CN101837284B

CN101837284B - 一种聚乙烯基四唑分离介质及其制备方法和应用

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Publication number: CN101837284B
Application number: CN2010101849722A
Authority: CN
Inventors: 卫引茂
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101837284A

Abstract

本发明公开了一种聚乙烯基四唑分离介质及其制备方法，结构通式如下所示，本发明的分离介质可在硅胶、琼脂糖或聚苯乙烯微球表面修饰聚乙烯基四唑得到。本发明的分离介质具有离子交换色谱和金属螯合色谱分离的双重功能，该介质用于蛋白质的离子交换分离和金属螯合色谱，具有蛋白质吸附容量、质量和活性回收率高的特点。

Description

一种聚乙烯基四唑分离介质及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种分离介质及其制备方法，具体涉及一种聚乙烯基四唑分离介质及其制备方法，属于色谱分离技术领域。

背景技术

色谱分离技术是中药、化工、生物工程等领域分离纯化目标成分的常用方法之一。在该方法中，分离介质是整个分离技术中的关键材料，其消耗占生产成本的50％左右。

目前开发出的吸附分离材料多种多样，根据吸附分离材料的性质和用途，可将其分为以下几类：(1)非离子型吸附分离材料；(2)生物亲和性分离材料；(3)金属阳离子配位型吸附剂；(4)离子交换吸附剂。这些材料吸附作用的不同主要取决于材料的化学结构。通过在表面引入各种功能基，可使吸附材料具有不同的选择性。在非离子型高分子吸附树脂中，功能团主要是非极性烷基和含有N、S、P、O等杂原子的非离子型饱和极性分子；螯合树脂的功能基主要有亚氨基二乙酸、硫脲、脲等螯合基团；离子交换树脂的功能团主要为氨基、羧基、磺酸基、磷酸基等基团。由于功能团种类的有限性，面对一些复杂体系，比如成分的极性从弱到强变化的中药提取液，现有吸附材料难以达到选择性分离的目的。

从吸附树脂的制备方法来看，对固体表面进行化学修饰是合成吸附材料的通用方法。现有的化学修饰方法通常是用带有功能头基的小分子或聚合物直接锚定在固体基体表面的“Grating to”方法。该方法存在下述局限性：①引入的功能团密度低，造成吸附剂的吸附容量小，不利于生产效率的提高；②在表面引入的功能团亲疏水性难以调控，难以满足极性变化范围很宽的复杂体系的分离，例如中药提取液；③用这种方法修饰的小分子吸附剂，因功能团的分子体积较小，对被吸附对象的位阻作用较小，容易引起被吸附物质与基体本身的吸附作用，造成吸附的选择性差。研究证明，在原子基团转移自由基聚合(ATRP)技术中，通过控制单体转化率、聚合反应时间，可以控制固体表面聚合物分子刷的分子链长，也可在固体表面制备嵌段共聚物[化学进展，2005，17(6)：1074-1080.]。因此，利用已有功能单体或寻找新型功能单体，结合ATRP技术可望实现新型吸附材料制备技术的突破。

在前期研究中，发明人发现了四唑基是一种新的离子交换功能团，并将其用“Grating to”方法固定在硅胶基体表面，结果发现，虽然四唑分离介质具有较好的分离效果，但其吸附容量较低[Genhu Lei，et al.J.Chromatogr.A，2008，1187，197-204；Genhu Lei，et al.J.Sep.Sci.，2008，31：3002-3008]。本发明采用ATRP方法，提出将聚乙烯基四唑聚合物高密度地修饰在硅胶、聚苯乙烯微球、琼脂糖微球表面，制备高吸附容量分离材料的技术。该吸附材料在制药、环保、化工和生物工程领域内具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种吸附容量大，具有离子交换色谱和金属螯合色谱分离双重功能的以聚乙烯四唑为配体的新型分离介质。

本发明的另一目的是提供上述分离介质的制备方法。

本发明的还有一个目的是提供上述分离介质在生物大分子分离和中药组分分离中的应用。

本发明实现过程如下：

以聚乙烯四唑为功能基的分离介质，具有如下结构通式：

代表硅胶、琼脂糖或聚苯乙烯微球，

X为卤素原子。

所述硅胶基质颗粒是球形多孔硅胶，孔径范围为粒径为1μm～100μm。

所述的卤素原子优选为氯或溴原子。

本发明的分离介质可在硅胶、琼脂糖或聚苯乙烯微球表面修饰得到，具体方法如下：

1.以聚乙烯基四唑为配体的硅胶分离介质的制备(DCM＝二氯甲烷；TEA＝三乙胺；DMAP＝4-二甲氨基吡啶；Bpy＝联吡啶；CuBr＝溴化亚铜)

硅胶首先与氨丙基三乙氧基硅烷反应，然后再与2-溴-异丁酰溴反应，合成表面键合引发剂的硅胶，在溴化亚铜和联二吡啶催化作用下，4-乙烯基四唑在硅胶表面聚合即得聚乙烯四唑分离介质。

2、以聚乙烯基四唑为配体的琼脂糖凝胶分离介质的制备(THF＝四氢呋喃；TEA＝三乙胺；Bpy＝联吡啶；CuBr＝溴化亚铜)。

琼脂糖凝胶首先与2-溴-异丁酰溴反应，合成表面键合溴原子的琼脂糖凝胶，然后乙烯四唑在溴化亚铜和联二吡啶催化作用下在该琼脂糖表面聚合即得聚乙烯四唑分离介质。

3、以聚乙烯基四唑为配体的交联聚苯乙烯分离介质的制备(THF＝四氢呋喃；TEA＝三乙胺；Bpy＝联吡啶；CuBr＝溴化亚铜)

在溴化亚铜和联二吡啶催化作用下，4-乙烯基四唑在聚氯甲基苯乙烯微球表面直接聚合得到聚乙烯四唑分离介质。

本发明的优点与积极效果：

(1)表面键合聚乙烯四唑的分离介质具有离子交换色谱和金属螯合色谱分离的双重功能；

(2)该介质用于蛋白质的离子交换分离和金属螯合色谱，具有蛋白质吸附容量、质量和活性回收率高的特点。

(3)本发明聚乙烯四唑分离介质对中药组分吸附容量大，在中药组分选择性分离中有重要应用价值。

(4)填料使用寿命长。硅胶介质在pH＝2.0-8.0情况下、聚苯乙烯微球介质在pH＝1.0-12.0情况下使用1000小时，经清洗后，分离性能未见改变。

附图说明

图1蛋白质在硅胶基质聚乙烯基四唑介质上的离子交换色谱分离图；

图2蛋白在硅胶基质聚乙烯基四唑介质上的金属螯合色谱图；

图3蛋白质在琼脂糖基质聚乙烯基四唑介质上的离子交换色谱分离图；

图4基因工程产品重组人干扰素-γ的8mol/L脲提取液分离图。

具体实施方式

本发明所用的主要原料：大孔硅胶(7μm，孔径30nm)、交联聚氯甲基苯乙烯微球(西安电力树脂厂)、交联琼脂糖凝胶(上海君创生物科技精细化工产品)，γ-氨丙基三乙氧基硅烷，丙烯腈，苯乙烯，叠氮化钠，无水三氯化铝，溴化亚铜，乙二胺四乙酸(EDTA)和2-溴异丁酰溴为市售商品。

4-乙烯基四唑按文献方法制备(C.Arnold，et al.J.Org.Chem.1969，34(4)，1141)：在250mL的三颈瓶中加入150mL经过钠干燥过的四氢呋喃(THF)，21g叠氮化钠，4g干燥的丙烯腈以及10g无水三氯化铝，氮气保护下回流36小时。反应完毕，将混合液冷却至室温，加入15％盐酸至pH为2左右。过滤除去固体，滤液用50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋转蒸发除去有机溶剂，得到黄色固体。粗产物用氯仿重结晶2次得到4-乙烯基四唑。

实施例1：以聚乙烯基四唑为配体的硅胶分离介质的制备

称取2克大孔硅胶，加入30mL 1∶1盐酸，超声5min，然后在100℃下油浴回流3小时，反应完毕，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，在130℃干燥4h。将该硅胶加入到100mL三颈瓶中，加入35mL干燥甲苯，2.0mL氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应12小时。反应完毕，过滤，用干燥甲苯洗3次，丙酮洗4次得产物1。50℃真空干燥备用。元素分析结果：碳含量1.593％，氢含量0.425％，氮含量0.482％，表明氨丙基已经被键合在硅胶表面。

在100mL烧瓶中，加入2.0克产物1、20mL干燥二氯甲烷、3.5mL三乙胺、1.5mL 2-溴-异丁酰溴，室温下反应12h。反应完毕，再加入甲醇分解过量的2-溴-异丁酰溴，产物经二氯甲烷、丙酮、甲醇和水洗涤多次，得产物2。元素分析结果：碳含量2.442％，氢含量0.451％，氮含量0.499％。与产物1相比，碳元素含量明显上升，说明异丁酰溴已经被键合在产物1的表面。

在100mL烧瓶中，加入20mL纯净水、1.8g 4-乙烯基四唑，溶解后，用5M NaOH将pH值调为8.4，加入2g产物2，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg溴化亚铜及118mg联二吡啶，在冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，密封室温聚合12小时。产物净水、丙酮、甲醇反复洗涤后置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL甲醇、20mL 0.25M的EDTA搅拌6小时，产物用水、甲醇反复洗涤得本发明以聚乙烯基四唑为配体的硅胶分离介质。元素分析结果：碳含量4.073％，氢含量0.631％，氮含量2.346％。与产物2相比，氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在硅胶表面。

实施例2：以聚乙烯四唑为配体的琼脂糖分离介质的制备

在100mL烧瓶中，加入5g干琼脂糖微球、50mL干燥四氢呋喃、3.5mL三乙胺、1.5mL 2-溴-异丁酰溴，室温下反应12h。反应完毕，再加入甲醇分解过量的2-溴-异丁酰溴，产物经丙酮、甲醇和水各洗涤三次，室温下放置备用。元素分析结果：碳含量67.032％，氢含量7.631％，氮含量0.0％。

在100mL烧瓶中，加入100mL纯净水、1.8g 4-乙烯基四唑，溶解后，用5M NaOH将pH值调为8.4，加入5g上述产物，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg CuBr及118mg联二吡啶，在冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，在氮气保护下室温聚合12小时。产物用水、丙酮、甲醇反复洗涤后，再用20mL 0.25M的EDTA洗涤5次，产物用水、甲醇反复洗涤。元素分析结果：碳含量64.032％，氢含量7.631％，氮含量4.346％。氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在琼脂糖微球表面。

实施例3：以聚乙烯四唑为配体的交联聚苯乙烯微球的制备

在100mL烧瓶中，加入20mL二氯甲烷、1.8g 4-乙烯基四唑，加入2g交联聚氯甲基苯乙烯微球，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg CuBr及118mg联二吡啶，在冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，密封室温聚合12小时。产物丙酮、甲醇反复洗涤后，将其加入20mL甲醇、20mL 0.25M的EDTA溶液中搅拌6小时，产物用水、甲醇反复洗涤。元素分析结果：碳含量72.95％，氢含量7.226％，氮含量2.787％。氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在交联聚苯乙烯微球表面。

实施例4：采用实施例1制备的分离介质，对肌红蛋白、核糖核酸、α-糜蛋白酶原-A和细胞色素-C混合物进行离子交换色谱分离。

色谱柱：50×4.6mm不锈钢柱；流动相：A(平衡液)，20mmol/l磷酸盐(pH6.0)，流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/l NaCl(pH 6.0)；流动相流速：1.0ml/min；线性梯度20min，100％A-100％B，100％B延长10min.标准蛋白：1.肌红蛋白；2.核糖核酸酶-A；3，4.细胞色素-C；5.α-糜蛋白-A；6，溶菌酶。

分离效果良好，同时具有高的活性回收率和质量回收率。以溶菌酶为例，溶菌酶的活性回收率＞95％，质量回收率＞96％，吸附容量达到189mg/mL，比四唑小分子配体分离介质(Genhu Lei，Xiaohu Xiong，Yinmao Wei，et al.J.Chromatogr.A，2008，1187，197-204)吸附容量提高7倍，比报道的弱阳离子交换剂的最大吸附容量提高20％(A.Staby，M.B.Sand，R.G.Hansen，et al.J.Chromatogr.A，2005，1069，65；A.Staby，J.H.Jacobsen，R.G.Hansen，et al.J.Chromatogr.A，2006，1118，168)，可应用于生物工程产品的纯化中(图1)。

实施例5：采用实施例1制备的分离介质，螯合上Cu(II)后，对肌红蛋白、核糖核酸、α-糜蛋白酶原-A、细胞色素-C和溶菌酶混合物进行分离

色谱柱：50×4.6mm不锈钢柱；流动相：A(平衡液)，50mmol/l磷酸盐(pH6.0)；流动相B(洗脱液)，A+1.0mol/l NaCl(pH 6.0)；流动相流速：1.0ml/min；线性梯度20min，线性梯度20min，100％A-100％B，100％B延长10min.；标准蛋白：1.肌红蛋白；2.核糖核酸酶-A；3.细胞色素-C；4.α-糜蛋白-A；5，溶菌酶.

分离效果优于文献(Genhu Lei，et al.J.Sep.Sci.2008，31，3002-3008)。这四种蛋白的质量回收率＞90％，溶菌酶的活性回收率＞95％，吸附容量为163mg/mL。连续使用2天，Cu(II)离子的螯合量损失小于5％。可广泛应用于蛋白、酶和生物工程产品的分离纯化(图2)。

实施例6：采用实施例2制备的分离介质，对α-糜蛋白-A、细胞色素-C和溶菌酶混合物进行离子交换色谱分离。

色谱柱：50×10mm；流动相：A(平衡液)，20mmol/l PBS(pH 6.0)，流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/l NaCl(pH 6.0)；流动相流速：1.0ml/min；线性梯度20min，100％A-100％B，100％B延长10min.标准蛋白：2.α-糜蛋白-A；3.细胞色素-C；4，溶菌酶

分离效果良好，同时具有高的活性回收率和质量回收率。以溶菌酶为例，溶菌酶的活性回收率＞90％，质量回收率＞92％，吸附容量达到235mg/mL，比弱阳离子交换剂报道的最大吸附容量提高30％(A.Staby，M.B.Sand，R.G.Hansen，et al.J.Chromatogr.A，2005，1069，65；A.Staby，J.H.Jacobsen，R.G.Hansen，et al.J.Chromatogr.A，2006，1118，168)，说明本发明以聚乙烯四唑为功能基的分离介质可应用于生物工程产品的纯化中(图3)。

实施例7：采用实施例2制备的分离介质，对基因工程产品重组人干扰素-γ一步纯化

色谱柱：Zn²⁺螯合的聚乙烯基四唑硅胶装填于50×4.6mm不锈钢柱；流动相A：(平衡液)，50mmol/l磷酸盐(pH 6.0)，流动相B(洗脱液)，A+0.5mol/lNaCl(pH 6.0)；流动相流速：1ml/min线性梯度20min，线性梯度20min，100％A-100％B，100％B延长10min。^*纯化后重组人干扰素-γ，纯度为90％

纯化后重组人干扰素-γ纯度为90％，说明该分离介质可应用于生物工程产品的纯化中(图4)。

实施例8：采用实施例3制备的分离介质，对黄莲的乙醇提取液进行了分离，其对盐酸小檗碱的吸附容量达8.3mmol/g，比传统吸附剂容量提高一倍。

Claims

1.一种以聚乙烯基四唑为配体的硅胶分离介质的制备方法，其特征在于：

称取2克大孔硅胶，加入30mL 1:1盐酸，超声5min，然后在100℃下油浴回流3小时，反应完毕，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，在130℃干燥4h；将该硅胶加入到100mL三颈瓶中，加入35mL干燥甲苯，2.0mL γ-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应12小时；反应完毕，过滤，用干燥甲苯洗3次，丙酮洗4次得产物1，50℃真空干燥备用；元素分析结果：碳含量1.593%，氢含量0.425%，氮含量0.482%，表明氨丙基已经被键合在硅胶表面；

在100mL烧瓶中，加入2.0克产物1、20mL干燥二氯甲烷、3.5mL三乙胺、1.5mL 2-溴-异丁酰溴，室温下反应12h；反应完毕，再加入甲醇分解过量的2-溴-异丁酰溴，产物经二氯甲烷、丙酮、甲醇和水洗涤多次，得产物2；元素分析结果：碳含量2.442%，氢含量0.451%，氮含量0.499%；与产物1相比，碳元素含量明显上升，说明异丁酰溴已经被键合在产物1的表面；

在100mL烧瓶中，加入20mL纯净水、1.8g 4-乙烯基四唑，溶解后，用5M NaOH将pH值调为8.4，加入2g产物2，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg溴化亚铜及118mg 联二吡啶，再冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，密封室温聚合12小时；产物经水、丙酮、甲醇反复洗涤后置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL甲醇、20mL 0.25M的EDTA搅拌6小时，产物用水、甲醇反复洗涤得以聚乙烯基四唑为配体的硅胶分离介质；元素分析结果：碳含量4.073%，氢含量0.631%，氮含量2.346%；与产物2相比，氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在硅胶表面。

2.一种以聚乙烯基四唑为配体的琼脂糖分离介质的制备方法，其特征在于：

在100mL烧瓶中，加入5g 干琼脂糖微球、50mL干燥四氢呋喃、3.5mL三乙胺、1.5mL 2-溴-异丁酰溴，室温下反应12h；反应完毕，再加入甲醇分解过量的2-溴-异丁酰溴，产物经丙酮、甲醇和水各洗涤三次，室温下放置备用，元素分析结果：碳含量67.032%，氢含量7.631%，氮含量0.0%；

在100mL烧瓶中，加入100 mL纯净水、1.8g 4-乙烯基四唑，溶解后，用5M NaOH将pH值调为8.4，加入5g上述产物，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg CuBr及118mg联二吡啶，再冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，在氮气保护下室温聚合12小时；产物用水、丙酮、甲醇反复洗涤后，再用20mL 0.25M的EDTA洗涤5次，产物用水、甲醇反复洗涤；元素分析结果：碳含量64.032%，氢含量7.631%，氮含量4.346%；氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在琼脂糖微球表面。

3.一种以聚乙烯基四唑为配体的交联聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于：

在100mL烧瓶中，加入20mL二氯甲烷、1.8g 4-乙烯基四唑，加入2g交联聚氯甲基苯乙烯微球，超声15min，通氮气15min，冷冻-抽真空-融化-通氮气3次后，加入55mg CuBr及118mg联二吡啶，再冷冻-抽真空-融化-通氮气3次，密封室温聚合12小时，产物经丙酮、甲醇反复洗涤后，将其加入20mL甲醇、20mL 0.25M的EDTA溶液中搅拌6小时，产物用水、甲醇反复洗涤；元素分析结果：碳含量72.95%，氢含量7.226%，氮含量2.787%；氮元素含量明显上升，说明四唑已经被键合在交联聚苯乙烯微球表面。