CN116120464A - 一种融合蛋白crm197及其制备方法 - Google Patents

一种融合蛋白crm197及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116120464A
CN116120464A CN202211130185.9A CN202211130185A CN116120464A CN 116120464 A CN116120464 A CN 116120464A CN 202211130185 A CN202211130185 A CN 202211130185A CN 116120464 A CN116120464 A CN 116120464A
Authority
CN
China
Prior art keywords
crm197
fusion protein
protein
nacl
purification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211130185.9A
Other languages
English (en)
Inventor
吴强
王文
夏润洁
樊绍文
樊钒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Original Assignee
Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc filed Critical Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority to CN202211130185.9A priority Critical patent/CN116120464A/zh
Publication of CN116120464A publication Critical patent/CN116120464A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白CRM197及其制备方法，它包括包含以下步骤：S1：全基因合成融合蛋白的DNA序列；S2：通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体；S3：将步骤S2所述的重组大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将所述质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白；S4：对筛选高产菌株进行高密度发酵，经过酶切、第一步纯化和第二步二步纯化获取高纯度天然CRM197蛋白。本发明解决了市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制，在疫苗生产上具有广阔前景。

Description

一种融合蛋白CRM197及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程制药领域，更具体的说，使用促溶标签技术纯化载体蛋白，可应用在疫苗制造领域。
背景技术
白喉毒素（Diphtheria toxin）是β噬菌体将白喉杆菌溶源化后，其tox基因编码表达的外毒素。由535个氨基酸组成，分子量为58kD的多肽。分为N端催化区(1～193)、穿膜区(205～378)、 C端受体结合区(386～535)。具有ADP-核糖转移酶活性，通过使真核细胞肽链延伸因子 (EF-2)上的ADP核糖基化失活，阻止了EF-2在核糖体内促进多肽链延长的作用，最终导致蛋白质合成被阻断，造成细胞死亡。白喉毒素经过甲醛脱毒处理，可以制成白喉类毒素（Diphtheria toxoid，DT）。白喉类毒素可以用作免疫佐剂或抗细菌感染疫苗的载体蛋白，然而必须经过较大体积的毒性物质处理过程方能制得，且有可能恢复毒性。
CRM197（Cross Reacting Material 197）是一种无毒的DT突变体，因其一个碱基G突变为A，使第52位氨基酸Gly（甘氨酸）突变为Glu（谷氨酸），导致天然毒素的ADP-核糖转移酶活性丧失，无法与EP结合，丧失了细胞毒性。CRM197和白喉毒素一样，由535个氨基酸（58.4 kD）组成单个多肽链，由两个亚基组成（通过二硫键连接），CRM197和白喉毒素的总体折叠几乎相同。CRM197不具有白喉毒素的酶活性和毒性，不会产生白喉类毒素毒性逆转效应，但具有白喉毒素的免疫原性，并且保留了完整的潜在结合位点赖氨酸氨基结构，故常作为一种理想的免疫蛋白载体而广泛应用于疫苗开发领域。
目前，全球范围内用于儿童流感嗜血杆菌疫苗，肺炎球菌和脑膜炎球菌等疫苗。另外除了作为结合疫苗的蛋白载体，还发现CRM197可以作为药物透过血脑屏障的载体，可作为肿瘤抑制剂开发新型抗肿瘤药物。
市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制。研究者和生产商均努力尝试构建其他细菌以提高CRM197产量同时降低成本。纵观全球，生产CRM197的表达系统主要有天然白喉杆菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。其中无论是研究领域还是规模化生产，涉及最多的都是大肠杆菌。Hickey等（2018）的研究中针对来自3个表达系统生产的5个CRM197样品进行了理化性质和抗原性的评价。理化性质评价指标包括一级结构和翻译后修饰、高级结构、表面疏水性、电荷异质性等，结果显示尽管有一定的差异，但5个CRM197样品表现出高度的相似性；而在一系列抗体结合反应中，5个样品同样表现出基本相同的抗原性。以大肠杆菌表达系统生产的CRM197（临床前研究级）售价约为250美元/mg，从售价可侧面反应出大肠杆菌表达系统制造成本低的优势，也是更热门表达系统选项。
目前，在大肠杆菌系统表达的CRM197中，主要有包涵体表达和可溶性表达两种策略：
（1）CRM197在大肠杆菌包涵体表达
王春娥等（2008）将白喉棒状杆菌C7（β197）菌株（ATCC53281）基因组经表达载体pET-28a转化大肠杆菌BL21（DE3）表达带His标签的重组CRM197，发现CRM197主要以包涵体形式表达，相对分子质量约为60 000，凝胶电泳扫描分析，表达量约占菌体总蛋白的25%。包涵体经洗涤、溶解、金属螯合亲和层析等步骤，纯化得到纯度为95%以上的重组CRM197蛋白。并且与白喉抗毒素产生的特异反应，说明重组CRM197具有良好的反应原性。
赵雪娜等（2010）将合成的CRM197基因片段经表达载体pET25b转化大肠杆菌BL21（DE3）。CRM197主要以包涵体形式表达，表达量约占菌体总蛋白的20%。包涵体经洗涤、溶解、DEAE阴离子交换柱层析、S-100分子筛柱层析等步骤纯化得到纯度95%以上的重组CRM197。
肖钾钙镁等（2012）将合成的CRM197基因片段经表达载体磷酸盐缓冲液AD-DEST49转化大肠杆菌（ATCCMC1061）。CRM197主要以包涵体形式表达，包涵体经洗涤、溶解、DEAE阴离子交换柱层析等步骤纯化得到纯度95%以上的重组CRM197。
Biological E. Ltd构建大肠杆菌系统包涵体表达重组CRM197，命名为BioErCRM。其专利（用于CRM197的高水平表达的密码子优化多核苷酸；专利号：US10280409B2）中描述了优化编码CRM197的核苷酸密码子并通过表达载体转化大肠杆菌，产量可达到500-1000mg/L。产量得到显著提升。
（2）CRM197在大肠杆菌可溶性表达
高宇辉（2018）将CRM197编码序列与硫氧还蛋白（Trx）序列融合，经表达载体pET-32a（+）；HRV3C蛋白酶基因经表达载体pGArasd共同转化大肠杆菌Origami B（DE3）。Trx-His-CRM197可溶性表达，再经过HRV3C蛋白酶自动切割获得His-CRM197，目的蛋白产量约为90mg/L。
房婷等（2018）将优化合成的CRM197基因片段经表达载体pET-32a（+）转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达无标签的重组CRM197，结果显示CRM197可溶性高表达，约占碎菌上清总蛋白的40%。超声破菌后，经阴离子交换、肝素亲和以及脱盐三步柱层析获得纯度高于95%的CRM197。他们在专利（一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体；专利号：CN106350527B）中指出CRM197得率在200mg/L以上。
Scarab Genomics, LLC在其Clean Genome®平台使用减基因组大肠杆菌重组表达可溶性的CRM197。Scarab的Clean Genome平台的大肠杆菌K12菌株删除了20%以上非关键基因组。专利（重组CRM197在大肠杆菌中的增强表达；专利号：US10479820B2）中描述了，Scarab将编码CRM197的序列与周质信号序列融合表达，表达时信号肽可引导CRM197转移至细胞周质。纯化后CRM197纯度可达95%以上，在连续发酵工艺中，CRM197的产量可达3-5g/L/天。Scarab的临床前研究级别的CRM197售价为1mg/225美元，10mg/1200美元，20mg/2000美元。
Fina Biosolutions开发了一种高效的大肠杆菌表达系统，他们在专利（CRM197及其相关蛋白的表达和纯化；专利号：US10093704B2）中描述了经过筛选在二硫键还原酶基因的单个或多个突变的大肠杆菌菌株中，CRM197可溶性表达，CRM197（含CRM相关蛋白）产量可达200mg/L（至2000mg/L）以上。高水平的表达以及简便的纯化方法大大降低了CRM197的制造成品，产品命名为EcoCRMTM，目前其售价1mg为250美元，5mg为750美元，10mg为1250美元，50mg为5500美元。相比于List Biological的天然CRM197和Pfenex重组CRM197的售价，EcoCRM显得非常的经济合理。研究级别的EcoCRM已上市，而cGMP级别的EcoCRM预计2020年初上市。
本发明利用SUMO作为融合表达标签，在表达CRM197基因位点前导入His-SUMO基因，SUMO作为促溶标签，可以促进CRM197的正确表达，调节融合蛋白与其他蛋白之间的作用，提高融合蛋白的溶解性，His标签作为亲和纯化标签。本实验在pET系列表达载体上，SUMO作为促溶标签的CRM197表达工程菌，以表达量为依据，筛选出His-SUMO-CRM高产菌株并进行酶切去除标签，获取天然纯化CRM197蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白CRM197的纯化方法，以解决市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种融合蛋白CRM197，所述融合蛋白CRM197的DNA序列如下：
CACCATCATCATCATCATTCGGACTCAGAAGTCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGGTGCGGATGATGTGGTGGATAGCAGCAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTAGCAGCTATCATGGCACCAAACCGGGCTATGTGGATAGCATTCAGAAAGGCATCCAGAAACCGAAAAGCGGCACCCAGGGCAACTATGATGATGATTGGAAAGAATTTTATAGCACCGATAACAAATATGATGCGGCGGGTTATAGCGTGGATAACGAAAATCCGCTGTCTGGCAAAGCGGGCGGTGTGGTGAAAGTGACCTATCCGGGCCTGACCAAAGTGCTGGCCCTGAAAGTGGATAACGCGGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGAGCCTGACCGAACCGCTGATGGAACAGGTGGGCACCGAAGAATTTATTAAACGCTTTGGCGATGGCGCGAGCCGTGTGGTTCTGAGCCTGCCGTTTGCGGAAGGCAGCAGCAGCGTGGAATATATTAACAACTGGGAACAGGCGAAAGCCCTGAGCGTGGAACTGGAAATTAACTTTGAAACCCGTGGCAAACGTGGCCAGGATGCGATGTATGAATACATGGCGCAGGCGTGCGCGGGCAATCGTGTGCGTCGTAGCGTGGGCAGCAGCCTGAGCTGCATTAACCTGGATTGGGACGTCATTCGTGATAAAACCAAAACCAAAATCGAAAGCCTGAAAGAACATGGCCCGATCAAAAACAAAATGAGCGAAAGCCCGAACAAAACCGTGAGCGAAGAAAAAGCGAAACAGTATCTGGAAGAATTTCATCAGACCGCGCTGGAACATCCGGAACTGAGCGAACTGAAAACCGTGACCGGCACCAATCCGGTGTTTGCGGGTGCGAACTATGCGGCGTGGGCGGTGAATGTGGCGCAGGTGATTGATAGCGAAACCGCGGATAACCTGGAAAAAACCACCGCGGCCCTGAGCATTCTGCCGGGCATTGGCAGCGTGATGGGCATTGCGGATGGCGCGGTGCATCATAACACCGAAGAAATTGTGGCGCAGAGCATTGCCCTGAGCAGCCTGATGGTGGCGCAGGCGATTCCGCTGGTTGGCGAACTGGTGGATATTGGCTTTGCGGCGTACAACTTTGTGGAAAGCATCATCAACCTGTTTCAGGTGGTGCATAACAGCTATAACCGTCCGGCGTATTCTCCGGGTCATAAAACCCAGCCGTTTCTGCATGATGGCTATGCGGTGAGCTGGAACACCGTGGAAGATAGCATTATTCGTACCGGCTTTCAGGGCGAAAGCGGCCATGATATTAAAATTACCGCGGAAAACACCCCGCTGCCGATTGCGGGTGTTCTGCTGCCGACCATTCCGGGCAAACTGGATGTGAACAAAAGCAAAACCCATATTAGCGTGAACGGTCGTAAAATTCGTATGCGTTGCCGTGCGATTGATGGCGATGTGACCTTTTGCCGTCCGAAAAGCCCGGTGTATGTGGGCAACGGCGTGCACGCGAACCTGCATGTGGCGTTTCATCGTAGCAGCAGCGAAAAAATCCATAGCAACGAAATTAGCAGCGATAGCATTGGCGTGCTGGGCTATCAGAAAACCGTGGACCATACCAAAGTGAACTCTAAACTGAGCCTGTTCTTCGAAATCAAAAGCTAA（SEQ ID NO：1）。
进一步的，融合蛋白采用大肠杆菌细胞表达制备。
进一步的，所述的大肠杆菌为BL21。
本发明提供的一种融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1：全基因合成融合蛋白的DNA序列；
S2：通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体；
S3：将步骤S2所述的重组大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将所述质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白；
S4：对筛选高产菌株进行高密度发酵，经过酶切、第一步纯化和第二步二步纯化获取高纯度天然CRM197蛋白。
进一步的，所述步骤S4中第一步纯化包括以下步骤：
S411：超声体系中按1g：1ul加入全能核酸酶去除DNA和RNA；
S412：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmolpH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
S413：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
S414：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl和10mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；
S415：洗脱：分别用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液，20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2；
S416：用0.1 mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
S417：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。
进一步的，所述步骤S4中第二步纯化包括以下步骤：
S421：SUMO酶切：将含有纯化His-SUMO-CRM融合蛋白的组分E2用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成50mmol pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷和150mmol NaCl酶切缓冲液，按1g:1ml比例加入SUMO酶，4℃酶切过夜；
S422：样品预处理：将酶切后的蛋白液用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液；
S423：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmolpH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
S424：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
S425：洗脱：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；用20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E；
S426：用0.1mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
S427：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析；
S428：30kDa浓缩管进行蛋白样品的浓缩，BCA法测蛋白浓度，HPLC测定纯度。
进一步的，所述超声体系的功率为300W，开启2s 再关闭3s ，超声上清16000rpm，4℃离心10min，离心上清用0.45um滤膜过滤。
进一步的，所述30kD 密理博超滤管浓缩每次3000g ，温度为4℃，时间为10min。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
（1）本发明应用促溶标签在大肠杆菌系统中能够可溶表达正确折叠的CRM197。
（2）本发明采用高密度发酵方法使可溶蛋白产量达200mg/L。
（3）本发明的促溶标签可通过SUMO酶切去除，获得天然可溶CRM197。
（4）本发明CRM197蛋白具有正确一级结构、二级构象、免疫原性及安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1 是载体pET32a- His-SUMO-CRM197的图谱；
图2 是SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况；图中1为16℃诱导前；2~4为8h总蛋白、可溶蛋白、包涵体蛋白；5~7为16h总蛋白、可溶蛋白、包涵体蛋白；8~10为24h总蛋白、可溶蛋白、包涵体蛋白；
图3 (a)His-SUMO-CRM融合蛋白第一步镍柱亲和纯化结果1：1ugHSA；2~8：原样、LC、Wash、E1、E2； (b)去标签CRM197蛋白第二步镍柱亲和纯化1~4：酶切后蛋白、LC、E、CIP；5： 1ugHSA；6：浓缩LC；
图4是纯化后CRM197蛋白纯度HPLC检测；(a)CRM197标准品 ；(b)镍柱纯化CRM197蛋白；
图5是纯化后CRM197标准品蛋白圆二色谱检测；
图6是镍柱纯化CRM197蛋白圆二色谱检测；
图7是纯化后CRM197蛋白核酸酶活性检测；(+)：标准品CRM197蛋白；(-)：对照组；1~4：His-SUMO-CRM融合蛋白，用量分别为1pmol、4pmol、11pmol、13pmol ；5~8：CRM蛋白，用量分别为2pmol、12pmol、28pmol、38pmol；
图8是CRM197蛋白免疫原性检测；1.诱导16h总蛋白与DT一抗标准品结合2.诱导0h总蛋白与DT一抗标准品结合；
图9是纯化后CRM197蛋白免疫原性检测；1：对照组血清抗体检测；2：低剂量组血清抗体检测；3：高剂量组血清抗体检测。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当人认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
实施例1 pET32a-SUMO-CRM197融合蛋白载体的构建
（1）全基因合成SUMO- CRM197基因片段，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
（2）PCR (Invitrogen公司产品) pET32a质粒和目的蛋白基因片段，胶回收获得线性化pET32a载体和蛋白基因片段，将上述胶回收的pET32a载体片段和融合蛋白基因片段进行Infusion重组反应，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体，转化大肠杆菌感受态TOP10，涂于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送公司测序；
（3）将测序正确的pET32a-His-SUMO-CRM197融合蛋白质粒DNA转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态，涂于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基扩大培养。按接种量1%接入液体LB中摇培约2h，测OD600至0.6后进行IPTG诱导16h，超声破碎至澄清透亮，分别SDS-PAGE电泳检测上清、沉淀中目的蛋白表达情况，筛选高产菌株。
构建图谱如图1所示，融合蛋白的分子量约为70kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其中crm197的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
HHHHHHSDSE VNQEAKPEVK PEVKPETHIN LKVSDGSSEI FFKIKKTTPL RRLMEAFAKRQGKEMDSLRF LYDGIRIQAD QTPEDLDMED NDIIEAHREQ IGGADDVVDS SKSFVMENFS SYHGTKPGYVDSIQKGIQKP KSGTQGNYDD DWKEFYSTDN KYDAAGYSVD NENPLSGKAG GVVKVTYPGL TKVLALKVDNAETIKKELGL SLTEPLMEQV GTEEFIKRFG DGASRVVLSL PFAEGSSSVE YINNWEQAKA LSVELEINFETRGKRGQDAM YEYMAQACAG NRVRRSVGSS LSCINLDWDV IRDKTKTKIE SLKEHGPIKN KMSESPNKTVSEEKAKQYLE EFHQTALEHP ELSELKTVTG TNPVFAGANY AAWAVNVAQV IDSETADNLE KTTAALSILPGIGSVMGIAD GAVHHNTEEI VAQSIALSSL MVAQAIPLVG ELVDIGFAAY NFVESIINLF QVVHNSYNRPAYSPGHKTQP FLHDGYAVSW NTVEDSIIRT GFQGESGHDI KITAENTPLP IAGVLLPTIP GKLDVNKSKTHISVNGRKIR MRCRAIDGDV TFCRPKSPVY VGNGVHANLH VAFHRSSSEKIHSNEISSDS IGVLGYQKTVDHTKVNSKLS LFFEIKS（SEQ ID NO：2）；
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKYDAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGFQGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVGNGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS（SEQ ID NO：3）。
实施例2 表达条件
为最大限度获取可溶性融合蛋白，权衡产量与时间成本，对筛选出的高产菌株进行摇瓶水平和发酵罐水平IPTG诱导表达条件探索。
（1）摇瓶水平IPTG诱导表达：pET32a- His-SUMO-CRM197（BL21）按接种量1%接入液体LB中摇培约2h，测OD600至0.6。在优化温度16℃，优化诱导剂浓度0.2mmol，优化诱导时间16h下表达量最高且成本最低。
（2）发酵罐水平补料发酵：按照接种量1%接入M9+2YT发酵培养基，37℃ 220 rpm培养至OD600为1.0。使用AWD-10L发酵罐，10%接入摇瓶种子液，发酵初始阶段，溶氧设置为100%，通过控制转速维持溶氧为20-40%和补料维持溶氧在20-40%，待菌体生长进入对数生长期后期，流加IPTG至浓度为0.5 mmol/L，发酵过程中，用氨水控制pH在7.0，16℃诱导14h后下罐。
结果如图2所示，His-SUMO-CRM197融合蛋白的纯化量为160mg/L。
实施例3 天然CRM197获取与纯化
根据融合蛋白的性质，选择Ni Sepharose 6 Fast Flow进行第一步纯化，在SUMO酶切去除标签后进行第二步纯化，实验过程如下：
1、第一步纯化：
（1）超声体系中按1g:1ul加入全能核酸酶去除DNA和RNA，功率300W，2s ON 3sOFF。超声上清16000rpm，4℃离心10min，离心上清用0.45um滤膜过滤；
（2）柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
（3）上样：将适量样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
（4）用适量20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；
（5）洗脱：分别用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液，20mmol pH为7.8的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2；
（6）用0.1 mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
（7）用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料。SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。
2、第二步纯化：
（1）SUMO酶切：将含有纯化His-SUMO-CRM融合蛋白的组分E2用30kD 密理博超滤管浓缩，每次3000g 4℃ 10min。将浓缩后的蛋白液置换成50mmol pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷和150mmol NaCl酶切缓冲液，按1g:1ml比例加入SUMO酶，4℃酶切过夜；
（2）样品预处理：将酶切后的蛋白液用30kD 密理博超滤管浓缩，每次3000g 4℃10min。将浓缩后的蛋白液置换成20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液；
（3）柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
（4）上样：将适量样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
（5）洗脱：用适量20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；用20mmol pH为7.8的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E；
（6）用0.1mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
（7）用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料。SDS-PAGE进行蛋白样品的分析；
（8）30kDa浓缩管进行蛋白样品的浓缩，BCA法测蛋白浓度，HPLC测定纯度。
结果如图3~4所示，第一步纯化在E2中收集大部分His-SUMO-CRM197融合蛋白，第二步纯化在LC中获得CRM197蛋白。HPLC结果表明CRM197蛋白峰面积＞99%
（三）结构确证分析
（1）肽覆盖率检测蛋白一级结构。糜蛋白酶（Chymotrypsin）、胰蛋白酶（Trypsin）、胰蛋白酶（Trypsin）&Asp-N蛋白酶酶解处理，之后将处理好的样品通过液质联用（LC-MS/MS）分析，得到质谱原始结果的raw文件，经过软件Byonic分析，匹配数据，得到鉴定结果；
（2）圆二色谱检测蛋白二级结构。使用JASCO J-1500圆二色谱仪，分别在4℃、28℃、37℃、55℃下检测CRM197，范围为190nm到300nm。仪器自带分析软件上使用杨氏算法（Yang. Jsr）计算二级结构，得到各种二级结构的含量及比例。
结果如图5~6所示，CRM197蛋白与理论氨基酸序列的肽覆盖率为100%，一级序列验证正确。圆二色谱趋势与标准品CRM197蛋白相似，即二级结构类似。
实施例4 蛋白活性与免疫原性分析
使用生工λDNA 溶液（货号B600011）进行核酸酶活性检测。在冰上取出蛋白、缓冲液和λDNA 溶液溶解。每次使用1ugλDNA ，37℃的金属浴中保温60min，结束时用72℃失活5min，琼脂糖电泳检测。
蛋白免疫原性评价：为进一步评价蛋白功效，以低剂量1mg/kg、高剂量10mg/kg每两周免疫小鼠共4次，处死后检测血清。Western Blot实验检测本发明所表达的CRM197融合蛋白的免疫原性。
结果如图7~9所示，本发明所表达的CRM197融合蛋白具有降解λDNA能力，即纯化后CRM197产品具有活性。免疫原性上，本发明所表达的CRM197融合蛋白能与DT一抗标准品结合，与CRM197标准品一致，说明所表达蛋白具有相应免疫原性。免疫小鼠血清作为一抗能与CRM197标准品结合，说明本发明所表达的CRM197融合蛋白能引起机体免疫反应，与CRM197标准品一致，具有对应功效。
综上，本发明请求保护在BL21（DE3）大肠杆菌系统中表达His-SUMO-CRM197融合蛋白。通过优选表达载体、优选宿主菌、优化表达条件、高密度发酵等方法以低成本提高了CRM197产量，所生产的CRM197蛋白与标准品具有结构与功能的一致性。解决了市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制，在疫苗生产上具有广阔前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种融合蛋白CRM197，其特征在于，所述融合蛋白CRM197的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白CRM197，其特征在于：融合蛋白采用大肠杆菌细胞表达制备。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白CRM197，其特征在于：所述的大肠杆菌为BL21。
4.一种融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1：全基因合成融合蛋白的DNA序列；
S2：通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体；
S3：将步骤S2所述的重组大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白；
S4：对筛选高产菌株进行高密度发酵，经过酶切、第一步纯化和第二步纯化获取高纯度天然CRM197蛋白。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述步骤S4中第一步纯化包括以下步骤：
S411：超声体系中按1g：1ul加入全能核酸酶去除DNA和RNA；
S412：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
S413：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
S414：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl和10mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；
S415：洗脱：分别用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液，20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2；
S416：用0.1 mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
S417：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。
6.根据权利要求4所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述步骤S4中第二步纯化包括以下步骤：
S421：SUMO酶切：将含有纯化His-SUMO-CRM融合蛋白的组分E2用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成50mmol pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷和150mmol NaCl酶切缓冲液，按1g:1ml比例加入SUMO酶，4℃酶切过夜；
S422：样品预处理：将酶切后的蛋白液用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液；
S423：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；
S424：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；
S425：洗脱：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；用20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E；
S426：用0.1mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；
S427：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析；
S428：30kDa浓缩管进行蛋白样品的浓缩，BCA法测蛋白浓度，HPLC测定纯度。
7.根据权利要求5所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述超声体系的功率为300W，开启2s 再关闭3s ，超声上清16000rpm，4℃离心10min，离心上清用0.45um滤膜过滤。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述30kD 密理博超滤管浓缩每次3000g ，温度为4℃，时间为10min。
CN202211130185.9A 2022-09-16 2022-09-16 一种融合蛋白crm197及其制备方法 Pending CN116120464A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211130185.9A CN116120464A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 一种融合蛋白crm197及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211130185.9A CN116120464A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 一种融合蛋白crm197及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116120464A true CN116120464A (zh) 2023-05-16

Family

ID=86297905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211130185.9A Pending CN116120464A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 一种融合蛋白crm197及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116120464A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6184463B2 (ja) 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
US11535839B2 (en) Encoding genes of nitrilase mutants and application thereof
JP6276694B2 (ja) アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
AU652124B2 (en) Stabilized protein or peptide conjugates
AU2012233980B2 (en) Novel immunoglobulin-binding polypeptide
CN102459317A (zh) 用于crm197及其衍生物的生产的人工基因的细菌表达
KR20160113276A (ko) Crm197 및 관련 단백질의 발현 및 정제
CN105555801A (zh) Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法及识别方法
US11629168B2 (en) Immunoglobulin-binding protein
CN107428807A (zh) 对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和使用它的亲和分离剂、液相色谱柱
CN111117977A (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
JP4088584B2 (ja) 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。
CN116120464A (zh) 一种融合蛋白crm197及其制备方法
CN109266674B (zh) 一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段tspan12-lel制备方法
CN112358530B (zh) 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN111019927B (zh) 用于表达tev蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化tev蛋白的方法
CN111748505B (zh) 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用
CN113493780A (zh) 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶ii的方法及其所制备的sumo_肝素酶ii融合蛋白
CN114990097B (zh) L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
JP7363134B2 (ja) 免疫グロブリン結合性タンパク質
CN112322607B (zh) 一种融合型腈水合酶及其应用
KR20030034136A (ko) 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법
WO2022138718A1 (ja) イムノグロブリン結合ポリペプチド
KR20030010536A (ko) 융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법
WO2022263559A1 (en) Production of cross-reactive material 197 fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination