CN101288844A - 一种固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离与纯化技术,具体是一种固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法。固定相结构式如图,其中GMAPolymer微球,粒径为100nm-50um,GMAPolymer微球为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球。通过氨基化和磷酸脂化,得到一种具有高效的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物磷酸酯基新型固定化金属亲和色谱固定相的合成方法,通过与锆离子和铁离子螯合,用于磷酸化蛋白质组学中的研究,可用于磷酸化肽段高选择性分离、富集与纯化,同时较传统固定相,降低了对非磷酸化肽段的非特异性吸附。
Description
技术领域
本发明涉及分离与纯化技术,具体是一种固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法。
背景技术
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化作为一种最常见,最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,参与了几乎所有调节生命活动的整个过程,包括细胞的增殖,发育和分化,神经活动,肌肉收缩,新陈代谢,肿瘤发生等,蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号的主要传递方式。
蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记、化学修饰、Edman降解以及薄层层析等方法。这些方法操作相对繁琐,对实验技能要求较高,蛋白样品需求量较大,或存在放射性污染等问题,限制了其广泛使用。
近些年来用固定化金属亲和色谱来富集磷酸化肽段的方法由于其操作简单,成本较低,对实验室要求也不那么严格,近些年得到了最为广泛的应用。该方法的主要原理是利用磷酸化肽段所带的磷酸根与固定化金属亲和色谱中所固载的金属离子之间发生作用,而非磷酸化肽不与之发生作用,从而起到分离富集的效果。目前常用于磷酸化肽段富集的固定相多种多样,主要有琼酯糖基、淀粉基、Al2O3、磁珠以及硅胶基质等,通过用亚胺二乙酸等衍生,利用羧基再与金属离子如铁、镓等螯合,再用于磷酸化肽段富集Aprilita,N.H.等,“Poly(glycidyl methacrylate/divinylbenzene)-IDA-Fe-III inphosphoproteomics”,《Journal of Proteome Research》,P2312-2319(2005年);近些年来TiO2和ZrO2微球(Kweon,H.K等,“Selective zirconium dioxide-basedenrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis”,《AnalyticalChemistry》,1743-1749(2006年))也应用于磷酸化肽段的富集,其本身即充当基质,又提供与磷酸化肽段作用的金属离子。亦有文献报道利用磷酸酯中的磷酸集团,与锆等金属离子相互作用,得到寡核苷酸单分子层,或利用这种现象合成了以硅基质为基础的固定化金属亲和色谱基质,但以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物磷酸酯为基质的固定化金属亲和色谱固定相用于磷酸化肽段富集未见报道。
发明内容
本发明提供一种通过化学反应将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物,键合上磷酸酯基团,再与锆、铁等金属离子螯合,实现对磷酸化肽段的高选择性分离、富集与纯化固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
固定相结构式为:
其中GMA Polymer微球,粒径为100nm-50um。
所述GMA Polymer微球为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球。所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯的交联均聚物或甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚物微球。所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的交联均聚物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA-EDMA);甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的的交联共聚物。
固定相的制备方法包括以下步骤:
1)氨基化反应:将100-400g/L的氨基化试剂溶液与GMA Polymer微球以5-25ml/1g比例混合,在0-80℃下反应3-12h,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入流速为0.001-0.5mL/min,即得氨基化的整体柱。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于5-10ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应过夜,待用;无水乙腈溶液中含有40-100mM POCl3,40-60mM 2,4,6-三甲基吡啶;
或将含有40-100mM POCl3,40-60mM 2,4,6-三甲基吡啶的无水乙腈溶液以0.001-0.5mL/min的流速泵入步骤1)得到的氨基化的整体柱内,过夜;
3)将50-100倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的微球用醋酸或三氟乙酸将调至pH 2-3,而后加入100mM的EDTA溶液(1g/5-10ml),震荡1-2小时,离心,弃去上清液,沉淀用水洗涤3-5次,真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,然后将100mM的EDTA溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,再用水以0.001-0.5mL/min的流速冲洗整体柱30-60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
所述氨基化试剂为氨水、3,3-二氨丙基亚胺、乙二胺或1,6-二氨基己烷。
固定相的预处理,使用前将所述固定化金属亲和色谱固定相与锆或铁离子溶液以1∶50-100(g/ml)的比例加入含有100-200mM锆或铁离子的质量浓度10%的醋酸溶液,放置过夜;离心,弃去溶液部份,再用质量浓度10%的醋酸溶液洗涤3次,真空干燥;
磷酸化肽段的分离、富集与纯化,具体操作使用所得的固定相时,将固定化金属亲和色谱固定相与蛋白样品以重量比为100-200∶1混合,孵育30分钟,洗涤去除非磷酸化肽段,最后用质量浓度为12.5%的氨水洗脱。
本发明所具有的优点:
本发明较传统固定化金属亲和色谱固定相可有效提高对磷酸化肽段的选择性富集效果,且可以有效降低对非磷酸化肽段的非特异性吸附,基质化学性质稳定,可在较广的pH范围内使用。
本发明通过化学反应将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物,键合上磷酸酯基团,再与锆、铁等金属离子螯合,实现对磷酸化肽段的高选择性分离、富集与纯化。与传统的IMAC材料相比,其具有非特异性吸附小,分辨率高等优点,聚合物微球可以方便的装填成各成IMAC柱,整体柱由于体积可变,可以制成不同长度,不同内径的IMAC柱,特别是制成微柱后,适合于微量样品中的磷酸化肽段的富集,并且可以方便地与μHPLC-ESI-MS联用,提高质谱的检测限和灵敏度。
附图说明
图1为本发明的固定化金属亲和色谱固定相的合成路线示意图。
图2为采用本发明的固定化锆离子亲和色谱固定相富集α-酪蛋白中磷酸化肽段的MALDI TOF MS谱图。
图3为采用本发明的固定化锆离子亲和色谱固定相富集β-酪蛋白中磷酸化肽段与标准磷酸化酪氨酸肽段混合的MALDI TOF MS谱图。
图4为采用本发明的固定化铁离子亲和色谱固定相富集α-酪蛋白中磷酸化肽段的MALDI TOF MS谱图。
具体实施方式
下面结合附图说明对本发明作具体叙述。
实施例1
固定相的制备方法包括以下步骤:
GMA Polymer微球的制备:由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯所得的微球,通过溶胀法,以聚乙烯基苯为种子(0.5g),通过甲基丙烯酸缩水甘油酯(9.0g)与乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯(3.5g)在种子上聚合,2%(w/w)的AIBN为引发剂,在120mL 0.1%SDS(w/w)溶液反应,超声震荡至成固体,得到无孔的的聚合物微球,粒径8-12um。(参见Boling Gong,Jinxia Zhu,Long Li,Kejuan Qiang,Li Ren,Synthesis ofnon-porous poly(glycidylmethacrylate-co-ethylenedimethacrylate)beads andtheir application in separation of biopolymers,Talanta,2006,68:666-672。
1)氨基化反应:采用25%(质量浓度)的浓氨水为氨基化试剂与10ml/1g的上述制备的GMAPolymer微球混合,在60℃下反应3小时,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入速度为0.5mL/min。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于10ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应12小时,待用;无水乙腈溶液中含有40mM POCl3,40mM2,4,6-三甲基吡啶;
或将无水乙腈溶液以0.5mL/min的流速泵入步骤1)得到氨基化的整体柱内;使其用无水乙腈将反应体系置换至无水体系;
3)将50倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的产物用醋酸将调至pH 2-3,而后加入30μL 100mM的EDTA溶液,震荡1小时,离心,弃去上清液,沉淀水洗涤3次;真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3醋酸溶液以流速为0.5mL/min,时间30min,泵入整体柱,然后将100mM的EDTA溶液以流速为0.5mL/min,时间30min,泵入整体柱,再用水以0.5mL/min的流速冲洗整体柱30min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
固定相的预处理,使用前将所述固定化金属亲和色谱固定相与锆或铁离子溶液以1∶100(g/ml)的比例加入含有100mM锆离子的质量浓度10%的醋酸溶液,放置过夜;离心,弃去溶液部份,再用质量浓度10%的醋酸溶液洗涤3次,真空干燥;
磷酸化肽段的分离、富集与纯化,具体操作使用所得的固定相时,将固定化金属亲和色谱固定相与蛋白样品以重量比为100∶1混合,孵育30分钟,洗涤去除非磷酸化肽段,最后用质量浓度为12.5%的氨水洗脱。
实施例2
与实施例1不同之处在于:
GMA Polymer微球的制备:通过溶胀法,以聚乙烯基苯为种子,通过甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯在种子上聚合,得到大孔的的聚合物微球,粒径8-12um。(Boling Gong,Lili Wang,ChaozhanWang,Xindu Geng,Preparation of hydrophobic interaction chromatographicpackings based on monodyspersepoly(glycidylmethacrylate-co-ethylenedimethacrylate)beads and theirapplication,Journal ofChromatographyA,2004,1022:33-39。)
1)氨基化反应:将20g 3,3-二氨丙基亚胺溶于100mL无水丙酮中,聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球加入该无水丙酮溶液中(1g/10mL),室温条件下反应4h,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入速度为0.5mL/min。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于5ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应过夜,待用;无水乙腈溶液中含有100mM POCl3,60mM 2,4,6-三甲基吡啶;
或将无水乙腈溶液以0.001mL/min的流速泵入步骤1)得到每1g的氨基化的整体柱内;
3)将100倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的微球用三氟乙酸将调至pH 2-3,而后加入100mM的EDTA溶液(1g/5-10ml),震荡2小时,离心,弃去上清液,沉淀用水洗涤5次,真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3三氟乙酸溶液以泵入流速为0.001mL/min,时间60min整体柱,然后将100mM的EDTA溶液以流速为0.001mL/min,时间60min,泵入整体柱,再用水以0.001mL/min的流速冲洗整体柱60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
固定相的预处理,使用前将所述固定化金属亲和色谱固定相与锆或铁离子溶液以1∶50(g/ml)的比例加入含有100mM锆离子的质量浓度10%的醋酸溶液,放置过夜;离心,弃去溶液部份,再用质量浓度10%的醋酸溶液洗涤3次,真空干燥;
磷酸化肽段的分离、富集与纯化,具体操作使用所得的固定相时,将固定化金属亲和色谱固定相与蛋白样品以重量比为200∶1混合,孵育30分钟,洗涤去除非磷酸化肽段,最后用质量浓度为12.5%的氨水洗脱。
实施例3
与实施例1不同之处在于:
GMA Polymer微球的制备:通过溶胀法,以聚乙烯基苯为种子(0.5g),通过甲基丙烯酸缩水甘油酯(9.0g)与乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯(3.5g)在种子上聚合,2%(w/w)的AIBN为引发剂,在120mL 0.1%SDS(w/w)溶液反应,超声震荡至成固体,得到无孔的的聚合物微球,粒径8-12um。(Boling Gong,Jinxia Zhu,Long Li,Kejuan Qiang,Li Ren,Synthesis ofnon-porous poly(glycidylmethacrylate-co-ethylenedimethacrylate)beads andtheir application in separation of biopolymers,Talanta,2006,68:666-672)。
1)氨基化反应:将乙二胺40g溶于100mL pH 5左右的吗啉乙烷碘酸(MES),聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球加入溶液中(1g/10mL),室温条件下反应3h,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入速度为0.5mL/min。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于8ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应过夜,待用;无水乙腈溶液中含有60mM POCl3,50mM 2,4,6-三甲基吡啶;
或将无水乙腈溶液以0.05mL/min的流速泵入步骤1)得到每1g的氨基化的整体柱内;
3)将80倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的微球用三氟乙酸将调至pH 2-3,而后加入100mM的EDTA溶液(1g/5-10ml),震荡1.5小时,离心,弃去上清液,沉淀用水洗涤4次,真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3三氟乙酸溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,然后将100mM的EDTA溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,再用水以0.001-0.5mL/min的流速冲洗整体柱30-60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
实施例4
与实施例1不同之处在于:
GMA Polymer微球的制备:首先在3%的KPS(过磷酸钾)做引发剂,将亚胺基二乙酸(IDA)衍生的GMA与苯乙烯在乙醇/水溶液中70摄氏度反应12h,得到苯乙烯基-甲基丙烯酸缩水甘油酯-IDA-微球,粒径100nm左右。(C.Y.Chen,and C.Y.Chen,Stability constants of water-soluble and latex typesof chelating polymers containing iminodiacetic acid with some transition-metalions.European Polymer Journal,2003,39:991-1000.)
1)氨基化反应:将1,6-二胺基己烷10g冰水浴中溶于pH 7.5,200mM磷酸盐缓冲体系中,用浓HCl调节pH值保持在7.5,最终体积为100mL,聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球加入该溶液中(1g/10mL),4摄氏度反应5h,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入速度为0.001mL/min。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于7ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应过夜,待用;无水乙腈溶液中含有80mM POCl3,45mM 2,4,6-三甲基吡啶;
或将无水乙腈溶液以0.001-0.5mL/min的流速泵入步骤1)得到每1g的氨基化的整体柱内;
3)将50-100倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的微球用醋酸或三氟乙酸将调至pH 2-3,而后加入100mM的EDTA溶液(1g/5-10ml),震荡2小时,离心,弃去上清液,沉淀用水洗涤3次,真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,然后将100mM的EDTA溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,再用水以0.001-0.5mL/min的流速冲洗整体柱30-60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
应用例1
样品蛋白酶解溶液的制备:1mg的α-酪蛋白和β-酪蛋白的分别溶解在1mL,50mM的碳酸氢胺溶液中(pH 8.2),按照与胰蛋白酶的质量比40∶1的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应,反应时间为16h,酶解温度控制在37℃,加入0.1%甲酸。获得的蛋白酶解溶液置于冰箱中保存备用。
磷酸化肽段的分离、富集与纯化:将实施例1中所得的固定化锆离子亲和色谱固定相加入至乙腈,得最终浓度为30mg/mL。
1.将α-酪蛋白和β-酪蛋白的酶解液2pmol加入100μL的10%醋酸溶液,再加入10μL的实施例1的固定相,室温下孵育30分钟,然后在35000×g下高速离心,弃去上层清液。
2.加入100μL含100mM NaCl的10%醋酸溶液,振摇清洗5分钟,然后在35000×g下高速离心,弃去上层清液。
3.加入100μL的10%醋酸溶液,振摇清洗5分钟,然后在335000×g下高速离心,弃去上层清液。
4.加入100μL的12.5%氨水,超声清洗ZrO2纳米粒子5分钟,然后在35000×g下高速离心,收集上层清液。
5.将上步收集的上清液放入冷冻干燥机浓缩。
6.用MALDI TOF MS分析(参见图2、图3)
从图中可以看到所有的主要质谱峰均为磷酸化肽段,非磷酸化肽段的质谱峰很少,即使有也强度很低,这说明所合成的固定化锆离子亲和色谱固定相对磷酸化肽段具有很好的选择性和较高特异性。而且对各种类型的磷酸化肽段(苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸)都一样有效。
应用例2
样品蛋白酶解溶液的制备同应用例1。
磷酸化肽段的分离、富集与纯化:采用实施例2制备的固定化铁离子亲和色谱固定相
1.α-酪蛋白的酶解液用10%醋酸溶液调节pH值约为2,将2pmol蛋白酶解液缓慢通过整体柱中。
2.用30μL含100mMNaCl的10%醋酸溶液,冲洗柱子。
3.用30μL的10%醋酸溶液冲洗柱子。
4.用30μL的12.5%氨水,冲洗柱子并收集。
5.将上步收集的上清液放入冷冻干燥机浓缩干燥。
6.用MALDI TOF MS分析(参见图4)
从图中可以看到所有的主要质谱峰均为磷酸化肽段,非磷酸化肽段的质谱峰很少,即使有也强度很低,这说明所合成的固定化铁离子亲和色谱固定相对磷酸化肽段具有很好的选择性和较高特异性。
Claims (7)
2.按权利要求1所述固定化金属的亲和色谱固定相,其特征在于:所述GMA Polymer微球为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球。
3.按权利要求2所述固定化金属的亲和色谱固定相,其特征在于:所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯的交联均聚物或甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚物微球。
4.按权利要求3所述固定化金属的亲和色谱固定相,其特征在于:所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的交联均聚物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙烯基甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA-EDMA);甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的的交联共聚物。
5.一种权利要求1所述亲和色谱固定相的制备方法,其特征在于:包括以下步骤,
1)氨基化反应:将100-400g/L的氨基化试剂溶液与GMA Polymer微球以5-25ml/1g比例混合,在0-80℃下反应3-12h,反应后产物用水冲洗至中性,得氨基化的微球;
或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换,泵入流速为0.001-0.5mL/min,即得氨基化的整体柱。
2)将步骤1)得到每1g的氨基化的微球置于5-10ml无水乙腈溶液中,室温条件下反应过夜,待用;无水乙腈溶液中含有40-100mM POCl3,40-60mM 2,4,6-三甲基吡啶;
或将含有40-100mM POCl3,40-60mM 2,4,6-三甲基吡啶的无水乙腈溶液以0.001-0.5mL/min的流速泵入步骤1)得到的氨基化的整体柱内,过夜;
3)将50-100倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中,使其充分水解;
4)将水解后的微球用醋酸或三氟乙酸将调至pH 2-3,而后加入100mM的EDTA溶液(1g/5-10ml),震荡1-2小时,离心,弃去上清液,沉淀用水洗涤3-5次,真空干燥,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
或将pH 2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,然后将100mM的EDTA溶液泵入整体柱,流速为0.001-0.5mL/min,时间30-60min,再用水以0.001-0.5mL/min的流速冲洗整体柱30-60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。
6.按照权利要求5所述的固定化金属的亲和色谱固定相的制备方法,其特征在于:所述氨基化试剂为氨水、3,3-二氨丙基亚胺、乙二胺或1,6-二氨基已烷。
7.一种权利要求1所述的亲和色谱固定相的应用,其特征在于:固定相的预处理,使用前将所述固定化金属亲和色谱固定相与锆或铁离子溶液以1∶50-100(g/ml)的比例加入含有100-200mM锆或铁离子的质量浓度10%的醋酸溶液,放置过夜;离心,弃去溶液部份,再用质量浓度10%的醋酸溶液洗涤3次,真空干燥;
磷酸化肽段的分离、富集与纯化,具体操作使用所得的固定相时,将固定化金属亲和色谱固定相与蛋白样品以重量比为100-200∶1混合,孵育30分钟,洗涤去除非磷酸化肽段,最后用质量浓度为12.5%的氨水洗脱。
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