JP7143671B2

JP7143671B2 - Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合性測定方法

Info

Publication number: JP7143671B2
Application number: JP2018147095A
Authority: JP
Inventors: 亨田中
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2022-09-29
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: JP2020020765A

Description

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合性測定方法に関する。

タンパク質の中でもレセプターに分類されるタンパク質は、医療診断、物質の検出、物質の固定化、物質の分離（クロマトリガンド、ペーパークロマトグラフィー）など、様々な用途への適用が期待できる素材である。特に近年、遺伝子工学技術の発展により容易に取り扱うことが可能となったことから、様々な産業にて利用されている。

一方で、タンパク質はその構造の複雑さから、酸化、還元、異性化、糖付加、断片化、凝集化、三次元構造の崩れなど、結合性や安定性に影響する、様々な修飾を受ける可能性がある。このようなレセプタータンパク質の機能を解析し、品質を管理するためには、表面プラズモン共鳴装置や等温滴定カロリーメーター（例えば、非特許文献１参照）など、高価な装置と熟練した技術が必要とされており、低コストかつ簡便な評価法の構築が望まれていた。

ＷｅｉｎａＭａｅｔａｌ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ８，１４７－１５２（２０１８）

本発明の課題は、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合性を、低コストかつ簡便に評価できる方法を提供することにある。

本発明に係る抗体結合性測定方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液が分注された２以上の容器に、終濃度が異なるように抗体溶液を各容器に添加する工程と、当該混合液を恒温条件におけるサイズ排除クロマトグラフィーにて分析する工程と、得られたクロマトグラムにおける単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さを抽出する工程と、抗体量終濃度と抽出したピーク高さをもとに結合力の指標となる傾き値を得る工程と、を含む。

また、本発明に係る抗体結合性測定方法の一態様においては、前記Ｆｃ結合性タンパク質が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びそのアミノ酸変異体のいずれかである。

また、本発明に係る抗体結合性測定方法の一態様においては、前記傾き値について、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際の単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さで除した、補正値を用いる。

また、本発明に係る抗体結合性測定方法の一態様においては、前記傾き値について、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際の理論段数で除した、補正値を用いる。

本発明によれば、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合性を、低コストで簡便に評価することが可能となる。

当該測定法により得られる標準的なクロマトグラムと、ＦｃγＲＩＩＩＡのピーク位置を示す図である。親和性の異なる２種類のＦｃ結合性タンパク質について１２回測定を行い、実験番号を横軸に、傾き値を縦軸にプロットしたグラフである。親和性の異なる２種類のＦｃ結合性タンパク質について１２回測定を行い、実験番号を横軸に、傾き値より算出された補正値１を縦軸にプロットしたグラフである。親和性の異なる２種類のＦｃ結合性タンパク質について１２回測定を行い、実験番号を横軸に、傾き値より算出された補正値２を縦軸にプロットしたグラフである。

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液が分注された２以上の容器に、終濃度が異なるように抗体溶液を各容器に添加する工程と、当該混合液を恒温条件におけるサイズ排除クロマトグラフィーにて分析する工程と、得られたクロマトグラムにおける単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さを抽出する工程と、抗体量終濃度と抽出したピーク高さをもとに結合力の指標となる傾き値を得る工程と、を含む、抗体結合性測定方法である。以下、本発明の一実施形態について説明する。

なお、本発明において抗体結合性とは、抗体とＦｃ結合性タンパク質の結合速度と解離速度を総合した値であり、結合平衡定数や解離平衡定数、さらには比活性を反映した尺度として用いることができる。

まず、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液が分注された２以上の容器に、終濃度が異なるように抗体溶液を各容器に添加する。この際、添加すべき抗体濃度は測定対象のＦｃ結合性タンパク質の親和性に依るが、Ｆｃ結合性タンパク質の０．０１倍から１００倍の濃度が好ましく、さらには０．１倍から２０倍の濃度が好ましい。また、抗体を添加し過ぎて単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピークが消失しないように注意する。

Ｆｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＩ、補体タンパク質Ｃ１ｑ、マウスＦｃγＲＩ、マウスＦｃγＲＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＶ等が挙げられ、各々を構成するアミノ酸が部分的に置換した変異体を用いてもよい。

抗体とは、動物種を問わず、測定対象のＦｃ結合性タンパク質に結合すればよく、ヒト血液から製造されるガンマグロブリンでもよいし、動物細胞培養によって得られたリコンビナントタンパク質を例示することができる。また、広義の抗体として、酵素消化等によってＦｃ部位のみとした抗体や、Ｆｃ融合タンパク質であっても問題はない。抗体溶液の溶媒としては、抗体とＦｃ結合性タンパク質の親和性が消失せず、かつタンパク質が凝集しなければ良く、水、塩水、緩衝液が使用できる。

次に、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液に抗体溶液を添加して得られた混合液を、恒温条件におけるサイズ排除クロマトグラフィーにて分析する。サイズ排除クロマトグラフィーを実施する温度は、カラムオーブン等で恒温条件とし、実施するのが好ましい。具体的な温度はカラムが凍結しない０℃以上であればよいが、０℃以上１００℃以下であるとより好ましく、０℃以上３０℃以下がさらに好ましい。流速は適用するカラムに適した速度で実施するのが望ましい。検出はタンパク質の検出波長として一般的に用いられる２８０ｎｍで実施できるが、感度を上げる目的で、より短波長側での測定や蛍光検出での測定も利用できる。

次に、得られたクロマトグラムにおける単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さを抽出する。

次に、抗体量終濃度と抽出したピーク高さをもとに傾き値を得る。具体的には、横軸に抗体量終濃度、縦軸にピーク高さをプロットし、１次関数で回帰直線を導出する。導出された回帰直線の傾き値を得る。単位は任意の値を利用できる。この時、傾き値はＦｃ結合性タンパク質の結合力の高さを反映しており、傾きが小さい程（立っているほど）結合力が高いことを意味する。後述する補正値についても同様である。

上述した手順で、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合性を測定することができるが、傾き値を、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際の単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さで除した補正値を用いることで、よりバラつきの少ない測定が可能となる。

また、傾き値を、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際のピークの理論段数で除した補正値を用いても、同様によりバラつきの少ない測定が可能となる。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

以下の通り、実施例で用いる抗体溶液等の調製を行った。
（１）溶離液
リン酸一ナトリウム・二水和物（和光純薬製）を５．９ｇ、リン酸二ナトリウム・十二水和物（和光純薬製）を２２．３ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬製）を２１．３ｇ取り、９００ｍＬのミリＱ水に溶解後、メスシリンダーで１０００ｍＬにメスアップした。
（２）抗体溶液
（１）のリン酸緩衝液を用いて、サングロポール（ＣＳＬベーリング製）を５倍希釈したものを抗体溶液とした。本溶液をさらに２０倍希釈して２８０ｎｍにおける吸光度を測定したところ、０．６４８であったため、抗体濃度を９ｇ／Ｌ相当とした。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液
（１）のリン酸緩衝液に溶解した２ｇ／ＬのリコンビナントＦｃγＲＩＩＩＡ溶液を用意した。

実施例１通常型のＦｃγＲＩＩＩＡ
表１に記載の通り、混合サンプルを作成した。

ＨＰＬＣ装置（東ソー製）に溶離液とサイズ排除クロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、東ソー製、３ロット）をセットし、カラムを平衡化した。分析条件は、カラムオーブンを１５℃、流速を１．０ｍＬ／分、検出をＵＶ２８０ｎｍ、インジェクション量を５０μＬに設定し、３つの混合サンプルに対してカラム３ロット（カラムＬｏｔ１～３）を３回ずつ、分析した。標準的な分析例を図１に示した。

得られたクロマトグラムについて、１０分前後に現れるＦｃγＲＩＩＩＡピークの高さを抽出した。横軸に添加抗体の終濃度（単位：ｇ／Ｌ）、縦軸にＦｃγＲＩＩＩＡピーク高さをプロットし、１次関数で回帰直線を導出し、傾き値を算出した。また、下式を用いて理論段数も算出した。併せて、表２に示す。
理論段数＝５．５４×（保持時間／５０％高さにおけるピーク幅）＾２

傾き値をサンプル１ピーク高さで除することにより得られる補正値１、傾き値を理論段数で除することにより得られる補正値２を表３に示す。補正値を用いることで、バラつきが２倍以上低減していることが分かる。

実施例２高親和型のＦｃγＲＩＩＩＡ
Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液として、リン酸緩衝液に溶解した２ｇ／Ｌの高親和型リコンビナントＦｃγＲＩＩＩＡ溶液を用いて実施例１の手法に準じて抗体結合性分析を行った。カラムはＬｏｔ２を使用し、３回繰り返し分析を行った。得られた結果を表４に示す。

得られた傾き値に対して、実施例１と同様に補正値１、２を算出した（表５参照）。通常型のＦｃγＲＩＩＩＡの結果（表３）と比較しても、高親和型のＦｃγＲＩＩＩＡを用いて算出した値は大きく異なっており、抗体結合性に基づいた値となっていることを確認した（図２～４参照）。

Claims

Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液が分注された２以上の容器に、終濃度が異なるように抗体溶液を各容器に添加する工程と、
当該混合液を恒温条件におけるサイズ排除クロマトグラフィーにて分析する工程と、
得られたクロマトグラムにおける単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さを抽出する工程と、
抗体量終濃度と抽出したピーク高さをもとに結合力の指標となる傾き値を得る工程と、を含む、
抗体結合性測定方法。
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びそのアミノ酸変異体のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
前記傾き値について、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際の単量体Ｆｃ結合性タンパク質のピーク高さで除した、補正値を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
前記傾き値について、抗体を含まない一定量のＦｃ結合性タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した際のピークの理論段数で除した、補正値を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。