JP2003523406A - 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法 - Google Patents

病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法

Info

Publication number
JP2003523406A
JP2003523406A JP2001561361A JP2001561361A JP2003523406A JP 2003523406 A JP2003523406 A JP 2003523406A JP 2001561361 A JP2001561361 A JP 2001561361A JP 2001561361 A JP2001561361 A JP 2001561361A JP 2003523406 A JP2003523406 A JP 2003523406A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tumor
antibody
fusion protein
scfv
specific binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001561361A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4917232B2 (ja
Inventor
ツァルディ，ルチアーノ
ネリ，ダリオ
カルネモッラ，バルバラ
ニルソン，フレドリク
タルリ，ロレンツォ
ボルシ，ラウラ
ハリン，コルネリア
Original Assignee
フィロジェン ソチエタ レスポンサビリタ リミテ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by フィロジェン ソチエタ レスポンサビリタ リミテ filed Critical フィロジェン ソチエタ レスポンサビリタ リミテ
Publication of JP2003523406A publication Critical patent/JP2003523406A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4917232B2 publication Critical patent/JP4917232B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 病理学的脈管形成の病変、特に腫瘍、リウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、年齢関連の黄斑変性、及び血管腫の処理に関する。病変における標的細胞に対して殺生物性又は細胞毒性効果を発揮する分子、及びそのような病変に存在する細胞外マトリックス成分に対して向けられた抗体を含んで成る接合体が使用される。前記抗体はフィブロネクチン−２（IL−２）、ドキソルビシン、インターロイキン−12（IL−12）、インターフェロン−γ（IFN−γ）、腫瘍壊死因子α（TNFα）又は組織因子タンパク質（切断され得る）に対して方向づけられ得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、病理学的脈管形成の病変、特に腫瘍、リウマチ様関節炎、糖尿病性
網膜症、年齢関連の黄斑変性、及び血管腫の処理に関する。本発明の観点は、病
変における標的細胞に対して殺生物性又は細胞毒性効果を発揮する分子、及びそ
のような病変に存在する細胞外マトリックス成分に対して向けられた抗体の接合
体又は融合体を使用する。好ましい態様においては、抗体は、フィブロネクチン
ED−Bに対して向けられる。殺生物性又は細胞毒性分子の好ましい態様は、イン
ターロイキン−２（IL−２）、ドキソルビシン、インターロイキン−12（IL−12
）、インターフェロン−γ（IFN−γ）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、特にL19抗
体（下記を参照のこと）、組織因子（好ましくは、切断されている）を包含する
。細胞外マトリックス成分に生物活性分子を標的化することによって、標的細胞
の殺害が達成され得る。
【０００２】 腫瘍は、新規血管の形成（脈管形成）を伴なわないでは、一定の塊状物以上に
増殖することができず、そして微小血管密度と腫瘍侵襲性との間の相互関係が、
多くの腫瘍について報告されている（１）。脈管形成のマーカーを選択的に標的
化できる分子は、腫瘍、及び血管増殖により特徴づけられる他の疾病、例えばリ
ウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症及び年齢関連の黄斑変性により特徴づけられる
他の疾病の診断及び治療のための臨床学的機会を創造する（２−８）。
【０００３】 フィブロネクチン分子中への選択的スプライシングにより挿入される、フィブ
ロネクチンのED−Bドメイン、すなわちマウスにおいて同一の91個のアミノ酸の
配列が、新生血管構造体の周囲に特異的に蓄積し、そして分子介在のための標的
物を表す（９−11）。ED−ドメインに対するヒト組換え抗体（L19）を用いて、
インビボ新生血管形成標的化の可能性が異なった腫瘍モデルにおいて示されてい
る（12，13）。
【０００４】 本発明は、殺生物性又は細胞毒性効果を標的細胞に対して発揮する分子により
接合される、病理学的病変、例えば腫瘍における脈管形成に見出される、フィブ
ロネクチンのED−Bドメインに対して向けられた抗体を用いる発明者の実験作業
に基づかれる。そのようないくつかの分子は、標的細胞上の膜結合された受容体
と相互作用し、又は細胞膜の電気化学的電位を混乱せしめる。本明細書において
実験的に示される典型的な分子は、インターロイキン−２（IL−２）、組織因子
、ドキソルビシン、インターロイキン−12（IL−12）、インターフェロン−γ（
IFN−γ）及び腫瘍壊死因子α（TNFα）を包含する。
【０００５】 ヘルパー１細胞により生成される４αヘリックス束サイトカインは、特異的な
及び天然の免疫応答の活性化相において必須の役割を演じる（14）。IL−２は、
活性化されたT及びBリンパ球及び天然のキラー（NK）細胞の増殖及び分化を促進
し、そして細胞毒性T細胞（CTL）活性化及びNK/リンホカイン活性化されたキラ
ー（LAK）抗腫瘍細胞毒性を誘発する。IL−２は、いくつかのヒト腫瘍の免疫療
法アプローチにおいて使用されて来た（15）。単独で、又は適切にトランスファ
ーされたリンパ細胞と組合しての組換えIL−２（rTL2）の投与は、動物モデル及
び患者の両者における確立された腫瘍の抑制をもたらした。
【０００６】 しかしながら、そのインビボ治療効率は、その急速なクリアランスにより、及
び高い用量で、主に血管漏れ症候群に関連する重度の毒性により制限される（16
）。細胞表面腫瘍マーカーに対して向けられた抗体による腫瘍部位へのIL−２の
供給は、IL−２の活性局部濃度の達成、及び全身性投与に関する毒性の低化を可
能にする（17）。
【０００７】 1つの態様において、本発明は、病理学的病変における脈管形成に存在する細
胞外マトリックス成分に向けられる抗体にIL−２を接合することによって、引用
された従来技術とは異なる。示されたように、抗体を用いての供給による腫瘍の
処理にIL−２を用いる従来技術の試みにおいては、抗体は細胞表面腫瘍マーカー
に対して方向づけられて来た。しかしながら、腫瘍細胞は、細胞表面腫瘍マーカ
ーの発現において高い異種性を提供し、そして治療の間、ダウン−レギュレート
され得る。
【０００８】 腫瘍細胞表面で結合されるIL−２の存在は、免疫系のエフェクター細胞、例え
ばCD8+細胞毒性T細胞又は天然のキラー（NK）細胞の活性化及び/又は標的化、及
び効果的な抗腫瘍免疫応答の誘発をもたらす。T又はNK細胞は、腫瘍細胞表面で
適切なリガンドを特異的に認識する受容体（例えば、T細胞のためのT−細胞受容
体）と通して１つのシグナル、及び腫瘍細胞表面にも位置する、IL−２によるIL
−２受容体鎖を通して第２シグナルを受ける（Lodeなど., 1999, PNAS USA, 96:
8591-8596及びそこに引用される引例）。
【０００９】 他方では、下記により詳細に記載される実験においては、本発明者は、抗体−
IL−２融合タンパク質、すなわち病理学的病変における脈管形成に存在する細胞
外マトリックスの成分（特に、フィブロネクチンED−B）に対して方向づけられ
る抗体（L19、この配列はPiniなど.(1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776に
開示される）を、哺乳類細胞において構成し、そして発現した。インビボ生分布
においては、腫瘍担持のマウスにおける実験は、新しく形成する腫瘍血管の周囲
への融合タンパク質の蓄積を示した。この融合タンパク質は、腫瘍担持の動物に
おける治療実験において試験され、そして驚くべきことには、抗腫瘍効果を誘発
し、そしてL19及びIL−２の等モル混合物よりも、腫瘍増殖の軽減において、有
意により活性的であることが見出された。
【００１０】 組織因子は、血管の外膜において膜固定された形で通常存在し、そして従って
血液凝固カスケードの他の成分に接近できない、血管凝固カスケードの成分であ
る。血管が損傷を受ける場合（例えば、外傷において）、組織因子は接近できる
ようになり、そして第VIIa因子への結合に基づいて、血管凝固形成をもたらす一
連の生化学工程を開始する。TFの切断された形（残基１−219）は、血液凝固の
促進において有意に低い活性を有し、そして従って、単独で、又はモノクローナ
ル抗体に結合されて、全身的に注入され得る。
【００１１】 Thorpe及び彼の同僚達は、人工システムにおいて、腫瘍梗塞形成及び続く腫瘍
細胞の死をもたらす、腫瘍血管における選択的管腔内血液凝固の原理を示してい
る（X. Huang など., (1997) Science, 276, 547-550）。彼らは、インターフェ
ロンγを分泌し、そして従って、周囲（腫瘍性）の血管の管腔表面上でのMHC−I
I発現をアップ−レギュレートするよう構築された腫瘍細胞を皮下移植した。そ
のように行うことによって、彼らは、分子介在のために使用され得る脈管形成の
人工マーカーを創造した。次に、彼らは、組織因子（TF）の切断された形、及び
TFにより予備複合体化されたMHC−IIに同時結合できる、二特異的抗体によりそ
れらの腫瘍担持のマウスに注射した。この高分子複合体（Acoaguligand）は、処
理された腫瘍担持のいくつかのマウスにおいて、急速な腫瘍梗塞形成及び完全な
緩解に介在した。
【００１２】 第２の実験システムにおいては、Thorpe及び彼の同僚達は、TFに化学的に架橋
された、血管細胞付着分子−１（VCAM−１）に対して特異的なモノクローナル抗
体を、治療剤として使用した（Ranなど., (1998) Cancer Res., 58, 4646-4653
）。腫瘍モデルとして、彼らは、ヒトL540 Hodgkin’s 腫瘍を担持するSCIDマウ
スを選択する。腫瘍増殖速度の50％低下が観察された。彼らの観察に基づけば、
彼らは、正常細胞ではなく、腫瘍細胞に対する選択的血栓作用が、腫瘍内皮細胞
表面上での標的分子VCAM−１及びPSの同時発現のための必要条件に起因した。こ
れは、凝固リガンド（Coaguligands）が新規血管の管腔側に供給される場合のみ
、及びそれらの血管がそれらの管腔側上にPSを示す場合のみ、選択的血栓作用が
生じるであろう予測を提供する。
【００１３】 アメリカ特許第6,004,555号及び第5,877,289号が、組織因子についてのThorpe
による研究を記載する。 本発明者は、病理学的病変、例えば腫瘍の細胞外マトリックスに供給される組
織因子が、特にL19抗体分子に融合される場合、殺生物効果（例えば、腫瘍細胞
に対する）、特に梗塞形成に、驚くべきことには介在することができることを見
出した（下記参照のこと）。本発明によれば、組織因子（好ましくは、当業界に
おいて知られているように切断された）は、病理学的脈管形成の病変に見出され
る細胞外マトリックスの成分、例えばフィブロネクチンED−B又はテナスシン−C
に向けられる特異的結合メンバーとの接合体又は融合体として提供される。
【００１４】 ドキソルビシン（ドキソ）は、癌を処理するために使用される最も効果的な抗
癌薬剤の１つ及び抗脈管形成活性を有することが知られている少数の化学療法剤
の１つである。しかしながら、ドキソルビシンは、インターナライズしない、細
胞膜上の腫瘍関連マーカーに対して向けられた抗体に結合される場合、細胞毒性
活性を有さない（Chari (1998) Advanced Drug Delivery 31, 89-104）。ドキソ
ルビシン、及び腫瘍細胞の表面上に発現される腫瘍関連マーカーに対して向けら
れた、急速にインターナライズする抗体の接合は、抗腫瘍効果を有することが示
されている（R.V.J. Chari, 1998）。
【００１５】 本発明者は、細胞外マトリックスの成分に対して向けられた特異的結合メンバ
ーとの接合により、病変、例えば腫瘍の細胞外マトリックスにドキソルビシンを
標的化した。本明細書において実験的に示される好ましい態様においては、本発
明者は、切断できるリンカーによりフィブロネクチンED−Bに対して向けられた
抗体フラグメントにドキソルビシンを接合し、ドキソルビシンの遅い開放を可能
にした。この実験は治療効果を示す。他のアプローチとは異なって、この切断は
、細胞外環境において生じ、そしてインターナリゼーション及び/又はタンパク
質加水分解性切断に依存しない。
【００１６】 IL−12は、40kD (p40) のサブユニット及び35kD (p35) のサブユニットから成
るヘテロダイマータンパク質である。IL−12は、マクロファージ及びBリンパ球
により生成され、そしてT細胞及び天然のキラー（NK）細胞に対して複数の効果
を有することが示されている。それらのIL−12活性のいくつかは、休止及び活性
化されたT及びNK細胞におけるインターフェロンγの誘発、NK及びT細胞の細胞毒
性活性の増強、及びコミトゲンの存在下での休止T細胞増殖の刺激を包含する。
現在の証拠は、IL−12が細胞免疫性の主要メディエーターであることを示す。
【００１７】 その活性に基づけば、Il−12が、細胞−免疫性を促進するワクチンアジュバン
トとして、及び抗ウィルス及び抗腫瘍剤としての治療可能性を有することが提案
されている。実際、IL−12は、第I/II相臨床試験において抗癌薬剤として、現在
評価されている（Genetics Institute, Cambridge MA）。しかしながら、第II相
臨床試験においては、組換えヒトIL−12（rhIL-12）の投与が重度の毒性をもた
らした（Atkinsなど., A1, 1995）。これが、これまで、そのさらなる開発を阻
害して来た。これに関して、腫瘍へのサイトカインの局部的に制限された供給の
ための方法の開発が、臨床学的用途における毒性に関する問題を軽減するように
思える。
【００１８】 一本鎖ペプチドp40−p35融合体（Lieschkeなど., 1997）が、天然及び組換えI
L−12の活性に相当する特異的インヒビター活性を保持する。本発明者は、フィ
ブロネクチンのED−Bドメインに対して向けられた抗体L19、細胞外マトリックス
の成分及び脈管形成マーカーと共に、ネズミp.35−p40遺伝子の一本鎖ポリペプ
チド融合タンパク質を構成した。インビトロアッセイ（T細胞増殖アッセイ）に
よれば、IL−12− IL−19融合タンパク質が、市販のIL−12に相当するIL−12活
性を保持することが示された。さらに、マウスにおけるインビボ生分布実験は、
腫瘍における融合タンパク質の蓄積を示した。
【００１９】 IL−12は、細胞表面レベルで作用すると思われている。従って、腫瘍性細胞外
マトリックス（ECM）におけるその沈着及び富化が腫瘍増殖の速度に対していず
れの効果も有するとは予測できなかった。しかしながら、治療実験においては、
融合タンパク質は、腫瘍担持のマウスにおいて腫瘍増殖を有意に低めることによ
って、L19−IL2融合タンパク質により得られる抗腫瘍効果に匹敵する抗腫瘍効果
を誘発することが見出された。
【００２０】 インターフェロンγ（IFN−γ）は、宿主防御の生来の及び後天性機構の促進
において中心的役割を演じる多面発現性サイトカインである。IFN−γ、すなわ
ち非共有結合されたホモダイマーサイトカインは、ほぼすべての細胞上に偏在的
に発現されるIFN−γ受容体と相互作用することによって、その生物学的効果を
発揮することが、現在十分に理解される。機能的には、活性IFN−γ受容体は次
の明白なサブユニットから成る：90kDaの受容体α鎖及び62−kDaの受容体β鎖。
感染性生物に対する宿主耐性の促進におけるIFN−γの生理学的約役割は、明白
である（Newportなど., (1996) New Engl. J. Med., 335, 1941-1949; Jouanguy
など. (1996) New Engl. J. Med., 335, 1956-1961）。
【００２１】 対照的に、IFN−γが宿主抗−腫瘍応答の進行において演じる役割は、ほとん
ど十分には確立されていない。IFN−γは、移植可能腫瘍の拒絶の促進において
決定的な役割を演じる。さらに、内因的に生成されたIFN−γは、マウスにおい
て化学的に誘発された腫瘍及び自発的に発生した腫瘍の進行を制御する腫瘍監査
システムの基礎を形成する。
【００２２】 IFN−γの生成が腫瘍免疫原性を生成することを考慮すれば、IFN−γによる腫
瘍の装飾（例えば、IFN−γ−抗体融合タンパク質による）が、抗腫瘍応答を導
くことができることが推測される。全身的に投与される、接合されていないIFN
−γが、非常い穏かな応答速度を伴なって、癌を有する患者において多中心的臨
床試験で研究されて来た。しかしながら、卵巣癌を有する患者におけるIFN−γ
の腹腔内投与の臨床学的有用性の最近の徴候が、第III相臨床試験から入手でき
るようになった（Windbichlerなど. (2000) Br. j. Cancer, 82, 1138-1144）。
【００２３】 本発明者は、腫瘍担持のマウスにおける腫瘍血管形成にインターロイキン−12
融合タンパク質を標的化する場合、血液において高められたレベルのIFN−γが
観察されたことを見出した。対照的に、高められたレベルのIFN−γは、非標的
化されたscFv−インターロイキン−12融合タンパク質により検出され得なかった
。
【００２４】 腫瘍壊死因子α（TNFα）は、多くの細胞型、主に活性化された単球及びマク
ロファージにより生成されたサイトカインである。それは、26kDaの内部トラン
スメンブラン前駆体タンパク質として発現され、そのタンパク質から、約17kDa
の成熟タンパク質がタンパク質加水分解性切断により放出される。可溶性生活性
TNFαは、２種の異なった細胞表面受容体（Tartaglia L. A., など., J. Biol.
Chem., 268: 18542-18548, 1993）、すなわちp55TNFR (50-60kDa) 及びp76TNFR
(75-80kDa) と相互作用するホモトリマーである。p75TNFRは種特異的であり；実
際、ヒトTNFαはこのマウス受容体に結合しない。
【００２５】 TNFαは、移植された固形腫瘍の出血性壊死をインビボで誘発し（Carswell E.
A., など, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666-3670, 1975）、そしていく
つかの腫瘍細胞系に対してインビトロで細胞毒性活性を発揮することができる（
Helson L., など, Nature, 258: 731-732, 1975）。
【００２６】 いくつかの動物モデルにおけるTNFαの抗腫瘍効力は、ヒト癌における治療剤
としてのその可能性ある使用の希望を促進する。しかしながら、TNFαの抗腫瘍
効力を示すために行われる臨床学的試験は、全身的な投与される、治療的有効用
量から許容できない高レベルの全身性毒性、すなわち最も共通する用量限定毒性
効果である低血圧を伴なうことを示した。さらに、TNFαは、治療レベル下で血
液濃度を非常に急速に低める、血流からの非常に早いクリアランスを有する（一
般的に30分以下の血漿半減期）（Blick M. M.など. Cancer Res., 47: 2989, 19
87）。良好な臨床学的結果が、非散在性腫瘍の局部処理（肉腫及びメラノーマに
関しての単離された−四肢−灌流）においてのみヒトにおいて達成されている（
Franker D. L., など, Important Adv. Oncol. 179-192, 1994）。
【００２７】 多くの動物モデルにおけるTNFαの抗−腫瘍活性は、増殖する腫瘍血管形成の
内皮細胞に対する直接的な毒性効果の組み合わせ（TNFαにより相乗する腫瘍由
来の因子との組み合わせ）（Clauss M., など. J. Biol. Chem., 265: 7078-708
3, 1990a）、及び腫瘍脈管形成における増殖する内皮細胞のうっ血性質の変更（
Clauss., など. J. Exp. Med., 172: 1535-1545, 1990b）によると思われる。腫
瘍細胞に対する直接的な細胞毒性効果の証拠もまた存在する。TNFαの間接的（
宿主介在性）な効果、例えばT細胞−依存性免疫性の誘発は、動物モデルに対す
る腫瘍緩解に寄与することができる（Palladino Jr. M. A.,など. J. Immunol.,
138: 4023-4032, 1987）。
【００２８】 下記に記載される実験においては、本発明者は、哺乳類細胞上に、抗体−ネズ
ミTNFα（mTNFα）融合タンパク質を構成し、そして発現し、前記抗体L19は、病
理学的病変における脈管形成に存在するECMの成分（特に、B−FN）に対して向け
られる。腫瘍担持のマウスにおけるインビボ生分布実験は、新規形成性腫瘍血管
の周囲の融合タンパク質の蓄積を示した。融合タンパク質が腫瘍担持の動物にお
ける治療実験において試験され、そして驚くべきことには、抗腫瘍効果を誘発し
、そして腫瘍増殖の軽減において活性的であることが見出された。 本明細書に引用されるすべての記録は引用により組み込まれる。 本発明は、病理学的脈管形成の病変の処理を提供する。
【００２９】 1つの観点においては、本発明は、（i）細胞相互作用により標的細胞に対する
殺生物性又は細胞毒性効果を発揮する分子、及び（ii）病理学的病変における脈
管形成に存在する細胞外マトリックス成分に対して特異的な特異的結合メンバー
の接合体を投与することを含んで成る、病理学的病変における脈管形成を処理す
るための方法を提供する。 もう1つの観点においては、本発明は病理学的脈管形成の処理のための医薬の
製造のためへの（i）細胞相互作用により標的細胞に対する殺生物性又は細胞毒
性効果を発揮する分子、及び（ii）病理学的病変における脈管形成に存在する細
胞外マトリックス成分に対して特異的な特異的結合メンバーの接合体の使用を提
供する。
【００３０】 さらなる観点においては、本発明は、治療によるヒト又は動物の処理方法への
使用のために、（i）細胞相互作用により標的細胞に対する殺生物性又は細胞毒
性効果を発揮する分子、及び（ii）病理学的病変における脈管形成に存在する細
胞外マトリックス成分に対して特異的な特異的結合メンバーの接合体を提供する
。そのような処理は、脈管形成を含んで成る病理学的病変に対してであり得る。
【００３１】 本発明のさらなる観点は、（i）細胞相互作用により標的細胞に対する殺生物
性又は細胞毒性効果を発揮する分子、及び（ii）病理学的病変における脈管形成
に存在する細胞外マトリックス成分に対して特異的な特異的結合メンバーの接合
体を提供する。そのような接合体は好ましくは、殺生物性又は細胞毒性分子及び
特異的結合メンバーを含んで成るタンパク質を含んで成り、又は前記特異的結合
メンバーが二本鎖又は多鎖である場合、融合タンパク質は、殺生物性又は細胞毒
性分子及び前記特異的結合メンバーのポリペプチド鎖成分を含んで成る。好まし
くは、前記特異的結合メンバーは、一本鎖ポリペプチド、例えば一本鎖抗体分子
、例えばscFvである。
【００３２】 従って、本発明のさらなる観点は、殺生物性又は動物毒性分子、及び脈管形成
を含んで成る病変に存在する細胞外マトリックス成分、特に腫瘍関連細胞外マト
リックス成分に対して特異的な一本鎖Fv抗体分子を含んで成る融合タンパク質を
提供する。論じられたように、好ましい態様においては、正常なものと比較し、
病理学的病変の細胞外マトリックスの差別的標的化を可能にする成分は、フィブ
ロネクチンED−Bである。もう1つの好ましい態様においては、成分は、テナスシ
ン−CのC−ドメインである（Carnemollaなど. (1999) Am. J. Pathol., 154, 13
45-1352）。
【００３３】 細胞相互作用により標的細胞に対してその効果を発揮する殺生物性又は細胞毒
性分子は、標的細胞と直接的に相互作用することができ、標的細胞上の膜結合さ
れた受容体と相互作用することができ、又は細胞膜の電気化学電位を阻害するこ
とができる。膜結合された受容体と相互作用する分子は、ケモカイン、サイトカ
イン及びホルモンを包含する。細胞膜の電気化学的電位を阻害する化合物は、ヘ
モリシン、イオノフォア、イオンチャネルに対して作用する薬剤を包含する。典
型的な好ましい態様においては、分子は、インターロイキン−２、組織因子（好
ましくは、切断された）又はドキソルビシンである。他の態様は、インターロイ
キンに、インターフェロン−γ、IP−10及び腫瘍壊死因子−α（TNF−α）を用
いることができる。
【００３４】 下記において論じられるように、特異的結合メンバーは好ましくは、抗体であ
り、又は抗体抗原−結合部位を含んで成る。便利には、特異的結合メンバーは、
一本鎖ポリペプチド、例えば一本鎖抗体であり得る。これは、一本鎖抗体、及び
殺生物性又は細胞毒性分子（例えば、インターロイキン−２又は組織因子）を含
ん成る融合タンパク質の便利な生成を可能にする。他の態様においては、抗体抗
原−結合部位は、別々のポリペプチドにおける、例えば完全な抗体における、又
は抗体フラグメント、たとえばFab又はジアボディ（diabody）における抗体VHド
メイン及び抗体VLドメインの結合により提供される。特異的結合メンバーが二本
鎖又は多鎖分子（例えば、それぞれFab又は完全な抗体）である場合、殺生物性
又は細胞毒性分子は、特異的結合メンバーにおける１又は複数のポリペプチド鎖
により、融合ポリペプチドとして接合され得る。
【００３５】 特異的結合メンバーは、フィブロネクチンED−B、又はテナスシン−CのCドメ
インに対して特異的であり得る。 本発明に従っての特異的結合メンバーに使用される抗体抗原−結合部位は、抗
体L19、又はED−Bに対する結合についてL19と競争する抗体のVH及び/又はVLドメ
インを包含することができる。L19 VH及びL19 VLドメイン配列は、Piniなど. (1
998) J. Biol. Chem. 273: 21769-12776に開示される。 IL−２、TF、ドキソ、IL−12、IFN−γ又はTHF−α又は他の殺生物性又は細胞
毒性分子と接合され得、そして本発明に従って使用され得る他の非抗体特異的結
合メンバーは、病理学的病変に関連するECMの成分と相互作用できる、ペプチド
、アプタマー及び小有機分子を包含する。
【００３６】 注目されるように、好ましくは、特異的結合メンバーは、ペプチド結合により
殺生物性又は細胞毒性分子と接合され、すなわち前記分子及び前記特異的結合メ
ンバー又はそのポリペプチド鎖成分を含んで成る融合ポリペプチド内に存在する
。IL−２を含んで成る融合ポチペプチドの調製において有用なIL−２配列情報に
ついては、Taniguchiなど. (1983) Nature 301, 305-310; Maeda など. (1983)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047; Devosなど. (1983) Nucl. Aci
ds Res. 11: 4307-4823を参照のこと。切断された組織因子についての配列情報
は、Scarpatiなど. (1987) Biochemistry 26: 5234-5238及びRufなど. (1981) J
. Biol. Chem. 226: 15719-15725により提供される。接合についての他の手段は
、二管能価試薬を用いての化学的接合、特に架橋を包含する（例えば、ADOUBLE
−REAGENTSTM Croos-linking Reagents Selection Guide, Pierceを用いる）。
【００３７】 遅い開放が所望される場合、例えば殺生物性又は細胞毒性分子がドキソルビシ
ン、又は細胞膜の電気化学電位を阻害する他の分子である場合、化学的接合は、
特異的結合メンバー（ポリペプチド、例えば抗体又は抗体フラグメント）の第一
アミノ基と、殺生物性又は細胞毒性分子、例えばドキソルシビンの酸化された糖
成分（ダウノサミン）との間でのシッフ塩基（イミン）の形成によることができ
る。
【００３８】 処理される病変は、腫瘍、例えば次のもののいずれか１つ又は複数のものを包
含するが、但しそれらだけには限定されない：メラノーマ、神経芽腫、結腸直腸
癌、腎癌、肺癌、肺転移、乳癌、高度星状細胞腫（III度、IV度）、髄膜腫、血
管腫。 病変は、例えば年齢関連の黄斑変性から発生する接眼レンズであり得、ここで
脈管形成が脈絡膜血管から生じる。
【００３９】 特異的結合メンバー： これは、お互いに対して結合特異性を有する１対の分子のメンバーを記載する
。特異的結合対のメンバーは、天然に由来し、又は完全に又は部分的に合成生成
され得る。１対の分子の１つのメンバーは、１対の分子の他のメンバーの特定の
空間的及び極性機構に対して特異的に結合し、そして従って、それに対して相補
的である、その表面上での領域又はキャビティを有する。従って、前記の対のメ
ンバーは、お互いに対して特異的に結合する性質を有する。
【００４０】 抗体： これは、天然であるか、又は部分的又は完全に合成生成される免疫グロブリン
を記載する。この用語はまた、抗体抗原−結合ドメインであるか、又はそれに対
して実質的に相同である結合ドメインを有するいずれかのポリペプチド又はタン
パク質を包含する。それらは天然源に由来し、又はそれらは部分的に又は完全に
合成的に生成され得る。抗体の例は、免疫グロブリンイソタイプ及びそれらのイ
ソタイプのサブクラス；抗原結合ドメイン、例えばFab, scFv, Fv, dAb, Fdを含
んで成るフラグメント；及びジアボディである。
【００４１】 元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生成するために、モノ
クローナル及び他の抗体を採取し、そして組換えDNA技術の技法を用いることが
可能である。そのような技法は、異なった免疫グルブリンの不変領域、又は不変
領域及び骨格領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（CDR
）をコードするDNAを導入することを包含することができる。例えば、EP−A−18
4187号、GB2188638A号又はEP−A−239400号を参照のこと。抗体を生成するハイ
ブリドーマ又は他の細胞は、生成される抗体の結合特異性を変更できるか又はで
きない、遺伝子突然変異誘発又は他の変化を受けることができる。
【００４２】 抗体は多くの手段で修飾され得るので、用語“抗体”は、必要とされる特異的
を有する抗体抗原−結合ドメインを有するいずれかの特異的結合メンバーを包含
するよう構成されるべきである。従って、この用語は、抗体フラグメント、抗体
の誘導体、機能的同等物及び相同体、例えば天然の、又は完全に又は部分的合成
のいずれかの免疫グロブリン結合ドメインを含んで成るいずれかのポリペプチド
を包含する。従って、他のポリペプチドに融合される、免疫グロブリン結合ドメ
イン又はその同等物を含んで成るキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクロー
ニング及び発現は、EP−A−0120694号及びEP−A−0125023号に記載される。
【００４３】 完全な抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を行うことができることが示さ
れている。結合フラグメントの例は次のものである：（i）VL, VH, CL及びCH1ド
メインから成るFabフラグメント；（ii）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメ
ント；（iii）一本鎖抗体のVH及びVHドメインから成るFvフラグメント；（iv）
VHドメインから成るdAbフラグメント（Ward, E.S. など., Nature 341, 544-546
(1989)）; (v) 単離されたCDR領域；（vi）F (ab’)2フラグメント、すなわち
２種の結合されるFabフラグメントを含んで成る二価フラグメント；
【００４４】 （vii）一本鎖Fv分子（scFv）、ここでVH及びVLドメインは、抗原結合部位を
形成するために２種のドメインの会合を可能にするペプチドリンカーにより連結
される（Birdなど, Science, 242, 423-426, 1988; Hustonなど., PNAS USA, 85
, 5879-5883, 1988）; (viii) 二特異的一本鎖Fvダイマー（PCT/US92/09965号）
、及び（ix）“ディアボディ”、すなわち遺伝子融合により構成される多価又は
多特異的フラグメント（WO94/13804号；P. Holligerなど, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 90: 6448-6448, 1993）。Fv, scFv又はディアボディ分子は、VH及びVL
ドメインを連結するジスルフィド橋の組み込みにより確立され得る（Y. Reiter
など, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996）。CH3ドメインに連結されるscFv
を含んで成るミニボディもまた、製造され得る（S. Huなど, Cancer Res., 56:
3055-3061, 1996）。
【００４５】 抗原結合ドメイン： これは、抗原の一部又はすべてに対して特異的に結合し、そしてそれに対して
相補的である領域を含んで成る、抗体の部分を記載する。抗原が大きい場合、抗
体は、エピトープと称する、抗原の特定の部分に単に結合することができる。抗
原結合ドメインは、１又は複数の抗体可変ドメイン（例えば、いわゆるVHドメイ
ンから成るFd抗体フラグメント）により供給され得る。好ましくは、抗原結合ド
メインは、抗体L鎖可変領域（VL）及び抗体H鎖可変領域（VH）と含んで成る。
【００４６】 特異的： これは、特異的結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー以外の
分子に対していずれかの有意な結合も示さないであろう情況を言及するために使
用され得る。この用語はまた、例えば抗原結合ドメインが多くの抗原により担持
される特定のエピトープに対して特異的である場合、適用でき、この場合、抗原
結合ドメインを担持する特異的結合メンバーはエピトープを担持する種々の抗原
に結合できるであろう。
【００４７】 含んで成る： これは一般的に、包含の意味で使用され、すなわち１又は複数の特徴又は成分
の存在を可能にする。
【００４８】 単離された： これは、本発明の特徴的結合メンバー、又はそのような結合メンバーをコード
する核酸が一般的に、本発明に従って使用されるであろう状態を言及する。メン
バー及び核酸は、それらが天然において結合される材料、例えばそれらの天然の
環境下で、又はそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）（この場合、その
ような調製はインビトロ又はインビボで実施される組換えDNA技法によってであ
る）下で見出される他のポリペプチド又は核酸を有さず、又は実質的に有さない
であろう。
【００４９】 メンバー及び核酸は、稀釈剤又はアジュバンドと共に配合され得、そしてさら
に、単離される実施目的のためには、メンバーは通常、イムノアッセイへの使用
のためにマイクロタイタープレートを被覆するために使用される場合、ゼラチン
又は他のキャリヤーと共に混合され、又は診断又は治療に使用される場合、医薬
的に許容できるキャリヤー又は稀釈剤と共に混合されるであろう。特異的結合メ
ンバーは、天然において、又は異種真核細胞（例えば、CHO又はNSO（ECACC85110
503）細胞）のシステムにより糖化され得、又はそれらは糖化され得ない（例え
ば、原核細胞における発現により生成される場合）。
【００５０】 注目されるように、フィブロネクチンED−Bに対して向けられた抗体抗原−結
合ドメインが本発明の態様において使用される場合、好ましいそのようなドメイ
ンは、L19抗体VH及びVLドメインを含んで成る。１つの又は他のそれらのドメイ
ンの修飾された形、例えば１，２，３，４又は５個のアミノ酸置換が、特異的結
合メンバーがフィブロネクチンED−Bを結合する能力を保持しているCDR、例えば
CDR3及び/又はFRにおいて行われているL19 VH又はL19 VLドメインが、追加の態
様において使用され得る。そのようなアミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基、
例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他の残基による置換、
又は１つの極性残基の他の残基による、例えばアルギニンのリシンによる、グル
タミン酸のアスパラギン酸による、又はグルタミンのアスパラギンによる置換は
、一般的に“保存性”である。一定の位置で、非保存性置換が可能である。
【００５１】 本発明はさらに、フィブロネクチンED−Bへの結合のためにL19抗体と競争する
特異的結合メンバーの使用にも及ぶ。結合メンバー間の競争は、例えば同じエピ
トープ又はオーバーラップするエピトープを結合する特異的結合メンバーの同定
を可能にするために、他の標識されていない結合メンバーの存在下で検出される
１つの結合メンバーに、特異的受容体分子を標的化することによって、インビト
ロで容易にアッセイされ得る。 抗体配列の他に、本発明に従って使用される特異的結合メンバーは、例えば抗
原を結合する能力の他に、もう１つの機能的特徴を分子に付与するために、ペプ
チド又はポリペプチド、例えば折りたたまれたドメインを形成する他のアミノ酸
を含んで成ることができる。本発明の特異的結合メンバーは、検出できるラベル
を担持することができる。
【００５２】 さらなる観点においては、本発明は、上記で定義されたような特異的結合メン
バーをコードする配列を含んで成る単離された核酸（例えば、特異的結合メンバ
ー又はポリペプチド鎖成分が殺生物性又は細胞毒性分子との融合ポリペプチドと
して供給される場合）、及び前記結合メンバーの発現をもたらす条件下で前記核
酸を発現し、そして結合メンバーを回収することを含んで成る、本発明の特異的
結合メンバーの調製方法を提供する。 本発明はまた、上記のような少なくとも１つの核酸を含んで成る、プラスミド
、ベクター、転写又は発現カセットの形で構造体を供給する。
【００５３】 本発明はまた、上記のような１又は複数の構造体を含んで成る組換え宿主細胞
を提供する。さらなる観点は、宿主中にそのような核酸を導入することを含んで
成る方法を提供する。前記導入は、いずれかの入手できる技法を用いることがで
きる。真核細胞に関しては、適切な技法は、レトロウィルス又は他のウィルス、
例えばワクシニアを用いての、又は昆虫細胞、バキュロウィルスに関しての、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン、エレクトロポレー
ション、リポソーム介在性トランスフェクション、及びトランスダクションを包
含することができる。細菌細胞に関しては、適切な技法は、バクテリオファージ
を用いての、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びトランスフ
ェクションを包含する。
【００５４】 導入は、核酸からの発現を引き起こすか、又はその発現を可能にすることによ
り、例えば遺伝子の発現にための条件下で宿主細胞を培養することによって追跡
され得る。 発現は、核酸を含む組換え宿主細胞を、適切な条件下で培養することによって
便利には達成され得る。発現による生成に続いて、特異的結合メンバーは、いず
れかの適切な技法を用いて単離され、そして/又は精製され、次に適切なように
使用され得る。 １つの態様においては、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体
）中に組み込まれる。組み込みは、標準の技法に従って、ゲノムによる組換えを
促進する配列の包含により促進され得る。
【００５５】 種々の異なった宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のため
のシステムは、良く知られている。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母
及びバキュロウィルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現のための当業界に
おいて入手できる哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞
、子供ハムスター腎臓細胞、NSOマウスメラノーマ細胞及び多くの他のものを包
含する。通常の好ましい細菌宿主は、E．コリである。原核細胞、例えばE．コリ
における抗体又は抗体フラグメントの発現は、当業界において良く知られている
。再考のためには、例えばPluckthun, A. Bio/technology 9: 545-551 (1991)
を参照のこと。培養での真核細胞における発現はまた、特異的結合メンバーの生
成のための選択として、当業者に入手できる。最近の再考のためには、例えばRe
ff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. など. (199
5) Curr. Opinion Biotech. 6: 553-560を参照のこと。
【００５６】 適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニ
ル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切なベクタ
ーが選択されるか、又は構成され得る。ベクターは、適切な場合、プラスミド、
ウィルス、例えばファージ、又はファゲミドであり得る。さらなる詳細のために
は、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook
など., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。核酸構造
体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入及び遺伝子発現、及
びタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知技法及びプロトコー
ルは、Short Protecols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel など
., eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。Sambrookなど. 及びAu
subelなど. の開示は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００５７】 本発明はまた、上記のような特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現する
ために、発現システムにおける上記で定義されたような構造体を用いることを含
んで成る方法も提供する。 本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の処理方法、例えば有効量の本
発明の特異的結合メンバーを患者に投与することを含んで成る、ヒト患者におけ
る疾病又は障害の処理方法（予防処理を包含する）に使用され得る。本発明に従
って処理できる条件は、本明細書論じられている。
【００５８】 従って、本発明のされなる観点は、供給されるような特異的結合メンバーの投
与を含んで成る処理方法、そのような特異的結合メンバーを含んで成る医薬組成
物、及び医薬的に許容できる賦形剤と共に特異的結合メンバーを配合することを
含んで成る、薬剤又は医薬組成物の製造方法での投与のための薬剤の製造へのそ
のような特異的結合メンバーの使用を提供する。
【００５９】 本発明によれば、供給される組成物は、個人に投与され得る。投与は好ましく
は、“治療的有効量”で行われ、これは患者に対して有益性を示すのに十分であ
る。そのような有益性は、少なくとも１つの徴候の少なくとも改善であり得る。
投与される実際の量、及び投与の速度及び時間の経過は、処理されるものの性質
及び重症度に依存するであろう。処理の規定、例えば投用量の決定、等は、一般
的な実施者及び他の医者の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は、当業者に
おいて良く知られている；Ledermann J.A. など. (1991) Int. J. Cancer 47: 6
59-664; Bugshawe K.D. など. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiop
harmaceuticals 4: 915-922を参照のこと。 組成物は、処理される条件に依存して、単独で、又は他の処理と組合して、同
時に又は連続的に投与され得る。
【００６０】 本発明の特異的結合メンバー、例えば抗体抗原−結合ドメインを含んで成るそ
れらのメンバーは、いずれかの適切な経路を通して、通常血流中への注射により
、及び/又は処理される部位、例えば腫瘍中に直接的に注入の必要な患者に投与
され得る。正確な用量は、多くの要因、処理の経路、処理される領域（例えば、
腫瘍）のサイズ及び位置、抗体の正確な性質（例えば、完全な抗体、scFv分子）
、及び抗体に結合されるいずれか検出できるラベル又は他の分子の性質に依存す
るであろう。典型的な抗体用量は、10〜50mgの範囲であろう。これは、成人患者
の一回の処理のための用量であり、これは子供及び幼児のためには、比例して調
節され得、そしてまた、分子量に比例して、他の抗体型式のために調節され得る
。処理は、医師の考えで、毎日１度、週２度、週１度又は月１度の間隔で反復さ
れ得る。
【００６１】 本発明の特異的結合メンバーは通常、特異的結合メンバーの他に、少なくとも
１つの成分を含んで成る医薬組成物の形で投与されるであろう。 従って、本発明の及び本発明に従っての使用のための医薬組成物は、活性成分
の他に、医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤー、緩衝液、安定剤、又は当業者
に良く知られている他の材料を含んで成ることができる。そのような材料は、非
毒性であるべきであり、そして活性成分の効能を阻害すべきではない。キャリヤ
ー又は他の材料の正確な性質は、経口であり得るか、又は注射、例えば静脈内に
よってであり得る、投与の経路に依存するであろう。
【００６２】 静脈内注射、又は苦痛の部位での注射に関しては、活性成分は、発熱物質を有
さず、そして適切なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容できる水溶性
の形で存在するであろう。当業者は、例えば等張ビークル、例えば塩化ナトリウ
ム注射剤、リンガー注射剤、乳酸化されたリンガー注射剤を用いて、適切な溶液
を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び/又
は他の添加剤が、必要とされる場合、包含され得る。
【００６３】 組成物は、単独で又は他の処理と組合して、処理される条件に依存して、同時
に又は連続的に投与され得る。他の処理は、適切な用量の苦痛緩和薬剤、例えば
非ステロイド抗炎症薬剤（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェ
ン又はケトプロフェン）又はアヘン誘導体、例えばモルフィン又は抗催吐薬の投
与を包含することができる。
【００６４】 本発明は、病理学的病変における脈管形成に存在する細胞外マトリックス成分
への、本明細書において供給されるような特異的結合メンバーの結合を引き起こ
すか、又は可能にすることを含んで成る方法を提供する。注目されるように、そ
のような結合は、例えば特異的結合メンバー、又は特異的結合メンバーをコード
する核酸の投与に続いて、インビボで生じる。 本発明のさらなる観点及び態様は、当業者に明らかであろう。本発明の観点及
び態様は、次に実験セクションにより示される。
【００６５】 実施例例１ ．抗体−IL2融合体の構成及びインビボ抗腫瘍活性 材料及び方法： L19−IL2融合タンパク質の構成及び発現： L19−IL2 cDNAを、scFv L19をコードする配列の3’末端へのヒトIL2をコード
する合成配列の融合により構成した。L19−IL2 cDNA構造体の図表は、図１に示
される。IL2 cDNAを、BC−666及びBC695プライマー、及びMeazzaなど. 1996 (18
) により記載のようにして、ヒト植物凝集素（PHA）−活性化された末梢血液リ
ンパ球から出発して逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（RT−PCR）により生成さ
れたIL2 cDNA（鋳型として）を用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により増幅
した。
【００６６】 前方向BC666プライマー（配列：ctcgaattctcttcctcatcgggtagtagctcttccggctc
atcgtccagcggcgcacctacttcaagttctaca）は、EcoRI制限酵素配列、15個のアミノ
酸リンカー (ser4-Gly)3 をコードする45bp及び成熟ヒトIL2配列の21個の塩基を
含んだ。 逆方向BC−695プライマー（配列：ctcggatccttatcaattcagatcctcttctgagatgag
tttttgttcagtcagtgttgagatgatgct）は、myc配列（13）、２個の停止コドン及びB
amHI制限酵素配列を含んだ。
【００６７】 Liなど. 1997 (19) により報告されるようなシグナル分泌リーダーペプチドの
ゲノム配列を、その5’末端に含むscFvL19を、ベクターpcDNA3.1（Invitrogen,
Coningen, The Netherlands）上のT7プライマー、及びL19の3’末端の21bp及びE
coRI制限酵素配列を含むBC679プライマー（配列：CTCGAATTCtttgatttccaccttggt
ccc）を用いて、PCRにより増幅した。融合された遺伝子を配列決定し、サイトメ
ガロウィルス（CMV）プロモーターを含むベクターpcDNA3.1中に導入し、そしてG
418 (750μg/ml、Calbiochem. San Diego, CA) の存在下でP3U1細胞において発
現した。G418−耐性細胞のクローンを、ヒトフィブロネクチン（FN）の組換えED
−Bドメインを抗原として用いてのELISAによりL19−IL2融合タンパク質の分泌に
ついてスクリーンした。
【００６８】 L19−IL2融合タンパク質のFN組換えフラグメント、ELISAイムノアッセイ及び精
製： タイプIII相同反復体7B89及びED−Bを含む組換えFNフラグメントを、Carnemol
laなど. 1996 (20) により記載のようにして生成した。ELISAイムノアッセイを
、Carnemollaなど. 1996 (20) により報告されるようにして行った。L19−IL2融
合タンパク質を、Carnemollaなど. 1996 (20) により報告されるようにして、親
和性クロマトグラフィーにより、セファロースに接合される組換えヒトフィブロ
ネクチンフラグメント7B89を用いて、１つの陽性クローンのならし培地から精製
した。融合タンパク質のサイズを、Superdex S-200クロマトグラフィーカラム（
Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）上でのFPLCゲル濾過により、S
DS−PAGE上での還元条件下で及び天然の条件下で分析した。
【００６９】 IL2バイオアッセイ： L19−IL2融合タンパク質のIL2活性を、Meazzaなど. 1996 (18) により記載さ
れるようにして、ヒトIL2に応答して増殖することが知られているCTLLマウス増
殖細胞系を用いて決定した。L19−IL2融合タンパク質、及び1000〜0.01ng/mlの
濃度でのL19及び組換えヒトIL2 (Proleukin, Chiron) の等モル混合物の一連の
稀釈溶液を、CTLL−2増殖アッセイに使用した。
【００７０】 動物及び細胞系： 雌の無胸腺症ヌードマウス（生後８周目のヌード/ヌードCD1マウス、雌）を、
Harlan Italy (Currezzana, Milano, Italy) から得た。F9、マウス胚癌腫、マ
ウスT細胞（CTLL−2）及びマウスメラノーマ細胞を、ATCC (American Type Cult
ure Collection, Rockville, MD, USA) から購入し；N592, すなわちヒト小細胞
肺癌（SCLC）細胞系は、Dr. J.D. Minna (National Cancer institute and Nava
l Hospital, Bethesda, Maryland) により提供される腎臓であり；C51、すなわ
ちBALB/cに由来するマウス結腸腺癌細胞系は、Dr. M. P. Colombo (21) により
提供される腎臓であった。
【００７１】 L19−IL2融合タンパク質の生分布： 精製されたL19−IL−2を、Iodogen方法（22）（Pierce, Rockford, IL）を用
いて、ヨウ素125により放射性ラベルした。免疫反応性放射性ラベルされたL19-I
L-2（90％以上）を、7B89/セファロースクロマトグラフィーカラム上で親和性精
製した。皮下移植されたF9ネズミ奇形癌を有するヌードマウス（20, 23）に、塩
溶液100μl中、約10μg（４μCi）のタンパク質を静脈内注入した。３匹の動物
を、個々の時点で使用した。器官の重量を計量し、そして放射能を計算した。す
べての器官及び腫瘍を、組織学的分析及びマイクロオートラジオグラフィーのた
めに固定剤に配置した。代表的な器官の標的化結果を、組織1g当たりの注射され
た用量の％として表す（％ID/g）。
【００７２】 L19−IL2融合タンパク質によるインビボ処理： 精製されたL19−IL2融合タンパク質による処理を、20×106個のN592，106個の
C51又は３×106個のF9細胞によりそれぞれ皮下注入された６匹のマウスのグルー
プにおいて行った。N592，F9及びC51細胞注入の24時間後、12μgのL19−IL2融合
タンパク質を、個々の動物の尾静脈中に10〜15日間、毎日注入した。類似するグ
ループの動物（グループ当たり６匹）に、L19（８μg）及び組換えヒトIL2（４
μg、72,000UIに対応する；Proleukin, 18×106UI, Chiron）の混合物、及びリ
ン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.4）により、同じ日数、注入した。処理の最後で、動
物を殺害し、腫瘍を計量し、そして器官（肺、肝臓、心臓、腎臓）を計量し、そ
して腫瘍を組織学的分析のために固定剤に配置した。
【００７３】 マイクロオートラジオグラフィー分析、免疫組織化学及び統計学的分析： 腫瘍及び器官検体を、Tarliなど., 1999 (12) により記載されるようにして、
腫瘍又は器官内での125I−L19−IL2融合タンパク質のパターンを評価するために
、マイクロオートラジオグラフィーのために処理した。免疫組織化学方法を、Ca
stellaniなど. 1994 (11) により報告されるようにして、行った。非パラメトリ
ックMann−Whitney試験を用いて、３種の異なった動物グループ（L19−IL2融合
タンパク質、L19＋IL2及びPBSの混合物により処理されたマウス）間での腫瘍重
量の差異を評価した。
【００７４】 結果： L19−IL2構造体及びL19−IL2融合タンパク質を発現するクローンの選択： G418耐性クローンを、前に記載されたようなELISAによりED−B配列に対する上
清液の抗体特異性についてスクリーンした。ED−B配列に対する免疫学的特異性
を示すクローンの上清液を、IL2生物学的活性について試験した。
【００７５】 scFv L19及びL19-IL2融合タンパク質を、SDS−PAGE上で試験した。L19−IL2を
、親和性クロマトグラフィーにより一段階で精製し、10％よりも低い汚染率がSD
S−PAGEにより検出できた。融合タンパク質は、約42kdの見掛け分子量を示し、
これは、融合タンパク質の予測されるサイズと一致した。S200 Superdexクロマ
トグラフィーカラム（Pharmacia）上での融合タンパク質のFPLC分析は、天然の
条件下での前記タンパク質が、scFv L19について前で観察されたように、約70％
のダイマー及び30％のモノマーから製造されることを示した。精製されたタンパ
ク質における、ScFv L19成分の免疫学的活性及びIL−2成分の生物学的活性を試
験した（図３）。両比活性は、精製され、分離された分子と比較できる。
【００７６】 腫瘍担持のマウスにおける放射性ラベルされたL19−IL2融合タンパク質の生分布
： L19−IL2融合タンパク質が腫瘍血管において効果的に局在化できるかどうかを
調べるために、Tarliなど. 1999 (12) によりscFv L19について報告されるよう
に、生分布実験を、F9奇形癌担持のマウスにおいて行った。
【００７７】 L19−IL2融合タンパク質を、グリア芽腫腫瘍の強く染色された血管に対して免
疫組織化学的に示した。放射生ラベルされたL19−IL2融合タンパク質を、皮下移
植されたF9腫瘍を有するマウスの尾静脈に注入し、そしてL19−IL2融合タンパク
質分布を、３，６及び24時での異なった時点で得た。組織１g当たりの注入され
た用量の14％（％ID/g）が、表１に報告されるように、注入の３時間後、腫瘍に
おいて局在化した。腫瘍性新規血管形成におけるL19−IL2融合タンパク質の局在
化を、マイクロラジオグラフィー分析により確かめられた。 放射成ラベルされた融合タンパク質の蓄積が、F9マウス腫瘍の血管において示
された。放射性ラベルされた融合タンパク質の蓄積が肝血管又は腫瘍担持のマウ
スの他の器官の血管において検出された。
【００７８】 L19−IL2融合タンパク質による腫瘍担持のマウスの処理： 腫瘍の増殖を抑制することにおけるL19−IL2融合タンパク質の効率を、次の３
種の異なった実験腫瘍モデルに基づいて試験した：マウス奇形癌、F9；マウス腺
癌、C51及びヒト小細胞癌、N592。腫瘍誘発のために、個々の腫瘍型の細胞（特
に、N592に関して20×106、C51に関して106及びF9に関して３×106）を動物に皮
化注入した。24時後、動物は、PBS（６匹の動物）、L19がIL2の混合物（６匹の
相物）又はL19−IL2融合タンパク質（６匹の動物）の15日間の毎日の静脈内注入
を受け始めた。最後の注入の24時間後、動物を殺害し、腫瘍塊状物を除去し、そ
して腫瘍を計量した。
【００７９】 表2に要約される結果は、L19及びIL2タンパク質の等モル混合物により注入さ
れた動物及びPBSにより処理された第３グループの両者に関して、L19−IL2融合
タンパク質により処理された動物のグループにおいて腫瘍増殖の有意な低下を示
す。 F9奇形癌腫瘍を、静脈内処理の11日後、ヌードマウスから切除した。L19−IL2
融合タンパク質処理グループにおいては、腫瘍塊状物は、６匹のマウスのうち３
匹においてのみ増殖した。非パラメトリックMann-Whitney試薬を用いて、動物の
３種のグループ間での腫瘍重量の差異の統計学的有意性を決定した。融合タンパ
ク質（L19−IL2）による処理、PBS又は混合物（L19＋IL2）による処理の間の腫
瘍重量の差異は、統計学的に有意であった（表３を参照のこと）。
【００８０】例２ ．抗体−組織因子融合体の構成及びそのインビボ使用 切断された組織因子に遺伝子的に融合された、scFv形状での抗体フラグメント
を含んで成る融合タンパク質（scFv-TF）を、クローン化し、そして発現した。
フィブロネクチンED−Bドメインに対して特異的な標的化剤としてのscFv（L19）
を、標的化のために、及び負の対照そしてscFv（D1.3）(めんどり卵リゾチーム
に対して特異的)を使用した。融合タンパク質scFv (L19)-TF及びscFv (D1.3)−T
Fを、E. コリにおいて発現し、そして均質に精製した。抗体成分は、抗原結合ア
ッセイにより活性的であることが示された。TF成分は、Rufなど, J. Biol. Chem
. 226: 2158-2166の方法を用いて、活性的であることが示された。固形腫瘍を標
的化するscFv (L19)-TFの能力を、腫瘍担持のマウスにおいて、静脈内注入され
た、放射性ラベルされたscFv (L19)-TFを用いて、定量的生分布分析により示し
た（図３）。
【００８１】 scFv (L19)-TF及びscFv (D1.3)-TFの抗腫瘍活性を、F9ネズミ奇形癌、C51ネズ
ミ癌又はFE8腫瘍（皮下移植されたras−形質転換されたラット繊維芽細胞に由来
する）を担持するネズミにおいて試験した。実験は、小さな腫瘍を担持するマウ
ス及び非常に大きな腫瘍を担持するマウスの両者において行われた。 scFv (D1.3) 又は塩溶液ではなく、scFv (L19)−TFは、注入の数時間後、急速
且つ集中的な腫瘍梗塞を仲介した。
【００８２】 20μgのscFv (L19)-TFの３回の注入は、小さな腫瘍いおいて増殖速度の約50％
の低下をもたらした（図４及び５）。大きな腫瘍においては、20μgのscFv (L19
)-TFの一回の注入が、大部分の腫瘍を黒色で皮殻質の塊状物に向けることによっ
て、腫瘍増殖を停止せしめた（図６及び７）。対照的に、20μgのscFv (F1.3)-T
Fの１回の注入は、抗腫瘍効果を有さなかった（図６及び７）。
【００８３】材料及び方法 ： scFv (L19)-TFのクローニング： scFv (L19)-TF発現ベクターを、scFv (D1.3) 遺伝子がscFv (L19) 遺伝子によ
り置換されている、ベクターpDN5 (D. Neriなど. (1996) Nature Biotechnology
14, 485-490) の誘導体のNot1/EcoR1部位を用いて、ヒトscFv (L19) をコード
するDNA配列の3’末端で、ヒトTFをコードする合成DNA配列をクローニングする
ことによって構成した。ヒトTF DNA配列は、ATCCから購入され、そして次の通り
にしてPCRにより修飾された：
【００８４】 プライマーTF−banot (5’−T GAG TCA TTC GCG GCC GCA GGT GGC GGT GGC TC
T GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA−3’) は、エンドヌクレアーゼNot１のための
制限部位を、TF DNA配列の5’末端に導入した。それはまた、４個のグリシン及
びセリンから成る制限部位の短いリンカー（GGGGS）をC−末端に導入した。 プライマーTF−fostuecol (5’−GTC CTT GTA GTC AGG CCT TTC AGC GAA CTC
ACC TTT CTC CTG GCC CAT ACA−3’) は、TF DNA配列の3’末端に、Stu1エンド
ヌクレアーゼ制限部位及び次に、FLAG−標識の最初の４個の残基を導入した。そ
れはまた、サイレント突然変異誘発により、TF配列におけるアミノ酸216のため
のコドンにおけるEcoRI制限部位を除去した。 プライマーTF−fostueco2 (5’−AGA GAA TTC TTA TTA CTT ATC GTC ATC GTC
CTT GTA GTC TGG CCT TTC ACG−3’) は、TF−fostuecolの生成物の3’末端に、
FLAG−標識の残り（DYKDDDDK）、EcoRI制限部位及び最終的に、２個の停止コド
ンを導入した。
【００８５】 scFv (D1.3)-TFのクローニング： scFv (D1.3)-TF 発現ベクターを、scFv (L19)-TFについて上記に記載のように
して類似する態様で構成した。手短には、TF遺伝子を、scFv (D1.3) 遺伝子をす
でに含むベクター、pDN5のNot1/EcoR1部位においてクローン化した。
【００８６】 scFv-TF融合タンパク質の発現及び精製： ベクターを、TG1 E．コリ細胞に導入した。タンパク質発現、及び親和性クロ
マトグラフィーによる精製を、scFv (D1.3) 及びscFv (L19) について記載のよ
うにして行った（Neriなど., 1996; Tarliなど., (1999) Blood, 94, 192-198）
。さらに、イオン交換クロマトグラフィーによる精製段階を、相同タンパク質調
製物を得るために行った。 融合タンパク質のサイズを、SDS−PAGE上で還元条件下で、及びSuperdex S-75
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 上でのFPLCゲル濾過により
天然の条件下で分析した。
【００８７】 組換えscFv-TF融合タンパク質のインビトロ活性： scFv-TF融合タンパク質の免疫反応性を、Neriなど., 1996: D. Neriなど., 19
97, Nature Biotechnology, 15, 1271-1275; Tarliなど., 1999により記載のよ
うにして、ELISAイムノアッセイにより、BIAcoreにより、及び抗原カラム上での
親和性クロマトグラフィーにより分析した。 svFv-TF融合タンパク質の酵素活性を、Rufなど., 1991により記載のようにし
て、Spectrozyme FXa アッセイ（American Diagnostica, Pfungstadt, Germany
）を用いて分析した。
【００８８】 組換えL19-TF融合タンパク質のインビボ標的化活性： インビボ標的化性能を、Tarliなど. (1999) に記載のようにして、生分布分析
により分析した。手短には、精製されたscFv (L19)-TF融合タンパク質を、放射
性ラベルし、そして皮下移植されたF9ネズミ奇形癌を有するヌードマウス中に注
入した。マウスを、注入後24時間で殺害した。器官を計量し、そして放射能を計
数した。代表的器官の標的化結果を、組織1g当たり注入された用量の％（％ID/g
）として表される。
【００８９】 組換えL19-TF融合タンパク質によるインビボ処理： 腫瘍担持のマウスを、106個のFE8ラット線維芽細胞、C51結腸癌又はF9奇形癌
細胞の皮下注入により得た（Tarliなど., 1999）。細胞を、腫瘍体積がスライド
−カリパスにより測定されるまで、増殖せしめた。 約200−300mm3の腫瘍体積を有するマウスに、塩溶液200μl中、10μgに対応す
るscFv-TF融合タンパク質20μgを注入した。注入は、48及び96時間後、反復され
た。マウスを、腫瘍体積、重量及び外観、例えば写真記録によりモニターした。 約500mm3の体積の腫瘍を有するマウスに、塩溶液200μl中、10μgのTFに対応
するscFv-TF融合タンパク質20μgを、１回の用量で注入した。注入は反復されな
かった。マウスを、腫瘍体積、重量及び外観、例えば写真記録によりモニターし
た。
【００９０】例３ ．抗体−ドキソルビシンの構成及びインビボ使用 抗−FN ED-B scFv L19及びドキソルビシンの結合体を構成した。切断可能リン
カーについての化学として、L19抗体の第１アミノ基とドキソルビシンの酸化さ
れた糖成分（ダウノサミン）との間にシッフ塩基（イミン）の形成を選択した。 scFv (L19) からのドキソルビシンの開放能力を、HPLCによりアッセイした。
ドキソルビシン開放の半減期は、pH7.4及び37℃で約10時間であった（図８）。
【００９１】 開放されたドキソルビシンの隣接する細胞により取り組まれる能力（インビボ
）及び殺生物性活性を仲介する能力を、C51ネズミ癌細胞系を用いて細胞毒性ア
ッセイにより試験した。図９は、純粋なドキソルビシン及びscFv (L19)−ドキソ
ルビシンから開放されるドキソルビシンの両者は、0.1μMの範囲で、C51細胞に
対して50％阻害濃度を有することを示す。 scFv (L19)−ドキソルビシン免疫接合体の抗腫瘍活性性を、皮下移植されたC5
1ネズミ腫瘍を担持するマウスにおける反復された静脈内注入によりインビボで
試験した。18μgのscFv (L19)−ドキソルビシンの５回の注入が、塩溶液を注入
された対照マウスに比較して、腫瘍増殖速度の50％低下を引き起こした。
【００９２】材料及び方法 ： scFv (L19) に対するドキソルビシンの接合： 抗体フラグメントscFv (L19) を、Tarliなど. (1999) Bloud, 94, 192-198に
記載のようにして調製した。 1mg（1.72μモル）のドキソルビシンを、1mlのリン酸緩衝液（pH＝7.4）にお
いて、0.53mg（2.5μモル）のNaIO4と共に混合し、そして暗室において室温で１
時間インキュベートした。次に、１μlの20％グリセロールを添加し、過剰の過
ヨウ素酸塩を消費した。酸化された薬剤の溶液を、0.15Mの炭酸カリウム緩衝液
（pH＝9.5）において、1.3mg（43nモル）のscFv (L19) と共に混合した。形成さ
れた沈殿物を、遠心分離（4000rpm，1’）により除去し、そして液体相を、PD−
10の使い捨てゲル濾過カラム上に負荷した。
【００９３】 ドキソルビシン及びscFv (L19) のモル濃度を、280nmでのドキソルビシンの吸
光度についての補正を伴なって、それぞれ496及び280nmでそれらのUV吸光度から
決定した。接合体カップリングの程度を、次の式から（scFv: ドキソ）モル比（
MR）として計算した： MR＝{[A290B (0.724×A496)]/[（1.4）（2.7×104）]}/[A496/（8.03×103）]
ここで、Aは分光光度吸光度を示し：0.724は280nmでのドキソルビシン吸光度の
ための補正値であり；2.7×104はscFvの分子量であり；1.4はscFvの1mg/ml溶液
の280nmでの吸光値であり；8.03×103（M-1cm-1）は496nmでのドキソルビシンの
吸光度数である。
【００９４】 NaIO4により前もって酸化されたドキソルビシンによりL19抗体ブラグメントを
カップリングする場合、抗体フラグメント１モル当たり結合されるドキソルビシ
ン５分子が得られた。 接合の後の抗体免疫反応性を、パスツールピペット上の200μlのED−B−Sepha
rose樹脂（容量＞2mgED−B/ml樹脂）上への200μgの（L19−ドキソ）接合体の負
荷、続く496nmでの流動及び溶出液画分の吸光度測定により測定した。抽出され
た画分の吸光度値と、溶出された画分及び流動画分の値の合計との間の割合とし
て定義される免疫反応性は、30％であった。
【００９５】 細胞毒性試験： 15mlのFalcon管において、scFv−ドキソ接合体（2ml）のサンプルを、12,000
−14,000の分子量カットオフ（MMCO）（Socochim SA, Switzerland) を用いて、
37℃で振盪しながら、PBS（4ml）に対して透析した。 異なった時間の間隔で、透析緩衝液を抜き取り、そして濾過した。放出される
ドキソルビシンの量を、496nmでの吸光度から測定し、そしてシグナルの組込み
を、逆相HPLCにより得た（図８）。放出される薬剤の活性の評価のために、マイ
クロ滴定プレートにおける比色細胞毒性アッセイを、Crystal Violet (Serva)
により細胞の染色によるバイオマスの定量化に基づいて使用した。接合されてい
ないドキソルビシン及び接合体から放されるドキソルビシンを同時に分析した。
【００９６】 C51ネズミ腺癌細胞を、ウェル当たり106〜107個の細胞の密度で、24−ウェル
プレートに接種した。プレートを、単層の増殖を確保するために、湿潤された５
％CO2雰囲気下で、37℃で一晩インキュベートした。次に、培地を除去し、そし
て異なった濃度のドキソルビシンを添加した。処理された及び対照プレートにお
ける相対的細胞数を、結晶紫色染色により決定した。定量化は、70％エタノール
に吸収された色素を溶解し、そして590nmで光学密度を決定することによって可
能であり、ここで吸光度は細胞数に直接的に比例する。相対的細胞数は、T/C＝T
−C0/C-C0×100[T＝処理された培養物の吸光度、C＝対照培養物の吸光度、及びC
o＝インキュベーションの開始（ｔ＝0）での培養物の吸光度]としてあらわされ
得る。この研究の結果は、図９に示される。
【００９７】 インビボ抗腫瘍活性： C51腺癌細胞を前もって皮下注入された１組の６匹のヌードマウスは、過ヨウ
素酸塩酸化を通して、scFv (V19) に接合されたドキソの静脈内注入を受けた。
同じ時点で、１組の５匹のマウスは、塩溶液緩衝液の注入を受けた。 ５回の注入を、マウスに対して行い、それぞれは、約18μgのドキソルビシン
誘導体に対応する（静脈内注入されたドキソルビシンについての最大の耐性用量
の1/10以下、すなわち8mg/kg）。 L19−ドキソにより処理されたマウスの腫瘍を、カリペスにより規則的に測定
し、そしてそれは、未処理のマウスにおける腫瘍よりも遅く増殖した。腫瘍移植
後14日で、処理された動物における腫瘍の平均体積は、未処理の動物における腫
瘍の平均体積の約半分であった。
【００９８】例４ ．IL12−L19融合タンパク質をコードするDNA構造体の調製及び融合タンパク 質の生成 DNA構造体の調製 ： IL12−L19 cDNA構造体の図示が、図11に与えられる。遺伝子融合体を、ネズミ
IL−12サブユニットp35及びp40及びscFv (V19) の個々の遺伝子からの２回のPCR
アセンブリーを行うことによって構成した。 ネズミIL−12サブユニットp35及びp40の配列を、ATCC (American Type Cultur
e Collection, Manassas, VA 20110, USA) から得、そして次のプライマーによ
るPCRにより増幅した：
【００９９】 プライマーsp40bockEco (5’−ccg gaa ttc atg tgt cct cag aag cta acc at
c−3’) は、p40の内因性分泌配列に対してアニーリングし、そしてエンドヌク
レアーゼEcoR1のための制限部位をその5’末端に付加する。 プライマーlinkp40for (5’−cc gcc acc gct ccc tcc gcc acc gga acc tcc
ccc gcc gga tcg gac cct gca ggg aac−3’) は、p35の5’末端へのそのPCRア
センブリーを可能にするために、(Gly4Ser)3−リンカーの一部を、p40の3’末端
に導入する。 プライマーlinkp35back (5’−ggc gga ggg agc ggt ggc gga ggt tcg agg gt
c att cca gtc tct gga cct−3’) は、p40とのPCRアセンブリーのための (Gly4 Ser)3−リンカーの相補的配列を、5’末端に導入する。
【０１００】 プライマーlinkp35for (5’−ctc acc tcc atc agc gct tcc ggc gga gct cag
ata gcc−3’) は、p40の3’末端にアニーリングし、そしてIL12及びL19のp45
サブユニットを連結するために、短いアミノ酸リンカー（GSADGG）の配列を付加
する。 FLAG標識を有するL19の遺伝子配列を、次のプライマーによりPCR増幅した： プライマーlink19back (5’−gcc gga agc gct gat gga ggt gag gtg cag ctg
ttg gag tc−3’) は、p35とL19との間の短いアミノ酸リンカー（GSADGG）相補
的配列を、L19の5’末端に付加する。
【０１０１】 プライマーFlagforNot (5’−a agg aaa aaa gcggccgc cta ttt gtc atc atc
gtc ttt gta gtc−3’) は、L19FlagのFlag配列にアニーリングし、3’末端で、
停止コドン、及びエンドヌクレアーゼNot1のための制限部位を導入する。 IL12−L19をコードする核酸を、２回のPCRアセンブリーを行うことによって構
成した。最初に、p40及びp35フラグメントを、プライマーsp40backEco及びlinkp
35forを用いて、PCRアセンブリーにより融合した。プライマーsp40backEco及びF
lagforNotによる第２のPCRアセンブリー段階においては、p40−リンカー−p35を
コードするDNAフラグメントを、L19の5’末端に融合した。アセンブルされたIL1
2−L19を、哺乳類細胞発現ベクターpcDNA3.1（＋）ベクター（Invitrogen, Cron
ingen, The Netherlands）中に、ベクターのEcoR1/Not1部位を用いて、クローン
化した。
【０１０２】IL12−IL19の発現及び精製 ： HEK293細胞（ヒト胚腎臓細胞）を、ベクターによりトランスフェクとし、そし
て安定したトランスフェクタントをG418 (500μg/ml)の存在下で選択した。G418
耐性細胞のクローンを、抗原としてヒトフィブロネクチンの組換えED−Bドメイ
ンを用いて、ELISAにより、ILに発現についてスクリーンした。 IL12−L19融合タンパク質を、セファロースに接合されるED−B上での親和性ク
ロマトグラフィーにより細胞培養培地から精製した。融合タンパク質のサイズを
、SDS−PAGE上で、還元条件下で、及びSuperdex S-200 (Amersham Pharmaceutic
a Biotech, Uppsala, Sweden) 上でのFPLCゲル濾過により天然の条件下で分析し
た。
【０１０３】IL−12生活性の決定 ： IL12−L19融合タンパク質のIL12活性を、T細胞増殖アッセイを行うことによっ
て決定した（Gatelyなど., Current Protecols in Immunology, 1997）。休止ヒ
ト末端血液単球（PBMC）を、マイトジェン（植物凝集素及びIL−12）と共に３日
間、培養し、そして次に、融合タンパク質又は市販の組換えネズミIL12標準のい
ずれかの一連の稀釈溶液と共にインキュベートした。増殖を、[3H] チミジン組
込みにより連続的に測定した（図12）。
【０１０４】例５ ．IL12−L19融合タンパク質のインビボ処理 インビボ標的化活性を、皮下移植されたF9ネズミ奇形癌を担持するヌードマウ
ス（RCC Fullinsdorf）において、放射性ヨウ素化された融合タンパク質による
生分布実験を行うことによって分析した（Tarliなど., 1999）。生分布データは
、注入の１，４及び24時間後で殺害されたマウスから得られた。それらの時点で
、腫瘍、器官及び血液を除去し、計量し、そして放射能を計数した。標的化結果
を、組織g当たりの％注入された用量（％ID/ｇ）として表された。結果は図13に
示される。
【０１０５】 BALB/cマウス（RCC Fullinsdorf）に、C51結腸癌の５×106個の細胞を皮下注
入した。グループ当たり５又は６匹の動物を包含する２つの治療実験を、小さな
又は大きな腫瘍を担持するマウスに対して行った。 第１の場合、治療を、小さな腫瘍が明白に見える場合（約30mm3）、腫瘍細胞
注入の４日後に開始した。処理されたグループにおいては、マウスの尾静脈中に
2.5μgのIL12−L19融合タンパク質を、48時間ごとに注入した。対照グループは
、同じスケジュールに従って、PBS注入を受けた。処理の最後で、動物を殺害し
、腫瘍を計量し、そして器官及び腫瘍を、組織分析のために固定剤に配置した。
【０１０６】 結果は、図14に示される。 第２の実験においては、治療を、平均腫瘍体積が300mm3に達した場合に開始し
た。治療されたグループのマウスに、10μgのIL12−L19融合タンパク質を、48時
間ごとに静脈内注入し、そして対照グループは、PBS注入を受けた。 結果は、図15に示される。
【０１０７】例６ ．scFv(L19)−インターフェロン−γ 本発明者は、腫瘍担持のマウスにおける腫瘍血管形成にL19−インターロイキ
ン−12融合タンパク質を標的化する場合、血液における高められたレベルのIFN
−γが観察されたことを見出した。対照的に、高められたレベルのIFN−γは、
標的化されていないscFv−インターロイキン−12融合タンパク質により検出され
得なかった。
【０１０８】 本発明者は、scFv（例えばL19）にIFN−γを融合するための２種の達成方法を
研究した。これまでは、IFN−γは、生物学的活性であるためにはホモダイマー
である必要がある事実により提供される困難性が存在している。IFN−γと（他
方では、ホモダイマー分子である）IgG（のH鎖又はL鎖のいずれか）との間の融
合タンパク質は、その得られる融合タンパク質の非共有重合/沈殿をもたらすで
あろう。
【０１０９】 第１のアプローチ（図17）においては、IFN−γモノマーを、scFvのC−末端で
融合した。得られる融合タンパク質を、安定してトランスフェクロされた哺乳類
細胞培養物において十分に発現し、還元SDS−PAGEにおいて43キロドルトンの見
掛け分子量を有する純粋なタンパク質（ED−B樹脂上での親和性クロマトグラフ
ィー処理の後）を生成した。タンパク質は、Superdex-200カラム（Amersham−Ph
armacia, Zurich, Switzerland）を用いて、ゲル濾過クロマトフラフィーにより
決定される場合、溶液において主にホモダイマーであった。scFv（実際,L19)−I
FN−γは、典型的なIFN−γ−依存性態において、フィブロネクチンのED−Bドメ
インに高い親和性で結合し、そして腫瘍細胞の増殖阻止することができるので、
融合タンパク質において活性的であることが示された。
【０１１０】 第２のアプローチ（図18）においては、IFN−γホモダイマー（ポリペプチド
リンカーにより一緒に連結された２つのIFN−γから成る）を、scFv (L19) のC
−末端で融合した。得られる融合タンパク質を、安定してトランスフェクトされ
た哺乳類細胞培養物において十分に発現し、還元SDS−PAGEにおいて59キロドル
トンの見掛け分子量を有する純粋なタンパク質（ED−B樹脂上での親和性クロマ
トグラフィー処理の後）を生成した。タンパク質は、Superdex−200カラム（Ame
rsham−Pharmacia, Dubendrf, Zurich, Switzerland）を用いて、ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより決定される場合、溶液において主にホモダイマー性であっ
た。
【０１１１】 ４個の抗原−結合部位及び４個のIFN−γモノマー単位を有する融合タンパク
質の溶液における性質は、生物学的活性と適合できる。融合タンパク質は、典型
的なIFN−γ−依存性態様で、ELISA及びBIAcore分析により、フィブロネクチン
のED−Bドメインへの強い結合を示し、そしてそれは腫瘍細胞の増殖を阻止する
ことができた。 scFv (L19)−IFN−γ及びscFv (L19)−(IFN−γ)2の抗腫瘍活性が、腫瘍担持
のマウスにおいて示される。
【０１１２】実験方法 ： プライマー配列は、表４に示される。pcDNA3.1 (＋)ベクター: プラスミドpIS14中へのL19−IFN−γのクローニング ： ネズミIFN−γコード配列（ATCC、Manassas, VA20110，USA, ATCC No. 63170
） を、プライマー６及び５を用いて増幅した。第２のPCR反応においては、ペプ
チドフラグ標識を、プライマー６及び２を用いて、融合タンパク質のC−末端に
付加した。
【０１１３】 得られる挿入体を精製し、SacII/NotIにより消化し、そしてSacII/NotI二重消
化され、修飾されたpcDNA3.1 (＋) ベクターにおいて連結した。前記ベクターは
、次の通りに前もって修飾されていた：IgG分泌配列を、scFv (L19) にN−末端
的に融合し、そしてその構造体を、HindIII/EcoRI消化されたpcDNA3.1（＋）ベ
クター中にクローン化した。scFv (L19) のC−末端は、TCC GGA TCC GCG GGAに
よりコードされる短い５個のアミノ酸リンカーである。図19を参照のこと。
【０１１４】pcDNA3.1 (＋)ベクター：プラスミドpIS16中へのL19−(IFN−γ)2のクローニン
グ ： ネズミIFN−γダイマーを、２種の別々に増幅されたIFN−γモノマーを連結す
ることによってクローン化した。１つのIFN−γモノマーを、プライマー６及び
８を用いて増幅し、従ってSacII制限部位を、その5’末端に付加し、そして内部
EcoRI制限部位を含む、GGC GAT GGG GGA ATT CTT GGT TCA TCC GGAによりコード
される10個のアミノ酸リンカーをその3’末端に付加した。図18を参照のこと。
第２のIFN−γモノマーを、プライマー７及び５により増幅し、続いてプライマ
ー７及び２を用いて、第２のPCR反応にゆだね、従って、内部EcoRI制限部位を含
む10個のアミノ酸のリンカーをその5’末端に、及びペプチドFlag−標識、続い
てNotI制限部位をその3’末端に付加した。
【０１１５】 IFN−γのモノマーサブユニットに対応する２種のフラグメントを、EcoRIによ
り消化し、そして連結した。連結生成物に対応するバンドを、アガロースゲル上
でゲル精製し、SacII/NotIにより消化し、そしてSacII/NotIにより二重消化され
、修飾されたpcDNA3.1（＋）ベクター中に連結した。前記ベクターは次の通りに
前もって修飾されていた：IgG分泌配列を、scFv (L19) にN−末端的に融合し、
そしてその構造体を、HindIII/EcoRIにより消化されたpcDNA3.1 (＋)ベクター中
にクローン化した。scFv (L19) のC−末端は、短い５個のアミノ酸リンカーであ
る（図20を参照のこと）。
【０１１６】L19−IFN−γ及びL19−(IFN−γ)2の発現及び精製 ： HEK293細胞（ヒト胚腎臓細胞）を、ベクターpIS14及びpIS16によりトランスフ
ェクトし、そして安定したトランスフェクタントを、標準のプロトコール（Invi
trogen, Groningen, the Nether lands）を用いて、G418 (500/μg/ml)の存在下
で選択した。G418−耐性細胞のクローンを、抗原としてヒトフィブロネクチンの
組換えED−Bドメインを用いて、ELISAによりIFN−γ発現についてスクリーンし
た。L19−IFN−γ及びL19−(IFN−γ)2融合タンパク質を、ED−B結合されたCMセ
ファロースカラム上での親和性クロマトグラフィーにより、細胞培養培地から精
製した。融合タンパク質のサイズを、SDS−PAGE上での還元条件下で、及びSuper
dex S-200カラム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）上でのFPLC
ゲル濾過により天然の条件下で分析した。
【０１１７】例７ ．抗体mTNFα融合体の構成及びインビボ抗腫瘍活性 材料及び方法 ： L19−mTNFα融合タンパク質の構成及び発現： L19−mTNFα cDNAを、マウスTNFα（Pennica など., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82: 6060-6064, 1985）をコードする合成配列のscFv L19をコードする配
列の3’末端への融合により構成した。L19− mTNFα cDNA構造体の図表は、図21
に示される。TNFαcDNAを、BC742及びBC749プライマー、及び免疫化されたマウ
スの脾臓から得られたRNAから出発して逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（RT−P
CR）により生成されたmTNFα cDNA（鋳型として）を用いて、ポリメラーゼ鎖反
応（PCR）により増幅した。
【０１１８】 前方向プライマー（BC724）（配列：5’−CTCGAATTCTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTC
TTCCGGCTCATCGTCCAGCGGCCTCAGATCATCTTCTCAAAAT−3’）は、EcoRI制限酵素配列
、15個のアミノ酸リンカー (ser4-Gly)3 をコードする45bp及び成熟マウスTNFα
配列（Pennicaなど., 1985）の21個の塩基を含んだ。 逆方向BC−749プライマー（配列：5’−CTCGCGGCCGCTCATCACAGAGCAATGACTCCAA
AGTA−3’）は、成熟マウスTNFα配列（Pennicaなど., 1985）の21個の塩基、２
個の停止コドン及びNotI制限酵素配列を含んだ。
【０１１９】 Liなど. （Protein Engineering, 10: 731, 1996又は1997）により報告される
ようなシグナル分泌リーダーペプチドのゲノム配列を、その5’末端に含むscFvL
19を、ベクターpcDNA3.1（Invitrogen, Coningen, The Netherlands）上のT7プ
ライマー、及びL19の3’末端の21bp及びEcoRI制限酵素配列を含むBC679プライマ
ー（配列：CTCGAATTCtttgatttccaccttggtccc）を用いて、PCRにより増幅した。
【０１２０】 融合された遺伝子を配列決定し、サイトメガロウィルス（CMV）プロモーター
を含むベクターpcDNA3.1中に導入し、そしてG418 (750μg/ml、Calbiochem. San
Diego, CA) の存在下でP3U1細胞において発現した。G418−耐性細胞のクローン
を、ヒトフィブロネクチン（FN）の組換えED−BドメインをL19のための抗原とし
て用いて、及び免疫反応性mTNFαのための特異的試薬としてのウサギ抗−ネズミ
TNFαポリクローナル抗体（PeproTech, UK）もちいてのELISAによりL19− mTNF
α融合タンパク質の分泌についてスクリーンした。
【０１２１】 L19− mTNFα融合タンパク質のFN組換えフラグメント、ELISAイムノアッセイ及
び精製： 組換えED−B FNフラグメントを、Carnemollaなど. （Int．J．Cancer,68:397
、1996 ） により記載のようにして生成した。ELISAイムノアッセイを、Carnemo
llaなど. 1996 により報告されるようにして行った。L19− mTNFα融合タンパク
質を、Carnemollaなど. 1996 により報告されるようにして、親和性クロマトグ
ラフィーにより、セファロースに接合される組換えヒトフィブロネクチンフラグ
メントEd-Bを用いて、１つの陽性クローンのならし培地から精製した。融合タン
パク質のサイズを、Superdex S-200クロマトグラフィーカラム（Amersham Pharm
acia Biotech, Uppsala, Sweden）上でのFPLCゲル濾過により、SDS−PAGE上での
還元条件下で及び天然の条件下で分析した。
【０１２２】 L−M細胞毒性アッセイ： L19−mTNFα融合タンパク質のmTNFα活性を、Cortiなど. (J. Immunol. Metho
ds, 177: 191-194, 1994) により記載されるようにして、マウスL−M線維芽細胞
を用いて、細胞毒性アッセイにより決定した。1000〜0.4pg/mlの濃度でのL19−m
TNFα融合タンパク質及び組換えmTNFα（２×107単位/ml）の一連の稀釈溶液を
、細胞毒性アッセイに使用した。結果は、負の対照に関して、生存細胞の％とし
て表される。
【０１２３】動物及び細胞系 ： 雄及び雌の129及びBalb-Cマウス（生後８周目雌）を、Harlan Italy (Currezz
ana, Milano, Italy) から得た。F9、マウス胚癌腫、マウスL-M線維芽細胞及び
マウスメラノーマ細胞を、ATCC (American Type Culture Collection, Rockvill
e, MD, USA) から購入し； C51、すなわちBALB/cに由来するマウス結腸腺癌細胞
系を使用した（Colombo など., Cancer Metastasis Rev., 16: 412-432, 1997）
。
【０１２４】L19− mTNFα融合タンパク質の生分布 ： 精製されたL19− mTNFαを、Iodogen方法(Salacinski など., Anal. Biochem.
, 117: 136, 1981)（Pierce, Rockford, IL）を用いて、ヨウ素125により放射性
ラベルした。ラベリングの後、免疫反応性放射性は90％以上であった。皮下移植
されたF9ネズミ奇形癌を有する129匹のマウスに、塩溶液100μl中、約４μg（２
μCi）のタンパク質を静脈内注入した。３匹の動物を、個々の時点で使用した。
マウスを、注入後３，６，24及び48時間後に殺害した。器官の重量を計量し、そ
して放射能を計算した。すべての器官及び腫瘍を、組織学的分析及びマイクロオ
ートラジオグラフィーのために固定剤に配置した。代表的な器官の標的化結果を
、組織1g当たりの注射された用量の％として表す（％ID/g）。
【０１２５】L19− mTNFα融合タンパク質によるインビボ処理 ： 精製されたL19− mTNFα融合タンパク質による処理を106個のC51細胞によりそ
れぞれ皮下注入された３匹のBalb.cマウスのグループにおいて行った。C51細胞
注入の12日後、0.8 μgのL19− mTNFα融合タンパク質を、個々の動物の尾静脈
中に注入した。類似するグループの動物（グループ当たり３匹）に、リン酸緩衝
溶液（PBS）（pH7.4）を注入した。動物を全身性毒性（体重の低下）及び腫瘍増
殖について毎日６日間、追跡した。処理の最後で、動物を殺害し、腫瘍を組織学
的分析のために固定剤に配置し、そして免疫組織学的分析のために凍結した。
【０１２６】マイクロオートラジオグラフィー分析、免疫組織化学及び統計学的分析 ： 腫瘍及び器官検体を、Tarliなど., （Blood, 94: 192-198, 1999） により記
載されるようにして、腫瘍又は器官内での125I−L19 mTNFα融合タンパク質のパ
ターンを評価するために、マイクロオートラジオグラフィーのために処理した。
免疫組織化学方法を、Castellaniなど. (Int. J. Cancer, 59: 612-618, 1994)
により報告されるようにして、行った。
【０１２７】結果 ： L19− mTNFα構造体及びL19− mTNFα融合タンパク質を発現するクローンの選択
： G418耐性クローンを、材料及び方法に記載されるようなELISAにより、ED−B配
列に対する及び免疫反応性mTNFαに対する上清液の抗体特異性についてスクリー
ンした。 ED−B配列及び免疫反応mTNFαに対する免疫学的特異性を示すクローンの上清
液を、L−M細胞毒性アッセイにおけるTNFα生物学的活性について試験した（材
料及び方法を参照のこと）。
【０１２８】 L19−mTNFα融合タンパク質を、次の２段階方法で精製した： ａ）ED−Bセファロースカラム上での免疫親和性クロマトグラフィー、続いて ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex200、Pharmacia）。 SDS−PAGEにおいては、融合タンパク質は、予測されるように、約42kDaの見掛
け分子量を示した。精製されたタンパク質におけるscFv L19成分の免疫学的活性
及びmTNFα成分の生物学的活性を試験した。
【０１２９】 腫瘍担持のマウスにおける放射性ラベルされたL19− mTNFα融合タンパク質の生
分布： L19− mTNFα融合タンパク質が腫瘍血管において効果的に局在化できるかどう
かを調べるために、Tarliなど. （Blood, 94: 192-198, 1999）によりscFv L19
について報告されるように、生分布実験を、F9奇形癌担持のマウスにおいて行っ
た。
【０１３０】 L19− mTNFα融合タンパク質を、グリア芽腫腫瘍の強く染色された血管に対し
て免疫組織化学的に示した。放射生ラベルされたL19− mTNFα融合タンパク質を
、皮下移植されたF9腫瘍を有するマウスの尾静脈に注入し、そしてL19− mTNFα
融合タンパク質分布を、３，６,24及び48時での異なった時点で得た。組織１g当
たりの注入された用量の22％（％ID/g）が、表１に報告されるように、注入の３
時間後、腫瘍において局在化し、そして48時間後、９％ID/gが腫瘍において存在
した。腫瘍性新規血管形成におけるL19− mTNFα融合タンパク質の局在化を、マ
イクロラジオグラフィー分析により確かめられた。放射成ラベルされた融合タン
パク質の蓄積が、F9マウス腫瘍の血管において示された。放射性ラベルされた融
合タンパク質の蓄積が肝血管又は腫瘍担持のマウスの他の器官の血管において検
出された。
【０１３１】L19−mTNFα融合タンパク質による腫瘍担持のマウスの処理 ： 腫瘍増殖の抑制におけるL19−mTNFα融合タンパク質の効率を、マウス腺癌C51
の１つの実験腫瘍モデルに基づいて試験した。腫瘍誘発のために、106個のC51細
胞を、Balb/c動物に皮下注入した。12日後（腫瘍が約100−200mm3に達する場合
）、動物は、PBS (３匹の動物)又はL19−mTNFα融合タンパク質（３匹の動物）
のいずれかの静脈内注入を受けた。動物を、受領及び腫瘍増殖について、６日間
、毎日モニターした。図23に要約される結果は、PBSを注入された動物（棒はSE
を表す）に対する、L19−mTNFα融合タンパク質により処理された動物のグルー
プにおける腫瘍増殖ン低下を示す。重量の低下は、実験時間じゅうで、常６％以
下であった。
【０１３２】 参考文献： 1) Folkman Nat. Med. 1: 27, 1995. 2) O’Reilly など. Nat. Med. 2: 689, 1996. 3) O’Reilly など. Cell, 88, 277, 1997. 4) Friedlander など. Science, 270: 1500, 1995. 5) Pasqualini など, Nat. Biotechnol. 15: 542, 1997. 6) Huang など. Science, 275: 547, 1997. 7) Kim など. Nature, 362: 841, 1993. 8) Schmidt-Erfurth など. Br. J. Cancer, 75: 54, 1997. 9) Zardi など. EMBO J., 6, 2337-2342, 75: 54, 1997. 10) Carnemolla など. J. Cell Biol., 108, 1139-1148 (1989). 11) Castellani など. Int. J. Cancer, 59, 612-618 (1994).
【０１３３】 12) Tarli など. Blood, 94: 192-198, 1999. 13) Vitiなど. Cancer Res. 59: 347, 1999. 14) Taniguchi など. Cell 73: 5-8, 1993. 15) Rosenberg J. Clin. Oncol. 10:180-199, 1992. 16) Siegel and Puri Interleukin-2 toxicity. J. Clin. Oncol. 9: 694-704
, 1991. 17) Lode など. Pharmacol. Ther. 80: 277-292, 1998. 18) Meazza など. Br. J. Cancer, 74: 788-795, 1996. 19) Li など. Protein Engineering, 10: 731, 1997. 20) Carnemolla など. Int. J. J. Cancer 68: 397, 1996. 21) Colombo など. Cancer Metastasis Rev. 16: 421-432, 1997. 22) Salacinskiなど. Anal. Biochem. 117: 136, 1981. 23) Neri など. Nat. Biotechnol. 15: 1271, 1997.
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、scFv L19−IL2 cDNA構造体の図示である。ScFv−L19及びIl2 cDNAが
、15個のアミノ酸 (SSSSG)3をコードするDNAリンカー（−）により遺伝子的に融
合され、そしてHind III及びBanHI制限部位を用いて、pcDNa3哺乳類発現ベクタ
ー中にクローン化された。平行線を書かれたボックスは、CMVプロモーター配列
を表し、塗りつぶされたボックスは、シグナル分泌リーダーペプチドのゲノム配
列（ゲノム配列の内部のイントロン）を表し、そして空白のボックスはscFV−L1
9及びIL2配列のVH又はVLを表す。T7、BC666, BC679及びBC695は、材料及び方法
に記載されるPCR増幅に使用されるプライマーである。
【図２】 図２は、融合タンパク質のIL2部分の生物学的活性（○）、及びCTLL細胞増殖
により測定される、等モル濃度のL19及びIL2の混合物に含まれるIL2の生物学的
活性（●）を示す。
【図３】 図３は、放射性ヨウ素化されたscFv(L19)−TFを静脈内注入された、皮下移植
されたネズミF9奇形癌を担持するマウスにおいて行われる生分布分析の結果を示
す。
【図４】 図４は、scFv (L19)−TF又はscFv (D1.3)−TFのいずれかの３回の用量を静脈
内注入された、マウスにおける皮下移植されたF9ネズミ寄形癌腫瘍の体積のプロ
ット（時間に対する）である。最初の注入（矢印により示される）は、腫瘍が小
さい場合に行われた。標準誤差は示される。
【図５】 図５は、scFv (L19)−TF又はscFv (D1.3)−TFのいずれかの３回の用量を静脈
内注入された、マウスにおける皮下移植されたC51ネズミ寄形癌腫瘍の体積のプ
ロット（時間に対する）である。最初の注入（矢印により示される）は、腫瘍が
小さい場合に行われた。標準誤差は示される。
【図６】 図６は、scFv (L19)−TF（20μg）又はscFv (D1.3)−TF（20μg）又はリン酸
緩衝溶液のいずれかの１回の用量を静脈内注入された、マウスにおける皮下移植
されたC51ネズミ寄形癌腫瘍の体積のプロット（時間に対する）である。注入（
矢印により示される）は、腫瘍が１ｇ以上である場合に行われた。標準誤差は示
される。
【図７】 図７は、scFv (L19)−TF（20μg）又はscFv (D1.3)−TF（20μg）又はリン酸
緩衝溶液のいずれかの１回の用量を静脈内注入された、マウスにおける皮下移植
されたFE8 ras−形質転換された線維芽細胞腫瘍の体積のプロット（時間に対す
る）である。注入（矢印により示される）は、腫瘍が１ｇ以上である場合に行わ
れた。標準誤差は示される。
【図８】 図８は、HPLCにより分析される、scFv (L19)−ドキソルビシン接合体からのド
キソルビシン開放の運動学を示す。
【図９】 図９は、scFv (L19)−ドキソルビシン接合体から開放されるドキソルビシンに
より介在される、C51ネズミ癌細胞に対する毒性を示す。
【図１０】 図10は、scFv (L19)−ドキソルビシン［18μｇ/注入］又はリン酸緩衝溶液の
いずれかの５回の用量を静脈内注入された、マウスにおける皮下移植されたF9ネ
ズミ寄形癌腫瘍の体積のプロット（時間に対する）である。最初の注入（矢印に
より示される）は、腫瘍が小さい場合に行われた。標準誤差は示される。
【図１１】 図11は、IL12−L19 cDNA構造体の図示である。p35及びp40サブユニットは、15
個のアミノ酸をコードするDNAリンカー(GGGGS)3により遺伝子的に融合され、そ
してさらに、６個のアミノ酸のもう1つのリンカー（GSADGG）によりL19配列に融
合された。完全な融合タンパク質をコードする配列は、下記のようにして、EcoR
1及びNot1制限部位を用いて、pcDNA3.1哺乳類発現ベクター中にクローン化され
た。sp40backEco, Linkp40for, linkp35back, linkp35for, linkL19back 及びFl
agforNotは、実験記載に記載されるPCR増幅に使用されるプライマーである。
【図１２】 図12は、T細胞増殖アッセイにおいて測定される場合、市販の組換えネズミIL1
2に比較しての融合タンパク質のIL12成分の生物学的活性を示す。
【図１３】 図13は、放射性ヨウ素化されたIL12−L19融合タンパク質を静脈内注入された
、皮下移植されたF9奇形癌を担持するマウスにおいて行われた生分布分析の結果
を示す。
【図１４】 図14は、PBS又は2.5μgのIL12−L19融合タンパク質を、48時間ごとに注入され
た（矢印により示される）マウスにおける皮下移植されたC51結腸癌腫瘍の体積
（mm3）のプロット（時での時間に対する）を示す。注入は、腫瘍が小さい（約3
0mm3）場合に開始された。
【図１５】 図15は、PBS又は10μgのIL12−L19融合タンパク質を、48時間ごとに注入され
た（矢印により示される）マウスにおける皮下移植されたC51結腸癌腫瘍の体積
（mm3）のプロット（時での時間に対する）を示す。
【図１６】 図16は、PBS、IL12−HyHEL10融合タンパク質（2.5μｇ/注入）又はIL12−L19
融合タンパク質（2.5μｇ/注入）を、48時間ごとに注入された（矢印により示さ
れる）マウスにおける皮下移植されたC51結腸癌腫瘍の体積（mm3）のプロット（
時での時間に対する）を示す。
【図１７】 図17は、IFN−γのモノマーがscFv（L19）のC−末端で融合されている融合タ
ンパク質をコードする構造体を示す。IFN−γは、融合タンパク質のホモダイマ
ー化を引き起こす。
【図１８】 図18は、一本鎖ホモダイマーIFN−γがscFv (L19) のC−末端で融合されてい
る融合タンパク質をコードする構造体を示す。溶液においては、タンパク質は非
共有的にダイマー化し、MW＝125kDaのタンパク質を生ぜしめる。
【図１９】 図19は、L19 scFv及びモノマーIFN−γを含んで成る融合タンパク質をコード
するベクターpIS14を示す。
【図２０】 図20は、L19 scFv及びダイマーIFN−γを含んで成る融合タンパク質をコード
するベクターpIS16を示す。
【図２１】 図21は、scFv L19− mTNFαcDNA構造体の図示である。ScFv−L19及びmTNFαcD
NAが、15個のアミノ酸 (SSSSG)3をコードするDNAリンカーにより遺伝子的に融合
され、そしてHind III及びNotI制限部位を用いて、pcDNA哺乳類発現ベクター中
にクローン化された。平行線を書かれたボックスは、CMVプロモーター配列を表
し、塗りつぶされたボックスは、シグナル分泌リーダーペプチドのゲノム配列（
ゲノム配列の内部の---イントロン）を表し、そして空白のボックスはscFV−L19
及びmTNFα配列のVH又はVLを表す。T7、BC679, BC742及びBC749は、材料及び方
法に記載されるPCR増幅に使用されるプライマーである。
【図２２】 図22は、マウスL-M線維芽細胞に対する細胞毒性アッセイにより測定される（
例７の材料及び方法を参照のこと）、融合タンパク質のmTNFα部分の生物学的活
性（ぬりつぶした正方形）、及び組換えmTNFαの生物学的活性（ぬりつぶした三
角形）を示す。
【図２３】 図23は、scFv (L19)−mTNFα又はPBS(負の対照としての)のいずれかにより静
脈内注入された、Balb/Cマウスにおける皮下移植されたC51ネズミ結腸の体積の
プロット（時間に対する）である。注入は、腫瘍が約100−200mm3である場合に
行われた。標準誤差は示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ネリ，ダリオ スイス国，ツェーハー−8057 チューリ ヒ，ビンテルツラーシュトラーセ 190， イルヘル ユップシロン36 エム14，スイ ス フェデラル インスティテュート オ ブ テクノロジー チューリヒ，デパート メント オブ アプライド バイオサイエ ンシズ (72)発明者 カルネモッラ，バルバラ イタリア国，イ−16166 ジェノア，ビア ウンベルト テッラチーニ，134／２ (72)発明者 ニルソン，フレドリク スイス国，ツェーハー−8057 チューリ ヒ，ビンテルツラーシュトラーセ 190， イルヘル ユップシロン36 エム14，スイ ス フェデラル インスティテュート オ ブ テクノロジー チューリヒ，デパート メント オブ アプライド バイオサイエ ンシズ (72)発明者 タルリ，ロレンツォ スイス国，ツェーハー−8057 チューリ ヒ，ビンテルツラーシュトラーセ 190， イルヘル ユップシロン36 エム14，スイ ス フェデラル インスティテュート オ ブ テクノロジー チューリヒ，デパート メント オブ アプライド バイオサイエ ンシズ (72)発明者 ボルシ，ラウラ イタリア国，イ−16128 ジェノア，ビア エウジェニア ラバスコ，４／２ (72)発明者 ハリン，コルネリア スイス国，ツェーハー−8057 チューリ ヒ，ビンテルツラーシュトラーセ 190， イルヘル ユップシロン36 エム14，スイ ス フェデラル インスティテュート オ ブ テクノロジー ツューリヒ，デパート メント オブ アプライド バイオサイエ ンシズ Ｆターム(参考） 4C085 AA25 AA26 CC23 DD63 4H045 AA11 BA41 CA40 DA76 EA23 FA74

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）病理学的病変における脈管形成に存在する細胞外マト
    リックス成分に対して特異的な特異的接合メンバー、及び（ii）インターロイキ
    ン−２（IL−２）、インターロイキン−12（IL−12）、腫瘍壊死因子α（TNFα
    ）、インターフェロン−γ（IFN−γ）、組織因子タンパク質及びドキソルビシ
    ンから成る群から選択された分子（但し、前記分子が組織因子タンパク質である
    場合、前記特異的結合メンバーは、抗体L19の１又は複数のVH及び/又はVLドメイ
    ンを含んで成り、そして/又はフィブロネクチンED−Bへの結合について抗体L19
    と競争し、前記抗体L19のVH及びVLドメインのアミノ酸配列は、Piniなど. (1998
    ) J. Biol. Chem. 273: 12769-21776に開示される）の接合体。
  2. 【請求項２】 前記特異的結合メンバーが、腫瘍における脈管形成に存在す
    る細胞外マトリックス成分に対して特異的である請求項１記載の接合体。
  3. 【請求項３】 前記細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチンED−Bで
    ある請求項２記載の接合体。
  4. 【請求項４】 （ｉ）病理学的病変における脈管形成に存在する細胞外マト
    リックス成分に対して特異的な特異的接合メンバーと、（ii）細胞相互作用によ
    り標的細胞に対して殺生物性又は細胞毒性効果を発揮する分子との接合体であっ
    て、前記特異的結合メンバーが、抗体L19の１又は複数のVH及び/又はVLドメイン
    を含んで成り、そして/又はフィブロネクチンED−Bへの結合について抗体L19と
    競争し、前記抗体L19のVH及びVLドメインのアミノ酸配列は、Piniなど. (1998)
    J. Biol. Chem. 273: 12769-21776に開示されることを特徴とする接合体。
  5. 【請求項５】 前記分子が、インターロイキン−２（IL−２）、インターロ
    イキン−12（IL−12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターフェロン−γ（IFN
    −γ）、組織因子タンパク質及びドキソルビシンから成る群から選択された請求
    項４記載の接合体。
  6. 【請求項６】 前記特異的結合メンバーが一本鎖である請求項１〜５のいず
    れか１項記載の接合体。
  7. 【請求項７】 （ａ）前記特異的結合メンバー、及び（ｂ）前記分子、又は
    前記分子の第２ポリペプチド鎖と結合する前記分子のポリペプチド鎖の融合タン
    パク質を含んで成る請求項６記載の接合体。
  8. 【請求項８】 前記特異的結合メンバーが多鎖である請求項１〜５のいずれ
    か１項記載の接合体。
  9. 【請求項９】 （ａ）前記特異的結合メンバーの第１鎖及び前記分子の鎖の
    融合タンパク質、及び（ｂ）前記特異的結合メンバーの第２鎖及び前記分子の鎖
    の融合タンパク質を含んで成る請求項８記載の接合体。
  10. 【請求項１０】 治療によるヒト又は動物の処理方法への使用のための請求
    項１〜９のいずれか１項記載の接合体。
  11. 【請求項１１】 病理学的病変における脈管形成の処理方法への使用のため
    の請求項10記載の接合体。
  12. 【請求項１２】 腫瘍の処理方法への使用のための請求項11記載の接合体。
  13. 【請求項１３】 病理学的病変における脈管形成の処理のための医薬の製造
    への請求項１〜９のいずれか１項記載の接合体の使用。
  14. 【請求項１４】 前記医薬が、腫瘍の処理のためである請求項13記載の使用
    。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜９のいずれか１項記載の接合体を投与すること
    を含んで成る、病理学的病変における脈管形成を処理するための方法。
  16. 【請求項１６】 腫瘍を処理することを含んで成る請求項15記載の方法。
JP2001561361A 2000-02-24 2001-02-22 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法 Expired - Fee Related JP4917232B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18476700P 2000-02-24 2000-02-24
US60/184,767 2000-02-24
US25719200P 2000-12-21 2000-12-21
US60/257,192 2000-12-21
PCT/IB2001/000382 WO2001062298A2 (en) 2000-02-24 2001-02-22 Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011236144A Division JP2012036216A (ja) 2000-02-24 2011-10-27 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003523406A true JP2003523406A (ja) 2003-08-05
JP4917232B2 JP4917232B2 (ja) 2012-04-18

Family

ID=26880452

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001561361A Expired - Fee Related JP4917232B2 (ja) 2000-02-24 2001-02-22 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法
JP2011236144A Withdrawn JP2012036216A (ja) 2000-02-24 2011-10-27 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011236144A Withdrawn JP2012036216A (ja) 2000-02-24 2011-10-27 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8623373B2 (ja)
EP (2) EP1719528B1 (ja)
JP (2) JP4917232B2 (ja)
AT (2) ATE333900T1 (ja)
AU (1) AU2001239470A1 (ja)
CA (1) CA2399866C (ja)
CY (1) CY1112168T1 (ja)
DE (1) DE60121733T2 (ja)
DK (2) DK1719528T3 (ja)
ES (2) ES2269361T3 (ja)
PT (2) PT1719528E (ja)
WO (1) WO2001062298A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009536170A (ja) * 2006-05-08 2009-10-08 フィロジェン・エッセペア 治療用の抗体標的指向サイトカイン
JP2014523238A (ja) * 2011-06-15 2014-09-11 サイル プロテインズ ゲーエムベーハー インターフェロンと標的化修飾ユビキチンタンパク質とを含むヒト融合タンパク質
JP2021513536A (ja) * 2018-02-09 2021-05-27 フィロジェン ソチエタ ペル アツィオーニ Ｅｄｂ標的化ｉｌ−１２組成物

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6749853B1 (en) * 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US6678669B2 (en) 1996-02-09 2004-01-13 Adeza Biomedical Corporation Method for selecting medical and biochemical diagnostic tests using neural network-related applications
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
EP1037927B1 (en) * 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
US20030045681A1 (en) * 1998-05-11 2003-03-06 Anthony J. Zelano Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CN1406249B (zh) 2000-02-11 2010-06-16 默克专利股份有限公司 增加基于抗体的融合蛋白的循环半衰期
ATE333900T1 (de) 2000-02-24 2006-08-15 Philogen Spa Zusamensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
JP2003524018A (ja) * 2000-02-24 2003-08-12 アイトゲネーシシェ テクニシェ ホッホシューレ チューリッヒ フィブロネクチンのｅｄ‐ｂドメインに特異的な抗体、前記抗体を含む複合体、および血管形成を検出および治療するためのその使用
PL358582A1 (en) * 2000-06-29 2004-08-09 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
EP1381629B1 (de) * 2000-09-07 2008-09-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft REZEPTOR DER EDb-FIBRONEKTIN-DOMÄNE (II)
US7148321B2 (en) * 2001-03-07 2006-12-12 Emd Lexigen Research Center Corp. Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE60239454D1 (de) * 2001-05-03 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung
US20030124132A1 (en) * 2001-09-27 2003-07-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined compositions for tumor vasculature coaguligand treatment
HU229098B1 (hu) * 2001-12-04 2013-07-29 Merck Patent Gmbh Megváltoztatott szelektivitású immuncitokinek
PT1483297E (pt) 2002-03-11 2010-03-29 Philogen Spa Anticorpos derivados de anti-ed-b l19 e direccionamento para a vasculatura tumoral
GB0209896D0 (en) 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
EP2366803B8 (en) 2002-10-16 2015-08-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
US7927840B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
KR101086660B1 (ko) * 2002-12-17 2011-11-24 메르크 파텐트 게엠베하 Ｇｄ2 에 결합하는 마우스 14.18 항체의 인간화 항체(ｈ14.18) 및 그것의 ｉｌ-2 와의 융합
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
EP1514561A1 (en) 2003-09-10 2005-03-16 Philogen S.p.A. Targeting of tumor vasculature using radiolabelled antibody L19 against fibronectin ED-B
RU2369616C2 (ru) * 2003-12-30 2009-10-10 Мерк Патент Гмбх Слитые белки il-7
DK1699821T3 (da) * 2003-12-31 2012-07-16 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER
JP2007517506A (ja) * 2004-01-05 2007-07-05 イーエムディー・レキシゲン・リサーチ・センター・コーポレーション 標的化用化合物
JP4438054B2 (ja) * 2004-05-31 2010-03-24 キヤノン株式会社 通信システム、通信装置、アクセスポイント、通信方法およびプログラム
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US7785591B2 (en) 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
DE602005020837D1 (de) * 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1842553A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule
US20090110680A1 (en) * 2006-04-07 2009-04-30 Stephanie Sieger Combination of an anti ED-B fibronectin domain antibody and gemcitabine
US9513296B2 (en) 2006-08-21 2016-12-06 Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of Fyn kinase
US9689879B2 (en) 2006-08-21 2017-06-27 Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of Fyn kinase
EP1917980A1 (en) * 2006-10-31 2008-05-07 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a fusion protein between a cytokine and an antibody targeting the ED-B fibronectin domain for the treatment of atherosclerosis
EP1925664A1 (en) 2006-11-15 2008-05-28 Scil proteins GmbH Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin
WO2008120101A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Philogen S.P.A. The ed-a antigen of fibrinogen is associated with the neovasculature of tumour metastases
EP2167541B1 (en) 2007-07-25 2012-12-19 Philogen S.p.A. The ed-a antigen of fibronectin is associated with the neovasculature of tumour metastases
BRPI0818272B8 (pt) 2007-10-30 2021-05-25 Philogen Spa uso de um membro de ligação que se liga à isoforma extra domínio-a (ed-a) da fibronectina para a preparação de um medicamento para tratamento de artrite reumatóide
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
ATE548052T1 (de) * 2008-01-17 2012-03-15 Philogen Spa Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler
EP2116555A1 (en) 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma
CA2747154C (en) 2008-12-19 2015-11-10 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
US9527907B2 (en) 2009-01-07 2016-12-27 Philogen S.P.A. Antigens associated with endometriosis, psoriatic arthritis and psoriasis
WO2010121766A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
SG178443A1 (en) 2009-08-17 2012-04-27 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
AU2010332938B2 (en) 2009-12-14 2012-12-20 Navigo Proteins Gmbh A method for identifying hetero-multimeric modified ubiquitin proteins with binding capability to ligands
WO2012107416A2 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP2721152B1 (en) 2011-06-15 2019-03-27 Navigo Proteins GmbH Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins
ES2657743T3 (es) 2011-07-19 2018-03-06 Philogen S.P.A. Terapia secuencial con anti-CTLA-4 e IL-2 dirigida
EP3834847A1 (en) 2011-07-27 2021-06-16 Philogen S.p.A. Il-12 immunoconjugate
AU2012314860B2 (en) * 2011-09-26 2017-02-23 Philogen S.P.A. Immunocytokine combination therapy
WO2013186329A1 (en) 2012-06-13 2013-12-19 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains
KR102011549B1 (ko) 2012-10-03 2019-08-16 필로겐 에스.피.에이. 염증성 장 질환과 연관된 항원
WO2014094799A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Scil-Proteins-Gmbh Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life
WO2014174105A1 (en) * 2013-04-25 2014-10-30 Philochem Ag Antibody-drug conjugates
US10611830B2 (en) * 2013-06-06 2020-04-07 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Human antibody against ED-B domain of fibronectin and uses thereof
AU2014299561B2 (en) * 2013-06-24 2017-06-08 Ablbio Antibody-drug conjugate having improved stability and use thereof
US9636340B2 (en) 2013-11-12 2017-05-02 Ayyappan K. Rajasekaran Kinase inhibitors
EP3253785B1 (en) 2015-02-06 2019-04-10 Navigo Proteins Gmbh Novel egfr binding proteins
CA2991812C (en) 2015-07-16 2024-02-13 Navigo Proteins Gmbh Immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification
JP2018520675A (ja) 2015-07-20 2018-08-02 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法
US20180340936A1 (en) * 2015-11-16 2018-11-29 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia
CN108430511B (zh) * 2015-12-21 2021-06-04 合肥立方制药股份有限公司 一种药物设计方法和获得的药物及其应用
JP2019526526A (ja) 2016-05-04 2019-09-19 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ペプチドリンカーを含む化学的部分の部位特異的カップリングのための標的化合物
GB201612317D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Philogen Spa Antibody compositions
JP6951417B2 (ja) 2016-08-11 2021-10-20 レプリゲン・コーポレイションＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ アフィニティークロマトグラフィーのためのＦＣ−結合タンパク質、並びにＦｃ−結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスおよびその使用
AU2017344440B2 (en) * 2016-10-17 2020-07-30 Pfizer Inc. Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates
US11103592B2 (en) 2016-11-09 2021-08-31 Philogen S.P.A. IL2 and TNF mutant immunoconjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
CN110997718B (zh) 2017-06-07 2023-11-10 菲洛根股份公司 血管内皮生长因子/抗纤连蛋白抗体融合蛋白
WO2019091918A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
WO2020047333A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
CN113508127A (zh) 2018-11-06 2021-10-15 阿尔萨泰克公司 神经变性疾病的基于细胞的基因疗法
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
CN115666645A (zh) * 2020-05-22 2023-01-31 菲洛根股份公司 用于脑瘤治疗的TNFα免疫缀合物疗法
WO2022214664A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Philogen S.P.A. Improved interferon-gamma mutant
WO2023180341A1 (en) 2022-03-21 2023-09-28 Philogen S.P.A TNFα IMMUNOCONJUGATE PREPARATION
WO2023180409A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Philogen S.P.A Il2 immunoconjuqate preparation
WO2024028258A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Philochem Ag Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents
WO2024047237A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Philogen S.P.A. Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer
WO2024052333A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Philochem Ag Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058570A2 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use therefor for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IT1217724B (it) 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
PT627940E (pt) 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
WO1996001653A1 (en) 1994-07-11 1996-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
GB9610967D0 (en) * 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
JP2003524018A (ja) 2000-02-24 2003-08-12 アイトゲネーシシェ テクニシェ ホッホシューレ チューリッヒ フィブロネクチンのｅｄ‐ｂドメインに特異的な抗体、前記抗体を含む複合体、および血管形成を検出および治療するためのその使用
ATE333900T1 (de) 2000-02-24 2006-08-15 Philogen Spa Zusamensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058570A2 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use therefor for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009536170A (ja) * 2006-05-08 2009-10-08 フィロジェン・エッセペア 治療用の抗体標的指向サイトカイン
JP2014523238A (ja) * 2011-06-15 2014-09-11 サイル プロテインズ ゲーエムベーハー インターフェロンと標的化修飾ユビキチンタンパク質とを含むヒト融合タンパク質
JP2021513536A (ja) * 2018-02-09 2021-05-27 フィロジェン ソチエタ ペル アツィオーニ Ｅｄｂ標的化ｉｌ−１２組成物
JP7279054B2 (ja) 2018-02-09 2023-05-22 フィロジェン ソチエタ ペル アツィオーニ Ｅｄｂ標的化ｉｌ－１２組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US8784824B2 (en) 2014-07-22
ATE526039T1 (de) 2011-10-15
CY1112168T1 (el) 2015-12-09
PT1257297E (pt) 2006-12-29
DE60121733D1 (de) 2006-09-07
US20100316602A1 (en) 2010-12-16
AU2001239470A1 (en) 2001-09-03
PT1719528E (pt) 2012-01-06
US20140348784A1 (en) 2014-11-27
US8623373B2 (en) 2014-01-07
DK1257297T3 (da) 2006-11-20
WO2001062298A9 (en) 2003-07-31
EP1719528A2 (en) 2006-11-08
EP1719528A3 (en) 2007-12-12
ATE333900T1 (de) 2006-08-15
JP2012036216A (ja) 2012-02-23
JP4917232B2 (ja) 2012-04-18
WO2001062298A2 (en) 2001-08-30
DK1719528T3 (da) 2012-01-09
US20040013640A1 (en) 2004-01-22
ES2373966T3 (es) 2012-02-10
CA2399866A1 (en) 2001-08-30
EP1257297A2 (en) 2002-11-20
DE60121733T2 (de) 2007-08-09
EP1719528B1 (en) 2011-09-28
EP1257297B1 (en) 2006-07-26
WO2001062298A3 (en) 2002-06-20
ES2269361T3 (es) 2007-04-01
CA2399866C (en) 2011-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4917232B2 (ja) 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法
US11274133B2 (en) IL2 and TNF immunoconjugates
US20210369857A1 (en) Il2 and tnf mutant immunoconjugates
US5824782A (en) Immunoconjugates II
RU2129018C1 (ru) Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция
KR20090008467A (ko) 치료용의 항체­표적 사이토카인
EP3660039A1 (en) Il2 immunoconjugates
AU2008229789B2 (en) Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071204

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110216

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110216

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20110705

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111027

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20111028

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20111124

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120110

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120126

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150203

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 4917232

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees