CN109266674B - 一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段tspan12-lel制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，公开一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒中构建重组表达质粒，然后将质粒转化至表达宿主中，诱导表达TSPAN12蛋白LEL片段，最后纯化得到TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。本发明构建的蛋白表达体系提供了原核表达人源TSPAN12‑LEL的重组表达质粒构建方法，并将重组表达质粒转入表达宿主中构建了表达TSPAN12‑LEL的工程菌，通过诱导表达和纯化，获得高纯度可溶的TSPAN12‑LEL片段。本发明所采用的大肠杆菌表达系统具有表达效率高、表达量大、成本低等特点，并且可以实现TSPAN12‑LEL片段的高纯度可溶表达。

Description

一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段TSPAN12-LEL 制备方法

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，涉及一种人源蛋白质的表达和纯化方法，特别涉及一种人源四次跨膜超家族蛋白12(Tetraspanin 12，TSPAN12)的大胞外片段(large extracellular loop，LEL)制备方法，简称TSPAN12-LEL制备方法，是人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段结构域的克隆和可溶表达。包括TSPAN12-LEL的表达和纯化方法。

背景技术

TSPAN12是四次跨膜超家族蛋白(TransMembrane 4Super Family，TM4SF)的成员之一，含4个跨膜结构域，将自身分为两个大小不等的胞外片段和一个胞内环及胞质中的N和C末端。TSPAN12全长共305个氨基酸，其中小胞外片段为26个氨基酸，大胞外片段有103个氨基酸，大胞外片段约占全长蛋白的三分之一。

TSPAN12是Norrin/β-catenin信号通路的成员之一，在Norrin/β-catenin信号通路中，细胞膜上的卷曲蛋白4(Frizzled 4，FZD4)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)共同组成受体，Norrin为细胞外的配体，与FZD4和LRP5结合，激活下游信号通路。TSPAN12同样位于细胞膜上，与FZD4和LRP5相互作用，增强Norrin/β-catenin信号通路的活性。

TSPAN12在视网膜血管发育中发挥重要作用，而TSPAN12基因突变与常染色体显性遗传或隐性遗传的家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Familial ExudativeVitreoRetinopathy，FEVR)有关。TSPAN12LEL结构域内发生的许多突变同样会导致FEVR，如c.413A>G(p.Y138C)、c.419T>A(p.L140X)、c.438-439insT(p.T147YfsX12)、c.464G>C(p.R155T)、c.479G>A(p.C160Y)、c.542G>T(p.C181F)、c.562G>C(p.G188R)、c.566G>A(p.C189Y)、c.565T>C(p.C189R)、c.601delC(p.L201FfsX14)和c.629T>G(p.M210R)。

研究表明，TSPAN12通过LEL结构域与FZD4相互作用从而锚定至细胞膜上，仅需要LEL结构域就足以与NDP相互作用，而且TSPAN12的LEL结构域能修复由于NDP和FZD4基因突变导致的Norrin/β-catenin信号通路减弱。经文献检索和市场调研，目前还没有TSPAN12的LEL片段蛋白销售，也没有文献报道其制备方法。因此，表达和纯化TSPAN12的LEL片段有助于进一步研究TSPAN12与LRP5和FZD4相互作用的分子机制，为以Norrin/β-catenin信号通路为靶点新药开发奠定基础。

现在市场上销售的科研使用的TSPAN家族其他蛋白的价格为3980元/50μg，导致相关试验开展的成本很高。如果试验规模较大或者需要重复试验，那么试验原材料成本将会飙升到天文数字。进而导致部分课题研究开展困难，受限于原料获得成本，不得不压缩实验设计的规模大小，影响试验研究成果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中无法制备可溶高纯度的TSPAN12LEL片段的难度，提供一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒中构建重组表达质粒，然后将质粒转化至表达宿主(如大肠杆菌)中，诱导表达TSPAN12蛋白LEL片段，最后纯化得到TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。

本发明TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，通过将编码序列重组到质粒当中构建重组表达质粒，利用相应的重组表达质粒在大肠杆菌中增殖，诱导表达获得相应的TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。通过本发明制备方法可以低成本、高效率制备得到可溶、高纯度TSPAN12蛋白LEL片段，满足相关科研实验需要，促进家族性渗出性玻璃体视网膜病变的研究，为治疗相关基因遗传疾病的研究提供基础原材料。

本发明TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白是通过构建重组表达质粒，将质粒转化至大肠杆菌中，通过诱导表达并进一步纯化所得。

由于人源蛋白在大肠杆菌中表达容易出现包涵体，难以可溶表达，利用可溶蛋白与目的蛋白融合表达来增加目的蛋白的可溶性和稳定性。麦芽糖结合蛋白(MaltoseBinding Protein，MBP)是一种融合蛋白标签，有助于目的蛋白的可溶表达，并且可以作为一种亲和层析的标签，利用交联直链淀粉树脂亲和纯化目的蛋白。

同样的，谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase，GST)也是一种可以帮助名单蛋白可溶表达的蛋白标签，通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化目的蛋白。

本发明通过将TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒当中，经过大肠杆菌转化表达，并结合异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，实现相应的转化表达，获得含有TSPAN12蛋白LEL片段的产物。最后通过离心分离、亲和层析柱分离、离子交换柱分离得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段(MBP-TSPAN12LEL)或带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段(GST-TSPAN12LEL)。

因此本发明提供一种制备结合水溶性片段的TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，使得TPSPAN12蛋白LEL片段能够更好的制备形成溶于水的蛋白片段。

对于蛋白质的制备和表达，蛋白质分子中二硫键的形成对于蛋白质的正确折叠和三级结构稳定性至关重要。不能形成二硫键或者形成不正确的二硫键，会导致蛋白质分子错误折叠。TSPAN12-LEL片段中有6个半胱氨酸，理论上能形成3对二硫键。但大肠杆菌菌体内为还原性环境，不利于蛋白质的二硫键形成。DsbC是大肠杆菌二硫键异构酶家族的6个成员之一，其C末端结构域含有Cys-XX-Cys催化基序，能帮助蛋白质中不正确的二硫键打开，再重新形成正确的二硫键。本发明将DsbC的编码序列与TSPAN12LEL编码序列克隆至同一个质粒中进行共同表达，促进TSPAN12LEL片段的正确表达。

通过本发明提供TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，利用大肠杆菌宿主转化质粒表达以及纯化处理，获得高表达、高纯度TSPAN12蛋白LEL片段的方法，有助于TSPAN12蛋白的深入研究。

进一步，TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括重组表达质粒的构建、表达工程菌的构建、诱导表达和纯化；具体步骤如下：

①克隆TSPAN12的LEL片段的编码序列，限制性内切酶酶切后插入到表达载体的多克隆位点中，经测序验证获得TSPAN12-LEL重组表达质粒；

②将重组表达质粒转化至表达宿主中，通过筛选能可溶表达TSPAN12的LEL片段的菌株，获得TSPAN12-LEL表达工程菌；

③将TSPAN12-LEL表达工程菌用培养基培养后，加入诱导剂诱导表达TSPAN12的LEL片段，表达结束后收获TSPAN12-LEL融合蛋白；

④将收获的TSPAN12-LEL融合蛋蛋白用亲和层析和离子交换层析的方法纯化，得到高纯度、可溶的TSPAN12-LEL融合蛋白。

进一步，表达宿主可以选用大肠杆菌的BL21、Origami B或Rosetta菌株。

进一步，带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，更具体的来说，包括以下步骤：

(1)将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；

(2)将步骤(1)扩增出的片段和包含有麦芽糖结合蛋白编码序列的pMal质粒用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h；

(3)将步骤(2)连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒pMal-TSPAN12LEL；

(4)将步骤(3)得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌落用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；

(5)向步骤(4)所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，优选30min，收集蛋白上清液；

(6)将步骤(5)所得蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用麦芽糖溶液洗脱层析柱，得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，MBP-TSPAN12LEL；

(7)将步骤(6)所得的MBP-TSPAN12LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有MBP-TSPAN12LEL的流出液，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL。

进一步地，在步骤(3)和步骤(4)之间还可以包括步骤(8)至步骤(13)：

(8)将步骤(3)得到的含有MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pMal-TSPAN12LEL，经PCR扩增出MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列MBP-TSPAN12LEL；

(9)将步骤(8)扩增出的MBP-TSPAN12LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h；

(10)将步骤(9)的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证MBP-TSPAN12LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带MBP标签的TSPAN12LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL；

(11)将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列；

(12)将步骤(11)扩增出的DsbC的编码序列和步骤(10)得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h；

(13)将步骤(12)的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12LEL片段的重组表达质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL-DsbC；然后将此重组表达质粒pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL-DsbC应用于步骤(4)中替代原步骤(3)重组表达质粒转化至表达宿主中。(即，将步骤13制备的重组表达质粒转化至表达宿主)。

进一步，表达载体质粒选用pMal-c2x、pMal-c4x或pMal-c5x质粒。相应的上述方案中的pMal-c2x载体质粒可以使用其余几种载体质粒进行替换，进行相同的重组质粒操作。

进一步，步骤(1)，设计带有BamH I酶切位点的正向引物和HindIII酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：CGCGGATCCGAACAGGAACTTATGGTTCCAGT，所述反向引物可以举例选用：CCGAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA。本领域技术人员可以根据实际PCR扩增需要进行相应的设计PCR引物并进行引物制备。

进一步，步骤(2)，用限制性内切酶BamH I和HindIII于37℃酶切4-18h。

进一步，步骤(8)，设计带有Nco I酶切位点的正向引物和HindIII酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：CATGCCATGGGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGT，所述反向引物可以举例选用：CCCAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA。

进一步，步骤(11)，设计带有Nde I酶切位点的正向引物和XhoI酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：GGAATTCCATATGGATGACGCGGCAATTCAACA，所述反向引物可以举例选用：CCGCTCGAGTTATTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGG。

进一步，带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，更具体的来说，包括以下步骤：

(一)将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；

(二)将步骤(一)扩增出的片段和包含有谷胱甘肽巯基转移酶编码序列的pGEX质粒用限制性内切酶BamHI和SalI酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h；

(三)将步骤(二)连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pGEX质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒pGEX-TSPAN12LEL；

(四)将步骤(三)得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；

(五)向步骤(四)所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，优选30min，收集蛋白上清液；

(六)将步骤(五)所得蛋白上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶填充的层析柱结合后，用谷胱甘肽溶液洗脱层析柱，得到带GST标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，GST-TSPAN12LEL；

(七)将步骤(六)所得的GST-TSPAN12LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有GST-TSPAN12LEL的流出液，得到高纯度的GST-TSPAN12LEL。

进一步地，在步骤(三)和步骤(四)之间还可以包括步骤(八)至步骤(十三)：

(八)将步骤(三)得到的含有GST和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pGEX-TSPAN12LEL，经PCR扩增出GST和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列GST-TSPAN12LEL。

(九)将步骤(八)扩增出的GST-TSPAN12LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h。

(十)将步骤(九)的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证GST-TSPAN12LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带GST标签的TSPAN12LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-GST-TSPAN12LEL。

(十一)将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列。

(十二)将步骤(十一)扩增出的DsbC的编码序列和步骤(十)得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4～16h。

(十三)将步骤(十二)的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12LEL片段的重组表达质粒，pETDuet-1-GST-TSPAN12LEL-DsbC。然后，将此重组表达质粒pETDuet-1-GST-TSPAN12LEL-DsbC应用于步骤(四)中替代原步骤(三)重组表达质粒转化至表达宿主中。

进一步，构建重组表达载体质粒选用pMal-c2x、pMal-c4x、pMal-c5x、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3或pETDuet-1质粒。

进一步，表达载体质粒选用pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、或pGEX-6P-3质粒。相应的上述方案中的pMal-c2x载体质粒可以使用其余几种载体质粒进行替换，进行相同的重组质粒操作。

进一步，所述克隆菌株为大肠杆菌的DH5α或TOP10菌株。

进一步，步骤(一)，设计带有BamH I酶切位点的正向引物和SalI酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：CGCGGATCCGAACAGGAACTTATGGTTCCAGT，所述反向引物可以举例选用：ACGCGTCGACTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA。本领域技术人员可以根据实际PCR扩增需要进行相应的设计PCR引物并进行引物制备。

进一步，步骤(二)，用限制性内切酶BamH I和SalI于37℃酶切4-18h。

进一步，步骤(八)，设计带有Nco I酶切位点的正向引物和HindIII酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：CATGCCATGGGCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGA，所述反向引物可以举例选用：CCCAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA。

进一步，步骤(十一)，设计带有Nde I酶切位点的正向引物和XhoI酶切位点的反向引物，用PrimerSTAR作为DNA聚合酶进行PCR扩增。

优选地，所述正向引物可以举例选用：GGAATTCCATATGGATGACGCGGCAATTCAACA，所述反向引物可以举例选用：CCGCTCGAGTTATTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGG。

上述更具体的制备方法中制备步骤序号(1)(2)…(一)(二)和前述制备方法序号①②…相互独立，为了方便描述分别采用了不同的序号编排。各个序号(1)……(13)、(一)……(十三)描述并不代表实际操作过程中的绝对顺应，应当结合重组质粒制备和表达过程中进行相应的调整顺序加以实现。

进一步，步骤(10)和步骤(十)，采用大于7500×g的离心力进行离心处理10-30min，收集菌体。优选地，离心采用7548×g进行离心处理15min，收集菌体。

进一步，步骤(10)和步骤(十)，表达宿主可以选用大肠杆菌的BL21、Origami B或Rosetta菌株。

进一步，步骤(10)和步骤(十)，加入IPTG的终浓度是指加入异丙基硫代半乳糖苷以后，相应的IPTG的浓度。原来培养基(如1000mL)中不含IPTG，将IPTG配成100～1000mmol/L储备液，加1mL IPTG储备液至1000mL的培养基中(1ml×(100～1000mmol/L)÷1000mL＝0.1～1.0mmol/L)。或者可以理解为：加入IPTG至浓度为0.1～1.0mmol/L进行诱导表达。

进一步，步骤(11)和步骤(十一)，超声结束后用高速冷冻离心机，采用大于13000×g离心力进行离心处理20-40min，收集蛋白上清液。优选地，超声结束后用高速冷冻离心机13000×g离心30min收集蛋白上清液。

进一步，步骤(11)和步骤(十一)，所述的缓冲盐溶液pH为5.5～9.0。优选地，所述缓冲盐是pH＝7.4，含有20mmol/L Tris-HCl和100-500mmol/L NaCl的缓冲盐。

进一步，步骤(11)和步骤(十一)，超声破碎仪中以20-60％功率超声10-50min。优选地超声破碎仪以30％的功率超声20-30min。优选地，所述超声破碎仪额定功率100-500w，优选100-300w。

进一步，步骤(12)，用10～20mmol/L麦芽糖溶液洗脱层析柱，得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段(MBP-TSPAN12LEL)。

进一步，步骤(十二)，用10～20mmol/L还原性谷胱甘肽溶液洗脱层析柱，得到带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段(GST-TSPAN12LEL)。

进一步，步骤(13)和步骤(十三)，所述的含有NaCl的缓冲盐溶液为pH为5.5～9.0。优选地，含有NaCl的缓冲盐溶液是pH＝8.0，含有25mmol/LTris-HCl，0.05-1mol/L NaCl的缓冲盐溶液。

进一步，步骤(13)和步骤(十三)，所述阴离子交换柱为Source15Q、ResourceQ或MonoQ柱。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明方法可以获得可溶、高表达、高纯度TSPAN12蛋白LEL片段，有助于TSPAN12蛋白的深入研究。本发明方法采用原核表达系统制备TSPAN12蛋白LEL片段，生产成本低、表达量高。制备好表达工程菌后，可以快速增殖进行大量表达，制备得到大量的TSPAN12蛋白LEL片段产物。

2、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Familial Exudative Vitreoretinopathy，FEVR)是一种具有遗传异质性的眼部疾病，确诊后目前尚无有效的治疗手段，这与FEVR发病的分子机制研究不深入有关。TSPAN12基因的突变与FEVR有显著关联，通过本发明方法制备大量TSPAN12蛋白LEL片段产物，可以用于家族性渗出性玻璃体视网膜病变的相关研究深入，有助于人们对FEVR的发病机理的认识，而表达制备TSPAN12的细胞外大片段将丰富人们研究的手段和纬度，并有可能将其制备成治疗FEVR的一种蛋白药物。

3、本发明制备方法只需要1L大肠杆菌培养液可以获得1000μg的蛋白。若将相应的蛋白开发成供科研使用的试剂，1L大肠杆菌培养液制备的蛋白价值就可以达到79600元(以市场TSPAN家族其他蛋白价格计算)，而1L大肠杆菌培养液的成本仅需10元。大肠杆菌表达系统容易放大，生产成本低，如果后期能够与厂家合作转化为产品批量生产销售，预期具有较好的市场应用前景和经济价值。

附图说明：

图1：MBP-TSPAN12LEL表达和纯化流程图。

图2a：pMal-TSPAN12LEL重组表达质粒示意图。

图2b：pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL重组表达质粒示意图。

图2c：pGEX-TSPAN12LEL重组表达质粒示意图。

图2d：pETDuet-1-GST-TSPAN12LEL-DsbC重组表达质粒示意图。

图3：交联直链淀粉树脂纯化MBP-TSPAN12LEL(图中所有泳道均为亲和层析后得到的MBP-TSPAN12LEL粗提品)。

图4a：阴离子交换层析纯化MBP-TSPAN12LEL：阴离子交换层析洗脱示意图。

图4b：阴离子交换层析纯化MBP-TSPAN12LEL：图4a中peak1的SDS-PAGE电泳图谱，1号泳道为高纯度MBP-TSPAN12LEL。

图5：高纯度MBP-TSPAN12LEL的SDS-PAGE电泳图谱。

图6：对比例中所表达的TSPAN12LEL的SDS-PAGE电泳图谱(TSPAN12LEL均出现在沉淀中，不可溶)。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，应该理解的是下面这些实施例只是举例说明本发明，并非以任何形式限制本发明的范围，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所使用的TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列购买自OriGene公司，限制性内切酶和交联直链淀粉树脂购自NEB公司，T4连接酶购自Takara公司，谷胱甘肽琼脂糖凝胶、Source 15Q和ResourceQ阴离子交换柱够自GE公司，pET22b、pET40b、pETDuet-1、pGEX-6P-1和pMal-c2x购自长沙优宝生物科技有限公司，大肠杆菌菌株DH5α和BL21购自北京全式金生物技术有限公司，OrigamiB菌株购自成都传世科为生物技术有限公司，其他未作特别说明的试剂，均购自上海生工生物工程有限公司。

<实施例1>

以本实验室保存的含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒为模板，加入带有BamH I酶切位点的正向引物和带有HindIII酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pMal-c2x质粒用限制性内切酶BamH I和HindIII于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal-c2x质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒(pMal-TSPAN12LEL)。

以pMal-TSPAN12LEL为模板，加入带有NcoI酶切位点的正向引物和带有HindIII酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶NcoI和HindIII于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点(multiple cloning site 1，MCS1)，从而获得pETDuet-MBP-TSPAN12LEL的重组质粒。

以含有二硫键异构酶C(disulfide bond isomerase，DsbC)编码序列的pET40b质粒为模板，加入带有Nde I酶切位点的正向引物和带有XhoI酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出DsbC的编码序列。将扩增出的DsbC片段和pETDuet-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和XhoI于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证DsbC的编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点(multiple cloning site 2，MCS2)，从而获得pETDuet-MBP-TSPAN12LEL-DsbC的重组质粒。

将pETDuet-MBP-TSPAN12LEL-DsbC重组质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h。挑取单菌用LB培养基培养至OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG于16℃诱导表达14h。诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，以7493g的速度离心15min收集菌体。

按照每升菌液所得菌体中加入20mL缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)的比例，加入相应体积的缓冲液，重新悬浮菌体，并在超声破碎仪中以30％的功率超声30min。超声结束后用高速冷冻离心机13000g离心30min收集蛋白上清液。将蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用含10mmol/L麦芽糖(Maltose)的缓冲盐溶液(10mmol/L Maltose，20mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，pH＝7.4)洗脱层析柱得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段(MBP-TSPAN12LEL)。将所得的MBP-TSPAN12LEL与Source 15Q阴离子交换柱结合，用含有0.05-1.0mol/L NaCl的缓冲盐溶液(20mmol/LTris-HCl，0.05-1.0mol/L NaCl，pH＝8.0)，以NaCl浓度线性增加的方式洗脱阴离子交换柱，每1mL蛋白洗脱液收集至1个EP管(eppendorf管，小型的离心管)中，经SDS-PAGE电泳检测后，收集MBP-TSPAN12LEL所在的EP管，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL。

<实施例2>

以本实验室保存的含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒为模板，加入带有BamH I酶切位点的正向引物和带有HindIII酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pMal-c2x质粒用限制性内切酶BamH I和HindIII于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal-c2x质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒(pMal-TSPAN12LEL)。

将pMal-TSPAN12LEL重组质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h。挑取单菌用LB培养基培养至OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG于16℃诱导表达14h。诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，以7493g的速度离心15min收集菌体。

按照每升菌液所得菌体中加入20mL缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)的比例，加入相应体积的缓冲液，重新悬浮菌体，并在超声破碎仪中以30％的功率超声30min。超声结束后用高速冷冻离心机13000g离心30min收集蛋白上清液。将蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用含10mmol/L麦芽糖(Maltose)的缓冲盐溶液(10mmol/L Maltose，20mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，pH＝7.4)洗脱层析柱得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL片段(MBP-TSPAN12LEL)。将所得的MBP-TSPAN12LEL与Source 15Q阴离子交换柱结合，用含有0.05-1.0mol/L NaCl的缓冲盐溶液(20mmol/LTris-HCl，0.05-1.0mol/L NaCl，pH＝8.0)，以NaCl浓度线性增加的方式洗脱阴离子交换柱，每1mL蛋白洗脱液收集至1个EP管(eppendorf管，小型的离心管)中，经SDS-PAGE电泳检测后，收集MBP-TSPAN12LEL所在的EP管，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL。

<实施例3>

以本实验室保存的含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒为模板，加入带有BamH I酶切位点的正向引物和带有SalI酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pGEX-6P-1质粒用限制性内切酶BamH I和SalI于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pGEX-6P-1质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒(pGEX-TSPAN12LEL)。

以pGEX-TSPAN12LEL为模板，加入带有NcoI酶切位点的正向引物和带有HindIII酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶NcoI和HindIII于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点(multiple cloning site 1，MCS1)，从而获得pETDuet-GST-TSPAN12LEL的重组质粒。

以含有二硫键异构酶C(disulfide bond isomerase，DsbC)编码序列的pET40b质粒为模板，加入带有Nde I酶切位点的正向引物和带有XhoI酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出DsbC的编码序列。将扩增出的片段和pETDuet-GST-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和XhoI于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证DsbC的编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点(multiple cloning site 2，MCS2)，从而获得pETDuet-GST-TSPAN12LEL-DsbC的重组质粒。

将pETDuet-GST-TSPAN12LEL-DsbC重组质粒转化至大肠杆菌感受态Origami B中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h。挑取单菌用LB培养基培养至OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG于16℃诱导表达14h。诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，以7493g的速度离心15min收集菌体。

按照每升菌液所得菌体中加入20mL缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)的比例，加入相应体积的缓冲液，重新悬浮菌体，并在超声破碎仪中以30％的功率超声30min。超声结束后用高速冷冻离心机13000g离心30min收集蛋白上清液。将蛋白上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶填充的层析柱结合后，用含10mmol/L还原型谷胱甘肽(glutathione)的缓冲盐溶液(10mmol/L glutathione，20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)洗脱层析柱得到带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段(GST-TSPAN12LEL)。将所得的GST-TSPAN12LEL与Source 15Q阴离子交换柱结合，用含有0.05-1.0mol/L NaCl的缓冲盐溶液(20mmol/L Tris-HCl，0.05-1.0mol/L NaCl，pH＝8.0)，以NaCl浓度线性增加的方式洗脱阴离子交换柱，每1mL蛋白洗脱液收集至1个EP管(eppendorf管，小型的离心管)中，经SDS-PAGE电泳检测后，收集GST-TSPAN12LEL所在的EP管，得到高纯度的GST-TSPAN12LEL。

<实施例4>

以本实验室保存的含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒为模板，加入带有BamH I酶切位点的正向引物和带有SalI酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pGEX-6P-1质粒用限制性内切酶BamH I和SalI于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于4℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pGEX-6P-1质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒(pGEX-TSPAN12LEL)。

将pGEX-TSPAN12LEL重组质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h。挑取单菌用LB培养基培养至OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG于16℃诱导表达14h。诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，以7493g的速度离心15min收集菌体。

按照每升菌液所得菌体中加入20mL缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)的比例，加入相应体积的缓冲液，重新悬浮菌体，并在超声破碎仪中以30％的功率超声30min。超声结束后用高速冷冻离心机13000g离心30min收集蛋白上清液。将蛋白上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶填充的层析柱结合后，用含10mmol/L还原型谷胱甘肽(glutathione)的缓冲盐溶液(10mmol/L glutathione，20mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH＝7.4)洗脱层析柱得到带GST标签的TSPAN12蛋白LEL片段(GST-TSPAN12LEL)。将所得的GST-TSPAN12LEL与Source 15Q阴离子交换柱结合，用含有0.05-1.0mol/L NaCl的缓冲盐溶液(20mmol/L Tris-HCl，0.05-1.0mol/L NaCl，pH＝8.0)，以NaCl浓度线性增加的方式洗脱阴离子交换柱，每1mL蛋白洗脱液收集至1个EP管(eppendorf管，小型的离心管)中，经SDS-PAGE电泳检测后，收集GST-TSPAN12LEL所在的EP管，得到高纯度的GST-TSPAN12LEL。

<对比例1>

以本实验室保存的含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒为模板，加入带有BamH I酶切位点的正向引物和带有XhoI酶切位点的反向引物，以及PrimerSTAR聚合酶，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列。将扩增出的片段和空白pET22b质粒用限制性内切酶BamH I和XhoI于37℃酶切16h，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于16℃连接16h。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pET22b质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒(pET22b-TSPAN12LEL)。

将pET22b-TSPAN12LEL重组质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于37℃培养16h。挑取单菌用LB培养基培养至OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG于16℃诱导表达16h。诱导表达结束后，取1L菌液以7493g离心30min收集菌体。

向所得菌体中加入20mL缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mmol/L NaCl，pH＝7.4)，重新悬浮菌体，并在超声破碎仪中以30％的功率超声30min。超声结束后用高速冷冻离心机13000g离心30min收集蛋白上清液，向离心后的沉淀中再次加入20mL缓冲液(20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mmol/L NaCl，pH＝7.4)再次悬浮，得到沉淀混悬液。将蛋白上清液和沉淀经SDS-PAGE检测，目的蛋白TSPAN12LEL均出现在沉淀中，无法实现可溶表达。

序列表

TSPAN12的LEL片段的编码序列信息(SEQ No.1)

GAACAGGAACTTATGGTTCCAGTACAATGGTCAGATATGGTCACTTTGAAAGCCAGGATGACAAATTATGGATTACCTAGATATCGGTGGCTTACTCATGCTTGGAATTTTTTTCAGAGAGAGTTTAAGTGCTGTGGAGTAGTATATTTCACTGACTGGTTGGAAATGACAGAGATGGACTGGCCCCCAGATTCCTGCTGTGTTAGAGAATTCCCAGGATGTTCCAAACAGGCCCACCAGGAAGATCTCAGTGACCTTTATCAAGAGGGTTGTGGGAAGAAAATGTATTCCTTTTTGAGAGGAACCAAA

MBP-TSPAN12LEL片段的编码序列信息(SEQ No.2)

ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCGAACAGGAACTTATGGTTCCAGTACAATGGTCAGATATGGTCACTTTGAAAGCCAGGATGACAAATTATGGATTACCTAGATATCGGTGGCTTACTCATGCTTGGAATTTTTTTCAGAGAGAGTTTAAGTGCTGTGGAGTAGTATATTTCACTGACTGGTTGGAAATGACAGAGATGGACTGGCCCCCAGATTCCTGCTGTGTTAGAGAATTCCCAGGATGTTCCAAACAGGCCCACCAGGAAGATCTCAGTGACCTTTATCAAGAGGGTTGTGGGAAGAAAATGTATTCCTTTTTGAGAGGAACCAAA

GST-TSPAN12LEL片段的编码序列信息(SEQ No.3)

ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGAACAGGAACTTATGGTTCCAGTACAATGGTCAGATATGGTCACTTTGAAAGCCAGGATGACAAATTATGGATTACCTAGATATCGGTGGCTTACTCATGCTTGGAATTTTTTTCAGAGAGAGTTTAAGTGCTGTGGAGTAGTATATTTCACTGACTGGTTGGAAATGACAGAGATGGACTGGCCCCCAGATTCCTGCTGTGTTAGAGAATTCCCAGGATGTTCCAAACAGGCCCACCAGGAAGATCTCAGTGACCTTTATCAAGAGGGTTGTGGGAAGAAAATGTATTCCTTTTTGAGAGGAACCAAA

DsbC的编码序列信息(SEQ No.4)

GATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTAGCCAAAATGGGCATCAAAAGCAGCGATATTCAGCCCGCGCCTGTAGCTGGCATGAAGACAGTTCTGACTAACAGCGGCGTGTTGTACATCACCGATGATGGTAAACATATCATTCAGGGGCCAATGTATGACGTTAGTGGCACGGCTCCGGTCAATGTCACCAATAAGATGCTGTTAAAGCAGTTGAATGCGCTTGAAAAAGAGATGATCGTTTATAAAGCGCCGCAGGAAAAACACGTCATCACCGTGTTTACTGATATTACCTGTGGTTACTGCCACAAACTGCATGAGCAAATGGCAGACTACAACGCGCTGGGGATCACCGTGCGTTATCTTGCTTTCCCGCGCCAGGGGCTGGACAGCGATGCAGAGAAAGAAATGAAAGCTATCTGGTGTGCGAAAGATAAAAACAAAGCGTTTGATGATGTGATGGCAGGTAAAAGCGTCGCACCAGCCAGTTGCGACGTGGATATTGCCGACCATTACGCACTTGGCGTCCAGCTTGGCGTTAGCGGTACTCCGGCAGTTGTGCTGAGCAATGGCACACTTGTTCCGGGTTACCAGCCGCCGAAAGAGATGAAAGAATTCCTCGACGAACACCAAAAAATGACCAGCGGTAAATAA

PCR克隆TSPAN12的LEL片段的编码序列的正向引物序列(包含BamHI酶切位点)(SEQ No.5)

CGCGGATCCGAACAGGAACTTATGGTTCCAGT

PCR克隆TSPAN12的LEL片段的编码序列的反向引物序列(包含HindIII酶切位点)(SEQ No.6)

CCGAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA

PCR克隆TSPAN12的LEL片段的编码序列的反向引物序列(包含SalI酶切位点)(SEQNo.7)ACGCGTCGACTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA

PCR克隆MBP-TSPAN12LEL的编码序列的正向引物序列(包含NcoI酶切位点)(SEQNo.8)CATGCCATGGGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGT

PCR克隆MBP-TSPAN12LEL的编码序列的反向引物序列(包含HindIII酶切位点)(SEQ No.9)

CCCAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA

PCR克隆GST-TSPAN12LEL的编码序列的正向引物序列(包含NcoI酶切位点)(SEQNo.10)CATGCCATGGGCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGA

PCR克隆GST-TSPAN12LEL的编码序列的反向引物序列(包含HindIII酶切位点)(SEQ No.11)

CCCAAGCTTTTATTTGGTTCCTCTCAAAAAGGA

PCR克隆DsbC的编码序列的正向引物序列(包含NdeI酶切位点)(SEQ No.12)

GGAATTCCATATGGATGACGCGGCAATTCAACA

PCR克隆DsbC的编码序列的反向引物序列(包含XhoI酶切位点)(SEQ No.13)

CCGCTCGAGTTATTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGG

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省人民医院

<120> 一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段TSPAN12-LEL制备方法

<130> 2018-9

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaacaggaac ttatggttcc agtacaatgg tcagatatgg tcactttgaa agccaggatg 60

acaaattatg gattacctag atatcggtgg cttactcatg cttggaattt ttttcagaga 120

gagtttaagt gctgtggagt agtatatttc actgactggt tggaaatgac agagatggac 180

tggcccccag attcctgctg tgttagagaa ttcccaggat gttccaaaca ggcccaccag 240

gaagatctca gtgaccttta tcaagagggt tgtgggaaga aaatgtattc ctttttgaga 300

ggaaccaaa 309

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccg aacaggaact tatggttcca 1200

gtacaatggt cagatatggt cactttgaaa gccaggatga caaattatgg attacctaga 1260

tatcggtggc ttactcatgc ttggaatttt tttcagagag agtttaagtg ctgtggagta 1320

gtatatttca ctgactggtt ggaaatgaca gagatggact ggcccccaga ttcctgctgt 1380

gttagagaat tcccaggatg ttccaaacag gcccaccagg aagatctcag tgacctttat 1440

caagagggtt gtgggaagaa aatgtattcc tttttgagag gaaccaaa 1488

<210> 3

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccgaacagg aacttatggt tccagtacaa 720

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<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgcggatccg aacaggaact tatggttcca gt 32

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

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<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

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<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

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<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cccaagcttt tatttggttc ctctcaaaaa gga 33

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<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

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<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

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cccaagcttt tatttggttc ctctcaaaaa gga 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggaattccat atggatgacg cggcaattca aca 33

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccgctcgagt tattatttac cgctggtcat tttttgg 37

Claims (5)

1.一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

（1）将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；

（2）将步骤（1）扩增出的片段和包含有麦芽糖结合蛋白编码序列的pMal质粒用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（3）将步骤（2）连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal质粒，从而获得TSPAN12 LEL的重组表达质粒pMal-TSPAN12 LEL；

（4）将步骤（3）得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌落用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1~1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；

（5）向步骤（4）所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，收集蛋白上清液；

（6）将步骤（5）所得蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用麦芽糖溶液洗脱层析柱，得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，MBP-TSPAN12 LEL；

（7）将步骤（6）所得的MBP-TSPAN12 LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有MBP-TSPAN12 LEL的流出液，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL；

在步骤（3）和步骤（4）之间还包括步骤（8）至步骤（13）：

（8）将步骤（3）得到的含有MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pMal-TSPAN12 LEL，经PCR扩增出MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列MBP-TSPAN12 LEL；

（9）将步骤（8）扩增出的MBP-TSPAN12 LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（10）将步骤（9）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证MBP-TSPAN12 LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带MBP标签的TSPAN12 LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL；

（11）将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列；

（12）将步骤（11）扩增出的DsbC的编码序列和步骤（10）得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（13）将步骤（12）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12 LEL片段的重组表达质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL-DsbC；然后将此重组表达质粒pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL-DsbC应用于步骤（4）中替代原步骤（3）重组表达质粒转化至表达宿主中。

2.一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

（一）将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；

（二）将步骤（一）扩增出的片段和包含有谷胱甘肽巯基转移酶编码序列的pGEX质粒用限制性内切酶BamHI和SalI酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（三）将步骤（二）连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pGEX质粒，从而获得TSPAN12 LEL的重组表达质粒pGEX-TSPAN12 LEL；

（四）将步骤（三）得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1~1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；

（五）向步骤（四）所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，收集蛋白上清液；

（六）将步骤（五）所得蛋白上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶填充的层析柱结合后，用谷胱甘肽溶液洗脱层析柱，得到带GST标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，GST-TSPAN12 LEL；

（七）将步骤（六）所得的GST-TSPAN12 LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有GST-TSPAN12 LEL的流出液，得到高纯度的GST-TSPAN12 LEL；

在步骤（三）和步骤（四）之间还包括步骤（八）至步骤（十三）：

（八）将步骤（三）得到的含有GST和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pGEX-TSPAN12 LEL，经PCR扩增出GST和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列GST-TSPAN12 LEL；

（九）将步骤（八）扩增出的GST-TSPAN12 LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（十）将步骤（九）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证GST-TSPAN12 LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带GST标签的TSPAN12 LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-GST-TSPAN12 LEL；

（十一）将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列；

（十二）将步骤（十一）扩增出的DsbC的编码序列和步骤（十）得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（十三）将步骤（十二）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12 LEL片段的重组表达质粒，pETDuet-1-GST-TSPAN12 LEL-DsbC；然后将此重组表达质粒pETDuet-1-GST-TSPAN12 LEL-DsbC应用于步骤（四）中替代原步骤（三）重组表达质粒转化至表达宿主中。

3.根据权利要求1或2所述的TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，构建重组表达载体质粒选用pMal-c2x、pMal-c4x、pMal-c5x、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3或pETDuet-1质粒。

4.根据权利要求1或2所述TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，表达宿主为大肠杆菌的BL21、Origami B或Rosetta菌株中的一种。

5.根据权利要求1或2所述TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，

所述克隆菌株为大肠杆菌的DH5α或TOP10菌株。

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