TW201330926A - 蛋白質吸附材料 - Google Patents

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Naoyuki Shinohara
Yuta Sato
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Asahi Kasei Chemicals Corp
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Abstract

本發明揭示一種製造具有基體及固定於基體之表面之分子鏈之蛋白質吸附材料的方法。該方法依序包括如下步驟：乾熱處理步驟，其對具有基體及固定於基體之表面之分子鏈，且分子鏈包含弱電解性離子交換基之處理前吸附材料進行加熱；及濕熱處理步驟，其對處理前吸附材料於藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態下進行加熱而獲得蛋白質吸附材料。

Description

蛋白質吸附材料
本發明係關於一種蛋白質吸附材料。又，本發明係關於一種具備蛋白質吸附材料之管柱及模組。
例如於專利文獻1~5中揭示有關於用於蛋白質之大量純化之蛋白質吸附材料的技術。
於專利文獻1中揭示有包括使用孔隙表面具有接枝鏈且該接枝鏈上固定有陰離子交換基之多孔膜進行過濾之步驟的蛋白質之純化方法。
於專利文獻2中揭示有多孔質基材由具有鍵結有一級胺基之交聯聚合物之吸附材料被覆的多孔質吸附介質。
於專利文獻3中揭示有包含延續存在複數個孔之支持體構成構件、及配置於該支持體構成構件之孔中且填滿該支持體構成構件之孔之大多孔質交聯凝膠而成的複合材料，且其適於用於藉由吸附進行物質之分離。
於專利文獻4中提供一種包含具有陽離子官能基之交聯覆膜、及多孔質基材之帶正電之多孔質膜，且揭示有其可用於蛋白質、核酸、內毒素之類之生物分子之過濾、純化。
於專利文獻5中揭示有高分子基材粒子之表面經由高分子鏈固定有具有蛋白質吸附能力之官能基之可進行蛋白質等之高速吸附純化的吸附體及其製造方法。
於專利文獻6中揭示有藉由導入有通常已知作為可與蛋 白質相互作用之官能基之胺基或磺酸基的覆膜，而進行基材之表面改質之例。於專利文獻6中揭示有於高分子多孔質基材膜表面形成經N-鹵化之化合物(聚合物或聚合物前驅物)之覆膜，使接枝起始劑與單體接觸而於基材上進行接枝聚合的方法。進而，記載有藉由如下方式而獲得之膜：使作為上述單體之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA，glycidyl methacrylate)接枝聚合，其後，於GMA之環氧基上藉由二級/三級胺導入三級胺基/四級銨基，或藉由利用磺酸離子之處理使環氧基磺化。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/054226號
[專利文獻2]日本專利特開2009-53191號公報
[專利文獻3]日本專利特表2006-519273號公報
[專利文獻4]美國專利第6780327號說明書
[專利文獻5]日本專利特開2008-45906號公報
[專利文獻6]美國專利第5547575號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Kyoichi Saito, CHARGED POLYPER BRUSH GRAFTED ONTO POROUS HOLLOW - FIBER MEMBRANE IMPROVES SEPARATION AND REACTION IN BIOTECNOLOGY, Separation Science and Technology, ENGLAND, Taylar & Francis, 2002, 37 (3), 535 - 554
藉由如例如專利文獻1、5、6中所揭示之使包含具有蛋白質吸附能力之官能基之分子鏈固定於高分子成形體或其覆膜之表面而成的吸附材料，就吸附性能及純化處理速度之方面而言，某種程度上可期待達成較高之等級。
然而，關於具有該構成之吸附材料詳細地進行了研究，結果可明確：存在吸附性能之變動較大之傾向，該情況於吸附材料之實用化時可成為較大之問題。具體而言，於剛製造後與長期保管後，吸附性能之差容易變大。因此，預測吸附失效之時間點較為困難，例如使用大量吸附材料之純化設備之設計及運轉條件之設計較為困難，又，亦存在容易產生應吸附去除之成分之洩漏而發生純化液之品質降低之問題。
因此，本發明之主要目的在於對具有含有具有蛋白質吸附能力之弱電解性離子交換基，且固定於具有高分子成形體之基體之表面之分子鏈的蛋白質吸附材料改善吸附性能之穩定性。
本發明者等人為解決上述課題進行努力研究，結果發現使用特定之濕潤條件下對吸附材料進行檢定處理時之吸附容量之變化率作為指標對達成上述目的較為有效，基於上述見解完成本發明。
即，本發明係關於以下內容。
[1]
一種蛋白質吸附材料之製造方法，其係製造具有基體及固定於上述基體之表面之分子鏈之蛋白質吸附材料的方法，且依序包括如下步驟：乾熱處理步驟，其對具有上述基體及固定於上述基體之表面之上述分子鏈，且上述分子鏈含有弱電解性離子交換基的處理前吸附材料進行加熱；及濕熱處理步驟，其對上述處理前吸附材料於藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態下進行加熱而獲得上述蛋白質吸附材料。
[2]
如上述[1]之方法，其進而包括於上述乾熱處理步驟之前在上述基體之表面固定上述分子鏈的分子鏈形成步驟。
[3]
如上述[1]或[2]之方法，其中上述蛋白質吸附材料之牛血清白蛋白或溶菌酶之動態吸附容量為5 mg/mL以上。
[4]
如上述[1]至[3]中任一項之方法，其中上述乾熱處理步驟包括將上述處理前吸附材料於40℃~130℃下加熱1小時以上之內容。
[5]
如上述[1]至[4]中任一項之方法，其中上述濕熱處理步驟包括將上述處理前吸附材料於藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態下，於40~120℃下加熱30分鐘以上的內容。
[6]
如上述[1]至[5]中任一項之方法，其中於上述濕熱處理步驟之後，維持上述蛋白質吸附材料之濕潤化之狀態。
[7]
一種蛋白質吸附材料，其係具有基體及固定於上述基體之表面之分子鏈，且上述分子鏈含有弱電解性離子交換基者，且於進行將藉由含有1 mol/L之氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液而濕潤化之該蛋白質吸附材料於50℃下加熱8小時的檢定處理時，該檢定處理前後之該蛋白質吸附材料之動態吸附容量之變化率為±5%以內。
[8]
如上述[7]之蛋白質吸附材料，其中上述分子鏈與形成上述基體之化合物共價鍵結。
[9]
如上述[7]或[8]之蛋白質吸附材料，其中上述基體為多孔質體。
[10]
如上述[7]至[9]中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述基體為中空纖維狀。
[11]
如上述[7]至[10]中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述弱電解性離子交換基為三級胺基。
[12]
如上述[7]至[11]中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述 分子鏈為藉由接枝聚合而形成之直鏈狀之高分子鏈。
[13]
一種模組，其具備如上述[7]至[12]中任一項之蛋白質吸附材料。
[14]
一種管柱，其具備如上述[7]至[12]中任一項之蛋白質吸附材料。
根據本發明，可對具有含有具有蛋白質吸附能力之弱電解性離子交換基，且固定於具有高分子成形體之基體之表面之分子鏈的蛋白質吸附材料改善吸附性能之穩定性。由於吸附性能穩定，故而即便於構成使用吸附材料之大型純化裝置之情形時，純化設備之設計及運轉條件之設計亦較為容易，純化液之品質降低之危險性較小。
以下，針對本發明之較佳之實施形態詳細地進行說明。然而，本發明並不限定於以下實施形態，可於其主旨之範圍內進行各種變形而實施。
圖1係表示蛋白質吸附材料之一實施形態之模式圖。圖1所示之吸附材料1包括：具有含有高分子化合物之高分子成形體之基體3、及固定於基體3之表面之分子鏈5。分子鏈5含有具有蛋白質吸附能力之弱電解性離子交換基。分子鏈5形成吸附層6。本實施形態之高分子成形體之一例係形成有孔隙7之多孔質體，且於含有蛋白質之溶液通過孔 隙7時，蛋白質10主要基於弱電解性離子交換基之作用而吸附於吸附材料1。
於進行將藉由含有1 mol/L之氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液(以下有時稱為「鹽緩衝液」)而濕潤化之吸附材料1於50℃下加熱8小時的檢定處理時，該檢定處理前後之吸附材料1之動態吸附容量之變化率較小。有若該變化率充分小，則吸附材料之吸附性能穩定之傾向。具體而言，該變化率較佳為±5%以內，更佳為±3%以內，進而較佳為±2%以內。用於變化率測定之動態吸附容量之測定方法並無特別限制，於檢定處理前後在實質上相同之條件下測定動態吸附容量以可進行比較。針對變化率之測定方法之詳細內容，於下述之實施例中進行說明。
本實施形態之蛋白質吸附材料之上述檢定處理後之牛血清白蛋白或溶菌酶之動態吸附容量例如為5 mg/mL以上。由於謀求吸附更多蛋白質之蛋白質吸附材料，故而動態吸附容量較佳為10 mg/mL以上，更佳為20 mg/mL以上。
構成基體3之高分子成形體係包含高分子化合物，且具有特定形狀之構件，例如可將包含高分子化合物之材料成形為特定形狀而獲得。基體3例如可為高分子成形體本身，亦可包含高分子成形體及形成於高分子成形體之表面上之下述覆膜(圖1係基體3為高分子成形體本身之情形時之模式圖，於圖中未標出形成於高分子成形體之表面之覆膜)。基體3通常具有與高分子成形體相同之形狀。高分子成形體可為具有平板膜、不織布、中空纖維膜、單塊體或 顆粒之形態之多孔質體。多孔質體可增大吸附表面積，故而較佳。就可達成操作之容易性及較高之純化處理速度之方面而言，更佳為平板膜及中空纖維狀之類之膜狀之形態。就規模放大性、模組成型時之流路構造簡單之方面而言，尤佳為中空纖維多孔膜。於本實施形態中，所謂「中空纖維多孔膜」，意指由內壁形成中空部分之圓筒狀或纖維狀之多孔質體。中空纖維多孔膜之中空側(內側)與外側藉由作為貫通孔之孔隙連接。中空纖維多孔膜具有使液體或氣體藉由其孔隙而自內側向外側或自外側向內側透過之性質。中空纖維多孔膜之外徑及內徑只要可物理上使多孔膜保持形狀，則並無特別限定。或，高分子成形體只要為可使蛋白質之溶液接觸於其表面之形態，則亦可為非多孔質體。作為非多孔質體，例如可列舉膜、非多孔質顆粒、纖維、毛細管。
於高分子成形體為膜狀之多孔質體之情形時，其孔徑較佳為0.01 μm~10 μm，更佳為0.05 μm~7 μm，進而較佳為0.1 μm~1 μm。多孔質體中之孔隙所佔之體積比率即孔隙率只要為保持多孔質體之形狀且通液時之壓力損失無實用上問題之範圍，則並無特別限定，較佳為5%~99%，更佳為10%~95%，進而較佳為30~90%。孔徑及孔隙率之測定例如可藉由Marcel Mulder著之「膜技術」(IPC股份有限公司)中所記載般之對業者而言通常之方法進行。作為其具體例，可列舉利用電子顯微鏡之觀察、泡點法、水銀壓入法、透過率法。
作為形成構成基體3之高分子成形體之高分子化合物，並無特別限定，為保持機械性質，較佳為聚烯烴系聚合物、聚碸、聚醚碸、纖維素、纖維素衍生物。聚烯烴系聚合物例如可選自乙烯、丙烯、丁烯及偏二氟乙烯等烯烴之均聚物、兩種以上之該烯烴之共聚物、以及一種或兩種以上之烯烴與全鹵化烯烴之共聚物。於該等高分子之中，就機械強度尤其優異之方面而言，較佳為聚乙烯、聚偏二氟乙烯及聚碸，於利用放射線接枝聚合法形成分子鏈5之情形時，更佳為聚乙烯。
於基體3之表面之至少一部分上存在由含有弱電解性離子交換基之分子鏈5形成之吸附層6。由該分子鏈5形成之吸附層6之形態只要於加熱步驟、或蛋白質之吸附/解吸步驟中不會有吸附層6之溶解或通液時之壓力上升等問題，則並無特別限定。分子鏈5例如藉由共價鍵、被覆或吸附而固定於基體3上。分子鏈5較佳為與形成高分子成形體之高分子化合物、或形成在高分子成形體之表面上形成之下述覆膜之化合物共價鍵結的接枝鏈。
藉由分子鏈5形成之吸附層6之狀態並無限定。例如，分子鏈5可為直鏈狀之分子鏈，亦可為具有交聯結構之高分子鏈。於具有交聯結構之分子鏈之情形時，可為分子鏈彼此於基體表面上鬆弛地相互交聯之凝膠狀之吸附層，亦可為分子鏈彼此牢固地相互交聯之皮狀之吸附層。
分子鏈5具有弱電解性離子交換基作為其側鏈基、末端基、或構成主鏈之結構單元。分子鏈5所具有之弱電解性 離子交換基例如可為弱電解性陽離子交換基、或弱電解性陰離子交換基。作為弱電解性陽離子基，可列舉羧酸基(-COO-)、磷酸基(-PO3 -、-PO3 2-)及磷酸酯基(-PO3R-)。弱電解性陰離子交換基例如可為一級胺基(-NH2)、二級胺基(-NRH)、或三級胺基(-NR2)。於該等離子交換基中，R並無特別限定，尤其是於三級胺基之情形時，鍵結於同一N之R可相同亦可不同。R較佳為表示烷基、芳基、芳烷基等烴基。三級胺基例如可作為二乙基胺基乙基(DEAE(diethyl aminoethyl)、-(CH2)2-NEt2)、或二乙基胺基丙基(DEAP(diethyl aminopropyl)、-(CH2)3-NEt2)而導入分子鏈(接枝鏈)中。
基體3亦可進而具有利用與上述高分子成形體不同之材料或不同之微結構之高分子化合物覆蓋高分子成形體表面之至少一部分的覆膜。於此情形時，複數個分子鏈5之一部分或全部亦可固定於該覆膜之表面。覆膜例如可由藉由凝聚或吸附來塗佈尼龍等高分子化合物而形成，例如可藉由胺基甲酸酯樹脂等反應性塗佈材料而利用網狀塗佈形成，亦可藉由對高分子成形體表面之共價鍵結而形成。為防止被覆自吸附材料脫離，較佳為藉由網狀塗佈或共價鍵結而於高分子成形體上形成被覆。
本實施形態之吸附材料1例如可藉由依序包括如下步驟之方法而製造：獲得包含具有高分子成形體之基體3、及固定於基體3之表面之分子鏈5，且分子鏈5含有弱電解性離子交換基的處理前吸附材料之步驟(分子鏈形成步驟)； 加熱處理前吸附材料之步驟(乾熱處理步驟)；及將處理前吸附材料藉由液體或蒸氣而濕潤化後進行加熱之步驟(濕熱處理步驟)。
於基體3之表面導入分子鏈5之方法並無特別限定。有如下方法：藉由對高分子成形體之放射線照射而產生自由基，藉由自形成高分子成形體之高分子化合物之接枝聚合而形成作為分子鏈5之接枝鏈的方法；使具有弱電解性離子交換基之高分子化合物附著於基體後，藉由交聯劑將作為分子鏈5之高分子化合物固定於基體表面的方法；及形成覆蓋高分子成形體表面之聚合物或聚合物前驅物之覆膜而製成基體3後，由構成其覆膜之高分子化合物形成作為分子鏈5之接枝鏈的方法等。尤其是於期待形成高分子成形體或覆蓋其表面之覆膜之高分子化合物與分子鏈5之共價鍵所形成之牢固之鍵結的情形時，較佳為藉由自形成高分子成形體或覆膜之高分子化合物之接枝聚合而導入分子鏈5的方法。
於藉由自形成高分子成形體或覆膜之高分子化合物之接枝聚合導入分子鏈5之情形時，可採用：(1)使具有弱電解性離子交換基之單體直接聚合之方法，或(2)藉由自高分子化合物之接枝聚合而導入含有反應性官能基之接枝鏈，繼而，藉由反應性官能基之反應而將弱電解性離子交換基導入接枝鏈的方法。
(1)之方法可利用一階段之反應導入分子鏈5，因此較為簡便。作為上述單體並無特別限定，可列舉甲基丙烯酸酯 衍生物、乙烯基化合物、烯丙基化合物等。例如，上述單體可選自甲基丙烯酸二乙基胺基乙酯、烯丙基胺、丙烯酸、及甲基丙烯酸。
就弱電解性離子交換基之種類、及弱電解性離子交換基之導入率之選擇範圍較廣之方面而言，(2)之方法較為有利。作為利用該方法進行接枝聚合之單體，較佳為具有反應性較高之環氧基之甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)。即，分子鏈5較佳為由聚甲基丙烯酸縮水甘油酯鏈衍生之高分子鏈。
分子鏈5之量、及導入至分子鏈5之弱電解性離子交換基之量只要無通液時之壓力上升等問題，則並無特別限定。以下，對分子鏈5及弱電解性離子交換基之量列舉上述(2)之利用接枝聚合之方法之情形之例進行說明。
通常，接枝鏈對基體之鍵結率(接枝率，dg[%])係如下述式(1)所示，基於因導入接枝鏈而增加之質量進行定義。
W0：反應前之高分子成形體質量(g)
W0'：接枝鏈導入前之基體質量(g)
W1：接枝鏈導入後之總體質量(g)
於式(1)中，於基體由高分子成形體本身構成之情形時，W0'=W0。
弱電解性離子交換基相對於接枝鏈中之反應性官能基 (可導入弱電解性離子交換基之官能基)之存在比率係以式(2)所表示之「配位基轉化率」進行整理。即，弱電解性離子交換基之存在比率係以相對於接枝鏈中之反應性官能基之莫耳數的導入至接枝鏈之弱電解性離子交換基之莫耳數表示。例如，於接枝鏈係GMA之聚合物，且藉由GMA之環氧基與二乙基胺之反應而導入二乙基胺基之情形時，將GMA之分子量142 g/mol代入式(2)之M1中，將二乙基胺之分子量73 g/mol代入M2中。
W0'：接枝鏈導入前之基體質量(g)
W1：接枝鏈導入後之總體質量(g)
W2：弱電解性離子交換基導入後之總體質量(g)
M1：形成接枝鏈之單體單元之分子量(g/mol)
M2：弱電解性離子交換基之分子量(g/mol)
就同時確保更高之吸附容量及力學上穩定之強度之觀點而言，接枝率較佳為5%~200%，更佳為20%~150%，進而較佳為30%~90%。就獲得更高之吸附容量之觀點而言，配位基轉化率較佳為20%~100%，更佳為50%~100%，進而較佳為70%~100%。
於本實施形態之方法之情形時，乾熱處理係藉由加熱乾燥之狀態、換言之至少一部分未藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態的處理前吸附材料而進行。該乾熱處理可對處理前 吸附材料本身實施，亦可以將處理前吸附材料包裝於外殼內之形態(例如模組、管柱等)進行。任一情形實質上均發揮相同之效果。
導入有分子鏈5之處理前吸附材料例如可於用以藉由液相反應而導入分子鏈5之反應溶劑、或反應後之洗淨等所使用之液體(例如水分)附著於基體的狀態下獲得。或者，亦有於藉由氣相反應導入分子鏈5而實質上未於基體上附著液體之狀態下獲得處理前吸附材料的情況。對於利用液相反應而製造之處理前吸附材料，於進行乾熱處理之前，進行預先去除附著於基體之液體之乾燥處理，使處理前吸附材料之至少一部分成為未藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態。又，亦可將一系列之加熱步驟之前半部分設為用以使至少一部分成為未藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態的乾燥處理，將其接著的後半部分設為本實施形態之乾熱處理。用於乾熱處理之加熱溫度及加熱時間係以縮小上述檢定處理前後之吸附材料之動態吸附容量之變化率，充分地獲得吸附性能之穩定化之效果的方式加以調整。又，加熱溫度及時間係於使處理前吸附材料充分乾燥之溫度及時間以上且未產生強度劣化或熔解之溫度及時間以下之範圍內加以調整。進而，於實施將處理前吸附材料組裝於外殼(例如模組、管柱等)中之步驟之情形時，可於達成將外殼與處理前吸附材料接著之密封材料之完全硬化的溫度及時間內加以調整。具體而言，該加熱溫度較佳為40~130℃，更佳為45℃~110℃，進而較佳為50~95℃。加熱時間較佳為 1~150小時以上，更佳為2~100小時，進而較佳為4~60小時。
繼乾熱處理之後，進行藉由液體或蒸氣使處理前吸附材料濕潤化，其後加熱濕潤化之狀態之處理前吸附材料的濕熱處理。藉由該乾熱處理與濕熱處理之組合，可高效地製造上述檢定處理中之變化率較小之吸附材料。發揮該作用之機制雖未必明確，但認為其原因在於，藉由依序組合乾熱處理與濕熱處理，可使分子鏈效率良好地再次整齊排列，藉此，分子鏈之形態穩定化。例如，認為於乾熱處理中由於基體本身之高分子結構鬆動而解放束縛於基體表面附近之分子鏈結構，或藉由在乾熱處理中使分子鏈暫時經過縮緊之狀態，而於其後之濕熱處理中分子鏈再次延伸時，可使分子鏈效率良好地再次整齊排列，藉此使分子鏈之形態穩定化。
於本實施形態中，所謂「濕潤化之狀態」，係指藉由液體(濕熱處理液)使處理前吸附材料之表面(例如孔隙表面)濕潤之狀態。於使處於乾燥狀態之處理前吸附材料濕潤化之情形時，可藉由於暫時對吸附材料進行親水化處理之後，最終以濕熱處理液進行置換，從而進行濕潤化。親水化處理例如可利用使水、醇水溶液、醇、蒸氣與處理前吸附材料接觸之方法進行。可藉由加壓及/或加熱來加速親水化。其中，利用醇或醇水溶液之親水化處理可以各種原材料或形狀實施。又，可利用醇或醇水溶液使處理前吸附材料濕潤，並暫時利用純水置換醇或醇水溶液後，最終藉 由濕熱處理液使處理前吸附材料成為濕潤之狀態。作為濕潤化之一例，有如下方法：藉由使處理前吸附材料與乙醇或乙醇水溶液接觸，並緩緩地提高純水之比率而暫時將乙醇或乙醇水溶液置換成純水，最終置換成濕熱處理液。置換成濕潤處理液之方法只要利用濕潤處理液充分地置換處理前吸附材料，則並無限定。例如於處理前吸附材料為膜狀之情形時，為充分地進行親水化或向溶液之置換，使濕潤處理液通液之方法較為有效。
於本說明書中，所謂吸附材料之「濕潤化之狀態」，更具體而言，意指濕潤度例如為0.1以上之狀態。濕潤度之測定可利用以下程序進行。
1.於管柱或模組中之吸附材料之情形時，將該等解體而取出固定量之吸附材料。
2.使附著於吸附材料之多餘之填充保存液止滴之後，測定吸附材料之含液時質量WW。
3.利用乙醇、水充分洗淨附著有填充保存液之吸附材料之後，於65℃之烘箱中乾燥16小時，測定吸附材料之乾燥質量WD。
4.根據吸附材料之含液時重量WW、乾燥重量WD，由以下之式計算濕潤度。
濕潤度=(WW-WD)/WD
濕熱處理中之加熱溫度及加熱時間係以縮小上述之檢定處理前後之吸附材料之動態吸附容量之變化率，充分地獲得吸附性能之穩定化之效果之方式加以調整。具體而言， 該加熱溫度較佳為40~130℃或40~120℃。就實施確實之加熱方面而言，更佳為50~130℃或50~120℃。若考慮例如處理設備維護之簡便性或經濟性，則更佳為將濕潤處理液用作水於50~99℃下實施，進而較佳為於70~99℃下實施。又，例如於將濕熱處理兼作為殺菌處理而實施之情形時，更佳為100~130℃，進而更佳為121℃~130℃。就實施確實之加熱之方面而言，加熱時間較佳為30分鐘以上，更佳為1小時以上，進而較佳為3小時以上。
加熱處理前吸附材料之方法只要為充分地加熱濕潤化之狀態之處理前吸附材料，對吸附材料之機械強度無影響之範疇，則並無特別限定。該濕熱處理可對處理前吸附材料本身實施，亦可以將處理前吸附材料包裝於外殼內之形態(例如模組、管柱等)進行，任一情形實質上均發揮相同之效果。加熱之方法有利用熱水浴之加熱、利用藉由高壓釜之高壓下水蒸氣接觸之加熱，亦可藉由加熱之濕潤處理液之通液或濕潤處理液之蒸氣之通氣而進行處理前吸附材料之濕熱處理。於自外殼外側加熱之情形或進行利用高壓釜之加熱之情形時，外殼內之溶液之填充量亦並無限定，濕熱處理液可為止滴狀態，亦可為滿液狀態。
為使處理前吸附材料濕潤化，濕熱處理液較佳為純水或水溶液。於加熱溫度為110℃以下之情形時，例如可列舉純水、緩衝液、無機鹽之水溶液、或含有無機鹽之緩衝液。通常於將蛋白質吸附於材料時，使用溶解有蛋白質之緩衝液，於進行解吸時，使用含有氯化鈉之緩衝液。因 此，使用緩衝液作為濕熱處理液較為簡便。於加熱溫度超過110℃且為130℃以下之情形時，處理液較佳為含有無機鹽之水溶液。於該情形時，陽離子種、陰離子種、價數並無限定。例如，作為一價陽離子，可列舉鋰離子、鈉離子、鉀離子，作為二價陽離子，可列舉鎂離子、鈣離子等。作為陰離子種，可列舉氫氧化物離子、氯化物離子、溴離子、硫酸根離子、硝酸根離子等，其與陽離子之組合並無限定。就通常用作蛋白質溶出液、或洗淨液之方面而言，較佳為含有無機鹽之緩衝液、或氫氧化鈉水溶液，更佳為含有氯化鈉之緩衝液。金屬離子之濃度較佳為0.05 mol/L以上，更佳為0.1 mol/L以上，進而較佳為1 mol/L以上。
認為藉由本實施形態之乾熱處理及繼其後之濕熱處理，可促進被覆基體之分子鏈之再次排列，使吸附性能穩定化。完成有效之再次排列之處理前吸附材料較佳為具有自基體直接形成之直鏈狀之接枝高分子鏈，或鬆弛地相互交聯而形成凝膠狀覆膜之高分子鏈。更佳為具有自基體直接形成之直鏈狀之接枝高分子鏈的處理前吸附材料。若對該等處理前吸附材料進行濕熱處理，則可尤為明顯地獲得使吸附性能穩定化之效果。
供至乾熱處理及濕熱處理之處理前吸附材料未必必需為未使用之吸附材料(一次都未吸附蛋白質之吸附材料)。例如，可使用反覆進行吸附及解吸而降低吸附容量之吸附材料，或藉由與本實施形態不同之熱處理而降低吸附容量之 吸附材料作為處理前吸附材料，對其實施濕熱處理。
濕熱處理後，所獲得之吸附材料可維持濕潤化之狀態。例如可於濕熱處理後直至用於蛋白質吸附為止之期間維持吸附材料之濕潤化之狀態。濕熱處理後之吸附材料之濕潤度可維持於0.1以上，亦可維持於0.5以上或1.0以上。濕潤度之上限並無特別限制，濕潤度例如可為3.0以下。
為了維持吸附材料之濕潤化之狀態，可於對模組或管柱中之吸附材料進行濕熱處理之後，將濕熱處理液置換成水、醇或醇水溶液等填充保存液，亦可保持藉由濕熱處理液而濕潤化之狀態。於保管中填充保存液中之水分揮發而難以維持濕潤化之狀態之情形時，亦可採用含有甘油等保濕劑之填充保存液。又，於期待殺菌或抑菌效果之情形時，可使用乙醇水溶液作為填充保存液。
為了使吸附材料維持濕潤之狀態，可以填充保存液填滿模組或管柱內，亦可捨棄多餘之填充保存液而設為所謂止滴狀態。
本實施形態之吸附材料例如可以管柱或模組之狀態用於蛋白質之分離純化等中。模組例如包含膜狀之吸附材料、及收容該吸附材料之外殼。尤其是於吸附材料為中空纖維膜之情形時，模組亦可具備兩端具有開口部之外殼、及固定於外殼內之一根或複數根中空纖維膜。使自外殼開口部側之管口供給之溶解有蛋白質之液體自中空纖維內側向外側於膜中通液，並自安裝於外殼側面之管口排出。管柱例如包含粒子狀之吸附材料、及收容該吸附材料之筒狀之容 器。
[實施例]
以下，列舉實施例進一步具體地說明本發明。但本發明並不限定於該等實施例。
於以下之實施例及比較例中，動態吸附容量及檢定處理前後之動態吸附容量之變化率之測定係按照以下程序進行。
(動態吸附容量之測定方法)
作為用以測定動態吸附容量之指標蛋白質溶液，以下述程序一併製作BSA(Bovine Serum Albumin)(牛血清白蛋白，Sigma-Aldrich製造)用於含有弱電解性陰離子交換基(二乙基胺基)之吸附材料用，製作溶菌酶(Sigma-Aldrich製造)用於含有弱電解性陽離子交換基(羧酸基)之吸附材料用。於pH值調整為8之20 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液(以下稱為「緩衝液」)中，使BSA或溶菌酶以1 g/L之濃度溶解。使所獲得之指標蛋白質溶液(BSA溶液或溶菌酶溶液)通過0.45 μm之過濾器。
將模組連接於HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析儀)系統(GE Healthcare Japan之AKTAexplorer100)。以5 MV/min之送液速度依序使緩衝液(50 MV)、指標蛋白質溶液(67 MV)、緩衝液(17 MV)、及含有1 mol/L之氯化鈉之緩衝液(鹽緩衝液)(25 MV)通液。此處，所謂「MV」意指膜體積，「1 MV」相當於使與膜體積相同之液量通液。膜體積之算出方法於下 文進行敍述。第1次緩衝液通液係以膜之平衡化為目的而進行，指標蛋白質溶液供給後之第2次緩衝液通液係以洗淨未吸附之指標蛋白質為目的而進行。進而，其後之鹽緩衝液之通液係以溶出吸附之指標蛋白質為目的而進行。
通液速度可於吸附材料及其模組可維持形狀並維持吸附功能之範圍內任意設定。通液之各液體之量只要為充分地置換先前通過之液體(例如於第1次緩衝液通液之情形時，係使吸附材料濕潤化之填充液)而達成該液體之目的(例如平衡化、洗淨)之量即可，可根據評價之模組之尺寸而任意地設定。可對使各液體向吸附材料通液後之該液體監控pH值、導電度、吸光度，由成為平衡狀態之情況而確認通液量充分。
一面使指標蛋白質溶液通液，一面測定自模組排出之濾液於波長280 nm中之吸光度，確認濾液之吸光度相對於原液(通液前之指標蛋白質溶液)之吸光度的比成為10%之時間點的濾液量。基於濃度1 g/L將該濾液量換算成指標蛋白質之質量，算出吸光度之比成為10%之時間點之指標蛋白質吸附量[mg]。進而，將算出之值再除以膜體積(於中空纖維之情形時，係根據中空纖維內外徑、有效纖維長計算之圓環部之體積)，藉此求出單位膜體積之指標蛋白質(BSA或溶菌酶)之吸附容量(mg/mL)。該值稱為「動態吸附容量」，通常用於生物技術之領域。
(檢定處理前後之變化率)
準備利用上述方法預先測定動態吸附容量、填充有鹽緩 衝液(含有1 mol/L之氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液，pH值8)之模組。於指標蛋白質吸附於吸附材料之情形時，使鹽緩衝液於模組中通液而使指標蛋白質溶出。於未填充鹽緩衝液之情形時，使鹽緩衝液充分地通液，確認通液後之該鹽緩衝液之導電度為65 mS/cm以上(HORIBA公司製造之CONDUCTIVITY METER B-173)。將使液體流路密閉之模組投入至預先設定為50℃之水浴中，於50℃下持續加熱8小時(檢定處理)。藉由上述方法測定檢定處理後之模組之動態吸附容量。藉由下述式，求出檢定處理後之動態吸附容量相對於檢定處理前之動態吸附容量的變化程度作為檢定處理前後之變化率(%)。
檢定處理前後之變化率=(檢定處理後之動態吸附容量/檢定處理前之動態吸附容量)×100-100
實施例1
吸附材料(具有接枝鏈之中空纖維多孔膜)之製造
預先混合微粉矽酸(Aerosil R972等級)27.2質量份、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，dibutyl phthalate)54.3質量份、及聚乙烯樹脂粉末(旭化成Sunfine SH-800等級)18.5質量份，利用雙軸擠出機擠出成中空纖維狀，獲得中空纖維狀之膜。繼而，藉由將該膜依序浸漬於二氯甲烷及氫氧化鈉水溶液中而萃取鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)及矽酸，其後，實施水洗、乾燥處理，獲得作為聚乙烯之成形體之中空纖維多孔膜。
將所獲得之中空纖維多孔膜放置於密閉容器中，利用氮 氣置換容器內。繼而，將放有中空纖維多孔膜之密閉容器與乾冰一併放置於發泡苯乙烯製之箱中，一面進行冷卻一面照射γ射線200 kGy，使聚乙烯產生自由基而使中空纖維多孔膜活化。
使活化之中空纖維多孔膜於氮氣環境之密閉容器內恢復至室溫。其後，將中空纖維多孔膜投入至反應容器中，密閉而設為真空狀態(100 Pa以下)。將混合甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)5質量份與甲醇95質量份並進行氮氣發泡而預先準備之反應液利用壓力差送液至真空狀態之反應容器內。使送液之反應液於40℃下循環4小時，並靜置一整夜後，排出反應液。以甲醇、水之順序充分洗淨中空纖維多孔膜，獲得聚乙烯主鏈上具有使甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝聚合而形成之接枝鏈的接枝中空纖維多孔膜。藉由上述式(1)求出之接枝率為85%。
於放入有接枝中空纖維多孔膜之反應容器中添加50體積份濃度之二乙基胺水溶液，於30℃下循環5小時，並靜置一整夜後，排出二乙基胺基水溶液。繼而，利用水充分地洗淨中空纖維多孔膜並使其乾燥，獲得具有作為鍵結於接枝鏈之配位基之二乙基胺基(DEA，diethyl amino)基(弱電解性離子交換基)的接枝中空纖維多孔膜作為吸附材料。藉由上述式(2)求出之配位基轉化率為95%。使用該接枝中空纖維多孔膜，組裝兩個纖維有效長度為9.4 cm、纖維根數為1根之模組。
將一模組(模組A)直接於90℃下加熱6小時(乾熱處理)。 乾熱處理係使用強制循環型乾燥機作為加熱裝置於大氣壓下進行。其後，利用作為濕熱處理液之水將模組內填滿，於使吸附材料濕潤化之狀態下將模組加熱20小時(濕熱處理)。濕熱處理係使用水浴作為加熱裝置於大氣壓下進行。測定濕熱處理後之模組A之動態吸附容量A00。動態吸附容量之測定係使用BSA溶液進行。
將另一模組(模組B)直接於90℃下加熱6小時(乾熱處理)。其後，利用作為濕熱處理液之水將模組內填滿，於使吸附材料濕潤化之狀態下將模組加熱20小時(濕熱處理)。繼而，將模組於10~30℃之室內環境下保管240天。對保管後之模組B實施檢定處理，測定檢定處理前之動態吸附容量A0、及檢定處理後之動態吸附容量A1。
進而，對第1次檢定處理後之上述模組B實施第2次檢定處理，測定檢定處理後之動態吸附容量A2。
實施例2
利用與實施例1相同之方法製作表1所示之接枝率、配位基轉化率之接枝中空纖維多孔膜作為吸附材料。自利用洗淨用之水濕潤之狀態乾燥後，組裝與實施例1相同之模組，於該狀態下，使用強制循環型乾燥機於大氣壓下、50℃下加熱48小時，藉此進行吸附材料之乾熱處理。對乾熱處理後之吸附材料實施表1所示之條件之濕熱處理。濕熱處理係藉由使熱水於吸附材料中循環之方法進行。以與實施例1相同之方式測定濕熱處理後之吸附材料之動態吸附容量A00、A0及A1。
實施例3
利用與實施例1相同之方法製作表1所示之接枝率、配位基轉化率之接枝中空纖維多孔膜作為吸附材料。藉由繼利用水之洗淨後加熱4小時而乾燥吸附材料，使用強制循環型乾燥機對乾燥之吸附材料直接於大氣壓下、70℃下加熱12小時，藉此進行吸附材料之乾熱處理。於乾熱處理之後，組裝與實施例1相同之模組，其後，對吸附材料實施表1所示之條件之濕熱處理。以與實施例1相同之方式測定濕熱處理後之吸附材料之動態吸附容量A00、A0及A1。
實施例4
使用丙烯酸代替甲基丙烯酸縮水甘油酯，使其接枝聚合，製作具有含有作為配位基之羧酸基(弱電解性陽離子交換基)之接枝鏈的接枝中空纖維多孔膜作為吸附材料。接枝率為35%。自利用洗淨用之水濕潤之狀態加熱至40℃而乾燥吸附材料，使用強制循環型乾燥機對乾燥之吸附材料直接於大氣壓下、70℃下加熱4小時，藉此進行吸附材料之乾熱處理。乾熱處理之後，組裝與實施例1相同之模組，其後對吸附材料實施表1所示之條件之濕熱處理。使用溶菌酶溶液作為指標蛋白質溶液，除此以外，以與實施例1相同之方式測定濕熱處理後之吸附材料之動態吸附容量A00、A0及A1。
實施例5
於室溫下攪拌尼龍6(0.2 g)、二氯甲烷(10 g)、甲酸0.1 g，於其中添加第三丁基次氯酸鈉2 g，等待尼龍6溶解。 於所獲得之溶液中以總體質量成為100 g之方式進而添加二氯甲烷，獲得用於覆膜形成之N-氯-尼龍6溶液。
將孔徑0.45 μm、膜厚0.15 mm之包含纖維素衍生物之多孔質平板膜(日本Millipore股份有限公司)浸漬於N-氯-尼龍6溶液中，等待溶液含浸於多孔質部中。自含浸有溶液之多孔質平板膜去除多餘之溶液，使該膜首先於室溫下乾燥，繼而於80℃之熱風循環乾燥器內進一步乾燥，最後於140℃下加熱15分鐘，藉此獲得具有纖維素衍生物之多孔質平板膜及覆蓋其表面之N-氯-尼龍6之覆膜的平板膜狀之基體。
將具有甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)5%、Tween80(關東化學股份有限公司製造)0.3%及二硫亞磺酸鈉0.1%之組成的磷酸鈉緩衝液(pH值7.5)於反應容器內充分攪拌。於該磷酸鈉緩衝液中投入上述平板膜狀之基體，於室溫下進行12分鐘之接枝聚合反應。利用純水、丙酮依序對反應後之膜進行洗淨之後，於80℃下進行乾燥，藉此獲得具有GMA接枝聚合而形成之接枝鏈的接枝多孔質平板膜。根據上述式(1)求出之接枝率為8%。
對該接枝多孔質平板膜實施與實施例1相同之反應，獲得具有作為鍵結於接枝鏈之配位基之二乙基胺基(DEA)基(弱電解性離子交換基)的多孔質平板膜作為吸附材料。根據上述式(2)求出之配位基轉化率為96%。
將5片所獲得之接枝多孔質平板膜重疊，於該狀態下夾持於不鏽鋼製之過濾器夾座中，藉此組裝兩個合計膜厚8 mm、有效膜面積15 cm2之模組。其後，對吸附材料實施表1所示之條件之乾熱處理及濕熱處理。以與實施例1相同之方式測定濕熱處理後之吸附材料之動態吸附容量A00、A0及A1。
比較例1
除未進行濕熱處理以外，以與實施例1相同之方式製作模組，測定其動態吸附容量A00、A0及A1。
比較例2
除未進行乾熱處理以外，以與實施例1相同之方式製作模組，測定其動態吸附容量A00、A0及A1。
實施例6~11
利用與實施例1相同之方法製作表2所示之接枝率、配位基轉化率之接枝中空纖維多孔膜作為吸附材料。使用各吸附材料，組裝與實施例1相同之模組。對所獲得之模組實施表2所示之條件之乾熱處理、濕熱處理，除此以外，以與實施例1相同之方式測定吸附材料之吸附容量A0及A1。實施例8之濕熱處理係藉由使熱水於吸附材料中循環之方法來代替利用水浴之加熱而進行。實施例10之濕熱處理係藉由將浸漬於90℃之熱水浴之狀態之模組於90℃之乾燥機中加熱6小時之方法來代替利用水浴之加熱而進行。實施例13之濕熱處理係藉由如下方法進行：於設定為121℃之高壓釜中，自利用作為濕熱處理液之鹽緩衝液使模組內濕潤之狀態使多餘液體止滴，於開放外殼之全部管口之狀態下，一面對模組進行加壓，一面對模組進行加熱。
於表1及表2中表示測定結果。關於實施例1~13中之任一模組，檢定處理前後之動態吸附容量之變化率(A1相對於A0之變化率)均為±5%以內。比較例1、2之模組之檢定處理前後之變化率約達10%~20%。
可確認關於實施例1~5之模組，動態吸附容量A00與A0幾 乎無不同，長期保管時之穩定性非常優異。相對於此，於由檢定處理而產生之變化率較大之比較例1、2之情形時，動態吸附容量A00與A0相比大幅降低，長期保管時之穩定性較差。根據該結果，可確認檢定處理前後之動態吸附容量之變化較小之模組可顯示優異之長期保存穩定性。
進而，實施例1之模組於實施第2次檢定處理之後亦維持較高之吸附性能。由此可確認，即便為蛋白質之吸附及脫離後之吸附材料，亦顯示較高之穩定性。
1‧‧‧吸附材料(中空纖維多孔膜)
3‧‧‧基體
5‧‧‧接枝鏈
6‧‧‧吸附層
7‧‧‧孔隙
10‧‧‧蛋白質
圖1係表示蛋白質吸附材料之一實施形態之模式圖。
1‧‧‧吸附材料(中空纖維多孔膜)
3‧‧‧基體
5‧‧‧接枝鏈
6‧‧‧吸附層
7‧‧‧孔隙
10‧‧‧蛋白質

Claims (14)

  1. 一種蛋白質吸附材料之製造方法，其係製造具有基體及固定於上述基體之表面之分子鏈之蛋白質吸附材料的方法，且依序包括如下步驟：乾熱處理步驟，其對具有上述基體及固定於上述基體之表面之上述分子鏈，且上述分子鏈含有弱電解性離子交換基的處理前吸附材料進行加熱；及濕熱處理步驟，其對上述處理前吸附材料於藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態下進行加熱而獲得上述蛋白質吸附材料。
  2. 如請求項1之方法，其進而包括於上述乾熱處理步驟之前，於上述基體之表面固定上述分子鏈的分子鏈形成步驟。
  3. 如請求項1或2之方法，其中上述蛋白質吸附材料之牛血清白蛋白或溶菌酶之動態吸附容量為5 mg/mL以上。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述乾熱處理步驟包括將上述處理前吸附材料於40℃~130℃下加熱1小時以上。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中上述濕熱處理步驟包括將上述處理前吸附材料於藉由液體或蒸氣而濕潤化之狀態下，於40~120℃下加熱30分鐘以上。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中於上述濕熱處理步驟之後，維持上述蛋白質吸附材料之濕潤化之狀態。
  7. 一種蛋白質吸附材料，其係具有基體及固定於上述基體 之表面之分子鏈，且上述分子鏈含有弱電解性離子交換基者，且於進行將藉由含有1 mol/L之氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液而濕潤化之該蛋白質吸附材料於50℃下加熱8小時的檢定處理時，該檢定處理前後之該蛋白質吸附材料之動態吸附容量之變化率為±5%以內。
  8. 如請求項7之蛋白質吸附材料，其中上述分子鏈與形成上述基體之化合物共價鍵結。
  9. 如請求項7或8之蛋白質吸附材料，其中上述基體為多孔質體。
  10. 如請求項7至9中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述基體為中空纖維狀。
  11. 如請求項7至10中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述弱電解性離子交換基為三級胺基。
  12. 如請求項7至11中任一項之蛋白質吸附材料，其中上述分子鏈為藉由接枝聚合而形成之直鏈狀之高分子鏈。
  13. 一種模組，其係具備如請求項7至12中任一項之蛋白質吸附材料。
  14. 一種管柱，其係具備如請求項7至12中任一項之蛋白質吸附材料。
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