CN105555801A - Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法及识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明第一课题在于提供Fc结合性蛋白质的稳定性、特别是对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，第二课题在于提供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法以及该方法中使用的材料。通过介由将人FcγRIIIa中的、细胞外区域中特定位点的氨基酸残基置换为其他特定的氨基酸而对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂，解决了第一课题。进而，通过使用将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的、能够特异地吸附具有糖链的抗体的吸附剂，解决了第二课题。

Description

Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法及识别方法
技术领域
本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质、使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法和识别方法。更详细而言，本发明涉及对热、酸的稳定性高于野生型的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法以及将该蛋白质固定化于不溶性载体而得到的抗体吸附剂。特别是，本发明涉及能够特异地吸附抗体中具有糖链的抗体的吸附剂、以及使用了该吸附剂的、具有糖链的抗体的纯化方法以及识别糖链有无附加于抗体的方法。
背景技术
Fc受体是与免疫球蛋白分子的Fc区域结合的一组分子。各个分子通过属于免疫球蛋白超家族的识别结构域，利用Fc受体上的识别结构域识别单一或相同组的免疫球蛋白同种型。由此决定免疫应答中何种辅助细胞起作用。Fc受体可进一步分类成几种亚型，有IgG(免疫球蛋白G)的受体即Fcγ受体、与IgE的Fc区域结合的Fcε受体、与IgA的Fc区域结合的Fcα受体等。另外，各受体更详细地分类，Fcγ受体有FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa、FcγRIIIb的存在被报导(非专利文献1：Takai.T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005)。
Fcγ受体中，FcγRIIIa存在于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等细胞表面，是人免疫机构中参与十分重要的ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性的重要的受体。有报导称，该FcγRIIIa与人IgG的亲和性为表示结合强度的结合常数(KA)为107M-1以下(非专利文献2：J.Galon等，Eur.J.Immunol.，27，1928-1932，1997)。人FcγRIIIa的氨基酸序列(序列号1)被UniProt(Accessionnumber：P08637)等公共数据库发布。另外，对于人FcγRIIIa的结构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肽序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发布。图1表示人FcγRIIIa的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中记载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信号序列(S)；第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为细胞外区域(EC)；第209位的缬氨酸(Val)至第229位的缬氨酸(Val)为止为细胞膜贯穿区域(TM)以及第230位的赖氨酸(Lys)至第254位的赖氨酸(Lys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知FcγRIIIa与IgG1至IgG4的人IgG亚类中特别是IgG1和IgG3强结合、而与IgG2和IgG4的结合弱。
另一方面，近年来，利用单克隆抗体所具有的特异性的药物(抗体药物)的开发有所进展。已知，报导了在抗体药物中所使用的人IgG中，根据Fc区域的第297位的天冬酰胺残基上附加的N型糖链的差异，ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性变化，特别是用去除了作为糖链的一种的岩藻糖的抗体，ADCC活性提高(非专利文献3：Shinkawa.T.，J.Biol.Chem.，278，3466-3473，2003)。即，抗体药物中，抗体所具有的糖链结构具有重要的意义。然而，抗体药物通常是使用以动物细胞作为宿主的基因重组技术而制造的，难以控制在宿主内附加于抗体的糖链。另外，对制造的抗体的糖链进行分析需要很多时间和劳力。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Takai.T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005
非专利文献2:J.Galon等，Eur.J.Immunol.，27，1928-1932，1997
非专利文献3:Shinkawa.T.，J.Biol.Chem.，278，3466-3473，2003
发明内容
发明要解决的问题
本发明的第一课题在于提供特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，本发明的第二课题在于提供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法以及该方法中使用的材料。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述第一课题进行了深入研究的结果发现，确定了人FcγRIIIa中的涉及稳定性提高的氨基酸残基，并且将该氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基的突变体具有对热、酸优异的稳定性，至此完成了本发明。
本发明人等为了解决上述的第二课题进行了深入研究的结果发现，通过使用将IgG受体(Fcγ受体)之一的FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，能够识别有无糖链附加于抗体，至此完成了本发明。
即，本发明包含以下的(A)至(Z)中所述的方式：
(A)一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中由第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生以下的(1)至(40)中至少任一种氨基酸置换；
(1)序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸
(2)序列号1的第27位的缬氨酸置换为谷氨酸
(3)序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸
(4)序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(5)序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者
(6)序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸
(7)序列号1的第48位的谷氨酰胺置换为组氨酸或亮氨酸
(8)序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸
(9)序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸
(10)序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
(11)序列号1的第56位的天冬酰胺置换为苏氨酸
(12)序列号1的第59位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(13)序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(14)序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸
(15)序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸
(16)序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸
(17)序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者
(18)序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酰胺
(19)序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸
(20)序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或缬氨酸
(21)序列号1的第90位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(22)序列号1的第92位的天冬酰胺置换为丝氨酸
(23)序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸
(24)序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸
(25)序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(26)序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酰胺
(27)序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸
(28)序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(29)序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸
(30)序列号1的第120位的谷氨酸置换为缬氨酸
(31)序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
(32)序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸
(33)序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸
(34)序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸
(35)序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸
(36)序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸
(37)序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(38)序列号1的第180位的天冬酰胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者
(39)序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸
(40)序列号1的第192位的谷氨酰胺置换为赖氨酸。
(B)根据(A)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。
(C)根据(B)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺或脯氨酸。
(D)根据(C)所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中由第33位至第208位为止的氨基酸残基。
(E)根据(D)所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。
(F)根据(A)至(C)的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生以下的(41)至(44)中至少任一个氨基酸置换；
(41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
(42)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
(43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
(44)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸
(G)一种吸附剂，其是将(A)至(F)的任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的。
(H)一种抗体的纯化方法，其使用了(G)所述的吸附剂。
(I)一种识别方法，使用(G)所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链结构的差异。
(J)一种抗体，其是用(H)所述的纯化方法得到的。
(K)一种糖链的分离方法，其使用了(G)所述的吸附剂。
(L)一种糖链，其是用(K)所述的分离方法得到的。
(M)一种多聚核苷酸，其编码(A)至(F)的任一项所述的Fc结合性蛋白质。
(N)一种表达载体，其包含(M)所述的多聚核苷酸。
(O)一种转化体，其是以(N)所述的表达载体转化宿主而得到的。
(P)根据(O)所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
(Q)一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对(O)或(P)所述的转化体进行培养而使Fc结合性蛋白质表达，从该培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
(R)一种具有糖链的抗体的吸附剂，其是将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的。
(S)根据(R)所述的吸附剂，其中，人FcγRIIIa为包含序列号1中记载的氨基酸序列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的多肽。
(T)根据(R)所述的吸附剂，其中，人FcγRIIIa为包含序列号1中记载的氨基酸序列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，并且前述氨基酸残基中的一个以上被其他的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个以上的多肽。
(U)根据(T)所述的吸附剂，其中，人FcγRIIIa为包含序列号1中记载的氨基酸序列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生了以下(i)至(iv)中至少任一种氨基酸置换的多肽。
(i)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
(ii)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
(iii)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
(iv)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸
(V)一种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括：将包含具有糖链的抗体的溶液添加至(R)至(U)的任一项所述的吸附剂中并使具有糖链的抗体吸附于该吸附剂的工序；和、使用洗脱液将吸附于前述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。
(W)一种抗体，其是用(V)所述的纯化方法得到的。
(X)一种识别方法，使用(R)至(U)的任一项所述的吸附剂来识别有无糖链附加于抗体。
(Y)一种糖链的分离方法，其使用了(R)至(U)的任一项所述的吸附剂。
(Z)一种糖链，其是用(Y)所述的分离方法得到的。
以下，对本发明详细地进行说明。
本发明的Fc结合性蛋白质是具有与抗体的Fc区域的结合性的蛋白质，是包含含有序列号1中记载的氨基酸序列的人FcγRIIIa的细胞外区域(图1的EC的区域)中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的蛋白质，是该第17位至第192位为止的氨基酸残基中的特定位点产生了氨基酸置换的蛋白质。因此，本发明的Fc结合性蛋白质可以包含位于细胞外区域的N末端侧的信号肽区域(图1的S)的全部或者一部分，也可以包含位于细胞外区域的C末端侧的细胞膜贯穿区域(图1的TM)和细胞外区域(图1的C)的全部或者一部分。前述特定位点中的氨基酸置换具体而言，是指序列号1中记载的氨基酸序列中下述至少任一种置换：Met18Arg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，以下相同)、Val27Glu、Phe29Leu、Phe29Ser、Leu30Gln、Tyr35Asp、Tyr35Gly、Tyr35Lys、Tyr35Leu、Tyr35Asn、Tyr35Pro、Tyr35Ser、Tyr35Thr、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、Thr95Ser、Leu110Gln、Arg115Gln、Trp116Leu、Phe118Tyr、Lys119Glu、Glu120Val、Glu121Asp、Glu121Gly、Phe151Ser、Phe151Tyr、Ser155Thr、Thr163Ser、Ser167Gly、Ser169Gly、Phe171Tyr、Asn180Lys、Asn180Ser、Asn180Ile、Thr185Ser、Gln192Lys。其中，产生Tyr35Asp、Tyr35Gly、Tyr35Lys、Tyr35Leu、Tyr35Asn、Tyr35Pro、Tyr35Ser、Tyr35Thr、Tyr35His、Glu121Gly中任一置换时，热稳定性提高，因而优选。另外，已知野生型人FcγRIIIa中有产生了Leu66His、Leu66Arg、Gly147Asp、Tyr158His或Val176Phe的置换的突变体，但除了前述特定位点中的氨基酸置换以外，也可以含有这些氨基酸置换。
需要说明的是，通过进行氨基酸置换来制备本发明的Fc结合性蛋白质时，对于特定位点的氨基酸残基，只要具有抗体结合活性，也可以置换为前述的氨基酸以外的氨基酸。作为其一例，可列举出保守的置换即两氨基酸的物理性质和化学性质或者其一类似的氨基酸间进行置换。对于本领域技术人员来说已知的是，保守的置换不限定于Fc结合性蛋白质，通常在产生置换的蛋白质与没有产生置换的蛋白质之间维持了蛋白质的功能。作为保守的置换的一例，可列举出甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之间、或者谷氨酸与丙氨酸之间产生的置换(蛋白质的结构和功能，MEDICALSCIENCESINTERNATIONAL,LTD.，9，2005)。
本发明的Fc结合性蛋白质中，对于置换的氨基酸的个数没有特别的限制。作为一例，可列举出以下的(a)至(h)所示的Fc结合性蛋白质。这些Fc结合性蛋白质从对热和酸的稳定性提高的观点出而优选。(a)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu和Tyr35Asn的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号27中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(b)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn和Phe75Leu的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号31中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(c)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号33中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(d)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生了Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu、Asn92Ser和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(e)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号41中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(f)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号43中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(g)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Glu120Val和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号47中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。(h)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser、Glu120Val和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号49中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
本发明的吸附剂中作为配体使用的、人FcγRIIIa的氨基酸序列(序列号1)被UniProt(Accessionnumber：P08637)等公共数据库所公开。另外，对于人FcγRIIIa的结构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肽序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发布。图1表示人FcγRIIIa的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中记载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信号序列(S)；第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为细胞外区域(EC)；第209位的缬氨酸(Val)至第229位的缬氨酸(Val)为止为细胞膜贯穿区域(TM)以及第230位的赖氨酸(Lys)至第254位的赖氨酸(Lys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，本发明的吸附剂中作为配体而使用的人FcγRIIIa并不一定需要使用人FcγRIIIa的全长(序列号1)，只要是至少包含序列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的多肽即可。进而，包含序列号1中记载的氨基酸序列中的至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基并且前述氨基酸残基中的一个以上被其他的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个以上的多肽，也包括在作为本发明的吸附剂的且作为配体使用的人FcγRIIIa中。另外，已知天然型人FcγRIIIa中有第66位的亮氨酸(Leu)置换成组氨酸(His)或精氨酸(Arg)、第147位的甘氨酸(Gly)置换成天冬氨酸(Asp)、第158位的酪氨酸(Tyr)置换成组氨酸(His)、或者第176位的缬氨酸(Val)置换成苯丙氨酸(Phe)的突变体，产生了至少任一个这些氨基酸置换的多肽也包括于作为本发明的吸附剂的配体而使用的人FcγRIIIa中。
本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人FcγRIIIa也可以在其N末端侧或C末端侧进一步附加在从杂质存在下的溶液中分离时有用的寡肽。作为前述寡肽，可列举出多聚组氨酸、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸等。另外，也可以将在本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人FcγRIIIa固定化于色谱法用的支持体等固相时有用的、包含半胱氨酸的寡肽附加于本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人FcγRIIIa的N末端侧或C末端侧。对于Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人FcγRIIIa的N末端侧或C末端侧所附加的寡肽的长度，只要不有损作为本发明的Fc结合性蛋白质或吸附剂的配体即人FcγRIIIa的IgG结合性、稳定性，则没有特别的限制。可以在使前述寡肽附加于本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人FcγRIIIa时，制备编码前述寡肽的多聚核苷酸之后，使用本领域技术人员公知的方法基因工程地附加在Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的N末端侧或C末端侧，也可以使化学地合成的前述寡肽化学地结合并附加于本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的N末端侧或C末端侧。进而，也可以在本发明的Fc结合性蛋白质或吸附剂的配体即人FcγRIIIa的N末端侧附加用于促进在宿主中的有效表达的信号肽。宿主为大肠杆菌的情况下的前述信号肽的例子，可例示出：PelB、DsbA、MalE(UniProtNo.P0AEX9中记载的氨基酸序列中第1位至第26位为止的区域)、TorT等这样的使蛋白质分泌于周质的信号肽(日本特开2011-097898号公报)。
作为本发明的多聚核苷酸的制备方法的一例，可例示出：(I)由本发明的Fc结合性蛋白质或吸附剂的配体即人FcγRIIIa的氨基酸序列转换成核苷酸序列，人工地合成包含该核苷酸序列的多聚核苷酸的方法；(II)直接人工地制备包含Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的整体或部分序列的多聚核苷酸，或者由Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的cDNA等使用PCR法这样的DNA扩增法来制备包含Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的整体或部分序列的多聚核苷酸，用适当的方法将制备的该多聚核苷酸进行连接的方法。前述(I)的方法中，由氨基酸序列转换成核苷酸序列时，优选考虑转化的宿主中的密码子的使用频率而进行变换。作为一例，宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)的情况下，精氨酸(Arg)中的AGA/AGG/CGG/CGA、异亮氨酸(Ile)中的ATA、亮氨酸(Leu)中的CTA、甘氨酸(Gly)中的GGA、脯氨酸(Pro)中的CCC由于分别使用频率少(由于是所谓的罕用密码子)、所以避开这些密码子而进行更换即可。密码子的使用频率的解析也可以利用公共数据库(例如,KazusaDNAResearchInstitute的主页中的CodonUsageDatabase等)。
对本发明的多聚核苷酸导入突变的情况下，可以使用易错聚合酶链反应(error-pronePCR)法。对于易错PCR法中的反应条件，只要是对编码人FcγRI(或者Fc结合性蛋白质)的多聚核苷酸导入所希望的突变的条件，则没有特别的限定；例如，将作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、以0.01至10mM(优选为0.1至1mM)的浓度向PCR反应液中添加MnCl2而进行PCR，由此能够向多聚核苷酸中导入突变。另外，作为易错PCR法以外的突变导入方法，可列举出如下方法：使包含人FcγRI的整体或部分序列的多聚核苷酸与作为突变原的试剂接触·作用，或照射紫外线，从而向多聚核苷酸导入突变来制备。作为该方法中作为突变原而使用的试剂，可以使用羟基胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等本领域技术人员通常使用的突变原性试剂。
使用本发明的多聚核苷酸来转化宿主的情况下，可以使用本发明的多聚核苷酸其自身，更优选使用在表达载体(例如，原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的噬菌体、粘粒、质粒等)的适当的位置插入本发明的多聚核苷酸的表达载体。需要说明的是，该表达载体只要是能够在转化的宿主内稳定地存在并复制的物质则没有特别的限制，以大肠杆菌作为宿主的情况下，可例示出：pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、pBBR质粒载体。另外，前述适当的位置是指不破坏涉及表达载体的复制功能、所希望的抗生素标记物、传递性的区域的位置。向前述表达载体中插入本发明的多聚核苷酸时，优选以与表达所需要的启动子这样的功能性多聚核苷酸连接的状态插入。作为该启动子的例子，在宿主为大肠杆菌的情况下，可列举出trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、进而λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子等。
为了使用通过前述方法制备的插入了本发明的多聚核苷酸的表达载体(以下，作为本发明的表达载体)来转化宿主，可以用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，作为宿主选择属于Escherichia属的微生物(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌BL21(DE3)株、大肠杆菌W3110株等)的情况下，可以通过公知的文献(例如,MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，256，1992)中记载的方法等进行转化。对于用前述的方法转化而得到的转化体可以用适当的方法进行筛选，从而得到能够表达本发明的Fc结合性蛋白质的转化体(以下，作为本发明的转化体)。需要说明的是，对于使本发明的Fc结合性蛋白质或吸附剂的配体即人FcγRIIIa表达的宿主，没有特别的限制；作为一例，可列举出：动物细胞(CHO细胞、HEK细胞、Hela细胞、COS细胞等)、酵母(Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Hansenulapolymorpha、Schizosaccharomycesjaponicus、Schizosaccharomycesoctosporus、Schizosaccharomycespombe等)、昆虫细胞(Sf9、Sf21等)、大肠杆菌(JM109株、BL21(DE3)株、W3110株等)、枯草杆菌。需要说明的是，使用动物细胞、大肠杆菌作为宿主时，从生产率的方面出发而优选，进而优选使用大肠杆菌作为宿主。
为了由本发明的转化体制备本发明的表达载体，从培养本发明的转化体而得到的培养物中使用碱提取法或QIAprepSpinMiniprepkit(QIAGEN制)等市售的提取试剂盒进行制备即可。对本发明的转化体进行培养，由得到的培养物对本发明的Fc结合性蛋白质进行回收，由此能够制造本发明的Fc结合性蛋白质。需要说明的是，本说明书中，培养物除了指所培养的本发明的转化体的细胞自身以外，也包括培养中所使用的培养基。本发明的蛋白质制造方法中所使用的转化体只要用适合于对象宿主培养的培养基进行培养即可，宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可列举出添加了必要的营养源的LB(Luria-Bertani)培养基。需要说明的是，为了通过本发明载体有无导入来选择地使本发明的转化体增殖，优选向培养基中添加对应于该载体所包含的药剂耐性基因的药剂而进行培养。例如，该载体包含卡那霉素耐性基因的情况下，可以向培养基中添加卡那霉素。另外，培养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，也可以添加适当的营养源，也可以根据需要含有选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种以上还原剂。进而，也可以添加甘氨酸这样的促进由前述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂；具体而言，宿主为大肠杆菌的情况下，优选对培养基添加2％(w/v)以下的甘氨酸。宿主为大肠杆菌的情况下，培养温度通常为10℃至40℃、优选为20℃至37℃、更优选为25℃左右，根据表达的蛋白质的特性进行选择即可。宿主为大肠杆菌的情况下，培养基的pH为pH6.8至pH7.4，优选为pH7.0左右。另外，本发明的载体中含有诱导性的启动子的情况下，优选在本发明的Fc结合性蛋白质能够良好表达的条件下实施诱导。作为诱导剂，可例示出IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。宿主为大肠杆菌的情况下，测定培养液的浊度(600nm处的吸光度)，成为约0.5至1.0时，添加适当量的IPTG之后，继续进行培养，由此能够诱导Fc结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以从0.005至1.0mM的范围适宜选择，但优选为0.01至0.5mM的范围。与IPTG诱导相关的各种条件按照该技术领域中公知的条件进行即可。
为了从培养本发明的转化体而得到的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可以采用适合于本发明的转化体中的本发明的Fc结合性蛋白质的表达形态的方法，从该培养物中进行分离/纯化，从而回收本发明的Fc结合性蛋白质。例如，在培养上清中表达的情况下，通过离心分离操作分离菌体，从得到的培养上清中纯化本发明的Fc结合性蛋白质即可。另外，在细胞内(包括周质)表达的情况下，通过离心分离操作收集菌体之后，通过添加酶处理剂、表面活性剂等而将菌体破碎，提取本发明的Fc结合性蛋白质之后进行纯化即可。为了对本发明的Fc结合性蛋白质进行纯化，使用该技术领域中公知的方法即可，作为一例，可列举出使用了液相色谱法的分离/纯化。液相色谱法中有离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等，通过组合这些色谱法进行纯化操作，从而能够高纯度地制备本发明的Fc结合性蛋白质。作为测定得到的本发明的Fc结合性蛋白质的对IgG的结合活性的方法，使用例如Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay(以下，记为ELISA)法、表面等离子共振法等测定对于IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选为人IgG，特别优选为人IgG1、人IgG3。
通过使本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa与不溶性载体结合，能够制造本发明的吸附剂。对于前述不溶性载体，没有特别的限定，可例示出：以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉这样的多糖作为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、聚氨酯这样的合成高分子作为原料的载体；以二氧化硅等的陶瓷作为原料的载体。其中，优选以多糖作为原料的载体、以合成高分子作为原料的载体作为不溶性载体。作为前述优选的载体的一例，可列举出：TOYOPEARL(TOSOHCORPORATION制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GEHealthcare制)等琼脂糖凝胶、Cellufine(JNCCorporation.制)等纤维素凝胶。对于不溶性载体的形状，没有特别的限定，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性的任一者。
为了将Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基卤代乙酰胺等活性基团,通过该活性基团使人Fc结合性蛋白质与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可以直接使用市售的载体；也可以在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的市售的载体，可例示出：TOYOPEARLAF-Epoxy-650M、TOYOPEARLAF-Tresyl-650M(均为TOSOHCORPORATION制)、HiTrapNHS-activatedHPColumns、NHS-activatedSepharose4FastFlow、Epoxy-activatedSepharose6B(均为GEHealthcare制)、SulfoLinkCouplingResin(ThermoScientific制)。
另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出：使存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等与具有2个以上活性部位的化合物的一者反应的方法。作为该化合物的一例中，作为对载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出：环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油基醚、丁二醇缩水甘油基醚、己二醇二缩水甘油基醚。通过前述化合物对载体表面导入环氧基之后,作为向载体表面导入羧基的化合物,可例示出:2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。
作为向载体表面存在的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示出：N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-[4-N-马来酰亚胺苯基]乙酸酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、2-马来酰亚胺乙酸、3-马来酰亚胺丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、6-马来酰亚胺己酸、(N-[α―马来酰亚胺乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯)、(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羰基-[6-氨基己酸])、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸)、(马来酰亚胺对苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯。
作为向载体表面存在的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示出：氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2-(碘代乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴代乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘代乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。需要说明的是，还可例示出使载体表面存在的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油基醚反应之后，用卤化剂将ω-烯基部位卤化而进行活性化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油基醚，可例示出烯丙基缩水甘油基醚、3-丁烯基缩水甘油基醚、4-戊烯基缩水甘油基醚；作为卤化剂，可例示出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺。
作为向载体表面导入活性基团的方法的其他的例，有如下方法：对于载体表面存在的羧基使用缩合剂和添加剂导入活性化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)、二环己基碳二酰亚胺、羰基二咪唑。另外，作为添加剂，可例示出N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并三唑。
作为将本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa固定化于不溶性载体时所使用的缓冲液，可例示出：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2-吗啉乙磺酸；2-Morpholinoethanesulfonicacid)缓冲液、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸；2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。对于固定化时的反应温度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa的稳定性的基础上，在5℃至50℃为止的温度范围中适宜设定即可，优选为10℃至35℃的范围。
使用将本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的本发明的吸附剂，为了对具有糖链的抗体进行纯化，例如，通过使用泵等送液手段向填充了本发明的吸附剂的柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液，使具有糖链的抗体特异地吸附于本发明的吸附剂之后，向柱添加适当的洗脱液，从而洗脱具有糖链的抗体即可。需要说明的是，能够用本发明的吸附剂纯化的具有糖链的抗体是与Fc结合性蛋白质或FcγRIIIa等的Fc受体具有亲和性的、至少包含具有糖链的抗体的Fc区域的抗体即可。作为一例，可列举出：通常作为用于抗体药物的抗体所使用的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的氨基酸置换体。另外，双特异性抗体(Bispecificantibody)、具有糖链的抗体的Fc区域与其他蛋白质的融合抗体、具有糖链的抗体的Fc区域与药物的复合体(ADC)等人工地改变了结构的抗体,也可以用本发明的吸附剂进行纯化。另外,向柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液之前,使用适当的缓冲液对柱进行平衡化时,能够将具有糖链的抗体更高纯度地纯化,因而优选。作为缓冲液,可例示出磷酸缓冲液等将无机盐作为成分的缓冲液,缓冲液的pH为pH3至10,优选为pH5至8。
为了将本发明的吸附剂所吸附的具有糖链的抗体洗脱,弱化具有糖链的抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa)的相互作用即可,具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counterpeptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于将本发明的吸附剂所吸附的、具有糖链的抗体洗脱的洗脱液的具体例，可列举出：比使具有糖链的抗体吸附于本发明的吸附剂时所使用的溶液更偏酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示出在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。对于缓冲液的pH，可以在不有损抗体所具有的功能的范围设定即可，优选pH2.5至6.0，更优选pH3.0至5.0，进而优选pH3.3至4.0。
需要说明的是，从包含具有糖链的抗体的溶液中，使用本发明的吸附剂对前述抗体进行纯化时，由于前述抗体所具有的糖链结构的差异，抗体的洗脱位置(洗脱级分)不同。因此，通过使用本发明的吸附剂对抗体进行分离，能够识别抗体所具有的糖链结构的差异。对于能够识别的糖链的结构，没有特别的限定，作为一例，可列举出：以CHO细胞这样的来自动物的细胞或以毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces)这样的酵母为宿主使抗体表达时附加的糖链；人抗体所具有的糖链；用化学合成法附加于抗体的糖链。另外，本发明的吸附剂可以基于抗体所具有的糖链结构的差异进行分离，所以也可利用于糖链其自身的分离。
需要说明的是，前面已提到了能够通过本发明的吸附剂识别抗体的糖链结构的差异，作为该吸附剂所使用的配体蛋白质，使用了FcγRIIIa以外的Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIb、FcRn)的情况下，也能够同样地识别糖链结构的差异。
发明的效果
本发明的Fc结合性蛋白质是将人FcγRIIIa的细胞外区域中的特定位点的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基的蛋白质。本发明的Fc结合性蛋白质与野生型人FcγRIIIa相比较，对于热和酸的稳定性提高了。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为用于分离免疫球蛋白的吸附剂的配体是有用的。
另外，本发明是涉及将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的吸附剂的发明；前述吸附剂特异地吸附抗体中的具有糖链的抗体，因此能够简便地识别糖链有无附加于抗体，这样的识别到目前为止是困难的。另外，通过使用本发明的吸附剂能够特异地纯化具有糖链的抗体，因此能够有效率地制造具有糖链的抗体。
附图说明
图1是人FcγRIIIa的示意图。图中的数字表示序列号1中记载的氨基酸序列的号。图中的S表示信号序列；EC表示细胞外区域；TM表示细胞膜贯穿区域；C表示细胞内区域。
图2是表示对置换了1个氨基酸的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性进行了评价的结果的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
图3是表示对置换了1个氨基酸的Fc结合性蛋白质的热稳定性进行了评价的结果的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
图4是表示使用了FcR5a固定化凝胶的抗体的洗脱的色谱图。图中的Fr表示回收的级分的位置。
图5是表示附加于抗体的糖链结构的列表的图。图中的N1至N8对应于表10的N1至N8；M1和M2对应于表11的M1和M2。
图6是表示使用了FcR5a固定化凝胶的抗体纯化的结果的图(SDS-PAGE)。分别地，(A)表示人IgG1的纯化结果；(B)表示人IgG3的纯化结果。
图7是具有糖链的人IgG1(有糖链的人IgG1)与去除了糖链的人IgG1(去除糖链的人IgG1)利用SDS-PAGE比较了分子量的图。图中的泳道(1)是具有糖链的人IgG1；泳道(2)是去除了糖链的人IgG1。
图8是将具有糖链的人IgG1和去除了糖链的人IgG1与人FcγRIIIa以及蛋白A的结合性进行了比较的图。(A)是人FcγRIIIa的结果；(B)是蛋白A的结果。
图9是对于具有糖链的人IgG1和去除了糖链的人IgG1用本发明的吸附剂进行了分离的结果。(1)是具有糖链的人IgG1的结果；(2)是去除了糖链的人IgG1的结果。
具体实施方式
实施例
以下，为了对本发明进一步详细地进行说明示出了实施例，本发明并不限定于实施例。
实施例1Fc结合性蛋白质或人FcγRIIIa表达载体的制备
(1)基于从序列号1中记载的人FcγRIIIa氨基酸序列中的第17位的甘氨酸(Gly)至第192位的谷氨酰胺(Gln)为止的氨基酸序列，使用DNAworks法(NucleicAcidsRes.，30，e43，2002)，设计将密码子由人型转换成大肠杆菌型的核苷酸序列。将设计的核苷酸序列示于序列号2。
(2)为了制备包含序列号2中记载的序列的多聚核苷酸，合成包含序列号3至20中记载的序列的寡核苷酸，使用前述寡核苷酸，进行下述所示的二阶段PCR。
(2-1)第一阶段的PCR：制备表1所示的组成的反应液，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在62℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3步骤作为1个循环的反应重复进行10个循环，合成多聚核苷酸，将其作为FcRp1。需要说明的是，表1中的DNA混合物是指将具有序列号3至20中记载的序列的18种寡核苷酸分别采集一定量进行混合而成的溶液。
[表1]
组成 浓度/容量
DNA混合液(序列号3～20） 各2.5mM
5×PrimeSTAR buffer(TAKARA BIO INC.制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
H2O 定容至50μL
(2-2)第二阶段的PCR：以(2-1)中合成的FcRp1作为模板、将具有序列号21(5’-TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3’)和序列号22(5’-CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGCCCCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物进行实施。具体而言，制备表2所示组成的反应液，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在62℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1.5分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应重复进行30循环来实施。
[表2]
组成 浓度/容量
模板DNA 2μL
正向引物 0.4μM
反向引物 0.4μM
5×PrimeSTAR buffer(TAKARA BIO INC.制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
H2O 定容至50μL
(3)对(2)中得到的多聚核苷酸进行纯化，用限制酶NcoI和HindIII进行消化之后，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21株(DE3)。
(4)对得到的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养之后，使用QIAprepSpinMiniprepkit(QIAGEN制)，提取表达载体pET-eFcR。
(5)在(4)中制备的表达载体pET-eFcR中的编码人FcγRIIIa的多聚核苷酸及其周边的区域中，基于链终止法而使用BigDyeTerminatorCycleSequencingreadyReactionkit(ThermoFisherScientificInc.制)供于循环测序反应，利用全自动DNAsequencerABIPrism3700DNAanalyzer(ThermoFisherScientificInc.制)对核苷酸序列进行解析。需要说明的是，进行该解析时，使用具有序列号23(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)或序列号24(5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为测序用引物。
分别地，将表达载体pET-eFcR表达的多肽的氨基酸序列示于序列号25中；将编码该多肽的多聚核苷酸的序列示于序列号26中。需要说明的是，序列号25中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为人FcγRIIIa的细胞外区域(序列号1的第17位至第192位为止的区域)；第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。
实施例2向Fc结合性蛋白质导入突变以及基因文库的制备
对于实施例1中制备的Fc结合性蛋白质表达载体pER-eFcR中的编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板使用实施例1中制备的pET-eFcR进行易错PCR。易错PCR如下进行：在制备表3所示的组成的反应液之后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理、在95℃下进行30秒的第1步骤、在60℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过前述易错PCR对编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸良好地导入突变，其平均突变导入率为1.26％。
[表3]
组成 浓度/容量
模板DNA(p ET-eFcR) 0.12 ng/μL
10μM PCR引物(序列号21) 4μL
10μM PCR引物(序列号22) 4μL
2.5 mM MgCl2 12μL
10 mM dATP 2μL
10 mM dGTP 2μL
10 mM dCTP 10μL
10 mM dTTP 10μL
10 mM MnCl2 4μL
10×E×Taq Buffer(TAKARA BIO INC.制) ×1
GoTaq polymerase(Promega KK.制) 1μL
H2O 定容至100μL
(2)对(1)中得到的PCR产物进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束之后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃下18小时)之后，将形成于平板上的菌落作为随机突变体基因文库。
实施例3热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例2中制备的随机突变体基因文库(转化体)接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)200μL，使用96孔深孔平板在30℃下振荡培养一晚。
(2)培养之后，将5μL的培养液继续植入500μL的包含0.05mM的IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、0.3％的甘氨酸和50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔平板，进一步在20℃下振荡培养一晚。
(3)培养之后，将通过离心操作得到的培养上清用包含150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)稀释2倍。对于稀释后的溶液，在45℃下进行10分钟热处理。
(4)对于(3)的进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性、以及(3)的没有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，分别用下述所示的ELISA法进行测定，将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以没有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算出残留活性。
(4-1)将作为人抗体的γ-球蛋白制剂(TheChemo-Sero-TherapeuticResearchInstitute制)以1μg/孔固定化(4℃下18小时)于96孔微孔平板的孔，固定化结束后，利用包含2％(w/v)的SKIMMILK(BD公司制)和150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行封闭(blocking)。
(4-2)用洗涤缓冲液(包含0.05％[w/v]的Tween20、150mM的NaCl的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4))进行洗涤之后，添加评价抗体结合活性的包含Fc结合性蛋白质的溶液，使Fc结合性蛋白质与固定化γ-球蛋白反应(30℃下1小时)。
(4-3)反应结束后，用前述洗涤缓冲液进行洗涤，以100μL/孔添加稀释至100ng/mL的Anti-6His抗体(BethylLaboratories公司制)。
(4-4)30℃下使之反应1小时，用前述洗涤缓冲液进行洗涤之后，以50μL/孔添加TMBPeroxidaseSubstrate(KPL公司制)。通过以50μL/孔添加1M的磷酸来停止显色，用酶标仪(TecanJapan制)测定450nm的吸光度。
(5)用(4)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与野生型(没有氨基酸置换)Fc结合性蛋白质相比较热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。对于前述选择的转化体进行培养，使用QIAprepSpinMiniprepkit(QIAGEN制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所插入的编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸区域的序列，通过与实施例1(5)的记载同样的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(5)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于野生型(没有氨基酸置换)Fc结合性蛋白质的氨基酸置换位点以及热处理后的残留活性(％)总结示于表4中。包含序列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Met18Arg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，以下同样)、Val27Glu、Phe29Leu、Phe29Ser、Leu30Gln、Tyr35Asn、Tyr35Asp、Tyr35Ser、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、Thr95Ser、Leu110Gln、Arg115Gln、Trp116Leu、Phe118Tyr、Lys119Glu、Glu120Val、Glu121Asp、Glu121Gly、Phe151Ser、Phe151Tyr、Ser155Thr、Thr163Ser、Ser167Gly、Ser169Gly、Phe171Tyr、Asn180Lys、Asn180Ser、Asn180Ile、Thr185Ser、Gln192Lys的至少任一种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与野生型的Fc结合性蛋白质相比较，可以说热稳定性提高了。
[表4]
将表4所示的进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中残留活性最高的产生了Val27Glu和Tyr35Asn的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质命名为FcR2，将包含编码FcR2的多聚核苷酸的表达载体命名为pET-FcR2。将FcR2的氨基酸序列示于序列号27，将编码FcR2的多聚核苷酸的序列示于序列号28。需要说明的是，序列号27中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR2的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号27中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位的位点。
实施例4氨基酸置换Fc结合性蛋白质的制备
通过累积实施例3中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制备以下(a)至(g)所示的7种Fc结合性蛋白质。
(a)对于FcR2进一步进行了Phe75Leu的氨基酸置换的FcR3
(b)对于FcR2进一步进行了Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的FcR4
(c)对于FcR4进一步进行了Asn92Ser的氨基酸置换的FcR5a
(d)对于FcR4进一步进行了Glu54Asp的氨基酸置换的FcR5b
(e)对于FcR5a进一步进行了Glu54Asp的氨基酸置换的FcR6a
(f)对于FcR5b进一步进行了Glu120Val的氨基酸置换的FcR6b
(g)对于FcR6a进一步进行了Glu120Val的氨基酸置换的FcR7
以下，对于各Fc结合性蛋白质的制备方法详细地进行了说明。
(a)FcR3从实施例3中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn和Phe75Leu，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR3。具体而言，对于编码FcR2的多聚核苷酸进行产生Phe75Leu的突变导入，从而制备FcR3。
(a-1)以实施例3中取得的pET-FcR2为模板实施PCR。该PCR中的引物使用具有序列号24和序列号29(5’-AGCCAGGCGAGCAGCTACCTTATTGATGCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下进行：制备表5所示组成的反应液之后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，98℃下进行10秒的第1步骤、55℃下进行5秒的第2步骤、72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将扩增的PCR产物供于琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquickGelExtractionkit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m3F。
[表5]
组成 浓度/容量
模板DNA 2μL
10μM正向引物 1μL
10μM反向引物 1μL
5×PrimeSTAR buffer(TAKARA BIO INC.制) 4μL
2.5mM dNTPs 2μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
H2O 定容至20μL
(a-2)将实施例3中取得的pET-FcR2作为模板、将具有序列号23和序列号30(5’-CCACCGTCGCCGCATCAATAAGGTAGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，与(a-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m3R。
(a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的2种PCR产物(m3F、m3R)混合，制备表6所示组成的反应液。进行如下PCR：对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，98℃下进行10秒的第1步骤、55℃下进行5秒的第2步骤、72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3步骤作为1个循环的反应进行5循环，从而得到连接了m3F和m3R的PCR产物m3p。
[表6]
组成 浓度/容量
PCR产物 各等mol
2.5 U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
5×PrimeSTAR buffer(TAKARA BIO INC.制) 4μL
2.5 mM dNTPs 2μL
H2O 定容至20μL
(a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m3p作为模板，将具有序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示组成的反应液之后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此制备编码对FcR2导入了1位点氨基酸置换的FcR3的多聚核苷酸。
[表7]
组成 浓度/容量
PCR产物 2μL
10μM正向引物 2μL
10μM反向引物 2μL
5×PrimeSTAR buffer(TAKARA BIO INC.制) 10μL
2.5 mM dNTPs 4μL
2.5 U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 1μL
H2O 定容至50μL
(a-5)对(a-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(a-6)对得到的转化体用添加了501μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR3的多聚核苷酸的质粒pET-FcR3，所述FcR3是对野生型Fc结合性蛋白质进行了3位点氨基酸置换的多肽。
(a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR3的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR3的氨基酸序列示于序列号31、将编码前述FcR3的多聚核苷酸的序列示于序列号32。需要说明的是，序列号31中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR3的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号31中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位的位点。
(b)FcR4从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR4。具体而言，通过对编码FcR2的多聚核苷酸进行产生Phe75Leu和Glu121Gly的突变导入来制备FcR4。
(b-1)用与(a-1)同样的方法得到PCR产物m3F。另外，将实施例3中取得的、表达包含Ala71Asp、Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(表4)的质粒作为模板，将具有序列号24和序列号29中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-1)同样的方法进行PCR，从而得到PCR产物m4R。
(b-2)将由(b-1)得到的2种PCR产物(m3F、m4R)进行混合之后，按照与(a-3)同样的方法进行PCR，将m3F和m4R连接。将得到的PCR产物作为m4p。
(b-3)将(b-2)中得到的PCR产物m4p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR4的多聚核苷酸。
(b-4)对(b-3)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(b-5)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR4的多聚核苷酸的质粒pET-FcR4，所述FcR4是对野生型Fc结合性蛋白质进行了4位点氨基酸置换的多肽。
(b-6)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR4的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR4的氨基酸序列示于序列号33、将编码前述FcR4的多聚核苷酸的序列示于序列号34。需要说明的是，序列号33中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR4的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号33中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(c)FcR5a从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu、Asn92Ser和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR5a。具体而言，对于编码(b)中制备的FcR4的多聚核苷酸进行产生Asn92Ser的突变导入，从而制备FcR5a。
(c-1)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将具有序列号22和序列号35(5’-GAATATCGTTGCCAGACCAGCCTGAGCACC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aF。
(c-2)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将具有序列号21和序列号36(5’-GATCGCTCAGGGTGCTCAGGCTGGTCTGGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aR。
(c-3)将(c-1)和(c-2)得到的2种PCR产物(m5aF、m5aR)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m5aF和m5aR连接。将得到的PCR产物作为m5ap。
(c-4)将(c-3)中得到的PCR产物m5ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR5a的多聚核苷酸。
(c-5)对(c-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(c-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR5a的多聚核苷酸的质粒pET-FcR5a，所述FcR5a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了5位点氨基酸置换的多肽。
(c-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR5a的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR5a的氨基酸序列示于序列号37、将编码前述FcR5a的多聚核苷酸的序列示于序列号38。需要说明的是，序列号37中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR5a的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号37中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(d)FcR5b从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR5b。具体而言，对于编码(b)中制备的FcR4的多聚核苷酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备FcR5b。
(d-1)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板，将具有序列号22和序列号39(5’-CAGGGCGCGTATAGCCCGGATGATAACAGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5bF。
(d-2)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将具有序列号21和序列号40(5’-CACTGGGTGCTGTTATCATCCGGGCTATAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5bR。
(d-3)将(d-1)和(d-2)中得到的2种PCR产物(m5bF、m5bR)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m5bF和m5bR连接。将得到的PCR产物作为m5bp。
(d-4)将(d-3)中得到的PCR产物m5bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR5b的多聚核苷酸。
(d-5)对(d-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(d-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR5b的多聚核苷酸的质粒pET-FcR5b，所述FcR5b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了5位点氨基酸置换的多肽。
(d-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR5b的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR5b的氨基酸序列示于序列号41、将编码前述FcR5b的多聚核苷酸的序列示于序列号42。需要说明的是，序列号41中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR5b的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号41中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(e)FcR6a从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR6a。具体而言，对于编码(c)中制备FcR5a的多聚核苷酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备FcR6a。
(e-1)将(c)中制备的pET-FcR5a作为模板、将具有序列号22和序列号39中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m6aF。
(e-2)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将具有序列号21和序列号40中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m6aR。
(e-3)将(e-1)和(e-2)中得到的2种PCR产物(m6aF、m6aR)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m6aF和m6aR连接。将得到的PCR产物作为m6ap。
(e-4)将(e-3)中得到的PCR产物m6ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR6a的多聚核苷酸。
(e-5)对(e-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(e-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR6a的多聚核苷酸的质粒pET-FcR6a，所述FcR6a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了6位点氨基酸置换的多肽。
(e-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR6a的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR6a的氨基酸序列示于序列号43、将编码前述FcR6a的多聚核苷酸的序列示于序列号44。需要说明的是，序列号43中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR6a的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号43中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(f)FcR6b从实施例3中已经明确的涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Glu120Val和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR6b。具体而言，对于编码(d)中制备的FcR5b的多聚核苷酸进行产生Glu120Val的突变导入，从而制备FcR6b。
(f-1)将(d)中制备的pET-FcR5b作为模板、将具有序列号22和序列号45(5’-GTGTTCAAAGTGGGGGATCCGATTCATCTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m6bF。
(f-2)将(d)中制备的pET-FcR5b作为模板、将具有序列号21和序列号46(5’-AATCGGATCCCCCACTTTGAACACCCACCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m6bR。
(f-3)将(f-1)和(f-2)中得到的2种PCR产物(m6bF、m6bR)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m6bF和m6bR连接。将得到的PCR产物作为m6bp。
(f-4)将(f-3)中得到的PCR产物m6bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR6b的多聚核苷酸。
(f-5)对(f-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(f-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR6b的多聚核苷酸的质粒pET-FcR6b，所述FcR6b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了6位点氨基酸置换的多肽。
(f-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR6b的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR6b的氨基酸序列示于序列号47、将编码前述FcR6b的多聚核苷酸的序列示于序列号48。需要说明的是，序列号47中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR6b的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外,序列号47中,分别地Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glu120Val的缬氨酸存在于第136位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(g)FcR7从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser、Glu120Val和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR7。具体而言，对于编码(e)中制备的FcR6a的多聚核苷酸进行产生Glu120Val的突变导入，从而制备FcR7。
(g-1)将(e)中制备的pET-FcR6a作为模板、将具有序列号22和序列号45中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m7F。
(g-2)将(e)中制备的pET-FcR6a作为模板、将具有序列号21和序列号46中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m7R。
(g-3)将(g-1)和(g-2)中得到的2种PCR产物(m7F、m7R)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m7F和m7R连接。将得到的PCR产物作为m7p。
(g-4)将(g-3)中得到的PCR产物m7p作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，进行与(a-4)同样的PCR。由此制备编码FcR7的多聚核苷酸。
(g-5)对(g-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(g-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR7的多聚核苷酸的质粒pET-FcR7，所述FcR7是对野生型Fc结合性蛋白质进行了7位点氨基酸置换的多肽。
(g-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR7的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR7的氨基酸序列示于序列号49、将编码前述FcR7的多聚核苷酸的序列示于序列号50。需要说明的是，序列号49中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR7的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号49中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glu120Val的缬氨酸存在于第136位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
实施例5改良Fc结合性蛋白质的热稳定性评价
(1)将表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质、实施例3中选择的突变型Fc结合性蛋白质(FcR2)和实施例4中制备的突变型的Fc结合性蛋白质(FcR3、FcR4、FcR5a、FcR5b、FcR6a、FcR6b、FcR7)的转化体分别接种于包含50μg/mL卡那霉素的3mL的2YT液体培养基中，在37℃进行一晩好氧地振荡培养，由此进行前培养。
(2)向添加了50μg/mL卡那霉素的20mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中接种前培养液200μL，37℃下好氧地进行振荡培养。
(3)在培养开始1.5小时之后，将培养温度变更为20℃，进行30分钟振荡培养。之后，以终浓度成为0.01mM的方式添加IPTG，接着在20℃下进行一晩好氧地振荡培养。
(4)培养结束后，通过离心分离进行集菌，使用BugBusterProteinextractionkit(TAKARABIOINC.制)制备蛋白质提取液。
(5)使用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的野生型Fc结合性蛋白质和突变型的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。此时，使用市售的FcγRIIIa的细胞外区域(R&DSystems公司：4325-FC-050)制备标准曲线，进行浓度测定。
(6)以各蛋白质的浓度成为5μg/mL的方式用包含150mM氯化钠的20mM的Tris缓冲液(pH7.4)进行稀释。对其进行等量分份，对一者使用热循环仪(EppendorfJapan制)在45℃下进行10分钟加热处理；对另一者不进行热处理。通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定前述热处理之后、或非热处理的蛋白质的抗体结合活性，将进行了热处理后的抗体结合活性除以没有进行热处理时的抗体结合活性，由此计算出残留活性。
将结果示于表8。此次评价的突变型的Fc结合性蛋白质(FcR2、FcR3、FcR4、FcR5a、FcR5b、FcR6a、FcR6b、FcR7)与野生型Fc结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型的Fc结合性蛋白质的热稳定性提高。
[表8]
实施例6改良Fc结合性蛋白质的酸稳定性评价
(1)按照与实施例5(1)至(5)同样的方法制备改良Fc结合性蛋白质。
(2)以各蛋白质的浓度成为30μg/mL的方式用包含150mM氯化钠的20mM的Tris缓冲液(pH7.4)进行稀释。将稀释的各Fc结合性蛋白质60μL和0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)120μL混合，在30℃下静置2小时。
(3)利用实施例3(4)中记载的ELISA法，对利用甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行酸处理后的蛋白质的抗体结合活性、和没有进行前述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性进行测定。之后，将进行了酸处理后的抗体结合活性除以没有进行酸处理时的抗体结合活性，由此计算出残留活性。
将结果示于表9。此次评价的突变型的Fc结合性蛋白质(FcR2、FcR3、FcR4、FcR5a、FcR5b、FcR6a、FcR6b、FcR7)与野生型Fc结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型的Fc结合性蛋白质的酸稳定性提高。
[表9]
实施例7进行了1位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的制备
对于实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中的序列号1的第27位的缬氨酸(Val)、第35位的酪氨酸(Tyr)和第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质，分别用下述的方法进行制备。
(A)将序列号1的第27位的缬氨酸(Val)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制备
(A-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号51(5’-CTGCCGAAAGCGNNKGTGTTTCTGGAACCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pF。
(A-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号52(5’-TTCCAGAAACACMNNCGCTTTCGGCAGATC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pR。
(A-3)将(A-1)和(A-2)中得到的2种PCR产物(27pF、27pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将27pF和27pR连接。将得到的PCR产物作为27p。
(A-4)将(A-3)中得到的PCR产物27p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码将序列号1的第27位的缬氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
(A-5)对(A-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(A-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Val27Gly(V27G)、Val27Lys(V27K)、Val27Thr(V27T)、Val27Ala(V27A)、Val27Trp(V27W)或Val27Arg(V27R)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
(B)将序列号1的第35位酪氨酸(Tyr)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制备
(B-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号53(5’-AACCGCAGTGGNNKCGCGTGCTGGAGAAAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pF。
(B-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号54(5’-AGCACGCGMNNCCACTGCGGTTCCAGAAAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pR。
(B-3)将(B-1)和(B-2)中得到的2种PCR产物(35pF、35pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将35pF和35pR连接。将得到的PCR产物作为35p。
(B-4)将(B-3)中得到的PCR产物35p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码将序列号1的第35位的酪氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
(B-5)对(B-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(B-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Tyr35Cys(Y35C)、Tyr35Asp(Y35D)、Tyr35Phe(Y35F)、Tyr35Gly(Y35G)、Tyr35Lys(Y35K)、Tyr35Leu(Y35L)、Tyr35Asn(Y35N)、Tyr35Pro(Y35P)、Tyr35Arg(Y35R)、Tyr35Ser(Y35S)、Tyr35Thr(Y35T)、Tyr35Val(Y35V)或Tyr35Trp(Y35W)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
(C)将序列号1的第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制备
(C-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号55(5’-GTGTTCAAAGAGNNKGATCCGATTCATCTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为121pF。
(C-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号56(5’-AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCACCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4的(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为121pR。
(C-3)将(C-1)和(C-2)中得到的2种PCR产物(121pF、121pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将121pF和121pR连接。将得到的PCR产物作为121p。
(C-4)将(C-3)中得到的PCR产物121p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行与实施例4(a-4)同样的PCR。由此，制备编码序列号1的第121位的谷氨酸置换成任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
(C-5)对(C-4)中得到的多聚核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)株。
(C-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Glu121Lys(E121K)、Glu121Pro(E121P)、Glu121Arg(E121R)、Glu121Gly(E121G)、Glu121His(E121H)或Glu121Val(E121V)氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸。
实施例8进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性评价
(1)对于表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质和实施例7中制备的进行了1个位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的转化体，按照与实施例3(1)和(2)同样的方法分别进行培养，使野生型Fc结合性蛋白质以及进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质表达。
(2)对于表达的进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质，按照与实施例3(4)中记载的ELISA法检查与抗体的结合活性。
将结果示于图2。通过将序列号1的第27位的缬氨酸置换成甘氨酸(V27G)、赖氨酸(V27K)、苏氨酸(V27T)、丙氨酸(V27A)、精氨酸(V27R)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高，另一方面，序列号1的第27位的Val置换成色氨酸(V27W)时，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
通过将序列号1的第35位的酪氨酸置换成天冬氨酸(Y35D)、苯丙氨酸(Y35F)、甘氨酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酰胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、苏氨酸(Y35T)、缬氨酸(Y35V)、色氨酸(Y35W)置换，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中，Y35D、Y35G、Y35K、Y35L、Y35N、Y35P、Y35S、Y35T、Y35W与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第35位的酪氨酸置换成半胱氨酸(Y35C)、精氨酸(Y35R)的情况下，为与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的抗体结合活性。
通过将序列号1的第121位的谷氨酸置换成赖氨酸(E121K)、精氨酸(E121R)、甘氨酸(E121G)、组氨酸(E121H)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中，E121G与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第121位的谷氨酸置换成缬氨酸(E121V)的情况下，是与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的抗体结合活性；置换成脯氨酸(E121P)的情况下，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
实施例9进行了1个氨基酸置换Fc结合性蛋白质的热稳定性评价
为了对实施例8中评价的进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的热稳定性进行比较，按照与实施例3(3)同样的方法进行热处理(45℃、10分钟)，计算出残留活性。
将结果示于图3。将序列号1的第35位的酪氨酸分别置换为天冬氨酸(Y35D)、甘氨酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酰胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、苏氨酸(Y35T)的Fc结合性蛋白质，以及将序列号1的第121位的谷氨酸置换成甘氨酸(E121G)的Fc结合性蛋白质，与野生型Fc结合性蛋白质相比较热稳定性大幅地提高。其中，Y35N、Y35P与野生型Fc结合性蛋白质相比较，热稳定性大幅地提高。
实施例10FcR5a的大量制备
(1)将实施例4(c)中制备的表达FcR5a的转化体接种至加入至2L的三角瓶的包含50μg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中，在37℃下好氧地振荡培养一晚，从而进行前培养。
(2)向包含葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.8L中接种(1)的培养液180mL，使用3L发酵罐(BiottCorporation制)进行主培养。设定温度30℃、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制pH，分别地，作为酸使用50％磷酸、作为碱使用14％氨水，溶解氧的控制通过使搅拌速度变化来进行控制，搅拌转速设定为下限500rpm、上限1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点，一边通过溶解氧(DO)进行控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。
(3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(OD600nm)到达约150时，将培养温度下降至25℃，确认到达设定温度之后，添加IPTG以使终浓度成为0.5mM，接着在25℃下继续培养。
(4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液在4℃下进行8000rpm、20分钟的离心分离，由此回收菌体。
(5)将(4)中回收的菌体的一部分用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)以成为5mL/1g(菌体)的方式悬浊，使用超声波发生装置(Insoneta201M(商品名)、久保田商事制)，在4℃下以约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4℃下进行2次20分钟、10000rpm的离心分离，回收上清。
(6)对(5)中得到的破碎液以终浓度成为20mM的方式添加咪唑之后，施加于预先用包含150mM的氯化钠和20mM咪唑的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的填充了NiSepharose6FastFlow(GEHealthcare制)50mL的XK26/20柱(GEHealthcare制)。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤之后，使用包含150mM氯化钠和0.5M咪唑的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱FcR5a。
(7)将(6)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的填充了IgG琼脂糖凝胶(GEHealthcare制)30mL的HR16/10柱(GEHealthcare制)。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱FcR5a。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1MTris盐酸缓冲液(pH7.0)而使pH恢复至中性附近。
实施例11FcR5a固定化凝胶的制备
(1)对实施例10制备的FcR5a使用超滤膜(MilliporeCorporation制：AmiconUltra15)进行浓缩·缓冲液交换，用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)浓缩至8.37mg/mL的浓度。
(2)使作为载体的亲水性乙烯基聚合物(TOSOHCORPORATION制：TOYOPEARL)的羟基与1,6-己二醇二缩水甘油基醚反应来制备环氧基TOYOPEARL凝胶。
(3)准备5根(2)中制备的加入了环氧基TOYOPEARL凝胶100μL的吸附柱(spincolumn；Bio-RadLaboratories,Inc.制)，用包含0.5M氯化钠的0.1M的硼酸缓冲液(pH9.0)0.5mL洗涤3次。
(4)将(1)中制备的FcR5a溶液0.3mL与包含0.5M氯化钠的0.1M的硼酸缓冲液(pH9.0)0.45mL混合，将混合溶液分别添加至(3)中记载的填充了凝胶的吸附柱，35℃下振荡3小时。
(5)对向凝胶中加入的FcR5a溶液与包含0.5M氯化钠的0.1M的硼酸缓冲液的混合溶液进行回收之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)0.2mL洗涤3次。之后，通过用包含150mM氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涤3次使pH恢复至中性附近，从而制备FcR5a固定化凝胶0.5mL。
对于(5)中回收的溶液以及洗涤液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计算出固定化于凝胶的FcR5a的量，从而计算出固定化率，添加的FcR5a的33.7％固定化于凝胶。
实施例12用FcR5a固定化凝胶的抗体分离
(1)将实施例11中制备的FcR5a固定化凝胶0.5mL填充于HR16/5柱(GEHealthcare制)，与AKTAprimeplus(GEHealthcare制)相连接。之后，用包含150mM氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)进行平衡化。
(2)使包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)以0.1mL的流速流动，用包含150mM氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)施加制备成1mg/mL的人IgG1(Sigma公司制：I5154-1MG)溶液0.5mL，使人IgG1吸附于FcR5a固定化凝胶。之后，通过流过20mM乙酸缓冲液(pH5.0)进行平衡化，利用20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)带来的pH梯度对吸附的人IgG1进行洗脱。洗脱的人IgG1每0.5mL回收级分。
将人IgG1的洗脱模式和回收的级分示于图4中。回收的洗脱级分中，将级分13(Fr13)和级分14(Fr14)混合而成的物质称为级分A(FrA)；将级分16(Fr16)和级分17(Fr17)混合而成的物质称为级分B(FrB)。
实施例13分离抗体的糖链结构解析
(1)对实施例12中使用的纯化前的人IgG1和洗脱级分(FrA、FrB)利用100℃、10分钟的热处理进行变性之后，用糖酰胺酶A/胃蛋白酶和链霉蛋白酶依次进行处理，经过利用凝胶过滤法的纯化操作，取得糖链级分。
(2)将(1)中得到的糖链用蒸发器进行浓缩·干燥之后，在乙酸溶剂下使2-氨基吡啶、接着使二甲胺硼烷依次作用而制成荧光标记化糖链，利用凝胶过滤法进行纯化。
(3)对于(2)中得到的荧光标记化糖链用阴离子交换柱(TSKgelDEAE-5PW、φ7.5mm×7.5cm：TOSOHCORPORATION制)分离成中性糖链级分和单唾液酸苷化糖链级分。
(4)对于(3)中得到的中性糖链级分和单唾液酸苷化糖链级分使用ODS柱分离成各个糖链。通过MALDI-TOF-MS分析得到分离的糖链的分子量信息之后，对照ODS柱色谱的保留时间(retentiontime)，匹配糖链结构。
将中性糖链的组成比示于表10中，将单唾液酸苷化糖链的组成比示于表11中。另外，将匹配的糖链结构(N1至N8以及M1至M2)示于图5。由表10所示的结果可知，具有糖链结构N2和N7的抗体在纯化前以及在FrB中被检测出，但没有从FrA中被检测到。即，具有前述2种糖链结构(图5的N2和N7)的抗体在作为早洗脱级分的FrA中没有被检测出，而在作为迟洗脱级分的FrB中被检测出，因此表明与具有其他糖链结构的抗体相比较，与FcR5a固定化凝胶强结合。由以上的结果可知，作为本发明的吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能够根据抗体所具有的糖链结构的差异而分离出抗体。
[表10]
[表11]
实施例14用FcR5a固定化凝胶的抗体纯化
使用实施例11中制备的FcR5a固定化凝胶进行人IgG1和人IgG3的纯化。
(1)用与实施例11同样的方法制备FcR5a固定化凝胶0.2mL。将制备的FcR5a固定化凝胶0.1mL填充于吸附柱。
(2)将(1)中制备的填充了FcR5a固定化凝胶的柱用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涤3次。
(3)对作为动物细胞用培养基的DMEM/F12培养基(ThermoFisherScientificInc.制)中添加了10％胎牛血清(FCS)的培养基，添加人IgG1(Sigma-AldrichCo.LLC.制：I5154-1MG)或人IgG3(Sigma-AldrichCo.LLC.制：I4639-1MG)以成为0.3mg/mL，从而制备模拟培养液。
(4)对(2)中洗涤的柱加入(3)中制备的模拟培养液0.4mL，25℃下进行2小时振荡。
(5)去除模拟培养液，用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涤4次之后，用500μL的0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱，每100μL回收级分。
(6)对模拟培养液、洗脱级分分别添加2×样品缓冲液(包含2(w/v)％十二烷基硫酸钠、6(w/v)％β-巯基乙醇、10(w/v)％甘油和0.005(w/v)％溴酚蓝的50mM的Tris盐酸缓冲液(pH6.8))进行加热处理。之后，对处理的样品用使用了5至20％梯度SDS-PAGE用凝胶(ATTOCorporation.制)的电泳进行分离。需要说明的是，作为比较，对于模拟培养液中添加的人IgG1和人IgG3(浓度：0.2mg/mL)也进行同样的处理，用SDS-PAGE进行分析。
将包含人IgG1或人IgG3的洗脱级分的利用SDS-PAGE的分析结果示于图6。对添加了人IgG1的模拟培养液进行纯化而得到的包含人IgG1的洗脱级分，显示出与模拟培养液中所添加的人IgG1同样的位置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所以能够确认对人IgG1进行了高纯度地纯化(图6的(A))。另外，对添加了人IgG3的模拟培养液进行纯化而得到的包含人IgG3的洗脱级分，显示出与模拟培养液中所添加的人IgG3同样的位置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所以能够确认对人IgG3进行了高纯度地纯化(图6的(B))。由这些结果可知，作为本发明吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能够从动物细胞用的培养液中纯化人IgG1和人IgG3。
实施例15去除了糖链的人IgG1的制备
用以下所示的方法进行从人IgG1中N型糖链的去除。
(1)以人IgG1(Fitzgerald公司制：31-AI17)的浓度成为3mg/mL的方式用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行稀释。
(2)向(1)的稀释液100μL中加入1M的Tris盐酸缓冲液(pH8.6)100μL，加入N-glycosidaseF(500mU/μL(TAKARABIOINC.制：4450)10μL之后，在37℃下静置24小时，从而去除IgG1的N型糖链。
(3)对预先用包含150mM氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的填充了ToyopearlAF-rProteinA-650F(TOSOHCORPORATION制：22803)100μL的开放柱(Bio-RadLaboratories,Inc.制)施加(2)的处理液。
(4)用500μL的包含150mM氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)洗涤3次之后，用100μL的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱7次，由此对去除了N型糖链的人IgG1(以下，简单地称为去除了糖链的人IgG1)进行纯化。需要说明的是，对该洗脱液通过加入洗脱液的1/4量的1M的Tris盐酸缓冲液(pH8.0)进行中和。
(5)对于(4)中得到的去除了糖链的人IgG1溶液添加等量的样品缓冲液(包含2(w/v)％十二烷基硫酸钠、6(w/v)％β-巯基乙醇、10(w/v)％甘油和0.005(w/v)％溴酚蓝的50mM的Tris盐酸缓冲液(pH6.8))进行加热处理，对去除了糖链的人IgG1进行还原处理。
(6)利用使用了5至20％梯度SDS-PAGE用凝胶(ATTOCorporation.制)的电泳对人IgG1进行分离。需要说明的是，作为比较，对于没有进行糖链处理的人IgG1(以下，称为有糖链的人IgG1)水溶液(浓度：0.5mg/mL)也进行与(5)的记载同样的还原处理，用SDS-PAGE进行分离。
将结果示于图7。通过SDS-PAGE能够确认的是，由于去除了糖链的人IgG1的重链被去除了N型糖链，因此与有糖链的人IgG1的重链相比较，变为低分子量的(参照图7的泳道(2))。即，可以确认，用本实施例的方法能够制备去除了N型糖链的人IgG1。
实施例16人FcγRIIIa的大量制备
(1)将能够表达实施例1中得到的人FcγRIIIa的转化体接种于加入至2L的三角瓶中的包含50μg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下好氧地振荡培养一晩，由此进行前培养。
(2)向包含葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.8L中接种(1)的培养液180mL，使用3L发酵罐进行主培养。设定温度30℃、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制pH，分别地，作为酸使用50％磷酸、作为碱使用14％氨水，溶解氧的控制通过使搅拌速度变化来进行控制，搅拌转速设定为下限500rpm、上限1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点，一边通过溶解氧(DO)进行控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。
(3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(OD600nm)到达约150时，将培养温度下降至25℃，确认到达设定温度之后，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以使终浓度成为0.5mM，接着在25℃下继续培养。
(4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液进行8000rpm、20分钟的离心分离，由此回收菌体。
(5)将(4)中回收的菌体用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)以成为5mL/1g(菌体)的方式悬浊，使用超声波发生装置(Insoneta201M(商品名)、久保田商事制)，在4℃下以约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4℃下进行2次20分钟、10000rpm的离心分离，回收上清。
(6)对(5)中得到的破碎液以终浓度成为20mM的方式添加咪唑之后，施加于预先用包含150mM的氯化钠和20mM咪唑的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的填充了NiSepharose6FastFlow(GEHealthcare制)50mL的XK26/20柱(GEHealthcare制)。
(7)用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤之后，使用包含150mM氯化钠和0.5M咪唑的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱人FcγRIIIa。
(8)将(7)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的填充了IgG琼脂糖凝胶(GEHealthcare制)10mL的HR16/10柱(GEHealthcare制)。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱人FcγRIIIa。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)而使pH恢复至中性附近。
实施例17对人FcγRIIIa的抗体的结合性测定
(1)对实施例16中制备的人FcγRIIIa用磷酸缓冲液(包含137mM的NaCl、8.1M的Na2HPO4、2.68mM的KCl和1.47mM的KH2PO4的pH7.4的缓冲液)进行透析来进行缓冲液交换，由280nm的吸光度测定人FcγRIIIa的浓度。
(2)将(1)中测定了浓度的人FcγRIIIa用20mM的乙酸缓冲液(pH5.5)稀释至10μg/mL之后，使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare制)固定化于传感器芯片(SensorChip)CM5(GEHealthcare制)，使用BiacoreT-100(GEHealthcare制)对人FcγRIIIa固定化量进行测定。结果，人FcγRIIIa的固定化量为488.2RU(1RU＝1pg/mm2)。另外，对于蛋白A(ProteNovaCo.,Ltd.制)也同样地，用20mM的乙酸缓冲液(pH5.5)稀释至10μg/mL，固定化于CM5(GEHealthcare制)。用BiacoreT-100测定固定化量的结果，固定化量为290.0RU。
(3)将具有糖链的人IgG1以及实施例15中制备的去除了糖链的人IgG1用HBS-EP(+)(包含10mM的HEPES、150mM的NaCl、3mM的EDTA和0.005(v/v)％的SurfactantP20(GEHealthcare制)的pH7.4的溶液)稀释至128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL。
(4)(2)中制备的蛋白质固定化芯片中，人FcγRIIIa固定化芯片的情况下，使4μg/mL至128μg/mL的具有糖链的人IgG1或去除了糖链的人IgG1以流速30μL/分钟流动；蛋白A固定化芯片的情况下，使1μg/mL至16μg/mL的具有糖链的人IgG1或去除了糖链的人IgG1以流速30μL/分钟流动，使人IgG1与固定化于芯片的蛋白质结合之后，用BiacoreT-100以接触时间210秒、解离时间400秒的条件进行测定，从而测定人IgG1与固定化于芯片的蛋白质的结合性。
将测定结果示于图8。可知，人FcγRIIIa对于具有糖链的人IgG1具有结合性，而对于去除了糖链的人IgG1则非常难以结合(参照图8(A))。即，由该结果可知，人FcγRIIIa识别由糖链对于抗体的附加导致的差异。另一方面，可知蛋白A无论糖链的有/无而对人IgG1具有同样的结合性(参照图8(B))。
实施例18人FcγRIIIa固定化凝胶的制备
(1)对实施例16中制备的人FcγRIIIa使用超滤膜(MilliporeCorporation制：AmiconUltra15)进行浓缩·缓冲液交换，用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)浓缩至2.6mg/mL的浓度为止。
(2)使作为载体的亲水性乙烯基聚合物(TOSOHCORPORATION制：TOYOPEARL)的羟基与1,6-己二醇二缩水甘油基醚反应来制备环氧基TOYOPEARL凝胶。
(3)将(2)中制备的环氧基TOYOPEARL凝胶70μL加入至吸附柱(Bio-RadLaboratories,Inc.)，用包含0.5M氯化钠的0.1M的硼酸缓冲液(pH9.0)0.5mL洗涤3次。
(4)将(1)中制备的人FcγRIIIa溶液0.4mL与包含0.5M氯化钠的0.1M的硼酸缓冲液(pH9.0)0.6mL混合，将该混合溶液添加至(2)的凝胶中，35℃下进行3小时振荡。
(5)将(4)中制备的凝胶用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)0.2mL洗涤3次之后，用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涤3次，由此使pH恢复至中性附近，从而制备人FcγRIIIa固定化凝胶0.2mL。
(6)对向(2)的凝胶中所添加的溶液和洗涤液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计算出固定化于凝胶的人FcγRIIIa量，从而计算固定化率，结果添加的人FcγRIIIa的84％被固定化于凝胶。
实施例19使用了人FcγRIIIa固定化凝胶的抗体分离
(1)将实施例18中制备的人FcγRIIIa固定化凝胶填充于HR16/5柱(GEHealthcare制)，将该柱与液相色谱法装置AKTAprime(GEHealthcare制)连接。
(2)对(1)中制备的柱用包含150mM氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行平衡化，以流速0.1mL/min添加0.1mL人IgG1(Fitzgerald公司制：31-AI17)或实施例2中制备的去除了糖链的人IgG1(溶液浓度均为1mg/mL)。用平衡化中所使用的缓冲液进行洗涤之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)进行洗脱。
将结果示于图9。可以确认，尽管流过了等量的IgG1，去除了糖链的人IgG1(参照图9的(2))与具有糖链的人IgG1(参照图9的(1))相比较，没有吸附于凝胶而通过的抗体量多。另外，具有糖链的人IgG1中添加了0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.5)时，抗体被洗脱了(参照图9的(1))，而去除了糖链的人IgG1几乎没有吸附于凝胶，所以抗体没有被洗脱(参照图9的(2))。即，将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的吸附剂具有能够特异地吸附具有糖链的抗体的性能，通过利用该性能能够识别糖链有无附加于抗体。
产业上的可利用性
本发明的吸附剂特异地吸附具有糖链的抗体，因此能够高纯度地分离·纯化具有糖链的抗体。因此，本发明的吸附剂可应用于抗体药物制造和品质管理。

Claims (19)

1.一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生以下的(1)至(40)中至少任一种氨基酸置换；
(1)序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸
(2)序列号1的第27位的缬氨酸置换为谷氨酸
(3)序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸
(4)序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(5)序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者
(6)序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸
(7)序列号1的第48位的谷氨酰胺置换为组氨酸或亮氨酸
(8)序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸
(9)序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸
(10)序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
(11)序列号1的第56位的天冬酰胺置换为苏氨酸
(12)序列号1的第59位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(13)序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(14)序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸
(15)序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸
(16)序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸
(17)序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者
(18)序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酰胺
(19)序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸
(20)序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或缬氨酸
(21)序列号1的第90位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(22)序列号1的第92位的天冬酰胺置换为丝氨酸
(23)序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸
(24)序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸
(25)序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(26)序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酰胺
(27)序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸
(28)序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(29)序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸
(30)序列号1的第120位的谷氨酸置换为缬氨酸
(31)序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
(32)序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸
(33)序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸
(34)序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸
(35)序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸
(36)序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸
(37)序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(38)序列号1的第180位的天冬酰胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者
(39)序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸
(40)序列号1的第192位的谷氨酰胺置换为赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。
3.根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺或脯氨酸。
4.根据权利要求3所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且分别地、该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少第27位的缬氨酸置换为谷氨酸、第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺。
5.根据权利要求4所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸残基。
6.根据权利要求5所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生以下的(41)至(44)中至少任一个氨基酸置换；(41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，(42)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸，(43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸，(44)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
8.一种吸附剂，其是将权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的。
9.一种抗体的纯化方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。
10.一种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括：
将包含具有糖链的抗体的溶液添加至权利要求8所述的吸附剂中并使该具有糖链的抗体吸附于该吸附剂的工序；和
使用洗脱液将吸附于所述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。
11.一种识别方法，其通过使用权利要求8所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链结构的差异。
12.一种抗体，其是用权利要求9或10所述的纯化方法得到的。
13.一种糖链的分离方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。
14.一种糖链，其是用权利要求13所述的分离方法得到的。
15.一种多聚核苷酸，其编码权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质。
16.一种表达载体，其包含权利要求15所述的多聚核苷酸。
17.一种转化体，其是以权利要求16所述的表达载体转化宿主而得到的。
18.根据权利要求17所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
19.一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对权利要求17或18所述的转化体进行培养而使Fc结合性蛋白质表达，从培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
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