CN103998926B - 蛋白质吸附材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制造具有基体和固定在基体的表面的分子链的蛋白质吸附材料的方法。该方法依次具备对具有基体和固定在基体的表面的分子链，且分子链含有弱电解性离子交换基团的处理前吸附材料进行加热的干热处理工序和在利用液体或蒸汽湿润化的状态下对处理前吸附材料进行加热而得到蛋白质吸附材料的湿热处理工序。

Description

蛋白质吸附材料
技术领域
本发明涉及一种蛋白质吸附材料。另外，本发明涉及一种具备蛋白质吸附材料的柱及组件。
背景技术
例如在专利文献1～5中公开有涉及用于精制大量蛋白质的蛋白质吸附材料的技术。
在专利文献1中公开了一种蛋白质的精制方法，其包含使用多孔膜进行过滤的工序，所述多孔膜在细孔表面具有接枝链且在该接枝链上固定有阴离子交换基团。
在专利文献2中公开了一种多孔吸附介质，其用吸附材料覆盖多孔基体材料而形成，所述吸附材料具有键合了伯胺基键而形成的交联聚合物。
在专利文献3中公开了一种适用于通过吸附而引起物质分离的含有多孔交联凝胶的复合材料，所述多孔交联凝胶延伸有多个孔的支承体构成部件及配置在该支承体构成部件的孔中且充满该支承体构成部件的孔。
在专利文献4中提供一种带正电的多孔膜，其由具有阳离子官能团的交联被膜和多孔基体材料构成，可用于过滤、精制如蛋白质、核酸、内霉素之类的生物分子。
在专利文献5中公开了一种可高速吸附精制蛋白质等的吸附体及其制造方法，所述吸附体介由高分子链在高分子基体材料粒子的表面固定了具有蛋白质吸附能力的官能团。
在专利文献6中公开了对基体材料的表面进行了改性的例子，其通过导入一般公知的氨基或磺酸基作为可与蛋白质相互作用的官能团而形成的被膜来进行。在专利文献6中公开了一种在高分子多孔基体材料膜表面形成经N-卤化的化合物(聚合物或者聚合物前体)的被膜，使接枝引发剂和单体接触，在基体材料上接枝聚合的方法。进而，公开有一种膜，其通过使作为上述单体的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝聚合，然后，向GMA的环氧基导入仲/叔胺产生的叔氨基/季铵基或者利用磺酸离子进行处理而产生环氧基的磺化而得到。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/054226号
专利文献2：日本特开2009-53191号公报
专利文献3：日本特表2006-519273号公报
专利文献4：美国专利第6780327号说明书
专利文献5：日本特开2008-45906号公报
专利文献6：美国专利第5547575号说明书
非专利文献
非专利文献1：KyoichiSaito，CHARGEDPOLYPERBRUSHGRAFTEDONTOPOROUSHOLLOW-FIBERMEMBRANEIMPROVESSEPARATIONANDREACTIONINBIOTECNOLOGY，SeparationScienceandTechnology，ENGLAND，Taylar&Francis，2002，37(3)，535-554
发明内容
发明要解决的问题
例如，如专利文献1、5、6中所公开的，可期待通过吸附材料在吸附性能以及精制处理速度方面实现某种较高程度的水平，所述吸附材料在高分子成形体或其被膜的表面固定了包含具有蛋白质吸附能力官能团的分子链。
但是，对具有相关构成的吸附材料进行了详细的研究，结果表明存在吸附性能变动较大的倾向，所述倾向在吸附材料进行实用化时成为较大的问题。具体而言，在刚制造后和长期保管后吸附性能的差容易变大。因此，难以预测吸附穿透的时机，例如难以进行使用了大量吸附材料的精制设备的设计及运转条件的设计，另外，也存在应吸附除去的成分发生泄漏，从而容易产生精制液品质降低的问题。
因此，本发明的主要目的在于，涉及一种包含具有蛋白质吸附能力的弱电解性离子交换基团、并具有在基体表面固定了分子链的蛋白质吸附材料，所述基体材料具有高分子成形体，且改善吸附性能的稳定性。
用于解决问题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，为了实现上述目的，将在特定的湿润条件下对吸附材料进行检定处理时的吸附容量的变化率作为指标很有效，基于这样的见解完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]一种制造蛋白质吸附材料的方法，所述蛋白质吸附材料具有基体和固定在所述基体表面的分子链，该方法依次具有以下工序：
干热处理工序，对处理前吸附材料进行加热，所述处理前吸附材料具有所述基体和固定在所述基体的表面的所述分子链，且所述分子链含有弱电解性离子交换基团；
湿热处理工序，在利用液体或蒸汽对所述处理前吸附材料进行了湿润化的状态下加热所述处理前吸附材料，从而得到所述蛋白质吸附材料。
[2]如[1]所述的方法，其中，在所述干热处理工序之前还具有将所述分子链固定在所述基体表面上的分子链形成工序。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，所述蛋白质吸附材料的牛血清白蛋白或溶菌酶的动态吸附容量为5mg/mL以上。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述干热处理工序中包括在40℃～130℃下对所述处理前吸附材料加热1小时以上。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述湿热处理工序包含在利用液体或蒸汽对所述处理前吸附材料进行了湿润化的状态下，在40℃～120℃下对所述处理前吸附材料加热30分钟以上。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，在所述湿热处理工序后，保持所述蛋白质吸附材料的湿润化状态。
[7]一种蛋白质吸附材料，其具有基体和固定在所述基体的表面的分子链，且所述分子链含有弱电解性离子交换基团，其中，
在进行如下检定处理时，该检定处理前后，该蛋白质吸附材料的动态吸附容量变化率在±5％以内，
所述检定处理是在50℃下对经过含1mol/L氯化钠的20mMTris-盐酸缓冲液湿润化的该蛋白质吸附材料加热8小时。
[8]如[7]所述的蛋白质吸附材料，其中，所述分子链与形成所述基体的化合物共价键合。
[9]如[7]或[8]所述的蛋白质吸附材料，其中，所述基体为多孔体。
[10]如[7]～[9]中任一项所述的蛋白质吸附材料，其中，所述基体为中空纤维状。
[11]如[7]～[10]中任一项所述的蛋白质吸附材料，其中，所述弱电解性离子交换基团为叔氨基。
[12]如[7]～[11]中任一项所述的蛋白质吸附材料，其中，所述分子链为通过接枝聚合形成的直链状的高分子链。
[13]一种组件，其具备[7]～[12]中任一项所述的蛋白质吸附材料。
[14]一种柱，其具备[7]～[12]中任一项所述的蛋白质吸附材料。
发明效果
根据本发明，涉及一种含有具有蛋白质吸附能力的弱电解性离子交换基团且具有固定在基体表面的分子链的蛋白质吸附材料，所述基体材料具有高分子成形体，且可以改善吸附性能的稳定性。由于吸附性能稳定，因此，即使在构成使用了吸附材料的大型精制装置的情况下，也容易进行精制设备的设计及运转条件的设计，且精制液品质降低的风险低。
附图说明
图1是表示蛋白质吸附材料的一个实施方式的示意图。
具体实施方式
下面，对本发明优选的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行多种变形来实施。
图1是表示蛋白质吸附材料的一个实施方式的示意图。图1所示的吸附材料1包含基体3和固定在基体3表面的分子链5，所述基体3具有含有高分子化合物的高分子成形体。分子链5含有具有蛋白质吸附能力的弱电解性离子交换基团。分子链5形成吸附层6。本实施方式的高分子成形体的一个例子为形成有细孔7的多孔体，在含有蛋白质的溶液通过细孔7时，蛋白质10主要基于弱电解性离子交换基团的作用而吸附于吸附材料1。
进行如下检定处理：在50℃下对利用含有1mol/L氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液(以下有时称为“盐缓冲液”。)进行了湿润化的吸附材料加热8小时，此时，该检定处理前后的吸附材料1的动态吸附容量的变化率较小。若该变化率充分小，则吸附材料的吸附性能具有稳定的倾向。具体而言，该变化率优选在±5％以内，更优选在±3％以内，进一步优选在±2％以内。用于变化率测定的动态吸附容量的测定方法没有特别限制，但为了能够进行比较，可在检定处理前后在实质上相同的条件下测定动态吸附容量。在后述的实施例中对详细的变化率测定方法进行说明。
上述检定处理后，本实施方式中蛋白质吸附材料的牛血清白蛋白或溶菌酶的动态吸附容量例如为5mg/mL以上。由于寻求吸附更多蛋白质的蛋白吸附材料，因此，动态吸附容量优选为10mg/mL以上，更优选为20mg/mL以上。
构成基体3的高分子成形体为含有高分子化合物且具有指定形状的部件，例如可以将含有高分子化合物的材料成形为规定的形状而得到。基体3例如可以为高分子成形体自身，也可以由高分子成形体和高分子成形体表面上形成的后述被膜构成(图1是基体3为高分子成形体自身时的示意图，图中没有标明高分子成形体的表面上所形成的被膜)。基体3通常具有与高分子成形体相同的形状。高分子成形体可以为平板膜、无纺布、中空纤维膜、具有整块状或珠态的多孔体。多孔体可以增大吸附表面积，故优选。从处理的容易性和能够实现较高精制处理速度的方面考虑，更优选平板膜及中空纤维状这样膜状的形态。从增加规模性、组件成型时流路结构简单的方面考虑，特别优选中空纤维多孔膜。在本实施方式中，“中空纤维多孔膜”是指沿着内壁形成有中空部分的圆筒状或纤维状的多孔体。中空纤维多孔膜的中空侧(内侧)和外侧通过贯穿孔即细孔连接。中空纤维多孔膜通过该细孔而具有液体或气体从内侧向外侧或者从外侧向内侧透过的性质。中空纤维多孔膜的外径以及内径只要物理上多孔膜能够保持形状就没有特别限定。或者若高分子成形体为可以使蛋白质的溶液与其表面接触的形态，也可以为非多孔体。作为非多孔体，例如可以举出：膜、非多孔珠、纤维、毛细管。
在高分子成形体为膜状的多孔体的情况下，其细孔孔径优选为0.01μm～10μm，更优选为0.05μm～7μm，进一步优选为0.1μm～1μm。多孔体中的细孔所占的体积比率即孔隙率，只要保持多孔体的形状且通液时的压损在实用上不会产生问题的范围就没有特别限定，优选为5％～99％，更优选为10％～95％，进一步优选为30～90％。细孔孔径及孔隙率的测定如可以通过如MarcelMulder著“膜技术”(株式会社IPC)中记载的、对于本领域技术人员来说常规的方法来进行。作为其具体例，可以举出：利用电子显微镜的观察、泡点法、水银压入法、透过率法。
作为用于形成构成基体3的高分子成形体高分子化合物，没有特别限定，为了保持机械性质，优选聚烯烃类聚合物、聚砜、聚醚砜、纤维素、纤维素衍生物。聚烯烃类聚合物例如选自乙烯、丙烯、丁烯及偏二氟乙烯等烯烃的均聚物、该烯烃的2种以上的共聚物、以及1种或2种以上的烯烃和全卤代烯烃的共聚物。在这些高分子中，从机械强度特别优异的方面考虑，优选聚乙烯、聚偏二氟乙烯及聚砜，在利用放射线接枝聚合法形成分子链5的情况下，更优选聚乙烯。
在基体3的至少一部分表面上存在吸附层6，其由含有弱电解性离子交换基团的分子链5形成。由该分子链5形成的吸附层6的形态只要在加热工序、或者蛋白质的吸附/脱吸附工序中不产生吸附层6的溶解或者通液时的压力上升等问题就没有特别限定。分子链5例如通过共价键合、包覆或吸附固定在基体3上。分子链5优选为与以下化合物进行共价键合而形成的接枝链：形成高分子成形体的高分子化合物、或形成在高分子成形体表面上所形成的后述被膜的化合物。
由分子链5形成的吸附层6的状态没有限定。例如分子链5可以为直链状的分子链，也可以为具有交联结构的高分子链。在具有交联结构的分子链的情况下，可以为在基体表面上分子链彼此松弛地相互交联而形成的凝胶状的吸附层，也可以为分子链彼此牢固地相互交联而形成的皮状的吸附层。
分子链5具有弱电解性离子交换基团来作为构成其侧链基团、末端基团、或主链的构成单元。分子链5所具有的弱电解性离子交换基团例如可以为弱电解性阳离子交换基团、或弱电解性阴离子交换基团。作为弱电解性阴离子基，可以举出：羧酸基(-COO-)、磷酸基(-PO3 -、-PO3 2-)及磷酸酯基(-PO3R-)。弱电解性阳离子交换基团例如可以为伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NRH)、或叔氨基(-NR2)。在这些离子交换基团中，R没有特别限定，特别是在叔氨基的情况下，与相同的N键合的R可以相同，也可以不同。R优选表示烷基、芳基、芳烷基等烃基。叔氨基例如可以以二乙氨基乙基(DEAE、-(CH2)2-NEt2)、或二乙氨基丙基(DEAP、-(CH2)3-NEt2)的形式导入到分子链(接枝链)中。
基体3还可以具有用与所述高分子成形体不同的材料或不同的微结构的高分子化合物覆盖高分子成形体的至少一部分表面的被膜。此时，可以将多个分子链5的一部分或全部固定在该被膜的表面上。被膜例如可以通过凝聚或吸附尼龙等高分子化合物从而使其进行包覆来形成，例如也可以通过氨酯树脂等反应性涂层材料以网状包覆来形成，还可以通过和高分子成形体表面的共价键合形成。为了防止从吸附材料上发生包覆脱离，优选相对于高分子成形体以网状包覆或者共价键合来形成包覆。
本实施方式的吸附材料1例如可以通过依次具有如下工序的方法来制作：得到处理前吸附材料的工序(分子链形成工序)，所述处理前吸附材料具备具有高分子成形体的基体3和固定在基体3表面的分子链5，且分子链5含有弱电解性离子交换基团；对处理前吸附材料进行加热的工序(干热处理工序)；利用液体或蒸汽对处理前吸附材料进行湿润化后进行加热的工序(湿热处理工序)。
在基体3的表面导入分子链5的方法没有特别限定。有以下方法：通过对高分子成形体照射放射线来生成自由基，并由形成高分子成形体的高分子化合物通过接枝聚合来形成作为分子链5的接枝链的方法；使具有弱电解性离子交换基团的高分子化合物附着在基体上，然后通过交联剂将作为分子链5的高分子化合物固定在基体表面的方法；形成覆盖高分子成形体表面的聚合物或聚合物前体的被膜而形成基体3后，由构成其被膜的高分子化合物形成接枝链作为分子链5的方法等。特别是在期待高分子成形体或者形成覆盖其表面的高分子化合物，和分子链5通过共价键合形成牢固键合的情况下，优选通过由高分子成形体或形成被膜的高分子化合物发生接枝聚合来导入分子链5的方法。
在通过形成高分子成形体或被膜的高分子化合物发生接枝聚合而导入分子链5的情况下，可以采用(1)使具有弱电解性离子交换基团的单体直接聚合的方法、或(2)通过由高分子化合物发生接枝聚合而导入含有反应性官能团的接枝链，接着，通过反应性官能团的反应将弱电解性离子交换基团导入到接枝链中的方法。
(1)方法由于能够通过一步反应导入分子链5，因此很简便。作为上述单体，没有特别限定，可以举出：甲基丙烯酸酯衍生物、乙烯基化合物、烯丙基化合物等。例如上述单体可选自甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、烯丙基胺、丙烯酸、及甲基丙烯酸。
(2)方法在弱电解性离子交换基团的种类及弱电解性离子交换基团的导入率的选择范围大的方面有利。作为以该方法接枝聚合的单体，优选具有反应性高的环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)。即，分子链5优选为由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯链衍生的高分子链。
对于分子链5的量及分子链5中所导入的弱电解性离子交换基团的量，只要不产生通液时的压力上升等问题就没有特别限定。下面，对分子链5及弱电解性离子交换基团的量，通过列举上述(2)中利用接枝聚合方法情况下的例子进行说明。
通常，如下述式(1)所示，相对于基体接枝链的键合率(接枝率，dg[％])可基于由于导入接枝链而增加的质量进行定义。
[数学式1]
dg [ % ] = W 1 - W 0 ′ W 0 × 100 - - - ( 1 )
W0：反应前的高分子成形体质量(g)
W0’：接枝链导入前的基体质量(g)
W1：接枝链导入后的整体质量(g)
在式(1)中，在基体由高分子成形体自身构成的情况下，W0’＝W0。
弱电解性离子交换基团相对于接枝链中的反应性官能团(可导入弱电解性离子交换基团的官能团)的存在比例，能够以式(2)所示的“配位体转化率”整理。即，弱电解性离子交换基团的存在比例，以接枝链中所导入的弱电解性离子交换基团的摩尔数相对于接枝链中的反应性官能团的摩尔数表示。例如在接枝链为GMA的聚合物且通过GMA的环氧基和二乙胺的反应导入二乙氨基的情况下，将GMA的分子量142g/mol代入式(2)的M1，将二乙胺的分子量73g/mol代入M2。
[数学式2]
T [ % ] = ( W 2 - W 1 ) / M 2 ( W 1 - W 0 ′ ) / M 1 × 100 - - - ( 2 )
W0’：接枝链导入前的基体质量(g)
W1：接枝链导入后的整体质量(g)
W2：弱电解性离子交换基团导入后的整体质量(g)
M1：形成接枝链的单体单元的分子量(g/mol)
M2：弱电解性离子交换基团的分子量(g/mol)
从同时确保更高的吸附容量及力学稳定性强度这样的观点考虑，接枝率优选为5％～200％，更优选为20％～150％，进一步优选为30％～90％。从得到更高的吸附容量这样的观点考虑，配位体转化率优选为20％～100％，更优选为50％～100％，进一步优选为70％～100％。
在本实施方式中的方法的情况下，干热处理可通过对干燥的状态，换言之，至少一部分未被液体或蒸汽湿润化的状态的处理前吸附材料进行加热来进行。该干热处理可以对处理前吸附材料本身实施，也可以以处理前吸附材料捆包在壳体内的形态(例如组件、柱等)进行。任一情况实质上均可发挥同等的效果。
导入了分子链5的处理前吸附材料，例如可以在用于通过液相反应导入分子链5的反应溶剂、或反应后的清洗等中所使用的液体(例如水分)附着于基体的状态下得到。或者，有时也可在通过气相反应导入分子链5而液体实质上未附着于基体的状态下得到处理前吸附材料。对于液相反应中制造的处理前吸附材料，可以在进行干热处理前预先进行干燥处理来除去附着在基体上的液体，诱导处理前吸附材料的至少一部分成为未被液体或蒸汽湿润化的状态。另外，也可以将一系列加热工序的前半部分设为干燥处理，其用于诱导处理前吸附材料的至少一部分成为未被液体或蒸汽湿润化的状态，将后续后半部分设为本实施方式的干热处理。调整用于干热处理的加热温度及加热时间，使上述的检定处理前后的吸附材料的动态吸附容量的变化率较小且可充分地得到吸附性能稳定化的效果。另外，在可充分地对处理前吸附材料进行干燥的温度及时间以上、且不会发生强度劣化或者熔解的温度及时间以下调整加热温度及时间。进而，在实施将处理前吸附材料组装在壳体(例如组件、柱等)中的工序的情况下，在可实现将粘接壳体和处理前吸附材料的密封材料完全固化的温度及时间下调整温度及时间。具体而言，该加热温度优选为40～130℃，更优选为45℃～110℃，进一步优选为50～95℃。加热时间优选为1～150小时以上，更优选为2～100小时，进一步优选为4～60小时。
干热处理后接着进行湿热处理，其包括通过液体或蒸汽使处理前吸附材料湿润化，然后加热湿润化状态的处理前吸附材料。通过组合所述干热处理和湿热处理，可以高效地制造上述检定处理中的变化率较小的吸附材料。相关作用的起效机制尚未十分明确，但认为原因在于：通过依次组合干热处理和湿热处理，分子链高效地重排，由此分子链的形态稳定化。例如认为通过干热处理中基体自身的高分子结构松弛来释放基体表面附近拘束的分子链结构，或者经过干热处理中分子链经过暂时收缩的状态，在之后的湿热处理中分子链再次伸长时，分子链高效地重排，由此分子链的形态稳定化。
在本实施方式中，“湿润化的状态”是指处理前吸附材料的表面(例如细孔表面)被液体(湿热处理液)润湿的状态。在对处于干燥状态的处理前吸附材料进行湿润化的情况下，也可以将吸附材料进行暂时亲水化处理后，最终用湿热处理液进行置换来湿润化。亲水化处理例如可以通过使水、醇水溶液、醇、蒸汽和处理前吸附材料接触的方法进行。也可以通过加压和/或加热来加速亲水化。其中，利用醇或醇水溶液的亲水化处理可以以各种原材料及形状实施。另外，也可以采用如下状态：用醇或醇水溶液润湿处理前吸附材料，暂时用纯水置换醇或醇水溶液后，最终由湿热处理液使前吸附材料成为润湿的状态。作为湿润化的一个例子有以下方法：使处理前吸附材料与乙醇或乙醇水溶液接触，通过缓慢提高纯水的比率暂时将乙醇或乙醇水溶液置换为纯水，最终置换为湿热处理液的方法。置换为湿润处理液的方法，只要处理前吸附材料用湿润处理液充分置换就没有限定。例如在处理前吸附材料为膜状的情况下，为了充分地进行亲水化或者置换为溶液，通液湿润处理液的方法很有效。
在本说明书中，吸附材料的“湿润化的状态”更具体而言是指，例如湿润度为0.1以上的状态。湿润度的测定可以按照以下步骤进行。
1.在柱或组件中的吸附材料的情况下，将它们拆开并取出一定量的吸附材料。
2.沥尽附着在吸附材料上的多余的填充保存液后，测定吸附材料含液时的质量WW。
3.用乙醇、水充分清洗填充保存液附着的吸附材料后，在65℃的烘箱中干燥16小时，测定吸附材料的干燥质量WD。
4.由吸附材料的含液时重量WW、干燥重量WD且按照以下的式子计算湿润度。
湿润度＝(WW-WD)/WD
调整湿热处理中的加热温度及加热时间，使上述的检定处理前后的吸附材料的动态吸附容量的变化率较小且可得到吸附性能的充分稳定化的效果。具体而言，该加热温度优选为40～130℃或40～120℃。在实施可靠的加热方面更优选50～130℃或50～120℃。例如若考虑处理设备保全的简便性或者经济性，则将水用作湿润处理液，更优选50～99℃，进一步优选在70～99℃实施。另外，例如在兼具杀菌处理实施湿热处理的情况下，更优选100～130℃，进一步更优选121℃～130℃。加热时间优选30分钟以上，更优选1小时以上，在实施可靠的加热方面进一步优选3小时以上。
加热处理前吸附材料的方法只要为可充分地加热湿润化状态的处理前吸附材料且对吸附材料的机械强度不产生影响的范畴就没有特别限定。该湿热处理可以对处理前吸附材料本身实施，也可以以处理前吸附材料捆包在壳体内的形态(例如组件、柱等)进行，任一情况实质上均发挥同等的效果。加热的方法也可以通过利用热水浴的加热、利用高压釜的高压下水蒸汽接触的加热、通过加热湿润处理液的通液或者湿润处理液的蒸汽的通气来进行处理前吸附材料的湿热处理。在从壳体外侧加热的情况及进行利用高压釜加热的情况下，壳体内溶液的封入量也没有限定，湿热处理液可以为沥尽状态，也可以为满液状态。
为了使处理前吸附材料湿润化，湿热处理液优选为纯水或水溶液。在加热温度为110℃以下的情况下，例如可以举出：纯水、缓冲液、无机盐的水溶液、或者含有无机盐的缓冲液。一般而言，吸附蛋白质于吸附材料时，使用溶解了蛋白质而形成的缓冲液，脱吸附时使用含有氯化钠的缓冲液。因此，使用缓冲液作为湿热处理液很简便。在加热温度超过110℃且在130℃以下的情况下，处理液优选含有无机盐的水溶液。此时，阳离子种、阴离子种、价数没有限定。例如作为1价的阳离子，可以举出：锂离子、钠离子、钾离子，作为2价的阳离子，可以举出：镁离子、钙离子等。作为阴离子种，可以举出：氢氧化物离子、氯化物离子、溴化物离子、硫酸离子、硝酸离子等，对阳离子的组合也没有限定。从通常用作蛋白质溶出液、或者清洗液的方面考虑，优选含有无机盐的缓冲液、或氢氧化钠水溶液，更优选含有氯化钠的缓冲液。金属离子的浓度优选为0.05mol/L以上，更优选为0.1mol/L以上，进一步优选为1mol/L以上。
认为通过本实施方式的干热处理和后续的湿热处理，可促进包覆基体的分子链进行重排，吸附性能稳定化。进行了有效地重排的处理前吸附材料优选具有由基体直接形成的直链状的接枝高分子链或松弛地相互交联而形成凝胶状被膜的高分子链。更优选为具有由基体直接形成的直链状的接枝高分子链的处理前吸附材料。若对这些处理前吸附材料进行湿热处理，则可特别显著地得到吸附性能稳定化的效果。
对提供至干热处理及湿热处理的处理前吸附材料未必需要是未使用的吸附材料(一次也未吸附蛋白质的吸附材料)。例如作为处理前吸附材料可使用重复吸附及脱吸附且吸附容量降低的吸附材料或通过与本实施方式不同的热处理使吸附容量降低的吸附材料，对上述材料实施湿热处理。
湿热处理后，可以使得到的吸附材料保持湿润化的状态。例如在湿热处理后、直到用于蛋白质吸附之间保持吸附材料的湿润化的状态。湿热处理后的吸附材料的湿润度可以保持在0.1以上，也可以保持为0.5以上或1.0以上。湿润度的上限没有特别限制，湿润度例如可以为3.0以下。
为了保持吸附材料湿润化的状态，可以对组件或柱中的吸附材料进行湿热处理，然后将湿热处理液置换为水、醇、或醇水溶液等填充保存液，也可以保持通过湿热处理液来进行了湿润化的状态。保管过程中由于填充保存液中的水分挥发而难以保持湿润化状态的情况下，也可以采用含甘油等保湿剂的填充保存液。另外，在期待杀菌或者抑菌效果的情况下，可以使用乙醇水溶液作为填充保存液。
为了保持吸附材料湿润的状态，可以用填充保存液填满组件或柱内，也可以舍弃多余的填充保存液形成所谓的沥尽状态。
本实施方式的吸附材料例如可以在柱或组件的状态下用于蛋白质的分离精制等。组件例如可由膜状的吸附材料和容纳该吸附材料的壳体构成。特别是在吸附材料为中空纤维膜的情况下，组件可以具备两端具有开口部的壳体和壳体内所固定的一根或多根中空纤维膜。溶解由壳体开口部侧的喷嘴供给的蛋白质而形成的液体从中空纤维内侧向外侧在膜中通过，由壳体侧面上所安装的喷嘴排出。柱例如由粒子状的吸附材料和收容该吸附材料的筒状容器构成。
实施例
下面，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。
在以下的实施例及比较例中，动态吸附容量及检定处理前后的动态吸附容量的变化率的测定按照以下步骤进行。
(动态吸附容量的测定方法)
作为用于测定动态吸附容量的标准蛋白质溶液，按照以下的步骤制作作为含有弱电解性阴离子交换基团(二乙氨基)的吸附材料用的BSA(牛血清白蛋白、Sigmaaldrich制)、作为含有弱电解性阳离子交换基团(羧酸基)的吸附材料用的溶菌酶(Sigmaaldrich制)。将BSA或溶菌酶以1g/L的浓度溶解于调整为pH8的20mMTris盐酸缓冲液(以下称为“缓冲液”。)中。使得到的标准蛋白质溶液(BSA溶液或溶菌酶溶液)通过0.45μm的过滤器。
连接组件于HPLC系统(GEhealthcare日本AKTAexplorer100)。以5MV/分钟的送液速度依次通液缓冲液(50MV)、标准蛋白质溶液(67MV)、缓冲液(17MV)、及含有1mol/L的氯化钠的缓冲液(盐缓冲液)(25MV)。在此，“MV”是指膜体积，“1MV”相当于通液与膜体积同量的液量。膜体积的计算方法在后面叙述。第一次缓冲液通液以膜的平衡化为目的，标准蛋白质溶液供给后的第二次缓冲液通液以清洗非吸附标准蛋白质为目的进行。进而，其以后的盐缓冲液的通液以溶出吸附的标准蛋白质为目的进行。
通液速度在可保持吸附材料及其组件的形状且保持吸附功能的范围内任意地设定。通液的各液体的量只要是充分地置换前面通液的液体(例如在第一次的缓冲液通液的情况下，对吸附材料进行湿润化的封入液)并达到该液体的目的(例如平衡化、清洗)的量即可，可根据评价的组件的尺寸任意地设定。可以通过对各液体通液至吸附材料后的该液体，监控pH、导电度、吸光度以其达到了平衡状态来判断通液量为充足。
一边通液标准蛋白质溶液一边测定从组件中所排出的滤液在波长280nm处的吸光度，确认滤液吸光度和原液(通液前的标准蛋白质溶液)吸光度的比为10％时的滤液量。基于浓度1g/L将该滤液量换算为标准蛋白质的质量，算出吸光度的比为10％时的标准蛋白质的吸附量[mg]。进而，通过算出的值除以膜体积(在中空纤维的情况下，由中空纤维内外径、有效纤维长度计算的圆环部的体积)，求出单位膜体积的标准蛋白质(BSA或溶菌酶)的吸附容量(mg/mL)。该值称为“动态吸附容量”，通常在生物技术领域中使用。
(检定处理前后的变化率)
预先用上述方法测定动态吸附容量，准备填充有盐缓冲液(含有1mol/L氯化钠的20mMTris盐酸缓冲液、pH8)的组件。在标准蛋白质吸附在吸附材料上的情况下，向组件通液盐缓冲液，使标准蛋白质溶出。在未填充有盐缓冲液的情况下，充分地通液盐缓冲液，确认通液后的该盐缓冲液的传导度为65mS/cm以上(HORIBA公司制CONDUCTIVITYMETERB-173)。将密闭了液体流路的组件投入到预先设定为50℃的水浴中，继续在50℃加热8小时(检定处理)。利用上述方法测定检定处理后的组件的动态吸附容量。利用下述式求出检定处理后的动态吸附容量相对于检定处理前的动态吸附容量的变化程度作为检定处理前后的变化率(％)。
检定处理前后的变化率＝(检定处理后的动态吸附容量/检定处理前的动态吸附容量)×100-100
实施例1
吸附材料(具有接枝链的中空纤维多孔膜)的制造
将微粉硅酸(AerosilR972等级)27.2质量份、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)54.3质量份、及聚乙烯树脂粉末(旭化成SunfineSH-800等级)18.5质量份预混合，用双轴挤出机挤出为中空纤维状，得到中空纤维状的膜。接着，通过将该膜依次浸渍于二氯甲烷及氢氧化钠水溶液中，萃取邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及硅酸，然后，实施水洗、干燥处理，得到聚乙烯的成形体即中空纤维多孔膜。
将得到的中空纤维多孔膜放入密闭容器，容器内进行氮气置换。接着，将装有中空纤维多孔膜的密闭容器与干冰一起放入发泡苯乙烯制的箱中，一边冷却一边照射γ射线200kGy，使聚乙烯产生自由基，活化中空纤维多孔膜。
将活化的中空纤维多孔膜在氮氛围的密闭容器内返回至室温。然后，将中空纤维多孔膜投入到反应容器中，密闭且形成真空状态(100Pa以下)。混合甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)5质量份和甲醇95质量份，进行氮冒泡并利用压力差将预先准备的反应液送向真空状态的反应容器内。进行了送液的反应液在40℃循环4小时，静置一整夜后，排出反应液。依次用甲醇、水充分清洗中空纤维多孔膜，得到接枝中空纤维多孔膜，其具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合于聚乙烯主链而形成的接枝链。按照上述的式(1)求出的接枝率为85％。
在装有接枝中空纤维多孔膜的反应容器中放入50体积份浓度的二乙胺水溶液，在30℃下循环5小时，静置一整夜后，排出二乙氨基水溶液。接着，用水充分地清洗中空纤维多孔膜，使其干燥，作为吸附材料得到接枝中空纤维多孔膜，其具有作为接枝链键合与配位体的二乙氨基(DEA)(弱电解性离子交换基团)。按照上述的式(2)求出的配位体转化率为95％。使用该接枝中空纤维多孔膜，组装2个装有有效纤维长度为9.4cm、纤维数为1根的组件。
将一个组件(组件A)直接在90℃加热(干热处理)6小时。干热处理使用强制循环型干燥机作为加热装置，且在大气压下进行。然后，用作为湿热处理液的水充满组件内，在对吸附材料进行了湿润化的状态下，对组件加热(湿热处理)20小时。湿热处理使用水浴作为加热装置，且在大气压下进行。测定湿热处理后的组件A的动态吸附容量A00。使用BSA溶液进行动态吸附容量的测定。
将另一个组件(组件B)直接在90℃加热(干热处理)6小时。然后，用作为湿热处理液的水充满组件内，在对吸附材料进行了湿润化的状态下对组件加热(湿热处理)20小时。接着，在10～30℃的室内环境下保管组件240天。对保管后的组件B实施检定处理，测定检定处理前的动态吸附容量A0和检定处理后的动态吸附容量A1。
进而，对第一次的检定处理后的上述组件B实施第二次的检定处理，测定检定处理后的动态吸附容量A2。
实施例2
作为吸附材料，用与实施例1同样的方法制作表1所示的接枝率、配位体转化率的接枝中空纤维多孔膜。在进行了用清洗用的水润湿的状态开始的干燥后，组装与实施例1同样的组件，在该状态下，使用强制循环型干燥机，在大气压下，在50℃加热48小时，由此进行吸附材料的干热处理。对干热处理后的吸附材料实施表1所示条件的湿热处理。湿热处理通过使热水循环于吸附材料的方法进行。与实施例1同样地测定湿热处理后的吸附材料的动态吸附容量A00、A0及A1。
实施例3
用与实施例1同样地方法制作表1所示的接枝率、配位体转化率的接枝中空纤维多孔膜作为吸附材料。用水清洗后接着通过4小时的加热来干燥吸附材料，使用强制循环型干燥机直接对干燥了的吸附材料，在大气压下，在70℃下加热12小时，由此进行吸附材料的干热处理。干热处理后，组装与实施例1同样的组件，然后，对吸附材料实施表1所示条件的湿热处理。与实施例1同样地测定湿热处理后的吸附材料的动态吸附容量A00、A0及A1。
实施例4
使用丙烯酸代替甲基丙烯酸缩水甘油酯，使其接枝聚合，作为吸附材料制作接枝中空纤维多孔膜，其具有含有羧酸基(弱电解性阳离子交换基团)作为配位体的接枝链。接枝率为35％。由用清洗用的水润湿的状态加热至40℃来干燥吸附材料，使用强制循环型干燥机直接对干燥的吸附材料，在大气压下，在70℃下加热4小时，由此进行吸附材料的干热处理。干热处理后，组装与实施例1同样的组件，然后，对吸附材料实施表1所示的条件的湿热处理。使用溶菌酶溶液作为标准蛋白质溶液，除此以外，与实施例1同样地测定湿热处理后的吸附材料的动态吸附容量A00、A0及A1。
实施例5
在室温下搅拌尼龙6(0.2g)、二氯甲烷(10g)、甲酸0.1g，向其中添加叔丁基次氯酸钠2g，等待尼龙6溶解。进一步向得到的溶液中加入二氯甲烷使整体质量为100g，得到用于形成被膜的N-氯-尼龙6溶液。
将由孔径0.45μm、膜厚0.15mm的纤维素衍生物构成的多孔平板膜(日本Millipore株式会社)浸渍于N-氯代尼龙6溶液中，等待溶液含浸在多孔部中。从含浸了溶液的多孔平板膜中除去多余的溶液，首先在室温下干燥该膜，接着，在80℃的热风循环干燥器内进一步干燥，最后在140℃下加热15分钟，由此，得到平板膜状的基体，其具有纤维素衍生物的多孔平板膜及覆盖其表面的N-氯-尼龙6被膜。
在反应容器内充分搅拌具有甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)5％、Tween80(关东化学株式会社制)0.3％及连二亚硫酸钠0.1％这样的组成的磷酸钠缓冲液(pH7.5)。向该磷酸钠缓冲液中投入上述的平板膜状的基体，在室温下进行12分钟的接枝聚合反应。依次用纯水、丙酮清洗反应后的膜后，在80℃下使其干燥，由此得到接枝多孔平板膜，其具有GMA接枝聚合而形成的接枝链。按照上述式(1)求出的接枝率为8％。
对该接枝多孔平板膜实施与实施例1同样的反应，得到多孔平板膜作为吸附材料，其具有二乙氨基(DEA)(弱电解性离子交换基团)作为与接枝链键合的配位体。按照上述式(2)求出的配位体转化率为96％。
重叠5张得到的接枝多孔平板膜，在该状态下夹在不锈钢制的过滤器支架上，由此组装2个合计膜厚为8mm、有效膜面积为15cm2的组件。然后，对吸附材料实施表1所示条件的干热处理及湿热处理。与实施例1同样地测定湿热处理后的吸附材料的动态吸附容量A00、A0及A1。
比较例1
未进行湿热处理，除此以外，与实施例1同样地制作组件，测定其动态吸附容量A00、A0及A1。
比较例2
未进行干热处理，除此以外，与实施例1同样地制作组件，测定其动态吸附容量A00、A0及A1。
实施例6～11
用与实施例1同样的方法制作表2所示的接枝率、配位体转化率的接枝中空纤维多孔膜作为吸附材料。使用各自的吸附材料组装与实施例1同样的组件。对得到的组件实施表2所示条件的干热处理、湿热处理，除此以外，与实施例1同样地测定吸附材料的吸附容量A0及A1。实施例8的湿热处理利用在吸附材料上循环热水的方法代替水浴加热来进行。实施例10的湿热处理利用将浸渍在90℃的热水浴中状态的组件在90℃的干燥机中加热6小时的方法代替水浴加热来进行。实施例13的湿热处理利用在设定为121℃的高压釜中，在由组件内部被作为湿热处理液的盐缓冲液润湿的状态开始到沥尽多余的液体的状态、且开放壳体的全部喷嘴的状态下，一边加压组件一边加热组件的方法来进行。
将测定结果示于表1及表2。实施例1～13中的任一组件，检定处理前后的动态吸附容量的变化率(A1相对于A0的变化率)均为±5％以内。比较例1、2的组件的检定处理前后的变化率达到约10％～20％。
[表1]
[表2]
关于实施例1～5的组件，确认到动态吸附容量A00和A0中几乎没有差别，长期保管时的稳定性非常优异。与此相比，在检定处理的变化率较大的比较例1、2的情况下，与A0相比动态吸附容量A00大幅降低，长期保管时的稳定性差。由该结果确认到检定处理前后的动态吸附容量的变化少的组件可显示优异的长期保存稳定性。
进而，实施例1的组件在实施了第二次的检定处理后也保持较高的吸附性能。由此可确认到即使为蛋白质的吸附及脱离后的吸附材料也显示较高的稳定性。
标记说明
1…吸附材料(中空纤维多孔膜)，
3…基体，
5…接枝链，
6…吸附层，
7…细孔，
10…蛋白质。

Claims (10)

1.一种制造蛋白质吸附材料的方法，所述蛋白质吸附材料具有基体和固定在所述基体表面的分子链，该方法依次具有以下工序：
干热处理工序，对处理前吸附材料进行加热，所述处理前吸附材料具有所述基体和固定在所述基体的表面的所述分子链，且所述分子链含有弱电解性离子交换基团；
湿热处理工序，在利用液体或蒸汽对所述处理前吸附材料进行了湿润化的状态下加热所述处理前吸附材料，从而得到所述蛋白质吸附材料；
其中，
所述基体为多孔体、且为膜状的形态，
所述分子链为通过接枝聚合形成的接枝率为5％～200％的直链状高分子链，
所述干热处理工序中包括在40℃～130℃下对所述处理前吸附材料加热1小时以上。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述干热处理工序之前还具有将所述分子链固定在所述基体表面上的分子链形成工序。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白质吸附材料的牛血清白蛋白或溶菌酶的动态吸附容量为5mg/mL以上。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述湿热处理工序中包括在利用液体或蒸汽对所述处理前吸附材料进行了湿润化的状态下，在40℃～120℃下对所述处理前吸附材料加热30分钟以上。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述湿热处理工序后，保持所述蛋白质吸附材料的湿润化状态。
6.一种蛋白质吸附材料，其具有基体和固定在所述基体表面的分子链，且所述分子链含有弱电解性离子交换基团，其中，
在进行如下检定处理时，该检定处理前后，该蛋白质吸附材料的动态吸附容量变化率在±5％以内，
所述检定处理是在50℃下对经过含1mol/L氯化钠的20mMTris-盐酸缓冲液湿润化的该蛋白质吸附材料加热8小时；
所述基体为多孔体、且为膜状的形态，
所述分子链为通过接枝聚合形成的接枝率为5％～200％的直链状高分子链。
7.如权利要求6所述的蛋白质吸附材料，其中，所述分子链与形成所述基体的化合物共价键合。
8.如权利要求6或7所述的蛋白质吸附材料，其中，所述基体为中空纤维状。
9.如权利要求6或7所述的蛋白质吸附材料，其中，所述弱电解性离子交换基团为叔氨基。
10.一种组件，其具有权利要求6～9中任一项所述的蛋白质吸附材料。
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