KR101086660B1

KR101086660B1 - Ｇｄ2 에 결합하는 마우스 14.18 항체의 인간화 항체(ｈ14.18) 및 그것의 ｉｌ-2 와의 융합

Info

Publication number: KR101086660B1
Application number: KR1020057011370A
Authority: KR
Inventors: 스테픈 디 길리즈; 킨밍 로
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2011-11-24
Also published as: ATE471946T1; DK1572748T3; EP1572748A1; BRPI0317376B8; US20100210831A1; WO2004055056A1; AU2003298187B2; AU2003298187A1; PT1572748E; CN1726227A; JP2006521085A; BR0317376A; CN100432105C; PL377337A1; JP4494977B2; US20040203100A1; CA2510180C; CA2510180A1; EP1572748B1; ZA200505681B

Abstract

본 발명은 인간 세포 표면 글리코스핑고리피드(glycoshpingolipid) GD2 에 결합하는 인간화 항체 H14.18 을 제공한다. 상기 항체는 변형된 가변영역, 더욱 특히 변형된 골격부위를 포함하는데, 이는 인간에게 투여될 때, 그 면역원성(immunogenicity)을 감소시킨다. 상기 항체는 IL-2 와 같은 치료제와 결합되어, 암 치료에 사용될 수 있다.

인간화 항체, 마우스 항체, 항체 가변영역

Description

ＧＤ2 에 결합하는 마우스 14.18 항체의 인간화 항체 (Ｈ14.18) 및 그것의 ＩＬ-2 와의 융합{HUMANIZED ANTIBODY (H14.18) OF THE MOUSE 14.18 ANTIBODY BINDING TO GD2 AND ITS FUSION WITH IL-2}

[기술분야]

본 발명은 일반적으로 변형 항체(modified antibody)에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 인간 세포 표면 글리코스핑고리피드(glycoshpingolipid) GD2 에 특이적으로 결합하는 감소된 면역원성(immunogenicity)을 가지는 변형 항체, 및 치료제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

[배경기술]

항체-기재 치료의 발달에 있어서 중요한 진보가 수년에 걸쳐서 있어왔다. 예를 들면, 연구자들은 다양한 암-특이적 표지(marker) 뿐만 아니라, 상기 표지에 특이적으로 결합하는 다양한 항체를 확인하였다. 항체는 특정 분자, 예를 들면, 독소 또는 면역 자극 모이어티(moiety), 예를 들면, 사이토킨(cytokine)을, 표지를 발현시키는 암세포에 전달하여 암세포를 선택적으로 사멸시키는데 사용될 수 있다.

14.18 항체는 세포 표면 글리코스핑고리피드 GD2 에 대하여 지정된 마우스- 유래 단일클론 항체이다. GD2 는, 뉴런 세포막의 외부 표면 상에서 중요한 수준으로 보통 단지 발현된 디시알로강글리오사이드(disialoganglioside)이며, 여기서 면역 체계에 대한 그 노출은 혈뇌장벽(blood brain barrier)에 의하여 제한된다.

대조적으로, 다수의 암세포들은 비정상적인 수준의 글리코스핑고리피드 세포 표면 발현을 가진다. 예를 들면, GD2 는 신경모세포종(neuroblastomas), 속질모세포종(medulloblastomas), 성상세포종(astrocytomas), 흑색종(melanomas), 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 골육종(osteosarcomas) 및 다른 연조직 육종(soft tissue sarcomas) 을 포함하는 넓은 범위의 종양 세포의 표면 상에서 발현된다. 따라서, GD2 는 종양 세포가 그들을 파괴하는 것에 대항하는 효과적인 면역 반응을 향상시키려는 의도로서, 면역-자극 단백질 도메인(domain)을 종양 세포에 표적화하는데 편리한 종양-특이적 표지이다. 14.18 마우스 항체(m14.18 항체)가 상기 단백질 도메인의 종양 세포로의 표적화에 조력할 수 있는 반면, 그 마우스-유래 아미노산 서열은 바람직한 치료 효과를 손상시킬 수 있다.

환자에게 투여될 때, 항체는 숙주 포유동물 내에서, 연관된 면역원성을 가질 수 있다. 이는 항체가 자가의 것(autologous)이 아닐 때, 더욱 쉽게 발생한다. 결과적으로, 항체-기재 치료요법의 유효성은 종종 치료적 항체에 대하여 지정된 면역원성 반응에 의하여 제한된다. 항체가 완전히 또는 부분적으로 숙주 포유동물과 다른 포유동물로부터 유래될때, 예를 들면 항체가 마우스로부터 유래되고, 수용자가 인간일 때, 상기 면역원성 반응은 전형적으로 증가된다.

인간에서 임상적인 이용에 있어서, 마우스-유래 항체를 더욱 근접하게 닮은 인간 항체로 변형하는 것이 유용하며, 이로써 마우스-유래 항체의 면역원성을 감소 또는 최소화할 수 있다. 마우스-유래 항체의 면역원성은 키메릭 항체(chimeric antibody)의 창조에 의해서 감소될 수 있는데, 여기서 인간 항체의 불변영역(constant region)이 마우스 가변영역(variable domain)으로 융합된다. 그러나, 잔존하는 마우스 가변영역은 일반적으로 여전히 인간에 면역원성이며, 따라서 항체-기재 치료요법의 효능을 손상시킬 수 있다.

"화장판 가공(veneering)" 및 "인간화(humanization)" 와 같은 면역원성을 감소시키기 위한 몇몇의 접근들은, 다수의 아미노산 치환체의 도입을 포함하며, 항체의 항원에의 결합을 단절시킬 수 있다. m14.18 항체는 보통의 친화성으로 GD2 에 결합한다. 따라서, m14.18 의 GD2 에 대한 친화성을 현저하게 감소시키는 변이(mutation)는, 인간 치료 목적에 있어서 이를 덜 효과적으로 만들게 될 것으로 기대된다. 따라서, GD2 를 효과적으로 표적화하고 인간에게 투여될 때 감소된 면역원성을 가지는 치료 항체에 대한 필요가 본 기술분야에 존재한다.

[발명의 요약]

일반적으로, 본 발명은 인간에게 덜 면역원성이지만, 여전히 m14.18 의 인간 GD2 에 대한 결합 친화성을 유지하는, m14.18 항체의 변형된 형태를 제공한다.

더욱 특히, 본 발명은 m14.18 항체의 인간화 형태(hu14.18 항체)를 제공하며, 여기서 하나 이상의 골격부위(framework region)에서 몇몇의 마우스-특이적 아 미노산은 다른 아미노산으로 치환되어, 인간에서의 그 면역원성을 감소시킨다. 또한, 본 발명은 표적 면역 치료요법의 효과를 강화시키기 위하여, hu14.18 항체의 하나 이상의 비-면역글로불린 모이어티에의 융합을 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 로 설정되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 가변영역을 제공하는데, 이는 면역글로불린 경쇄 가변영역 (V_L 영역)을 정의한다. 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 로 설정되는 아미노산 서열 을 포함하는 항체 가변영역에 관한 것인데, 이는 면역글로불린 중쇄 가변영역 (V_H 영역)을 정의한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2 로 설정된 아미노산 서열에 연결된, 항체 가변영역을 제공한다. 상기 아미노산 서열은 이황화결합 또는 펩티드 결합과 같은 것에 의해 연결될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 특이적으로 GD2 에 결합하고, 적어도 SEQ ID NO:1 의 아미노산 1-23, SEQ ID NO:2 의 아미노산 1-25 또는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 67-98 을 포함하는, 항체 가변영역에 관한 것이다. 상기 서열들은 hu14.18 항체의 면역글로불린 가변영역 내에서 골격부위를 정의한다. 골격부위는 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.

본 발명의 하나의 측면은, GD2 로 그 표면 상에 세포를 표적화하는 방법에 관한 것이고, 본 발명의 항체 가변영역을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 표적화된 세포는 종양 세포이다. 본 발명의 또다른 측면 은, 환자에게 투여될 수 있거나 in vitro 에서 단백질 생성에 사용될 수 있는, 항체 가변영역 또는 상기 핵산을 포함하는 세포를 암호화(encoding)하는 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체 가변영역 및 적어도 CH2 도메인, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 Fc 부분(portion)을 포함하는 폴레펩티드, 및 폴리펩티드, 핵산 또는 세포를 환자에게 투여함에 의하여, 세포를 GD2 를 사용하여 그 표면 상에 표적화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 몇몇의 구현예에서, Fc 부분은 IgG1 으로부터 유래된다.

항체 가변영역은, Fc 부분에 끼어들거나 또는 끼어들지 않고, 비-면역글로불린 모이어티에 연결될 수 있다. 구체적으로, 비-면역글로불린 모이어티는 인터루킨(interleukin), 조혈인자(hematopoietic factor), 림포킨(lymphokine), 인터페론(interferone) 또는 케모킨(chemokine)과 같은 사이토킨일 수 있다. 인터루킨은, 예를 들면, 인터루킨-2 또는 인터루킨-12 일 수 있다. 조혈인자 및 림포킨은, 각각, 예를 들면, 과립구-대식세포 집락 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; GM-CSF) 및 림프독소일 수 있다. 인터페론은, 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β 또는 인터페론-γ 일 수 있다. 본 발명의 몇몇의 구현예에서, 융합 단백질은 2 차 사이토킨과 같은 2 차 비-면역글로불린 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 항체 가변 영역, IL-2 및 IL-12 를 포함한다.

본원에 기재된 다양한 구현예의 특징은 상호 배타적이지 않고, 다양한 조합 및 순열에서 존재할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

도 1A 는 본 발명에 따른 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 1B 는 본 발명에 따른 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2A-D 는 본 발명에 따른 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄-IL-2 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구조를 포함하는, 발현 벡터의 핵산 서열을 나타낸다.

도 3A 는 본 발명에 따른 면역글로불린 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3B 는 본 발명에 따른 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 인간에게 덜 면역원성이지만, 여전히 인간 GD2 에 특이적으로 결합할 수 있는, m14.18 항체의 변형된 형태를 제공한다. 감소된 면역원성은 면역글로불린 가변영역에서 하나 이상의 변경된 아미노산 서열에 의해서 제공된다. 항체는, 특히 사이토킨 또는 다른 면역 조절자와 융합될 때, GD2-양성 종양을 치료하는데 유용하다.

본원에서 사용된, 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 은 (i) 무손상의(intact) 항체(예를 들면, 단일클론 항체 또는 다클론 항체), (ii) 예를 들면, Fab 분절(fragment), Fab' 분절, (Fab')₂ 분절, Fv 분절, 단일사슬 항체 결합자리, sFv 를 포함하는 그 항원 결합부, (iii) 양-특이적(bi-specific) 항체 및 그 항원 결합부, 및 (iv) 다중-특이적 항체 및 그 항원결합부를 의미하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된, 용어 "특이적으로 결합(bind specifically)", "특이적으로 결합(specifically bind)" 및 "특이적인 결합(specific binding)" 은 항체가 특정 항원에 대하여, 약 10⁶ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는, 약 10⁷ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10⁸ M^-1 이상, 가장 바람직하게는 약 10¹⁰ M^-1 이상의 결합 친화성을 가지는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된, 용어 "골격부위" 및 "FRs" 는 상보성결정부위(complementarity Determining Regions; CDRs)와 인접한 면역글로불린 가변영역의 영역을 의미하는 것으로 이해된다. CDRs 는 주로 항원과 상호작용하는 면역글로불린 가변영역의 부분이다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, V_H 및 V_L 영역은 양자 모두 4 개의 FRs 를 함유하고, 아미노산 서열의 상자화된(boxed) 부분 내에 위치한다.

특히, 도 1A 에 나타내어진 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 관련하여, 경쇄 FRs 는 아미노산 서열 Asp1 내지 Cys23 (huV_LFR1), His39 내지 His54 (huV_LFR2), Gly62 내지 Cys93 (huV_LFR3) 및 Phe104 내지 Lys113 (huV_LFR4)에 의하여 정의된다. 도 1B 에 나타내어진 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)에 관련하여, 중쇄 FRs 는 아미노산 서열 Glu1 내지 Ser25 (huV_HFR1), Trp36 내지 Gly49 (huV_HFR2), Arg67 내지 Ser98 (huV_HFR3) 및 Trp103 내지 Ser113 (huV_HFR4)에 의하여 정의된다.

본 발명의 단백질 서열

본 발명은 인간 세포 표면 글리코스핑고리피드 GD2 에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하고, m14.18 항체로부터 유래된 변형된 영역을 가지는 항체를 특징으로 한다. V_H 또는 V_L 아미노산 서열 (또는 양자 모두)은, 인간에게 투여될 때, 변형되거나 인간화되어 그 면역원성을 감소시킨다. 본 발명에 따르면, m14.18 항체는, 예를 들면, 탈면역화(deimmunization) 방법을 사용하여 인간화 될 수 있는데, 여기서 잠재 T 세포 에피토프(potential T cell epitope)는, 펩티드 에피토프의 MHC 클래스(Class) II 분자에의 결합을 감소시키는 변이의 도입에 의하여 제거되거나 약화된다(예를 들면, WO98/52976 및 WO00/34317 참조). 대안적으로, 비-인간 T 세포 에피토프는 변이되어, 인간 항체에 존재하는 인간 자가(self) 에피토프에 상응한다(예를 들면, 미국 특허 제 5,712,120 호 참조). 본 발명은 하나 이상의 인간화 FR 서열을 포함하는 V_L 및 V_H 영역을 가지는 GD2 항체를 제공하며, 이로써 인간에게 투여될 때 면역원성을 감소시킨다.

I. 중쇄 및 경쇄 가변영역

상기 언급된 바와 같이, hu14.18 은 인간 GD2 항원에 특이적인 결합을 유지 하는 m14.18 항체로부터 유래된 인간화 가변영역을 포함한다. 본 발명의 몇몇의 구현예에서, hu14.18 항체의 V_L 영역은 하기 폴리펩티드를 포함한다:

특정 구현예에서, hu14.18 항체는 SEQ ID NO:1 의 잔기 1 내지 23, 즉,

에 의해서 정의되는 경쇄 FR1 을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, hu14.18 항체의 V_H 영역은 하기 폴리펩티드를 포함한다:

특정 구현예에서, hu14.18 항체는 SEQ ID NO:2 의 잔기 1 내지 25, 즉

에 의해서 정의되는 중쇄 FR1 을 포함한다(huV_HFR1).

본 발명의 추가의 구현예에서, hu14.18 항체는 SEQ ID NO:2 의 잔기 67 내지 98,즉

에 의해서 나타내어지는 중쇄 FR3 을 포함한다(huV_HFR3).

앞선 구현예들의 다양한 조합은 또한 본 발명의 범위 내이다. 예를 들면, hu14.18 항체는 SEQ ID NO:1 로 설정된 V_L 서열 및 SEQ ID NO:2 로 설정된 V_H 서열을 포함할 수 있다. V_L 및 V_H 영역은 그 핵산 서열이 어떻게 구성되었는가에 따라 이황화 결합 또는 펩티드 결합에 의해서 연결될 수 있다. 일반적으로, V 영역은 그 서열이 분리된 DNA 구조 상에서 암호화될 때, 이황화 결합에 의해 연결된다. 대조적으로, V 영역은 그 서열이 단일사슬 DNA 구조 상에서 암호화 될 때, 전형적으로 펩티드 결합에 의해 연결된다.

또한, 본 발명은 GD2 에 특이적으로 결합하고, 적어도 인간화 V 영역의 부분을 포함하는 항체에 주목한다. 예를 들면, hu14.18 항체는 SEQ ID NO:1 에 의하여 정의된 V_L 영역 및 huV_HFR1 또는 huV_HFR2 과 같은 인간화 FR 을 하나 이상 가지는 V_H 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO:2 에 의하여 정의된 V_H 영역 및 huV_LFR1 과 같은 인간화 FR 을 하나 이상 가지는 V_L 영역을 포함할 수 있다. 또한, hu14.18 항체는 인간화 FR 을 하나 이상 가지는 V_H 영역 및/또는 인간화 FR 을 하나 이상 가지는 V_L 영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은, 각각, 면역글로불린의 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역에 연결될(coupled) 수 있다. 면역 글로불린 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 사슬로 지정되는 불변영역을 가진다. 본 발명의 특정 구현예에서, 경쇄 불변영역은 카파 사슬이다. 중쇄 불변영역 및 이의 다양한 변형 및 조합들은 하기에서 상세히 논의된다.

II. Fc 부분(Fc portion)

본 발명의 항체 가변 도메인은 Fc 부분에 융합될 수 있다. 본원에서 사용된, Fc 부분은 불변영역의 분절, 유사체(analog), 변종(variant), 변이체(mutant) 또는 유도체를 포함하는 면역글로불린, 바람직하게는 인간 면역글로불린의 중쇄 불변영역으로부터 유래된 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 불변영역은, 적어도 CH1, 경첩(hinge), CH2, CH3 및 몇몇의 중쇄에 있어서는 CH4 도메인을 포함하는 중쇄의 C-말단(terminal) 영역의 부분에 상동인, 자연발생적 또는 합성적으로 생성된 폴리펩티드에 의해서 정의된다. "경첩" 영역은 Fc 부분의 CH1 도메인을 CH2-CH3 영역에 결합시킨다. 모든 포유동물 면역글로불린의 중쇄의 불변영역은 광범위한(extensive) 아미노산 서열 유사성을 나타낸다. 상기 면역글로불린 영역에 대한 DNA 서열은 공지기술에 잘 알려져 있다 (예를 들면, Gillies 등, (1989), J. Immunol. Meth. 125:191 참조).

본 발명에서는, Fc 부분은 전형적으로 적어도 CH2 도메인을 포함한다. 예를 들면, Fc 부분은 전체 면역글로불린 중쇄 불변영역(CH1-경첩-CH2-CH3)을 포함할 수 있다. 대안적으로, Fc 부분은 모든 또는 일정 부분의 경첩 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다.

면역글로불린의 불변영역은 Fc 수용체(FcR) 결합 및 보체(complement) 고정 을 포함하는, 다수의 중요한 항체 효과기(effector)에 책임이 있다. 중쇄 불변영역의 다섯 가지의 주요한 클래스가 있는데, 이는 IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM 로 분류되며, 각각 특징적인 효과기 기능이 이소형(isotype)에 의해 지정된다.

예를 들면, IgG 는 네가지 γ 이소형: γ1, γ2, γ3 및 γ4 으로 나뉘어지며, 이는 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로 또한 알려져 있다. IgG 분자는 IgG 클래스의 항체에 특이적인 세가지 클래스의 Fcγ 수용체(FcγR), 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 를 포함하는, 다중 클래스의 세포 수용체와 상호작용할 수 있다. IgG 의 FcγR 수용체에 대한 결합에 있어서 중요한 서열은 CH2 및 CH3 도메인 내에 있는 것으로 보고되었다.

항체의 혈청(serum) 반감기는 항체의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 능력에 의해 영향받는다. 유사하게, 면역글로불린 융합 단백질의 혈청 반감기도 또한 상기 수용체에 결합하는 무능력(inability)에 의해 영향받는다 (Gillies 등, Cancer Research (1999) 59:2159-66). IgG2 및 IgG4 의 CH2 및 CH3 도메인은, IgG1 의 그것과 비교하여, Fc 수용체에 대한 검출불가능한 또는 감소된 결합 친화성을 가진다. 따라서, 주요한(featured) 항체의 혈청 반감기는 IgG2 또는 IgG4 이소형으로부터의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 사용함에 의하여 증가될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시키기 위해, 상기 도메인 내의 하나 이상의 아미노산이 변형된, IgG1 또는 IgG3 으로부터의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허출원 공보 2003-0105294-A1 에 공개된, 미국 특허출원 09/256,156 참조).

Fc 부분의 경첩 영역은 보통 중쇄 불변영역의 CH1 도메인의 C-말단에 인접해있다. 본 발명의 단백질들이 포함될 때, 경첩은 자연발생적인 면역글로불린 영역에 상동이고, 전형적으로 천연 면역글로불린으로서 이황화 결합을 통하여 두개의 중쇄를 연결하는 시스테인 잔기를 포함한다. 인간 및 마우스 면역글로불린에 있어서 경첩 영역의 대표적인 서열은 [문헌 Antibody Engineering, a Practical Guide, (Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co., 1992)] 에서 발견될 수 있다.

본 발명에 있어서 적절한 경첩 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 다른 면역글로불린 이소형으로부터 유래될 수 있다. IgG1 이소형은 경첩 영역 내에서, 효율적이고(efficient) 일치하는(consistent) 이황화 결합 형성을 가능하게 하는 두개의 이황화 결합을 가진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 경첩 영역은 IgG1 으로부터 유래된다. 임의로, 우선, IgG1 경첩의 대부분의 N-말단 시스테인은 변이되어 본 발명의 항체 또는 항체 융합 단백질의 발현 및 조립(assembly)을 강화시킨다 (예를 들면, 미국 특허출원 공보 2003-0044423-A1 에 공개된, 미국 특허출원 10/093,958 참조).

IgG1 과는 대조적으로, IgG4 의 경첩 영역은 인터체인(interchain) 이황화 결합을 비효율적으로 형성하는 것으로 알려져 있다 (Angal 등, (1993), Mol. Immunol. 30:105-8). 또한, IgG2 경첩 영역은 올리고머화(oligomerization) 및 재조합 체계에서, 분비 동안, 아마도 부정확한 이황화 결합을 촉진시키는 경향이 있는 네개의 이황화 결합을 가진다. 본 발명의 하나의 적절한 경첩 영역은 IgG4 경첩 영역으로부터 유래될 수 있으며, 우선적으로 중쇄-유래 모이어티 사이의 정확한 이황화 결합의 형성을 강화시키는 변이를 포함한다 (Angal 등, (1993), Mol. Immunol. 30(1):105-8). 다른 바람직한 경첩 영역은 IgG2 경첩으로부터 유래될 수 있으며, 여기서 최초 두개의 시스테인이 각각, 일반적으로 바람직한 순서로, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 메티오닌, 발린, 이소루신, 루신, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 셀레노시스테인과 같은 다른 아미노산으로 변이된다 (예를 들면, 미국 특허 공보 2003-0044423-A1 참조).

본 발명의 항체 가변영역에 융합된 Fc 부분은 다른 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 경첩 영역을 함유할 수 있다. 예를 들면, Fc 부분은 IgG2 또는 IgG4 의 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1 의 경첩 영역을 포함할 수 있다. 상기 하이브리드(hybrid) Fc 부분의 조립은 미국 특허출원 공보 2003-0044423-A1 에 기재되어 있다.

본 발명의 항체 가변영역에 융합될 때, Fc 부분은 바람직하게는, Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 일반적으로 연장시키는, 하나 이상의 아미노산 변형을 함유한다. 상기 아미노산 변형은, Fc 수용체 결합 활성 또는 보체 고정 활성을 본질적으로 감소 또는 제거시키는 변이를 포함한다. 예를 들면, 상기 변이의 한가지 형태는 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분의 글리코실화(glycosylation) 자리를 제거한다. IgG1 에서, 글리코실화 자리는 Asn297 이다 (예를 들면, 미국 특허출원 공보 2003-0166163-A1 에 공개된, 미국 특허출원 10/310,719 참조).

III. 융합 연접 영역(Fusion junction region)

본 발명의 항체 가변영역은, 연결 펩티드를 통해서와 같이, 비-면역글로불린 모이어티에 직접 또는 간접으로, 연결 또는 융합될 수 있다(예를 들면, (Gly₄-Ser)₃ (SEQ ID NO:3)). 개시된 융합 단백질의 면역원성은, 미국 특허출원 공보 2003-0166877-A1 에 기재된 바와 같이, 융합 연접 또는 연접 에피토프가 T-세포 수용체와 상호작용하는 능력을 손상시킴에 의하여 감소될 수 있다. 심지어 두가지 인간 단백질, 예를 들면 인간 Fc 및 인간 IL-2 사이의 융합에 있어서, 융합 연접 또는 연접 에피토프를 둘러싸는 영역은, 인체 내에서 보통 존재하지 않는 펩티드 서열을 포함하고, 따라서 이는 면역원성일 수 있다. 연접 에피토프의 면역원성은, 예를 들면, 하나 이상의 융합 연접 부근의 글리코실화 자리의 도입 또는 미국 특허출원 공보 2003-0166877-A1 에 기재된 바와 같은 연접을 방사하는 후보 T-세포 에피토프의 검출 및 후보 T-세포 에피토프가 T-세포 수용체와 상호작용하는 능력을 감소시키기 위한 연접 부근의 아미노산의 변화에 의해서 감소될 수 있다.

상기 단백질의 혈청 반감기는 또한, 융합 연접 영역 내로 변이를 도입함에 의하여 증가될 수 있다. 예를 들면, 비-면역글로불린 모이어티에 융합된 CH3 도메인을 포함하는 단백질 내에서, CH3 도메인의 C-말단 리신은, 알라닌과 같은 다른 아미노산으로 변화될 수 있는데, 이는 결과적인 융합 단백질의 혈청 반감기의 상당한 증가를 제공할 수 있다.

특정 구현예에서, 융합 연접의 단백분해 절단(proteolytic cleavage)이 바람직하다. 따라서, 유전자간(intergenic) 영역은 단백분해 절단 자리를 암호화하 는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 및 사이토킨 사이에 삽입된(interposed) 상기 자리는, 표적화 자리에서 사이토킨의 단백분해 유리를 제공하도록 지정될 수 있다. 예를 들면, 단백분해효소(protease)에 접근가능한 자리에서 리신 및 아르기닌 잔기 후에 플라즈민(plasmin) 및 트립신이 절단되는 것이 잘 알려져 있다. 다른 자리-특이적 내인성단백분해효소(endoprotease) 및 그들이 인식하는 아미노산 서열이 잘 알려져 있다.

IV. hu14.18 항체 융합 단백질을 사용한 인간 질병의 치료

본 발명의 항체 가변영역은 진단 및/또는 치료제에 부착될 수 있다. 상기 약제는 항체에 융합되어 융합 단백질을 생성할 수 있다. 대안적으로, 상기 약제는 화학적으로 항체에 연결되어, 면역-포합체(immuno-conjugate)를 생성할 수 있다. 예를 들면, 상기 약제는 독소, 방사선 표지(radiolabel), 영상 제제(imaging agent), 면역 자극 모이어티(immunostimulatory moiety) 등일 수 있다.

본 발명의 항체 가변영역은 사이토킨에 부착될 수 있다. 바람직한 사이토킨은 인터루킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 및 IL-18 과 같은 인터루킨, 과립구-대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 같은 조혈인자, 과립구 집락 자극인자(G-CSF) 및 에리트로포이에틴(erythropoietin), TNF 와 같은 종양 괴사 인자(TNF), 림프독소와 같은 림포킨, 렙틴(leptin)과 같은 대사과정 조절제, 인터페론α, 인터페론β 및 인터페론γ와 같은 인터페론 및 케모킨을 포함한다. 바람직하게는, 항체-사이토킨 융합 단백질 또는 면역포합체는 사이토킨 생물학적 활성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 항체 가변영역은 IL-2 에 융합된다. 바람직하게는, IL-2 모이어티 내의 몇몇의 아미노산들은, 미국 특허출원 공보 2003-0166163-A1 에 기재되어 있는 바와 같이 변이되어 독성을 감소시킨다.

예를 들면, 도 3A 및 3B 는 본 발명에 따른 항체 융합 단백질의 특정 구현예의 아미노산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 3A 는 가변영역 및 불변영역을 포함하는 인간화 면역글로불린 경쇄의 펩티드 서열을 나타낸다. 도 3B 는 IL-2 에 연결되어 있는 인간화 면역글로불린 중쇄의 펩티드 서열을 나타낸다. 상기 폴리펩티드는 GD2 에 특이적으로 결합하고, 면역 체계를 자극할 수 있는 인간화 항체 융합 단백질을 제공한다.

임의로, 상기 단백질 복합체는 추가로 2차 사이토킨과 같은 2차 약제를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, hu14.18 항체 융합 단백질은 IL-12 및 IL-2 를 포함한다. 면역글로불린 도메인 및, 두가지 상이한 사이토킨을 함유하는 단백질 복합체의 구조는, 미국 특허 제 6,617,135 호에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 융합 단백질은 암과 같은 인간의 질병을 치료하는데 유용하다. 인간의 암을 치료할 때, 본 발명의 V 영역을 포함하는 항체-IL-2 융합 단백질을, 0.1 내지 100 mg/㎡/환자 의 용량을 사용하여, 주사 또는 피하주사에 의하여 투여하는 것이 특히 유용하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 V 영역을 포함하는 항체-IL-2 융합 단백질을, 1 내지 10 mg/㎡/환자 및 더욱 바람직하게는 약 3 내지 6 mg/㎡/환자 의 용량을 사용하여, 주사 또는 피하주사에 의하여 투여하는 것이 특히 유용하다.

임상 연구는 하기의 hu14.18-IL-2, 융합 단백질의 투여가, IL-2 반응성(responsive) 세포를 IL-2 수용체를 통하여 활성화하는 그 능력을 보유하며, GD2-양성 종양 세포에 결합하고 IL-2 를 그 표면에 전달하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 더구나, hu14.18-IL-2 융합 단백질을 암 환자에게 투여하는 것은 놀라울 정도로 많은 수의 환자에게서 질병 진행의 안정화를 야기시켰다 (실시예 1 참조).

본 발명의 약학 조성물은, 바람직하게는 정확한 용량의 투여에 적합한 단위 제제로서, 예를 들면, 알약, 캡슐, 분말, 액상, 현탁액 등과 같은 고체, 반고체 또는 액체 제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 약학적 담체 또는 부형제를 포함하며, 게다가 다른 의약제제, 약학제제, 담체, 부가제 등을 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들면, 인간 혈청 알부민 또는 플라즈마 단백질과 같은 다른 단백질을 포함할 수 있다. 상기 제제를 제조하는 실제적인 방법은 공지되어 있거나, 당업자에게 명백하다. 상기 투여되는 조성물 또는 제형물은, 좌우간, 치료받고 있는 피검자에게서 바람직한 효과를 달성하는데 효과적인 양으로, 활성 성분의 양을 함유한다.

본원의 조성물의 투여는, 상기 활성을 나타내는 약제의 투여의 어떠한 일반적으로 인정되는 방식을 통한 것일 수 있다. 상기 방법은, 경구, 비경구 또는 국소 투여 및 다른방법으로 전신 투여를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 내에서의 정맥내 주사는 투여의 바람직한 방법이다 (실시예 1 참조).

물론, 투여되는 활성 화합물의 양은 치료받고 있는 피검자, 병의 심각성, 투 여의 방식 및 예방 의사의 판단에 의존한다.

본 발명의 핵산

I. hu14.18 항체 구조

본 발명은 또한 상기 형태의 단백질을 각각 발현시킬 수 있는 핵산을 특징으로 한다. 이는 예를 들면, SEQ ID NO:1 로 설정된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산; SEQ ID NO:2 로 설정된 아미노산; huV_LFR1 아미노산 서열을 포함하는 h14.18 항체 V_L 영역; huV_HFR1 아미노산 서열을 포함하는 h14.18 항체 V_H 영역; huV_HFR3 아미노산 서열을 포함하는 h14.18 항체 V_H 영역; 하나 이상의 앞서의 인간화 FR 서열 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 hu14.18 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

본 발명의 hu14.18 항체는 유전자 가공 기술; 즉, 본 발명의 바람직한 FRs 를 함유하는 GD2 특이적 항체를 암호화하는 핵산 구조의 형성에 의해서 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 5' 에서 3' 배향으로, 특징지워진 항체를 암호화하는 유전자 구조는, 그 안의 하나 이상의 인간화 FR 을 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분절(segment) 및 중쇄 불변영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함한다. 또다른 구현예에서, 사이토킨을 암호화하는 다른 DNA 분절은 중쇄 불변영역을 암호화하는 DNA 분절의 3' 말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 유전자 구조는, 5' 에서 3' 배향으로, 인간화 FR 을 하나 이상 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분절 및 사이토킨을 암호화하는 DNA 분절을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 핵산은, 5' 에서 3' 배향으로, 하나 이상의 그 안의 인간화 FR 을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 분절 및 사이토킨을 암호화하는 DNA 분절을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 사이토킨을 암호화하는 핵산은 골격(frame)에서, 불변영역을 암호화하는 유전자의 3' 말단(예를 들면, CH3 엑손)에, 직접 또는 유전자간 영역을 통하여 결합된다 (예를 들면, DNA 암호화(Gly₄-Ser)₃ (SEQ ID NO:3) 과 같은 것에 의한 적절한 링커(linker)에 의함).

II. hu14.18 항체 구조의 발현

본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산은 그것이 발현되는 적절한 수용자 세포내로의 도입을 위하여 하나 이상의 발현 벡터로 조립되거나 삽입될 수 있다. 핵산의 발현 벡터 내로의 도입은 표준 분자 생물학 기술에 의해서 성취될 수 있다. 바람직한 발현 벡터는 암호화된 단백질이 박테리아 또는 포유동물 세포 내에서 발현되는 것으로부터의 것을 포함한다.

본 발명에 따르면, 항체 가변영역의 중쇄는 바람직하게는 상응하는 경쇄를 사용하여 동일한 세포 내에서 공-발현(co-expressed)된다. 다중 폴리펩티드 사슬을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 하나 이상의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들면, 두개의 발현 벡터를 사용한 공-이입(co-transfection) 방법은, 양 벡터가 표적세포에 전달되는 것을 야기시킨다. 대안적으로, 동일한 세포 내에서 공-발현을 위해 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 단일 벡터를 사용하는 것이 때때로 유용하다.

예를 들면, 도 2A-D 는 본 발명에 따른 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 모두를 암호화하는 단일 벡터의 핵산 서열을 나타낸다. 또한, 상기 벡터는 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된 IL-2 를 암호화하는 핵산을 포함한다. 따라서, 세포 내로 도입될 때, 상기 벡터는 GD2 에 특이적으로 결합하고 면역 기능을 자극하는 인간화 항체-IL-2 융합 단백질을 단독으로 제공할 수 있다.

더구나, 단일-사슬 분자로서의 본 발명의 단백질을 발현시키는 것이 편리할 수 있다. 예를 들면, 항체 가변영역은 단일 사슬 항체 또는 비-면역글로불린 단백질에 융합될 수 있는 sFv 로서 발현될 수 있다. 또다른 구현예에서, (융합 사이토킨을 가지고 있거나, 가지고 있지 않은) 중쇄는 (융합된 사이토킨을 가지고 있거나, 가지고 있지 않은) 경쇄(또는 중쇄) 사슬 부본(counterpart)에 조합되어, 일가 및 이가 면역포합체를 형성한다.

수용자 세포 라인(line)은 바람직하게는 마이엘로마(myeloma) (또는 하이브리도마(hybridoma))와 같은 림프계 세포(lymphoid cell)이다. 마이엘로마는 이입된 유전자에 의해 암호화된 면역글로불린을 합성, 조립 및 분비할 수 있고, 단백질을 글리코실화할 수 있다. 특히 바람직한 수용자 세포는 Sp2/0 마이엘로마이며, 이는 보통 내인성 면역 글로불린을 생성하지 않는다. 이입되었을 때, 상기 세포는 단지 이입된 유전자 구조에 의해서 암호화된 면역글로불린만을 생성한다. 이입된 골수종 세포는 배양 또는 분비된 면역 포합체가 복수액(ascites fluid) 으로부터 회수될 수 있는 마우스의 복막(peritoneal) 내에서 성장할 수 있다. B 림프구와 같은 다른 림프계 세포는 또한 수용자 세포로서 사용될 수 있다.

림프계 세포를 키메릭 Ig 사슬을 암호화하는 핵산 구조를 함유하는 벡터를 사용하여 이입시키는 몇가지 방법이 있다. 벡터를 림프계 세포 내로 도입시키는 바람직한 방법은 스페로블라스트(spheroblast) 융합에 의해서이다 (예를 들면, Gillies 등, (1989) Biotechnol. 7:798-804 참조). 대안적인 방법은 전기천공법(electroporation) 또는 칼슘 포스페이트 침전법을 포함한다. 면역포함체를 제조하는 다른 유용한 방법은, 상기 구조를 암호화하는 RNA 서열 및 적절한 in vivo 또는 in vitro 시스템에서의 그의 해독(translation)의 제조를 포함한다. 일단 발현되면, 본 발명의 단백질은 표준 단백질 정제 공정에 의해서 수확(harvest)될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제 5,650,150 호 참조).

III. 유전자 치료요법에 의한 암의 치료

본 발명의 핵산은, 면역 체계를 특정 세포 형태에 표적화하는 것이 바람직한, 암 및 다른 질병의 치료에 있어서, 유전자 치료요법제로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포들은 인간 또는 동물로부터 회수될 수 있으며, 하나 이상의 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산은 상기 세포들 내로 이입될 수 있다. 그 후, 상기 세포들은 인간 또는 동물 내로 재도입될 수 있다. 이입된 세포들은 정상 세포 또는 암세포 일 수 있다. 대안적으로, 핵산은 정 위치에서(in situ) 세포 내로 도입될 수 있다. 그 후, 인간 또는 동물 세포는 암 세포에 대한 면역 반응을 갖추며, 이는 암을 치료하거나 그 심각성을 완화할 수 있다. 포유 동물 세포에서의 발현을 촉진하는 적절한 조절 원소에 결합된, 본 발명의 항체 가변영역은, 칼슘 포스페이트, "유전자 검(gene gum)", 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 양이온성(cationic) 리포솜, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) 또는 다른 어떠한 효과적인 이입방법을 포함하는 다양한 기술의 어떤 것에 의하여 세포 내로 이입될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, hu14.18 항체는 사이토킨을 in vivo 에서 표적세포로 선택적으로 전달하는데 사용되어, 사이토킨은 국소의 염증 반응, T 세포 성장 및 활성화의 자극 또는 ADCC 활성과 같은 국재화된(localized) 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 치료학적으로 유효량의 항체는 표적 세포를 번식시키는(harbor) 피검자의 순환계 내로 투여된다.

본 발명은 비-제한적인 실시예에 의하여 추가로 설명된다.

[실시예]

실시예 1

hu14.18-IL2 의 제형물의 정제

하나의 연구에서, hu14.18-IL2 를 NS/O 세포로부터 발현하고, 조직 배양 상층액을 수확하고, hu14.18-IL2 단백질을, 순차적으로, Abx Mixed Resin 컬럼 크로마토그래피, 재조합 단백질 A 크로마토그래피 및 Q 세파로스(Sepharose) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 이어서, 펠리콘 2 접선 흐름 여과(Pellicon 2 tangential flow diafiltration)하여 완충용액을 제형물 완충 용액으로 교환하였다. 상기 정제 단계의 상세한 내용은 하기에 기술된다. 바이러스 불활성화 및 제거 단계는 하기 기술된 바와 같은 상기 단계에 상호연결(interdigitate)된다. 바이러스 불활성화 및 제거 단계는 정제 자체에 필요하지는 않지만, 조절 고찰(consideration)을 만족시키는데 사용된다.

hu14.18-IL2 를 함유하는 2 리터의 NS/O 조직 배양 상층액을 1 M 의 아세트산으로 pH 가 5.9 가 되도록 조정하고, Abx 컬럼(J. T. Baker)을 적용하였다; pH 6.2 인 10 mM MES, 100 mM 아세트산 나트륨으로 세척하고; pH 7 인 아세트산 나트륨 500 mM 으로 용출시켰다. 상기 물질을 재조합 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 로 로드(load)하고; 100 mM 의 인산 나트륨, pH 7 인 NaCl 150 mM 로 세척하고; 100 mM 의 인산 나트륨, pH 6 인 NaCl 150 mM 로 세척하고; pH 7 인 인산 나트륨으 10 mM 로 세척하고; 100 mM 인산 나트륨, pH 3.5 인 NaCl 150 mM 로 용출시켰다. 용출된 물질의 pH 는 4.2 였다. 바이러스 불활성화를 촉진시키기 위하여, 상기 pH 를 3.8 로 감소시키고, 1 M NaOH 를 사용하여 pH 를 7 로 중화시킨 후에, 상기 제제(preparation)를 30 분 동안 배양(incubation)하였다. 핵산을 제거하기 위해서, 상기 물질을 Q 세파로스 컬럼 (Pharmacia) 상에 로드시키고, 100 mM 인산 나트륨, pH 7 인 150 mM NaCl 로 세척하였다. 단백질이 세척되어 흐름 내에서 발견되는 반면, 핵산은 컬럼에 결합되며, 이를 A280 이 기준선(baseline)으로 돌아올 때까지 반복하였다. 펠리콘 2 여과 (Millipore) 를 제조자의 지침에 따라서 수행하여, 최종 hu14.18-IL2 물질을 하기 제형물 내에서 확인하였다.

1. 만니톨 4%

2. 아르기닌 하이드로클로라이드 USP/NF 100 mM

3. 시트르산 USP/FCC 5 mM

4. 폴리솔베이트 80 0.01 % (w.v)

제형물 완충용액의 pH 를 1M NaOH 를 사용하여 7 로 조정하였다.

최종 단계로서, 상기 제제를 180,000 달톤의 분자량 차단(cutoff)을 가지는, Viresolve 180 membrane (Millipore) 를 통하여 여과하였다. 이는 상기 물질을 '닦아내는' 효과를 가졌으며, 그 결과 이합체를 응집시키고, 높은-차수(high-order) 올리고머를 제거하였다.

실시예 2

hu14.18-IL-2 융합 단백질의 항암 활성

제 1 상 임상 시험에서의 관찰

hu14.18-IL-2 의 안전성 및 효능을 평가하기 위하여, 제 1 상 임상 시험을 수행하였다. 자격이 있는 환자들은 외과학적 및 의학적으로 불치(incurable)라고 여겨지는 흑색종을 조직학적으로 확인하였다. 상기 환자들은 측정 또는 평가가능한 전이 질병을 가질 수 있으며, 이들은 원거리 전이 또는 부위(regional) 재발 질병의 외과 절제술에 이은 질병의 증거를 가질 수 없었다. 단지 그들이 림프절(lymph node)의 앞서의 증거를 가지고 있고, 각각의 재발이 2 개월 이상에 의해 때맞추어 분리되는 경우, 다중(2 이상의) 국소 또는 부위 재발을 가지는 환자를 포함하였다. 모든 환자들은, 적절한 골수 기능 (총 백혈구(WBC) > 3500/ml, 또는 총 과립구 > 2000/ml, 혈소판 > 100000/ml 및 헤모글로빈 > 10.0 g/dl 에 의해 정의됨), 적절한 간 기능 [아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase(AST) < 3 x 정상 및 총 빌리루빈(bilirubin) < 2.0 mg/dl 에 의해 정의됨], 및 적절한 신장 기능 (혈청 크레아틴 < 2.0 mg/dl 또는 크레아틴 청소율(clearance) > 60 ml/분 에 의해 정의됨) 을 가지는 것이 필요하다. 모든 환자들은 0 또는 1 의 피질뇌파검사(electrocorticograhy; ECOG) 활동도(performance status) 및 12 주 이상의 기대수명을 가졌다. 연구 전 4 주 이내에, 이미 화학 치료요법, 방사선 치료요법 또는 다른 면역억제 치료요법을 받았던 환자들은 제외하였다. 환자들은 본 연구를 시작하기 적어도 4 주 전에 치료되고 안정된다면, 사전(prior) 중추 신경계(CNS) 전이를 가질 수 있었다. 동의서식(informed consent)을 모든 환자로부터 받았었다.

제 1 상 임상을 개방 표지(open-label)로서 설계하였고, 비무작위화 용량 에스컬레이션(escalation) 연구를 지정하였는데, 3 내지 6 명의 환자들에게 hu14.18-IL-2 를 하기 용량 수준으로 투여하였다: 0.8, 1.6, 3.2, 4.8, 6.0 또는 7.5 mg/㎡/일. hu14.18-IL-2 를 각각의 과정(course)의 첫번째 주 동안 연속된 3 일에 걸쳐 4 시간 동안 정맥내 주사(IV)로서, 입원 환자에게 투여하였다. hu14.18-IL-2 융합 단백질을 환자들에게 4 % 만니톨; 아르기닌 HCl 100 mM; 시트레이트 5 mM; 및 pH 7 인 0.01 % 트윈 80 을 포함하는 제형물로 투여하였다. 세번째 주사의 완료 약 24 시간 후에, 안정하다면, 환자들은 병원에서 퇴원하였다. 유해 사례(adverse event) 및 독성을 [NCI Common Toxicity Criteria (2.0 버젼)] 및 [University of Wisconsin Comprehensive Cancer Center Toxicity Grading Scale for IL-2 (활동도, 체중증가 및 온도)] 으로 분류하였다. 용량-제한 독성(DLT) 을, 3 등급 림프구감소증(lymphopenia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 저인산혈증(hypophosphatemia) 또는 고혈당증(hyperglycemia) 이외에, 3 또는 4 등급의 발생(occurence)으로서 정의하였다. 최대 내성 용량(MTD) 을 과정 1 동안, 6 명의 환자 중 2 명이 DLT 를 가지는 용량 수준으로서 정의하였다. 3 등급 치료-관련 독성을 가진 환자들은 그들이 과정 2 에 있어서 50 % 용량 감소에서 치료를 재개할 수 있기 전에, 적어도 1 등급 으로 회복시키는 것이 요구되었다. 25 % 이상의 질병 진행을 가진 환자들을 연구에서 제외시켰다. 안정한 질병을 가진 환자들에게 과정 2 를 수행하였다.

hu14.18-IL-2 의 약물동력학적(pharmacokinetic) 성질을 환자들에게서 평가하였다. hu14.18-IL-2 수준이 33 명 모든 환자로부터 최초 4 시간의 주입 후에 즉시 일련의 샘플에서 증가될 때(첫째날, 과정 1), 반감기는 3.7 시간(0.9 시간의 +/- SD) 인 것으로 발견되었다. 이는 그 2 가지 성분 사이의 중간이고 (대략, IL-2 에 대해서 45 분 및 키메릭 m14.18 항체에 대해서 3 일), 마우스에서의 키메릭 m14.18-IL-2 의 반감기에서 관찰된 것에 필적하였다. IL-2 뿐만 아니라 hu14.18 항체 성분에서도, 다음의 상기 환자의 혈청으로부터의 hu14.18-IL-2 의 청소율은 검출되지 않았다. 과정 1 동안의 피크 혈청 및 곡선 하 면적(AUC) 은 상당한 용량 의존 증가를 나타내었다 (p < 0.001).

3 분의 2 의 환자가 상기 연구에서 치료되었다. 표 1 은 임상 결과를 나타낸다. 2 명의 환자 (6 %) 는 단지 과정 1 에 대하여 첫 3 일 중 2 일만을 완 료하였다. 상기 환자 중 한명 (용량 수준 3) 은 치료 둘째날에 3 등급 고빌리루빈 혈증을 가졌고, 다른 환자 (용량 수준 6) 은 유지되어야 할 치료를 요구하는 저산소증(hypoxia) 및 고혈압(hypertension) 을 가졌다. 상기 환자들 모두 질병의 진행을 가졌고 치료의 제 2 과정에 들어가지 않았다. 19 명의 환자 (58 %) 는 치료의 제 1 과정 후 안정한 질병을 가졌고, 치료의 제 2 과정에 들어갔다. 5 명의 환자 (모든 환자 중 15 %) 는 과정 1 에서의 유해 사례 때문에, 과정 2 에 있어서 50 % 용량 감소가 요구되었다. 17 명의 환자 (모든 환자 중 52 %) 는 과정 2 를 완료하였다. 한명의 환자 (용량 수준 4) 는 과정 2 동안 최종 주입을 받는 것을 거절하였고, 한명의 환자 (용량 수준 6) 는 고혈압 때문에, 과정 2 동안 최종 주입을 유지하였다. 8 명의 환자 (모든 환자 중 24 %) 는 치료의 제 2 과정 후 안정한 질병을 가졌다. 상기 실험결과는 hu14.18-IL-2 가 놀라울 정도로 많은 수의 환자에게서 질병 진행의 안정화를 야기한다는 것을 나타내었다.

33 명의 환자 중 8 명은 치료의 과정 2 후에 안정한 질병을 유지하였고, 상기 8 명중 4 명은 연구 치료(protocol therpay)를 완료한 후, 20-52 달 동안, 진행하는 질병의 어떠한 증거도 계속되지 않았다(안정된 질병 1 명 및 질병의 증거가 없음 3 명).

33 명의 환자 중 5 명은 재발 또는 전이의 외과 절제술에 이어 어떠한 측정가능한 질병 없이 연구에 들어갔다. 상기 5 명의 환자 중 2 명은 질병 진행을 가졌는데 반하여, 나머지 3 명은 질병의 증거가 없는 상태를 유지하였다 (20 - 52 달). 상기 발견은 면역치료요법 시술(intervention)이 낮은 종양 부담을 가진 환자에게서 가장 유리할 수 있다는 가설과 일치하였다. 하나의 추가의 환자는 치료의 2 가지 과정에 이어 폐 결절(nodule)에서 객관적인 감소를 가졌으나, 전체적인 질병 반응은 원거리 결절에서의 증가때문에 질병 진행으로서 기록되었다. 상기 결절은 hu14.18-IL-2 치료요법 후에 절제되었고, 상기 환자들은 3 년 이상 동안 질병 진행이 없게 되었다.

임상 결과

	환자의 수
과정 1 을 완료한 환자	31
과정 1 후에 안정한 질병	19
과정 2 를 위해 50 % 용량 감소	5
과정 2 를 완료한 환자	17
과정 2 후에 안정한 질병	8

제 1 상 임상 시험에서 hu14.18-IL-2 에 의한 in vivo 에서의 면역 자극.

hu14.18-IL-2 를 사용하여 치료된 환자에게 또한, 면역 자극의 지시를 시험하였다. 말초 혈액 림프구 증가증(peripheral blood lymphocytosis)이 2 - 4 일째에 발생하였고, 이 후, 5 - 22 일째에 림프구 증가증이 반동(rebound)하였다. 상기 변화 모두는 용량 의존적이었다(각각, p < 0.01 및 p < 0.05). 5, 8, 15 및 22 일째에서의 림프구 수는, 과정 1 에 대한 기준선보다 상당히 컸었다. 과정 2 (과정 1 의 29 일) 동안 기준선 림프구수는, 29 일째에 여전히 존재하는 치료의 제 1 과정의 효과를 나타내면서, 과정 1 동안의 기준선 림프구 수에 대하여 증가하였다. 게다가, 과정 2 의 5, 8 및 15 일째에서의 림프구 수는, 상기 12 명의 환자에 있어서 과정 1 동안의 5, 8 및 15 일째에서의 상응하는 값보다 컸다.

림프구 세포 표면 표현형(phenotype)은 hu14.18-IL-2 치료요법의 첫 주 후에, CD16+ 및 CD56+ 림프구 (자연살세포 표지(natural killer(NK) cell marker))의 확장(expansion)을 나타내었다. 상기 효과는 과정 1 의 29 일째 되는 날에도 여전히 존재하였다 (첫째날, 과정 2). 19 - 33 의 환자에 있어서 (4.8-7.5 mg/㎡/일 을 투여), 림프구 세포 표면 표현형을 1 및 8 일째에 더하여 15 및 22 일째에 결정하였다. 상기 분석은 CD56 및 CD56/CD16 공-발형 세포의 증강이, 8, 15 및 22 일째에 상당히 증가(p < 0.01)된 것을 보여주었다.

면역 활성의 측정으로서, 13 - 33 환자에 있어서 C-반응성 단백질 (CRP) 수준 및 과정 1 을 완료한 31 명의 환자에 있어서 가용성 IL-2 수용체 (sIL-2R) 수준이 획득되었다. 평균 CRP 의 상당한 증가는 각각의 과정의 기준선과 비교하여 과정 1 및 과정 2 모두에서 3 - 5 일째의 치료 상에 존재하였다. CRP 의 증가는 각각의 치료 과정 8 일 만에 기준선 수준으로 복귀하였다. sIL-2R 수준은 과정 1 및 과정 2 동안의 hu14.18-IL-2 주입 후, 초기 24 시간에, 기준선에 대하여 상당히 증가되었는데, 이는 8 일을 통하여 지속되었다. sIL-2R 에 있어서의 증가는 용량 의존적인 것으로 발견되었다(p = 0.014). 과정 2 에 대한 sIL-2R 값은, 양 과정에서 동일한 용량을 투여받은 환자에게서 (p < 0.05) 과정 1 의 1 - 5 일 동안의 상응하는 값과 비교하여 증가하였다.

GD2 를 발현하고, hu14.18-IL-2 에 결합하는 LA-N-5 신경모세포종 세포 라인은, 과정 1 을 완료한 31 명의 환자들로부터 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMC) 상에서, IL-2 활성화 NK 기능 및 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 증가시키는데에 사용되었다. 상기 두가지 분석에 있어서 1 일째와 비교하였을 때, 8 일째로부터의 림프구에 의해 조정된 사멸(killing)에 있어서 상당한 증가가 있었다. 과정 1 에서와 동일한 용량으로 과정 2 를 투여받은 12 명의 환자들은, 과정 1 동안 획득된 것과 매우 유사한 ADCC 실험결과를 나타냈다. 과정 2 에 있어서 과정 1 과 다르게 나타난 것으로 밝혀진 유일한 지표(parameter)는 29 일째에 증가된 것으로 남겨진 상기 분석에서 강화된 사멸을 지시하는, 1 일째에 IL-2 의 존재 하에서 증가된 사멸이다 (과정 2, 1 일).

LA-N-5 표적이 상대적으로 신선한 NK 세포에 저항성이기 때문에, IL-2 강화 사멸, 및 ADCC 를 측정하는 것이 유용하다. 그러나, 배지 (in vitro 에서 보조 IL-2 없음) 신선한 PBMC 에 의해 조절된 LA-N-5 의 약한 사멸은 1 일째 보다 8 일째에 상당히 더 크지는 않았다.

19 - 33 명의 환자에 있어서, 표준 NK 분석을 NK 감수성(susceptible) K562 표적 세포 라인을 사용하여 1, 8, 15 및 22 일째에 수행하였다. 배지에서 또는 IL-2 의 존재 하에서 시험될 때, K562 표적 세포의 NK 용해에 있어서의 상당한 증가를, 1 일째와 비교하여 8 일 및 22 일째에 관찰하였다. 또한, 선택된 환자로부터의 혈청 샘플을 평가하여 기능적인 IL-2 활성 및 기능적인 항-GD2 항체를 결정하였다.

IL-2 반응성 Tf-1b 세포 라인은 hu14.18-IL-2 의 주입 후에 수득된 환자 혈청을 사용한 IL-2-유도 증식을 나타내었다. 증식에서의 점진적인 증가를 4-시간 주입에 이어 최초 4 시간 동안 관찰하였다. 상기 주입후 16 시간 만에 값은 기준선으로 복귀하였고, 약 4 시간의 hu14.18-IL-2 에 대한 혈청 반감기와 일치하였다. 또한, 상기 시간-관점(point)으로부터의 혈청 샘플을 흐름 세포측정(flow cytometry)에 의해서 IL-2 성분 및 그 항-GD2 항체 활성을 보유하는 무손상 hu14.18-IL-2 면역사이토킨(IC)의 존재에 대하여 시험하였다. M21 세포 라인(GD2 양성)에 결합할 수 있는 hu14.18-IL-2 는 IC 의 주입 후, 환자 혈청 샘플에서 검출가능하였다. M21 에 결합하는 IC 의 양은, 4-시간의 주입에 이은 최초 4 시간 동안 점진적으로 증가하였고, 그 후 감소하였으며, 다시 약 4 시간의 반감기와 일치하였다. 최종적으로, in vitro 분석을 환자로부터의 표본(specimen)을 사용하여 수행하여, hu14.18-IL-2 의 투여가 in vivo 에서 ADCC 를 달성하는데 필요한 것과 일치하는 조건을 야기하는지를 결정하였다. 8 일째로부터의 PBMCs 는 hu14.18-IL-2 가 세포독성 분석에 첨가될 때, GD2+ 표적 세포에 대한 강화된 ADCC 를 나타내었다. 상기 동일한 ADCC 분석을, hu14.18-IL-2 를 상기 분석에 첨가하는 것 대신에, 8 일째로부터의 PBMC 를 사용하여 수행하였고, hu14.18-IL-2 투여 전 또는 후에 획득된 환자로부터의 혈청을 첨가하였다. 과정 2 의 8 일째에 환자로부터 획득된 PBMC 는, hu14.18-IL-2 투여 후에 획득된 혈청의 존재 하에서, 주입에 앞서 획득된 혈청을 사용하여 관찰된 것과 비교하여, LA-N-5 세포 라인의 강화된 사멸을 조절할 수 있었다. 따라서, IV 투여 후에 환자 내에서 순환하는 hu14.18-IL-2 는, in vivo 에서 동일한 환자로부터의 hu14.18-IL-2 에 의해서 활성화된 PBMCs 를 사용하여 ADCC 를 촉진할 수 있었다.

요약하자면, 상기 실험결과들은 림프구 수의 증가, CD16+ 및 CD56+ PBMC 의 퍼센티지(percentage)의 증가, NK 용해의 증가 및 ADCC 의 증가를 포함하는, 상기 hu14.18-IL-2 치료요법과 연관된 면역학적 변화가 있었음을 나타내었다. 면역 활성의 추가적인 증거는 CRP 및 sIL-2R 의 혈청 수준의 증가를 포함하였다. 혈청 및 PBMC 의 실험실적 분석은 IV 투여 후에 환자 혈청 내에서 순환하는 hu14.18-IL-2 분자가 IL-2 수용체를 통하여 IL-2 반응성 세포를 활성화 시키는 능력을 보유하고, 흐름 세포측정에 의해서 검출된 바와 같이, GD2 양성 종양 세포에 결합하고, IL-2 를 그 표면에 전달하는 능력을 보유하는 것을 나타내었다. NK 세포는 in vitro 에서의 NK 및 ADCC 기능을 조절하는 그 능력에 기초하여 in vivo 에서 활성화되었다. 더구나, 상기 환자들에게 투여된 hu14.18-IL-2 에 의해 in vivo 에서 활성화된 NK 세포는, 상기 동일한 환자의 혈청 내를 순환하는 hu14.18-IL-2 에 의해 촉진된 ADCC 를 조절할 수 있었다. 따라서, 면역 활성을 달성하는 조건이 상기 시험의 모든 환자에게서 성취되었다.

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aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg 5280 gctcagacct gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca 5340 aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac 5400 tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 5460 cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt 5520 agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct 5580 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 5640 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 5700 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 5760 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 5820 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 5880 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac 5940 atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct 6000 gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc acgggaggag 6060 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 6120 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 6180 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 6240 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 6300 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa gccccaactt caagttctac aaagaaaaca 6360 cagctgcaac tggagcatct cctgctggat ctccagatga ttctgaatgg aattaacaac 6420 tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acattcaagt tctacatgcc caagaaggcc 6480 acagagctca aacatctcca gtgtctagag gaggaactca aacctctgga ggaagtgcta 6540 aacctcgctc agagcaaaaa cttccactta agacctaggg acttaatcag caatatcaac 6600 gtaatagttc tggaactaaa gggatccgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag 6660 acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca 6720 acactaactt gataattaag tgctcgaggg atccagacat gataagatac attgatgagt 6780 ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 6840 ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 6900 ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc 6960 tctacaaatg tggtatggct gattatgatc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 7020 aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 7080 gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 7140 gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 7200 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 7260 taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 7320 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 7380 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7440 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 7500 cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 7560 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 7620 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 7680 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 7740 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 7800 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 7860 ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 7920 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 7980 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8040 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 8100 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 8160 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 8220 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 8280 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 8340 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 8400 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 8460 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 8520 gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 8580 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 8640 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 8700 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 8760 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 8820 tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 8880 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 8940 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 9000 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 9060 aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 9120 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 9180 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 9240 acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattccg atccagacat 9300 gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 9360 tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca 9420 agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 9480 tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc taaagccagc 9540 aaaagtccca tggtcttata aaaatgcata gctttcggag gggagcagag aacttgaaag 9600 catcttcctg ttagtctttc ttctcgtaga ccttaaattc atacttgatt cctttttcct 9660 cctggacctc agagaggacg cctgggtatt ctgggagaag tttatatttc cccaaatcaa 9720 tttctgggaa aaacgtgtca ctttcaaatt cctgcatgat ccttgtcaca aagagtctga 9780 ggtggcctgg ttgattcatg gcttcctggt aaacagaact gcctccgact atccaaacca 9840 tgtctacttt acttgccaat tccggttgtt caataagtct taaggcatca tccaaacttt 9900 tggcaagaaa atgagctcct cgtggtggtt ctttgagttc tctactgaga actatattaa 9960 ttctgtcctt taaaggtcga ttcttctcag gaatggagaa ccaggttttc ctacccataa 10020 tcaccagatt ctgtttacct tccactgaag aggttgtggt cattctttgg aagtacttga 10080 actcgttcct gagcggaggc cagggtcggt ctccgttctt gccaatcccc atattttggg 10140 acacggcgac gatgcagttc aatggtcgaa ccatgagggc accaagctag ctttttgcaa 10200 aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg 10260 gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa 10320 ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa 10380 ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg 10440 gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac 10500 tttccacacc ctaactgaca cacattccac a 10531 <210> 5 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Immunoglobulin Light chain <400> 5 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 6 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Immunoglobulin Heavy Chain-IL-2 <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser 435 440 445 Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 450 455 460 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg 465 470 475 480 Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 485 490 495 His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 500 505 510 Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile 515 520 525 Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 530 535 540 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu 545 550 555 560 Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 565 570 575

Claims

경쇄의 펩티드 서열로 SEQ ID NO:5 및 중쇄의 펩티드 서열로 SEQ ID NO:6 을 포함하는, GD2 에 특이적으로 결합하고 면역 기능을 자극하는, hu14.18-IL2 로 지칭되는 인간화 항체-IL2 융합 단백질.
제 1 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 SEQ ID NO:4 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
제 1 항의 융합 단백질 및 약학적 담체 또는 부형제를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물.
제 1 항의 융합 단백질을 포함하는, GD2 양성 종양의 진행을 안정화시키는 약제.
제 1 항의 융합단백질을 포함하는, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 NK (natural killer)-용해 (NK-lysis) 활성을 증가시켜 GD2 양성 종양의 진행을 안정화시키는 약제.
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