親水性ブロック]
本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーの親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロックの全体が、後述の疎水性ブロックとしてのポリ乳酸鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロックが疎水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。具体的には、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、2〜200、2〜100、又は2〜10個でありうる。あるいは、複数の親水性ブロック全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、30〜200、又は50〜100個でありうる。1つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、1〜60、1〜30、1〜10、又は1〜6でありうる。すなわち、親水性ブロックそれぞれは、サルコシン又はポリサルコシン鎖を含んで構成されることができる。
構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
さらに、親水性ブロックは、末端(すなわちリンカー部と反対側の末端)に親水性基(例えば水酸基に代表される)を有していることが好ましい。
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
本発明において、疎水性ブロックは、ポリ乳酸鎖を含むものである。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。具体的には、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、乳酸単位の数は、例えば5〜100、15〜60個、又は25〜45個でありうる。疎水性ブロックが分岐している場合は、分岐全てに含まれる乳酸単位の数の合計が、例えば10〜400、好ましくは20〜200個でありうる。この場合、1つの分岐当たりの乳酸単位数の平均は、例えば、5〜100、好ましくは10〜100個である。
構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
例えば、疎水性ブロックにおける当該乳酸単位が、L−乳酸単位のみで構成されてもよいし、D−乳酸単位のみで構成されてもよいし、L−乳酸単位とD−乳酸単位との両者から構成されてもよい。疎水性ブロックは、上記例示のものから選ばれた1種が単独で使用されてもよいし、複数種が組み合わされて使用されてもよい。
本発明の両親媒性ブロックポリマーにおいて、サルコシン単位数(すなわち、親水性ブロックの分岐全てに含まれるサルコシン単位の数の合計)をNSとし、ポリ乳酸単位数(すなわち、疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数、又は、疎水性ブロックが分岐している場合は分岐全てに含まれる乳酸単位数の合計)をNLとすると、それらの比NS/NLは、例えば0.05〜5又は0.05〜4でありうる。
さらに好ましくは、NS/NLは、0.05以上1.8未満、例えば0.05以上1.7以下、0.05以上1.67以下、0.1以上1.7以下、又は0.1以上1.67以下であってよい。
親水性ブロックと疎水性ブロックとを連結するリンカー部位の構造は、化学的に許容可能な構造であれば特に限定されるものではない。
例えば、親水性ブロック側の分枝の数が2である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある1つのN原子から、ポリサルコシン鎖を含む2本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているN原子が、直接的又は間接的に2本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。
親水性ブロック側の分枝の数が3を超える場合は、分枝がさらなる分岐構造を有するように分子設計されることができる。
疎水性ブロック側も分岐している場合についても、上記と同様の観点で分子設計されることができる。
分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成においては、疎水性ブロック部(ポリ乳酸部)の合成、親水性ブロック部(サルコシン部又はポリサルコシン部)の合成、及びそれらブロックを連結するリンカー部の合成がなされる。
また例えば、サルコシンをリンカー試薬に付加させた後に、又は、ポリサルコシン鎖を親水性ブロックとして予め重合反応により調製し、リンカー試薬に付加させた後に、ポリ乳酸鎖を伸長させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
さらに例えば、ポリサルコシン又はポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の両方をそれぞれ親水性ブロック及び疎水性ブロックとして予め用意しておき、別途合成されたリンカー試薬を用いてそれらブロックを連結させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
例えば、親水性ブロック側分岐数が3である分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合のリンカー試薬は、例えば2,2,2-トリエタノールアミン(Tris)構造を元に調製することができる。
ペプチド合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、N−カルボキシサルコシン無水物(サルコシンNCA)を開環重合することなどによって行うことが好ましい。
ポリエステル合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことが好ましい。
本発明の分子集合体(ラクトソーム)は、上記の分岐型両親媒性ポリマーの凝集により、或いは自己集合的な配向により成り立つ構造体である。本発明は、内側(コア部)が疎水性ブロック、外側が親水性ブロックとなるように構成されたミセル形状の分子集合体であることが実用性の観点から好ましい。本発明における分子集合体には、分岐型両親媒性ブロックポリマーから構成されるもの(単独系)、及び分岐型両親媒性ブロックポリマーと直鎖型両親媒性ブロックポリマーとから構成されるもの(混合系)を含む。
また、本発明の分子集合体は、適当な機能性構造を具備することによって、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
分岐型両親媒性ブロックポリマーは、分岐鎖としての複数のポリサルコシン鎖の存在により、直鎖型両親媒性ブロックポリマーに比べて親水性部位の分子断面積が大きくなる。このため、分岐型両親媒性ブロックポリマーから形成された分子集合体は、粒子としての安定性に優れている。さらにこの粒子は大きな曲率を備えることができる。このことから、本発明の分子集合体は、後述するように粒子の小型化が可能になるという基本的特徴を有する。
本発明の分子集合体に、分岐型両親媒性ブロックポリマーの他に混合される直鎖型両親媒性ブロックポリマーとしては、従来のラクトソームの構成要素として用いられてきた両親媒性ブロックポリマーであってもよいし、従来のラクトソームの構成要素になりえなかった両親媒性ブロックポリマーであってもよい。なお、従来のラクトソームの構成要素として用いられてきた両親媒性ブロックポリマーとは、それのみでも自己集合体として粒子を形成することができるポリマーである。具体的には、サルコシン単位数をNSとし、ポリ乳酸単位数をNLとすると、それらの比NS/NLが例えば1.8以上(この範囲に含まれる上限値は特に限定されないが、例えば5又は4)となるポリマーである。一方、従来のラクトソームの構成要素になりえなかった両親媒性ブロックポリマーとは、親水性ブロック及び疎水性ブロックから構成されるコポリマー分子全体として両親媒性を呈するものの、それのみでは自己集合体として粒子を形成することはできないポリマーである。具体的には、NS/NLが例えば1.8未満、例えば1.7以下又は1.67以下(この範囲に含まれる下限値は特に限定されないが、例えば0.05又は0.1)となるポリマーである。
本発明の分子集合体の粒子径は、例えば10〜50nmでありうる。この範囲に含まれる上限値は、35nm、30nm、25nm、又は20nmであってもよい。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。本発明の分子集合体は、既に述べたように、両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックの分岐構造により、基本的に、従来のものに比べて粒子径が小さい傾向にある。
一方、混合系の分子集合体の粒径は比較的大きい傾向にある。具体的には、混合系の分子集合体の粒子径は例えば20〜50nmでありうる。この範囲に含まれる下限値は、25nm、30nm、25nm、30nm又は35nmであってもよく、上限値は、35nmであってもよい。
本発明の分子集合体は、分子イメージングシステムや薬剤搬送システムに用いられる場合に有用となる形態や機能などを持たせることができる機能性構造を備えることができる。これによって、本発明の分子集合体は、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
機能性構造を備える分子集合体の具体的態様としては、分子集合体を構成する両親媒性ブロックポリマー自体にシグナル基及びリガンド基からなる群から選ばれる機能性基が結合している態様、及び、分子集合体がシグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる機能性物質を内包する態様が挙げられる。
機能性基は例えば有機基であり、分子集合体の用途に応じて当業者によって適宜選択されるものである。機能性基としては、シグナル基及びリガンド基が挙げられる。
本発明においては、近赤外蛍光基(例えばシアニン系色素、量子ドットなどに由来する基)を用いることが好ましい。
細胞接着ペプチドの例としては、RGD(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸)などの接着因子が挙げられる。
糖鎖の例としては、カルボキシルメチルセルロース、アミロースなどの安定剤や、ターゲット部位の細胞に発現しているタンパク質への特異的結合能を有するものが挙げられる。
水溶性高分子の例としては、ポリエーテル鎖、ポリビニルアルコール鎖などの高分子が挙げられる。
機能性物質は、シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれるものである。この物質は、疎水性化合物であり、分子集合体の疎水コア部に位置することによって内包される。
シグナル剤としては、上述のシグナル基を有する分子を用いることができる。その中でも、本発明においては、インドシアニングリーン系色素などの近赤外蛍光物質や、18Fなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などの放射性元素含有物質が好ましい場合がある。
薬剤としては、対象となる疾患に適したものが当業者によって適宜選択される。具体的には、抗がん剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤などが挙げられる。これら薬剤分子は、単独で又は複数種の組み合わせで用いることができる。
ポリ乳酸基は、乳酸単位を主たる構成成分とする基である。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。基本的に、ポリ乳酸基の構造、鎖長及び光学純度は、上述の疎水性ブロックの分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、機能性物質と両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックとの親和性に優れるという効果も得られる。
分子集合体の作成法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる機能性構造の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。
なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
本発明における分岐型両親媒性ブロックポリマーは低沸点溶媒への溶解性を有するため、フィルム法を用いた分子集合体の調製が可能である。
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器(例えばガラス容器)中に、分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液(例えば分岐型両親媒性ブロックポリマーと機能性物質とを有機溶媒中に含む溶液)を用意する工程;前記の溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁に分岐型両親媒性ブロックポリマーを含むフィルム(例えば分岐型両親媒性ブロックポリマーと機能性物質とを含むフィルム)を得る工程;及び、前記の容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、フィルム状物質を、分子集合体(例えば機能性物質を内包する分子集合体)に変換して分子集合体の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
混合系の分子集合体を調製する場合は、直鎖型両親媒性ブロックポリマーは分岐型両親媒性ブロックポリマーに混合させた状態で各工程を行えばよい。
このような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られた分子集合体の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、分子集合体を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、分子集合体の分散液を得ることによって、分子集合体を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
インジェクション法は、以下の工程を含む。すなわち、容器(例えば試験管など)中に、分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程、及び有機溶媒を除去する工程が行われる。さらに、インジェクション法は、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
インジェクション法に用いる有機溶媒としては、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。
水又は水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行うことができる。
[3−1.分子集合体の投与対象]
本発明の薬剤搬送システム及び分子イメージングは、上記の分子集合体を生体内に投与することを含む。分子集合体を投与される生体としては特に限定されないが、ヒト又は非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類(マウス、ラットなど)、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射(針有型、針無型)、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
本発明の分子イメージングにおいては、投与された分子集合体に由来するシグナルを検出する工程を含む。投与された分子集合体を検出することによって、体外から投与ターゲットの様子(特にがんなどの組織の位置・大きさ)を観測することができる。
検出方法としては、投与された分子集合体を可視化させることができるあらゆる手段を用いることができる。当該手段としては、分子集合体が有するシグナル基又はシグナル物質の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
本実施例においては、1本のポリ乳酸(L−ポリ乳酸;PLLA)鎖に3本のポリサルコシン(PS)鎖が結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。
具体的な合成手順は以下の通りである。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 1.9 g(0.016 mol)のEtOH溶液(75 mL)にBoc-glycine 2.5 g(0.014 mol)とEEDQ 6.0 g(0.024 mol)とを加え、リフラックス(95℃)しながら4.5時間撹拌した。反応終了後、濾紙で沈殿物を取り除き、EtOHを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、CHCl3/MeOH混合比(v/v)が1/0、40/1、及び10/1のものの順に用いた)。得られた生成物2の重量は3.2 g(0.012 mol)、収率82%であった。
化合物2(278 mg, 1.0 mmol)、Cbz-Sar-OH(804 mg, 3.6 mmol)、DCC(887 mg, 4.3mmol)、及びDMAP(26 mg, 0.21 mmol)の混合物に氷冷したジクロロメタンを10 mL加えた後、室温にて一晩撹拌した。反応終了後、酢酸エチルにて洗浄し、白色沈殿(ウレア)を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、n-ヘキサン/酢酸エチル混合比(v/v)が2/1、1/1、及び1/2のものの順に用いた)。これにより、目的とする化合物3(719 mg)を収率84%で得た。
氷冷した化合物3(710 mg)に4 mol/L HCl/Dioxane(7.0 mL)を加えて溶解させた後、室温で5分撹拌した。その後、反応溶液から溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った(溶離液は、CHCl3/MeOH混合比(v/v)が10/0のものを用いた)。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHCl塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物4を得た。
具体的な合成手順は以下の通りである。
開始剤4(485 mg, 0.61 mmol)の溶解したDMF溶液(2 mL)に開始剤に対して15等量(1.32 g, 9.2 mmol)のl-lactide(5)とDMAP(75 mg, 0.61 mmol)とを加えた後、アルゴン雰囲気下中、55℃にて一晩(約15時間)撹拌した。減圧留去によって反応溶媒であるDMFをある程度除去、濃縮した後、冷MeOH中に滴下した。得られた白色沈殿を遠心分離することによって回収することで、化合物6を得た。
化合物6をジクロロメタン10 mLに溶解させ、反応溶液を0 ℃に冷却した後、25% HBr-AcOHを20 mL加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた白色沈殿についてNMR測定を行うことによって、Cbz基の脱保護が完了していることを確認した。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHBr塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物7を得た。
化合物7をマクロイニシエーターとして親水性部位の重合反応を行った。化合物7のDMF溶液に、開始剤に対して40又は60当量のSar-NCAを加えた後、Sar-NCA濃度が0.50 Mとなるように調整した。室温にて24時間撹拌し化合物8を得た後、グリコール酸とHATU及びDIEAとをそれぞれ加え、更に24時間撹拌した。反応終了後、サイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex LH20, 溶離液:DMF)を用いて濃縮した反応溶液を精製し、目的の両親媒性ブロックポリマー9を得た。
本実施例においては、実施例1で得られた分岐型両親媒性ブロックポリマー9から分子集合体(高分子ミセル;ラクトソーム)をフィルム法によって調製した。
1.0 mgの分岐型両親媒性ブロックポリマー9を適量のクロロホルムに溶解させた後、溶媒を減圧留去することによって試験管壁にポリマーフィルムを形成した。一晩真空乾燥させ、クロロホルムを十分に除去したフィルムに生理食塩水1.0 mLを加え、85 ℃の水浴中にて5分間バス型ソニケーターにて超音波処理することで分子集合体の分散液を調製した。
得られた分散液について、動的光散乱(DLS)、透過型電子顕微鏡(TEM)による観察を行った。
図3に、TEM観察結果を示す。図3においては、縮尺の異なる3種類の写真を示す。図3より、粒子径が20 nm前後の小さな粒子径を有する高分子ミセル(小粒径ラクトソーム)が得られていることが確認された。
1本のポリ乳酸(L−ポリ乳酸;PLLA)鎖に1本のポリサルコシン(PS)鎖が結合した直鎖型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。
[アミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)の合成]
L−ラクチド(11)とN−カルボベンゾキシ−1,2−ジアミノエタン塩酸塩(12)とを用いて、アミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)を合成した。
サルコシン−NCA(Sar-NCA)とアミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)とから、両親媒性物質ポリサルコシン−ポリL-乳酸(PSL1)を合成した。
サルコシン−NCA(Sar-NCA)とポリ(ロイシン−アミノイソブチル酸)(LAI)とから、両親媒性物質サルコシン−ポリ(ロイシン−アミノイソブチル酸)(SLA)を合成した。
上記の直鎖型ポリ乳酸系両親媒性ブロックポリマーのクロロホルム溶液(0.2 mM)を調製した。その後、溶媒を減圧留去しガラス容器の壁面にフィルムを形成させた。さらに、フィルムを形成したガラス容器内に、水又は緩衝液中に分散させ、温度60℃で30分間超音波処理を行うことにより、分子集合体の分散液を得た。
また、得られた分散液を液体窒素で凍結し、減圧下で昇華させることにより凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物に、再度水を加えラクトソームを得た。
直鎖型両親媒性ブロックポリマーのみを構成要素とする分子集合体の粒子系は、35nmであった。
本実施例においては、実施例1で得られた分岐型両親媒性ブロックポリマーと、比較例1で得られた直鎖型両親媒性ブロックポリマーとの混合物から、分子集合体(高分子ミセル;ラクトソーム)をフィルム法によって調製した。
図4にDLS測定結果を示す。図4において、横軸は直鎖型両親媒性ブロックポリマーの含有量(Content of AB(L)%)、縦軸は粒径(Size/nm)を示す。図4より、調製した集合体溶液をDLS測定したところ、両親媒性ブロックポリマーの混合比率に従って粒径が変化したことが確認された。
図5にTEM観察結果を示す。図5において、混合比率を、分岐型両親媒性ブロックポリマー/直鎖型両親媒性ブロックポリマーとして表す。図5より、両親媒性ブロックポリマーの混合比率に従って、粒子径の異なる均一な高分子ミセル(ラクトソーム)を形成していることが確認された。
[ICG標識ポリL-乳酸(PLA-ICG)の合成]
アミノ化ポリL-乳酸(a-PLA)にICG標識を行い、ICG標識ポリL-乳酸(PLA-ICG)を得た。具体的には、a-PLAを1.9 mg (1.0 eq)含むDMF溶液に、インドシアニングリーン誘導体(ICG-sulfo-OSu)1mg (1.3 eq)を溶かしたDMF溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、LH20カラムにて精製を行い、化合物PLA-ICGを得た。
分岐型両親媒製ブロックポリマーのクロロホルム溶液にさらに3 wt%のICG標識ポリ乳酸(ICG-PLLA)を混合したことを除いては、実施例2と同様の操作を行った。これにより、ICG修飾分岐単独系分子集合体の分散液を調製した。本実施例で得られたICG修飾分岐単独系分子集合体を用い、担癌マウス(右肩、皮下移植)のin vivo蛍光イメージングを行った。
比較用として、比較例1で合成された直鎖型両親媒性ブロックポリマーからも同様の操作をおこなうことにより、ICG修飾直鎖単独系分子集合体を調製し、in vivo蛍光イメージングを行った。
本実施例においては、分岐単独系分子集合体及び直鎖単独系分子集合体(比較用)について、実施例4で行われたマウスへの投与から8日後に、再度の投与を行い、in vivo蛍光イメージングを行った。なお、分岐単独系分子集合体投与群及び分岐単独系分子集合体投与群それぞれとして、マウスを二匹づつ用いた。
図8に、図6と同様に蛍光イメージング結果を示す。また、図9に、投与初回(1st)及び2回目(2nd)における肝臓(Liver)、背中(Background)及び右肩の腫瘍(Tumor)のROIの経時変化を示す。
本実施例においては、実施例1とは異なるリンカー試薬を用い、1本のポリ乳酸鎖の一端に3本のポリサルコシン鎖が結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。
本実施例においては、実施例6で得られた分岐型両親媒性ブロックポリマー15から分子集合体(高分子ミセル;ラクトソーム)をインジェクション法及びフィルム法によって調製した。
2 mgの分岐型両親媒性ブロックポリマー15をガラス試験管に入れ、0.1 mlのDMF溶液に溶解した。別のガラス試験管に超純水1.9 mlを入れ、0℃の水浴に浸し5分間撹拌した。ポリマー15のDMF溶液を撹拌しながら超純水中に分散し、さらに5分間撹拌した。得られた粒子分散液を室温に戻した後、PD-10カラム処理に供して有機溶媒を除去し、分子集合体の分散液を調製した。
分岐型両親媒性ブロックポリマー15を2.0mg、生理食塩水を2.0mL使用したことを除いて、実施例2と同じ操作で分子集合体の分散液を調製した。
85℃の水浴中、バス型ソニケーターでの超音波処理を20分に変更したことを除いて、上記フィルム法1と同様の操作を行い、分子集合体の分散液を調製した。
得られた分散液についての粒子径測定結果を、粒度分布指数(PdI)とともに表1に示す。また、動的光錯乱(DLS)測定結果を図11に示す。図11中、(i)はインジェクション法、(ii)はフィルム法1、及び(iii)はフィルム法2によって作成された粒子の測定結果である。本実施例では、粒子径20nm〜24nmの粒子が作成された。
本実施例においては、1本のポリ乳酸鎖の一端に3個のサルコシンが結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。
本実施例においては、実施例8で得られた分岐型両親媒性ブロックポリマー16から分子集合体(高分子ミセル;ラクトソーム)をインジェクション法によって調製した。
分岐型両親媒性ブロックポリマー16を使用したことを除いて、実施例7と同様の操作を行った。さらに、粒子作成温度が、実施例7と同様の0℃である場合と、当該温度に代わって60℃である場合との両方の場合についてそれぞれ分散液を得た。
得られた粒子分散液について粒子径を測定した。その後、除粒子孔径 200nmのフィルターを用いたフィルタリング処理を行い、再度、粒子径を測定した。粒子径測定結果を、粒度分布指数(PdI)とともに表2に示す。また、DLS測定結果を図13に示す。図13中、(i)は0℃、(ii)は60℃の温度条件下で作成された粒子の測定結果である。
1本のポリ乳酸(L−ポリ乳酸;PLLA)鎖に1本のポリサルコシン(PS)鎖が結合した直鎖型両親媒性ブロックポリマーの合成を、乳酸単位数(NL)及びサルコシン単位数(NS)を様々に変えて行った。具体的な合成法は、比較例1と同様である。
一方、本発明の分岐型両新媒性ブロックポリマー(例えば、実施例8で合成された化合物16;NS/NLは0.1)からは、本比較例で粒子形成不可能であった1.8未満のNS/NLであっても粒子形成可能であった(実施例9)。
Claims (17)
- サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する、分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が2〜200個である、請求項1に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 前記親水性ブロックの分岐数が3である、請求項1又は2に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 前記ポリ乳酸を構成する乳酸単位が10〜400個である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 前記疎水性ブロックが分岐していない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における1つの炭素原子から分岐している、請求項5に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 下記式(I):
で示される構造を有する、請求項6に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。 - 前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、0.05以上1.8未満である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマー。
- 請求項1〜8に記載の分岐型両親媒性ブロックポリマーを有する分子集合体。
- 親水性ブロックとして1本のポリサルコシン鎖と、疎水性ブロックとして1本のポリ乳酸鎖とを有する直鎖型両親媒性ブロックポリマーをさらに有する、請求項9に記載の分子集合体。
- シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる機能性物質を内包する、請求項9又は10に記載の分子集合体。
- 前記物質がポリ乳酸鎖を有するものである、請求項11に記載の分子集合体。
- 前記分岐型両親媒性ブロックポリマーが、シグナル基及びリガンド基からなる群から選ばれる機能性基を有するものである、請求項9又は10に記載の分子集合体。
- 粒子径が10〜50nmである、請求項9〜13のいずれか1項に記載の分子集合体。
- 以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項9〜14のいずれか1項に記載の分子集合体。 - 以下の工程:
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項9〜14のいずれか1項に記載の分子集合体。 - 請求項11〜16のいずれか1項に記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送システム。
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