WO2004078724A1 - リン酸化ペプチドの標識方法および選択的吸着方法、該方法に使用される錯体化合物、該錯体化合物の製造方法、および該錯体化合物の原料化合物 - Google Patents
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Definitions
- the method according to the present invention is characterized by labeling a phosphorylated peptide with the complex compound represented by the formula (I) or selectively adsorbing the phosphorylated peptide. ⁇ .
- a reactive group R 1 is reacted with R 2 to introduce a labeling group Y into the main skeleton via a bonding group X.
- a reductive amination reaction is performed as a condensation reaction.
- the solvent used in this case can be used without particular limitation as long as it can substantially dissolve the compounds (VI) and (VII) and does not inhibit the reaction. Examples thereof include methanol and ethanol. And alcohols such as isopropanol; ethers such as getyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; water; or a mixed solvent thereof.
- R 3 to R 5 each represent an electron-donating substituent at the 4- or 6-position on the pyridine ring. ].
- the zinc complex according to the present invention has the structure shown below, which is referred to as MALDI I-TOF mass spectrum (matrix: 2 ', 4', 6'_trihydroxyacetophenone). Confirmed by.
- a filter one Yunitto, ivy three times the line the operation of centrifugal filtration 1 5 seconds 2000 Xg.
- Each filtrate was designated as fractions 2, 3, and 4.
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Description
明細書 リン酸化ペプチドの標識方法および選択的吸着方法、 該方法に使用される錯体 化合物、 該錯体化合物の製造方法、 および該錯体化合物の原料化合物 技術分野
本発明は、 リン酸化ペプチドを標識する方法および選択的に吸着する方法、 当 該方法に使用可能な錯体化合物、 当該錯体化合物の製造方法、 並びに当該製造方 法の原料化合物として使用可能な化合物に関するものである。 背景技術
ある種の生体内酵素は、 活性中心ゃァロステリック部位を代表とする特定部位 にセリンゃトレオニン， チロシン残基を有し、 これらの水酸基が、 キナーゼ等と 呼ばれる酵素によりリン酸化されたり或いは脱リン酸化されることによって、 酵 素活性が調節されている。 また、 リシン， アルギニン， ヒスチジンのアミノ基或 いはイミノ基や、ァスパラギン酸，ダル夕ミン酸の力ルポキシル基がリン酸化（ま たは脱リン酸化） されることによって、 活性が調節されている酵素もある。
この様なリン酸化—脱リン酸化により調節されている代謝系としては.. グリコ —ゲン合成の抑制とその分解系がよく知られている。 この代謝系は、 主としてリ ン酸化—脱リン酸化によりカスケ一ド制御され、 調節されている。
そして近年、 このリン酸化一脱リン酸化が、 疾病に関係する代謝系において重 要な役割を有していることが明らかとなってきている。
例えば、 細胞のガン化は、 リン酸化一脱リン酸化の異常が一因であるといわれ ている。 つまり、 細胞周期の進行や停止は様々な酵素 （タンパク質） のリン酸化 (または脱リン酸化） により制御されており、 このリン酸化（または脱リン酸化） にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ （C D K) が関与しているが、 斯か るメカニズムが損傷するとリン酸化 （または脱リン酸化） に乱れが生じ、 その結 果、 細胞の異常'増殖が引発されることになる。
その他にも、 プロテインキナーゼ Cが、 アトピー性皮膚炎や花粉症などのァレ
ルギー疾患の原因となるヒスタミンの脱顆粒に関与することや、 ァルツハイマ一 病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、 リン酸化されたタウタンパク質による ことが明らかにされている。 .
従って、 タンパク質のリン酸化一脱リン酸化状況を把握することは、 生体組織 細胞の遺伝子発現を探索したり、 酵素活性評価のみならず、 疾病の診断や治療に も役立つ可能性がある。
ところが、 従来より用いられてきたリン酸化タンパク質 （または脱リン酸化夕 ンパク質） の特定方法には、 様々な欠点がある。
例えば、 酵素免疫法は、 対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能 という利点があるが、 必要な抗体を充分量得ることが困難であり、 また、 対象夕 ンパク質が数 kD a以下である場合には、 タンパク質中のリン酸化部位に結合す る抗体を調製することができない。
また、 放射性同位元素32 Pで標識されたリン酸を使用することによって、 タン パク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、 放射性同位元素の取扱い には当然に注意が必要であり、 廃液の管理や処理まで要求される。
更に、 リン酸化タンパク質と脱リン酸化タンパク質とでは電荷が異なることか ら、 二次元電気泳動法の応用も考えられる。 しかし、 特に生体試料を分析する場 合には、 試料に多種類のタンパク質が含まれていることから、 スポットの特定が 非常に困難である。 それに加え、 このスポット特定のために放射性同位元素を用 いるとすれば、 前述した問題が生じてくる。
ところで、学術文献であるヤシ口 ·モリオ，他 2名， Preparation and Study of Dinuclear Zinc (II) Complex for the Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in a Diribo匿 leot ide」， ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ケミ カル ·ソサエティ ·ケミカル ·コミュニケ一ションズ (Journal of the Chemical Society, Chemical communications), p.1793- 1794 (1995年） に は亜鉛錯体が記載されており、 当該亜鉛錯体は、 二つの亜鉛イオンがジヌクレオ チド中のリン酸基 （リン酸ジエステル基） に作用し、 切断するという機能を有す る。 しかし、 当該文献における当該錯体の機能はあくまで触媒としてのものであ り、 リン酸基との配位結合能に関しては、 一切記載されていない。 実際、 本発明
者らによる実験によれば、 当該錯体と 2つのヌクレオシド間のリン酸基 （リン酸 ジエステル基） との解離定数は非常に高い。 即ち、 リン酸ジエステル基に対する 当該錯体の配位結合能は低レ。
また、 同じく学術文献であるヒデカズ ·ァリイ， 他 6名， 「 A novel di i ron complex as a funct ional model for hemerythr inj , ジャーナル *ォブ*インォ —ガニック 'バイオケミストリー （Journal of Inorgani c Biochemi s try) , 第 8 2巻， p . 1 5 3— 1 6 2 ( 2 0 0 0年） にも、 上記亜鉛錯体と類似の構造を有す る鉄錯体が記載されている。.しかし、 当該鉄錯体は、 酸素分子の運搬タンパク質 であるヘムエリトリン (hemerythr in) のモデルとして合成されたものであり、 当 該鉄錯体とリン酸モノエステル基との配位結合能に関して全く記載も示唆もされ ていないことは、 上記ヤシ口らによる学術文献と同様である。 発明の開示
上述した状況の下、 本発明が解決すべき課題は、 リン酸化ペプチド (タンパク 質） を容易に検出すべくこれを標識する方法、 およびリン酸化ペプチドを精製等 するため選択的に吸着する方法を提供することにある。
これに加えて、 本発明では、 リン酸化ペプチドに対して優れた配位結合能を有 し、 上記方法に使用できる化合物， その製造方法 s およびその原料化合物を提供 することも目的としている。
. 本発明者らは、 上記課題を解決すべく、 タンパク質に結合したリン酸基 （リン 酸モノエステル基） に配位可能な金属錯体について鋭意研究を進めたところ、 本 発明の化合物は、 リン酸イオン或いはリン酸モノエステル中の 2つの水酸基に対 する配位結合能が極めて高く、 その結果、 ぺプチドへ結合したリン酸基 (リン酸 モノエステル基) へ強く配位して、 多数のぺプチドを含んだ混合試料でもリン酸 化ペプチドへ特異的に結合して複合体を形成することができ、 また、 本発明の化 合物は標識基を有していることから、 当該複合体を容易に特定できることを見出 して本発明を完成した。
即ち、 本発明に係る方法は、 式 （I ) で表わされる錯体化合物によりリン酸化 ぺプチドを標識すること、 またはリン酸化べプチドを選択的に吸着することを特
徵とする。
[式中、 Xは結合基を示し、 Yは標識基を示す。]
従って、 上記式 （I ) で表わされる錯体化合物は、 リン酸化ペプチドへ特異的 に結合して複合体を形成することができ、 且つ標識基を有していることから当該 複合体を容易に特定できるものとして、 特に生化学的研究や病気の診断治療にお いて非常に有用である。
また、 上記方法においては、 上記錯体化合物として標識基がピオチンである化 合物を用いることが好ましい。 取扱いが容易であり、 また、 様々な発色反応を応 用できることから利便性が高く、 リン酸化べプチドを容易に特定できるからであ る。
上記式 ( I ) で表わされる錯体化合物は、 スキーム 1を含むことを特徴とする 方法によつて容易に製造することができる。
[スキーム 1 ]
また、 式 （II) で表わされる化合物は、 上記スキーム 1に使用されるものとし て、 即ち、 上記式 （I) で表わされる錯体化合物の製造原料化合物として有用で ある。
[式中、 R1は反応性基を示す。 但し、 アミノメチル基， ヒドロキシメチル基， アミノ基および力ルポキシル基を除く。]。
本発明に係るリン酸化ペプチドの標識方法によれば、 リン酸化ペプチド （タン パク質) を容易に検出することができる。 従って、 生体試料等に本発明方法を適 用することによって、 病気の診断等に応用でき得る点で非常に有用である。 また、 本発明に係る化合物 （I) は、 リン酸化ペプチドに対して従来にない配 位結合性を示すことから、 上記方法で使用できる化合物として有用である。 その 上、本発明化合物（I)は、 リン酸化ペプチドへ特異的に吸着することによって、 リン酸化べプチドを精製或いは濃縮したり、 リン酸化べプチドの化学的な情報を 得るために有用である。 図面の簡単な説明
図 1 本発明に係る亜鉛錯体の MALD I一 TOFマススぺクトルである。 図 2 電気泳動ゲルを、本発明の亜鉛錯体で染色したものと （A)、更に従来の 染色方法で染色したもの （B) である。 従来の染色方法では全てのペプチドが染 色されているのに対し、 本発明方法によれば、 リン酸化されたペプチドのみを特 定できることがわかる。
図 3 本発明に係る亜鉛錯体の MALD I— TOFマススペクトルと、 特定範 囲の拡大図である。
図 4 本発明に係る亜鉛錯体の MA L D I— T〇Fマススペクトルと、 特定範 囲の拡大図である。
図 5 本発明化合物に係る錯体化合物の製造原料化合物であって、 標識基とし てピオチンを有する化合物の MA L D I一 T O Fマススぺクトルと、 特定範囲の 拡大図である。
図 6 本発明化合物に係る錯体化合物の製造原料化合物であって、 標識基とし てピオチンを有する化合物の MA L D I— T〇Fマススぺクトルと、 特定範囲の 拡大図である。
図 7 本発明に係る亜鉛錯体の MA L D I—T〇Fマススペクトルと、 特定範 囲の拡大図である。
図 8 本発明に係る亜鉛錯体の M A L D I—T O Fマススぺクトルである。 図 9 電気泳動ゲルを、本発明の亜鉛錯体で染色したものと （A)、更に従来の 染色方法で染色したもの ( B ) である。 ''従来の染色方法では全てのぺプチドが染 色されているのに対し、 本発明方法によれば、 リン酸化されたペプチドのみを特 定できることがわかる。 発明を実施するための最良の形態
本発明方法が享有する最大の特徴は、 標識基を有する式 ( I ) の錯体化合物を 特異的にリン酸化ぺプチドと結合させ複合体を形成させることによって、 リン酸 化べプチドを容易に特定できることにある。
即ち、従来、リン酸基と結合できる金属錯体は種々知られていたものの、式（ I ) に類似の化合物で且つ標識基を有するものはなかった。 そこで、 本発明者らは、 式 （I ) の錯体化合物を用いれば、 複数のぺプチドが含まれている生体試料中で も、 極めて容易にリン酸化ペプチドを検出し特定できることを見出し、 本発明を 完成したものである。
以下に、 本発明に係るリン酸化ペプチドを標識する方法を例示する。
先ず、 対象となる組織細胞から、 その細胞を構成する実質的に全てのペプチド を含む試料を調製する。 この調製は、 生化学分野で一般的に用いられている方法 により行なうことができる。
次に、 当該試料に含まれるペプチドを分離する。 この分離方法は特に制限なく 一般的なものを使用できるが、 例えば電気泳動を用いればよい。
電気泳動を使用する場合、 泳動後ゲルを式 （I ) の錯体化合物の溶液に浸漬し てリン酸化ペプチドを標識し、 標識基の種類に応じた検出方法を用いて、 リン酸 化べプチドを特定することができる。
式 （I ) の錯体化合物溶液に使用できる溶媒は、 リン酸化ペプチドの検出を阻 害しないものであれば特に制限されないが、 例えば水 （緩衝液やその他の塩溶液 を含む）；メタノール， エタノール等のアルコール；これらの混合溶媒を挙げるこ とができる。 好適には、 水系溶媒を使用する。 主としてペプチドを変性させない ことによる。
次に、 上記方法に用いられる化合物 （I ) について説明する。
[式中、 Xは結合基を示し、 Yは標識基を示す。]
上記式 （I ) において、 配位金属として Z nを選択した理由は、 リン酸化タン パク質のリン酸基（リン酸モノエステル基）への配位能が極めて高いことによる。
「結合基」 とは、式（I ) の化合物中、主骨格と標識基とを結合する基であり、 化合物 ( I ) の製造を容易にしたり、 また、 化合物 ( I ) とペプチドに結合した リン酸基との配位を標識基が阻害しない様にする作用を有する。 従って、 化合物 ( I ) の製造において、 標識基が主骨格に直結した原料化合物の入手が容易であ つたり、標識基が比較的小さくリン酸基への配位が阻害されない場合には、 「結合 基」 は、 主骨格と標識基を直結する単なる共有結合であってもよい。
「結合基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、 例えば C卜 C6アルキレン基， アミノ基 （― NH— ) , エーテル基 （_〇—）， チォ
エーテル基 （一 S _) , 力ルポニル基 （一 C (=〇）—）， チォニル基 （― c (= s ) 一）， エステル基， アミド基， ウレァ基 （一 NH C (=〇）N H—）， チォゥレア基 ( _ N H C (= S ) NH— )；アミノ基， エーテル基， チォエーテル基， カルボニル 基， チォニル基， エステル基， アミド基， ウレァ基， チォゥレア基からなる群よ り選択される基を一端に有する C1-C6アルキレン基；アミノ基， エーテル基， チ ォエーテル基， カルポニル基， チォニル基， エステル基， アミド基， ウレァ基， チォゥレア基からなる群より選択される同一または異なった基を両端に有する C1-C6 アルキレン基；およびアミノ基， エーテル基， チォェ一テル基， 力ルポ二 ル基， チォニル基， エステル基, アミド基， ウレァ基, チォゥレア基および C卜 C6 アルキレン基からなる群より選択される 2以上の基が直線状に結合された基を挙 げることができる。
ここで、 rci-C6アルキレン基」 とは、 炭素数 1〜 6の直鎖状または分枝鎖状の 2価脂肪族炭化水素基をいい、 例えば、 メチレン, エチレン, プロピレン， テト ラメチレン， へキサメチレン， メチルエチレン， メチルプロピレン， ジメチルプ 口ピレン等を挙げることができ、 C1-C アルキレン基が好ましく、 C1-C2アルキレ ン基がより好ましい。
本発明における 「標識基」 は、 生化学分野で一般的に使用されるものであれば 特に制限はないが、 取扱性の面から放射性同位元素を含むものは好ましくない。 この様な 「標識基」 としては、 例えば蛍光発色基， ニトロォキシドラジカル含有 基， ピオチン等を挙げることができる。
「蛍光発色基」 は、 比較的長波長の蛍光を安定的に発色し得る置換基をいい、 水溶性， 脂溶性を問わず、 生化学分野で一般的に使用されるものを特に制限なく 用いることができる。 その様な 「蛍光発色基」 としては、 例えばアミノメチルク マリンおよびその誘導体， フルォロセィンおよびその誘導体， テトラメチルロー ダミンおよびその誘導体, アントラニロイルおよびその誘導体， ニトロべンゾォ キサジァオールおよびその誘導体， ジメチルァミノナフタレンおよびその誘導体 を挙げることができる。
「ニトロォキシドラジカル含有基」 は、 安定したラジカルを有する基であり、 電子スピン共鳴 （E S R) によって、 リン酸化ペプチドを検出可能にするもので
ある。 つまり、 生体分子は通常不対電子を有しないので電子スピン共鳴を示さな いが、 ニトロォキシドラジカル含有基を有する化合物 （I ) が配位したペプチド は電子スピン共鳴を示すので、 リン酸化べプチドを特定することができる。
「ピオチン」 は、 卵白由来のアビジンと放線菌由来のストレプトアビジンに対 して、 特異的で且つ強い親和性を有している。 従って、 標識基としてピオチンを 有する本化合物 （I ) にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させ、 更にビ ォチン化した酵素を作用させれば、 ピオチンおよびアビジン等を介して、 本発明 の錯体化合物と酵素とを特異的に結合させることができる。 そして、 当該酵素と してアル力リホスファ夕一ゼ, ペルォキシダ一ゼ， ルシフェラーゼ等を用い、 各 酵素に応じた発色試薬を作用させれば、 リン酸化ペプチドを特定することができ る。 例えば、 リン酸化ペプチドに本発明の錯体化合物を結合させ、 当該錯体化合 物にストレプトアビジンを介し酵素としてアルカリホスファターゼを結合させ、 発色試薬として二トロブルーテトラゾリゥムと 5_ブロモ - 4-ク口口- 3 -ィンドリ ルリン酸を用いて数時間反応させると、 リン酸化したぺプチドは紫色に発色する ので、 これにより特定される。 また、 ローダミン等の蛍光色素で標識されたスト レプトアビジンも市販されており、 これを使用すれば、 通常の蛍光画像解析法で リン酸化べプチドを特定できる。
次に.. 本発明に係るリン酸化べプチドの選択的吸着方法を例示する。
この場合には、 上記標識基として、 特定化合物と特異的に結合することができ るピオチン等を用いる。 例えば、 ストレブトァビジンの結合したァガロースゲル も市販されており、 これに標識基としてピオチンを有する本発明の錯体化合物を 作用させると、 本発明の錯体化合物が結合したァガロースゲルを生成させること ができる。 このァガロースゲルに試料混合物を作用させると、 リン酸化ペプチド を選択的に吸着することが可能となる。 その後、 リン酸緩衝液など本錯体化合物 とリン酸化ペプチドを脱着できる条件を作用させると、 リン酸化ペプチドのみを 得ることができる。 即ち、 この様なァガロースゲルを用いれば、 電気泳動法によ らなくても、 リン酸化ペプチドの精製や濃縮が可能となる。 同様にストレブトァ ビジンの結合した磁気ビーズも発売されており、 これを用いてリン酸化ペプチド の精製や濃縮が可能となる。 更に、 表面プラズモン共鳴 （S P R) 測定用のプレ
ートとしてストレプトァビジンの結合したプレートが市販されており、 これと標 識基としてピオチンを有する本発明の錯体化合物を作用させると、 本錯体化合物 の結合した表面プラズモン共鳴 （SPR) 測定用のプレートとなる。 これを用い て未知試料の表面プラズモン共鳴 （SPR) を測定することによって、 未知試料 中のリン酸化ペプチドの有無を特定できる。
尚、 化合物 （I) の化合物では、 本発明と同一の作用効果を享有するものとし て、 ピリジン環にメチル基等を導入することも可能であるが、 この様な均等化合 物も本発明の範囲内に含まれるものとする。
また、 本発明に係る化合物における（一 X— Y)基の位置も特に限定されず、 下 記化合物 (!') に示す位置に存在する場合もある。
上記式 (I) で表わされる錯体化合物は、 スキーム 1を含むことを特徴とする 方法によって容易に製造することができる。
[スキーム 1]
[式中、 Xおよび Yは前述したものと同義を示す。 また、 R1と R2は、 結合基 X を形成するための反応性基を示す。]。
上記スキームにおいては、 先ず、 反応性基 R1と R 2を反応させて主骨格に結合 基 Xを介して標識基 Yを導入する。
従って、 1と1 2の種類ゃ溶媒， 反応温度， その他の試薬 s 精製方法等は、 主 として Xの種類により決定される。 例えば、 アミノ基 （第二級または第三級アミ ノ基） を介して標識基が導入される場合には、 R 1と R 2の組合わせとしては末端 にァミノ基 (第一級または第二級アミノ基) を有する基とハロゲン原子等の脱離 基との組合わせを挙げることができる。 この場合の一般的な反応条件は、 溶媒中 塩基の存在下で両化合物を縮合することが挙げられる。 また、 R1が活性基であ れば、 標識基の導入は非常に容易である。
次に、 化合物 （I V) の溶液に金属塩を添加することによって、 化合物 （I) を得ることができる。例えば硝酸亜鉛（II)や酢酸亜鉛（II)を添加すればよいが、 酢酸亜鉛（II)を添加する場合には、一旦酢酸が配位した以下の化合物が得られる。
化合物 (I) の原料化合物である化合物 (II) は、 以下のスキーム 2により合 成することができる。
[スキーム 2]
[式中、 R1は前述したものと同義を示す。 また、 "Ha 1" は、 ハロゲン原子 を示し、 好適には臭素原子を示す。]
原料化合物である化合物（V I) (1， 3-ジァミノ- 2-プロパノ一ル） は、市販 のものを使用することができる。 また、 化合物 （VII) と化合物 （I X) は比較
的簡単な構造を有しているので、 市販のものを用いるか、 或いは当業者公知の方 法により合成することができる。
スキーム 2では、 先ず、 触媒の存在下に化合物 （V I) と （VII) を縮合反応 させて、 化合物 （VIII) を得る。 本反応は一段階ずつ化合物 （VII) を導入して いってもよいが、 3当量以上の化合物 （VII) を使用することによって一段階反 応で化合物 （VIII) を得ることもできる。
スキーム 2では、 縮合反応として還元的ァミノ化反応を行なっている。 その場 合に使用される溶媒は、 化合物 （V I) と （VII) とを実質的に溶解でき、 反応 を阻害しないものであれば特に制限なく使用することができるが、 例えば、 メタ ノール, エタノール， イソプロパノール等のアルコール類；ジェチルエーテル， テトラヒドロフラン， ジォキサン等のエーテル類；水；又はこれらの混合溶媒を 使用することができる。
還元的ァミノ化反応では、 先ず化合物 （V I) と （VII) を触媒としての濃塩 酸存在下に縮合した後、 一般的な還元試薬により還元することができる。
反応温度と反応時間は、 原料化合物の種類等によって好適な条件を採用すれば よいが、 例えば 20〜8 で 12〜100時間反応させる。
反応終了後は、 溶媒等を減圧留去した後に水を加え、 非水溶性溶媒で抽出し、 油層を無水硫酸マグネシウム等で乾燥した後 溶媒を減圧留去する。 次いで、 残 渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ—等の公知方法により精製して、 化合物 (VIII) を得ることができる。
尚、 化合物 (VIII) を得る方法はスキーム 2で示した方法に限られず、 例えば 化合物 （VI) とハロゲン化合物から化合物 （VIII) を合成してもよい。
次に、 化合物 (I X) を反応させることにより、 化合物 (II) を得ることがで きる。 この反応は、 一般的な三級ァミンの合成反応を採用することができる。 例 えば、 溶媒中塩基の存在下で縮合させる。 また、 当該ステップにおいては、 R1 の種類に応じて、 適宜保護基の導入と脱保護を行なってもよい。 或いは、 化合物 ( I X) 中 R1の代わりに不活性置換基を有する化合物を用いて当該ステップを 行なつた後、 官能基変換により当該不活性置換基を R 1へ変換することによって、 化合物 （II) を合成してもよい。 例えば、 不活性置換基としてニトロ基と有する
化合物を使用し、 当該ステップ後、 ニトロ基を反応性基であるアミノ基に変換し てもよい。
本発明に係る方法に使用できる化合物としては、 化合物 （I ) の代わりに、 下 の化合物 （X) を用いることもできる。
[式中、 X, Yは前述したものと同義を示す。 また、 R 3〜R 5は、 ピリジン環上 の 4または 6位における電子供与性置換基を示す。]。
本発明方法に使用される化合物 （X) は、 適切な置換位置に導入された電子供 与性置換基によってピリジン窒素が電気的にリッチとなっているため、 亜鉛に対 する配位性に優れており、 結果的に製造が容易であり、 また、 安定性を有する。 化合物 (X) の使用方法, 製造方法, 原料化合物については、 化合物 （I ) に 準ずるものを使用することができる。 以下に、 製造例および試験例を示し、 本発明を更に詳細に説明するが、 本発明 の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例
製造例 1一 1 6-ブロモメチルニコチン酸メチル
6_メチルニコチン酸メチル 50g (331腿 o l) の四塩化炭素 （625m 溶液に N-ブ ロモコハク酸イミド 59g (331匪 o l) を加えた。 更に過酸化ベンゾィル l . Ogを添
加後、 投光器で光を照射しながら 40〜50°Cで 24時間反応させた。
反応液を冷却後、 析出した結晶を濾別し、 濾液を炭酸水素ナトリウム水溶液で 洗浄した後に濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで 精製し、 37gの目的物を得た。
'H-NMR (CDC13, 300MHz) ： 6 3.96(3H, s, 0C¾), 4·58(2Η， s, CH2Br) , 7.54(1H, d, Py), 8.30(1H, dd, Py), 9.17(1H, d, Py) 製造例 1一 2 Ν，Ν，Ν'-トリ（2 -ピリジルメチル） -1,3 -ジァミノプロパン- 2-ォー ル
1,3-ジァミノプロパン- 2-オール 32.6g (362腿 ol) のメタノール (2400mL) 溶 液に濃塩酸 60mLを加え、 更に 2-ピリジンアルデヒド 116.3g (1.09mol) を滴下 した後、 シァノトリヒドロホウ酸ナトリウム 50.16g (798丽 ol) を添加した。 添 加終了後、 室温で 3日間反応させた。
反応液に濃塩酸を加えて pH 6に調整した後、 ある程度濃縮し、 0.1N水酸化ナ トリウム水溶液を加えて pH 7に調整し、 クロ口ホルムで抽出した。 当該クロ口 ホルム層を集め、 乾燥した後に濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一で精製し、 34gの目的物を得た。
Ή-腿 (CDC13, 300MHz) ： δ 2.59-2.83 (4Η, i, C¾), 3.86-4.01 (7H, m， NCH2Py, CH), 7.15(3H, dd, Py), 7.23-7.32 (3H, m, Py), 7.56-7.65 (3H, m, Py), 8.53(3H, dd, Py)
製造例 1一 3 Ν，Ν，Ν'-トリ（2-ピリジルメチル) -Ν'- (5-メトキシカルボニル -2 - ピリジルメチル) - 1, 3 -ジァミノプロパン - 2 -オール
反応後、溶液を冷却した後、 750mLの水に投入して 1N塩酸で p H 8に調整した。 酢酸ェチルで抽出後、 酢酸ェチル層を集め、 水， 飽和食塩水で洗浄した後に濃縮 した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、 21.5g の 目的物を得た。
Ή-NMR (CDC ， 300MHz) ： δ 2.58-2.73 (4Η, m, CH2), 3.83-3.95 (12H, in, 0C¾, NCH2Py, CH)， 7.10-7.14(3H, m, Py), 7.34(3H, d， Py), 7.50-4.60 (4H, m, Py), 8.17(1H, dd, Py), 8.50(3H, d， Py), 9.09(1H; d, Py) 製造例 1一 4 Ν,Ν,Ν'-トリ (2-ピリジルメチル） -N' - [5 - N' ' - (2-ァミノェチル）力 ルバモイル- 2 -ピリジルメチル] -1， 3-ジァミノプロパン- 2-オール
反応後、 溶液を濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー で精製し、 9.72gの目的物を得た。
Ή-NMR (CDC13, 300MHz) ： δ 2.54-2.71 (4Η, m， CH2)， 2.94(2H, t, CH2N) , 3.49(2H, dt, CHZN) , 3.80-3.99 (9H, m, NCH2Py, CH), 7.1 (3H, ddd, Py), 7.35(3H, d， Py), 7.45(1H, d， Py) , 7.58 (3H, ddd, Py), 8.02(1H, dd, Py), 8.49(3H, ddd, Py), 8.89(1H, d, Py) 製造例 1一 5 Ν,Ν,Ν' -トリ (2-ピリジルメチル) -N' - [5-N' ' - (7-二トロ- 2， 1 , 3-ベ ンゾォキサジァゾ一ル- 4-ィルアミノエチル）力ルバモイル- 2-ピリジルメチ ル] - 1， 3-ジァミノプロパン- 2-オール
反応後、 溶液を濃縮し、 ジクロロメタン 50mLと水 50mLを加え分液し、 ジクロ ロメ夕ン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 得られた残渣をシリカゲル力ラムク 口マトグラフィ一で精製し、 71.2mgの目的物を得た。
lH - NMR (CDC13， 300MHz) ： δ 2.46-2.69 (4Η, m, CH2), 3.65-3.95 (13H, m, N CH2CH2N, NCH2Py, CH), 6.06(1H, d, Ar)， 7.08-7.13 (3H, m, Py), 7.32(3H, d, Py), 7.42(1H, d, Py) ， 7.56(3H, ddd, Py), 7.96(1H, dd, Py), 8.44-8.48 (3H, m, Py),
8.19 (1H, d, Ar)， 8.83(1H, d， Py) 製造例 1一 6 本発明に係る亜鉛錯体溶液
製造例 1-5の化合物
また、 亜鉛錯体の存在を次の方法によって確認した。 即ち、 上記製造例 1 _ 5 で合成した化合物をリン酸緩衝液 （ p H = 6. 86) に溶解して濃度 50 M溶液 とし、 2倍モルの硝酸亜鉛を加えた。 この溶液中で、 本発明に係る亜鉛錯体は下 に示す構造を有しており、 これを MALD I一 TOFマススぺクトルによって確 認した。マススぺクトルの測定条件は、 マトリクス： 2'，4'，6'-トリヒドロキシァ セトフエノン、 実験モード：リフレクタ一 （Reflector), 加速電圧： 20000V、 グ リッド電圧： 57.500%、 レーザ一強度： 2500、 測定回数： 128、 真空度： 5.05e - 07 とした。
MALD I— TOFマススペクトルの結果を、 図 1として示す。 図 1中、 分子 イオンピークが 926.2 (exact mass： 926.11) として観測され、 また、 910.2のピ ークは、 ォキサジァゾ一ル基の酸素が脱離したピークと考えられる。
製造例 2— 1 Ν，Ν，Ν' -トリ (2-ピリジルメチル） -Ν'- [5_Ν''- (2- D -ピオチンアミ ドエチル）力ルバモイル -2-ピリジルメチル] -1， 3 -ジァミノプロパン- 2-オール
反応終了後、 反応液を水 50mLに投入し、 クロ口ホルム 50mLで 2回抽出した。 クロ口ホルム層を濃縮して得られた粗製品をシリカゲル力ラムクロマトグラフィ —で精製し、 265mgの目的物を得た。
Ή -丽 R (CDC13, 300腿 z) ： 6 1. 7-1. 7 (2H5 m5 CH2), 1.50-1.75 (4H, m, C¾), 2.13-2.26 (2H, m， C0CH2) , 2.52-2.74(5H, m, CH2, SCH2) , 2.79-2.88 (1H, ra， SCH2)， 3.01-3.12(1H, m, SCH) , 3.43-3.65 (4H, m, NCH2CH2N) , 3.80-4.02 (9H, m, NCH2Py, CHO), 4.22-4.28 (1H, , NCH), 4.42-4.49 (1H, m, NCH) , 5.83(1H, bs， HCO) , 6.60(1H, bs， NHCO) , 7.07-7.18(3H, m, Py), 7.31-7.38 (3H, m, Py), 7.44(1H, d, Py), 7.59(3H, ddd, Py), 8.03(1H, dd, Py), 8.15 (1H, bs, NHCO) , 8.42-8.58 (3H, m, Py), 8.94(1H, d, Py)
製造例 2— 2 本発明に係る亜鉛錯体溶液
製造例 2-1の化合物
上記製造例 2— 1で合成した化合物をリン酸緩衝液 （pH=6. 86) に溶解 して濃度 3mMの溶液とし、 2倍モルの硝酸亜鉛を加えた。
この溶液中で、 本発明に係る亜鉛錯体は下に示す構造を有しており、 これを M ALD I一 TOFマススぺクトル（マトリクス： 2'，4'， 6'_トリヒドロキシァセト フエノン) によって確認した。
MALD I一 TOFマススぺクトルの結果を、 図 3として示す。 図 3中、 分子 イオンピークは 989.6 (exact mass:989.19) として観測された。 試験例 1 10% Native-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
先ず、 以下の条件で電気泳動用ゲル， 泳動用 pH緩衝液とサンプル溶解用色素 液を調製した。
濃縮ゲル
125mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 6. 8)
4. 5% (w/v) ポリアクリルアミド (アクリルアミド： ビスアクリルァ ミド = 30 ： 1)
分離ゲル
375mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 8. 8)
1 0% (w/v) ポリアクリルアミド (アクリルアミド：ビスアクリルアミ ド =30 ： 1)
泳動用 pH緩衝液 （pH8. 3)
25 mM トリス
1 9 OmM グリシン
サンプル溶解用色素液 （3倍濃縮液）
1 95mM トリス—塩酸緩衝液 （pH 6. 8)
1 0% (w/v) グリセ口一ル
0. 1 % (w/v) BPB (ブロムフエノールブル一：泳動色素マーカ一）。 次に、 1 ：ゥシ血清アルブミン， 2 ： /3—カゼイン (リン酸化型）, 3 ·· β—力 ゼイン （脱リン酸化型） それぞれ 11 をサンプル溶解用色素液に溶解して試料 とし、 これを調製した電気泳動用ゲルにプロットした後、 泳動色素マーカーが流 れ出るまで 4 mAの定電流電気泳動を行なった。
得られたゲルを上記製造例 1一 6で調製した本発明に係る亜鉛錯体溶液 (50 M) に約 30分間浸漬した後、溶液から取り出して、 UVランプにより紫外線光を 照射しつつ写真撮影を行なつた。 続いて、 クマシ一ブリリアントブル一によって 通常の染色を行ない、 写真撮影した。 本発明に係る亜鉛錯体溶液による染色後の ゲルを A， 続いてクマシ一ブリリアントブル一染色後のゲルを Bとして図 2に示 す。
図 2の通り、 本発明方法によれば、 リン酸が結合した )3—カゼイン (2) のみ が特定できる。 従って、 本発明方法によれば、 生体試料からリン酸化されたぺプ チドのみを特定でき得ることが明らかとなった。 製造例 3— 1 Ν,Ν,Ν'-トリ（2-ピリジルメチル） - Ν'- [5-Ν''- 2-(6_D -ピオチンァ ミドへキサカルポキシアミドエチル）力ルバモイル- 2 -ピリジルメチル] -1, 3 -ジァ ミノプロパン- 2-オール
zz
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C46H61Nn09PSZn2 Mol. Wt.: 1105.85
Exact Mass: 1102.27 上記製造例 3— 1で合成した化合物 （200 IO1) をリン酸緩衝液 （pH=6.86)に 溶解して 3mMの溶液とし、 2倍モルの硝酸亜鉛を加えた。
この溶液を MALD I— TO Fマススぺクトル (マトリクス： 2'，4'，6'—トリヒ ドロキシァセトフエノン) により分析することによって、 上記亜鉛錯体の存在を 確認した。 MALD I _T〇Fマススぺクトルの結果を、 図 4として示す。 図 4 中、 分子イオンピークは 1102.3 (exact mass： 1102.27) として観測された。 試験例 2
ス卜レブ卜 7ビジンァガロース (ピオチン結合部位量： 60〜120nmol/mL) と緩 衝液の懸濁液 0.3mL (シグマアルドリツチ社製）を遠心式フィルタ一ュニット（容 量 0.5mL, フィルターボア径 0.22 m) に充填し、 遠心加速度： 2000Xgで 15秒 間遠心分離機にかけ、 緩衝液を濾過した。 次いで、 5.0mM トリスーアセテート緩 衝液 (pH=7.4, 0.30mL) をフィル夕一ユニットに担持し、 2000 Xgで 1 5秒間遠 心濾過洗浄する操作を 5回行なった。
このフィルターユニットに、 製造例 3— 1で合成した化合物 （120nmol/mL) と 酢酸亜鉛 （500nm/niL) を溶解した 5.0mM トリスーアセテート緩衝液 （pH==7.4， 0.30mL) を担持し、 5分間平衡化した後、 これを 2000Xgで 1 5秒間遠心濾過し た。 次に、 5.0mMトリス-アセテート緩衝液 （ρΗ=7·4, 0.30mL) をフィル夕一ュ ニットに担持し、 2000Xgで 1 5秒間遠心濾過洗浄する操作を 5回行なった。 更
に、 10nmol/mL酢酸亜鉛を溶解した 5.0mM トリス—アセテート緩衝液 （pH=7.4， 0.30mL) をフィルターユニットに担持し、 2000Xgで 1 5秒間遠心濾過洗浄する 操作を 5回行なった。
得られたフィルターユニッ トに、 試料として非リン酸化ペプチド p60c (p60c-src peptide 521-533, Hnmol/iL) およびリン酸化ペプチド P- p60c (O-phosphoryl p60c-src peptide 521-533, 12塵 1/mL) を溶解した 5.0mM トリ ス—アセテート緩衝液 （ρΗ=7·4, 0.30mL) を担持し、 5分間平衡化した後、 2000 Xgで 15秒間遠心濾過し、 この濾液をフラクション 1とした。
次に、 5.0 トリス—アセテート緩衝液 （pH=7.4， 0.50M NaN03, 0.30mL) を フィルタ一ュニットに担持し、 2000 Xgで 1 5秒間遠心濾過する操作を 3回行な つた。 それぞれの濾液を、 フラクション 2, 3， 4とした。
更に、 l.OmMリン酸一水酸化ナトリウム緩衝液（pH=7.4, 0.50M NaN03, 0.30mL) をフィルターュニッ卜に担持し、 2000Xgで 1 5秒間遠心濾過する操作を 2回行 なった。 それぞれの濾液を、 フラクション 5， 6とした。
上記各フラクションのペプチド含有量を、 高速液体クロマトグラフィー (HP LC) で定量した。 得られた分離回収率の結果を表 1に示す。
表 1
HP LC分析条件
カラム ： Capcell Pak CI 8 type UG80， 4.6ΙΜΙΦ X 150ηιπι
移動相 ： ァセトニトリル/水 =14/86 (v/v)， 0.1%(ν/ν)トリフルォロ酢 lraL/min
カラム温度 40°C
検出方法 UV 266nra
保持時間 P-p60c 5.3分， 60c 13.4分。
上記結果より、 本発明の錯体化合物はリン酸化ペプチドを選択的に吸着できる
ことから、 本発明の錯体化合物を用いれば、 リン酸化ペプチドと非リン酸化ぺプ チドの混合試料から、リン酸化べプチドを選択的に分離できることが実証された。 比較例 1
ストレプトアビジンァガ口一ス （ピオチン結合部位量： 60〜120nmol/mL) と緩 衝液の懸濁液 0.3mL (シグマアルドリッチ社製） を、 遠心式フィル夕一ユニット (容量 0.5mL， フィルタ一ポア径 0.22 Π に充填し、 2000Xgで 15秒間遠心分 離機にかけ、 緩衝液を濾過した。 次いで、 5.0mM トリスーアセテート緩衝液 （pH = 7.4, 0.30mL) をフィルターユニットに担持し、 2000Xgで 1 5秒間遠心濾過洗 浄する操作を 5回行なった。
得られたフィルタ一ュニット (本発明の錯体化合物は無し) について、 上記試 験例 2と同様の試料を用いて同様の処理を行ない、フラクション 7〜1 2を得た。 得られたフラクション 7〜12にっき、 上記試験例 2と同様の条件で H PLC 分析を行なった。 結果を表 2に示す。
表 2
当該結果より、 本発明の錯体化合物を用いなければ、 同様の処理を行なっても リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドを分離できないことが明らかにされた。 製造例 4一 1 2-ァセトキシメチル -4-ニトロピリジン
無水酢酸 200mL を 10 O に加熱し、 2-メチル _ 4-ニトロピリジン Ν-ォキシ ド 25. Og (162mmmol) をゆつくり添加した。 添加後徐々に昇温し、 1 30°Cで 2
0分反応させた。 反応液を 8 0°Cまで冷却し、 エタノール 200mLを滴下して反応 を停止させた。 反応液を濃縮後、 水 500mLに投入し、 炭酸水素ナトリウムで pH を 9に調整した。 酢酸ェチル （500mLと 200mL) で抽出後、 有機層を水 （200mL)、 飽和食塩水（200mL)で洗浄した。有機層を濃縮して得られた粗製品をシリカゲル カラムクロマトグラフィーで精製し、 7.68gの目的物を得た。
Ή-NMR (CDC13, 300MHz) ： δ 2.23(3H, s, C0CH3) , 3.36(2H, s， CH2Py) , 7.97(1H, dd, Py), 8.07(1H, d, Py), 8.90(1H, d, Py) 製造例 4一 2 2-ヒドロキシメチル -4-ニトロピリジン
上記製造例 4一 1で合成した 2-ァセトキシメチル -4-ニトロピリジン 7.68g (39.2mmol) に 1 0 %塩酸 30mL を加え、 5 で 3 0分反応させた。 反応液を 冷却した後水 200mLに投入し、 炭酸水素ナトリウムで pHを 9に調整した。酢酸 ェチルで抽出 （100mLX 3)後、 有機層を濃縮した。 得られた残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィ—で精製し、 4.70gの目的物を得た。
Ή -匪 R (CDC13, 300MHz) ： δ 3.36(1H, t , OH), 4.94(2H, d, CH2Py) , 7.95 (1H, ddt, Py), 8.09(1H, dt, Py), 8.86(1H, d, Py) 製造例 4一 3 2-ブロモメチル -4-ニトロピリジン
Ή-NMR (CDC13, 300MHz) ： δ 4.66(2H, s, CH2Py) , 7.96(1H, dd, Py), 8.19 (1H, dd, Py), 8.88(1H, dd, Py) 製造例 4一 4 N, N， N' -トリ（2-ピリジルメチル) - N' - (4-二ト口- 2-ピリジルメチ ル ) -1,3-ジァミノプロパン- 2 -オール
Ή-NMR (CDC13， 300MHz) ： δ 2.60-2.78 (4Η, m, NCH2) , 3.84-3.96 (6H, m, CH2Py) , 3.96-4.03 (1H, m, OCH), 4.07(2H, s, CH2Py) , 7.09-7.14(3H, m, Py), 7.34(3H, t,Py), 7.55-7.62 (3H, m, Py), 7.80(1H, dd, Py), 8.22(1H, d, Py), 8. 9-8.52 (3H, m, Py), 8.76(1H, dd, Py) 製造例 4一 5 Ν,Ν,Ν'-トリ（2_ピリジルメチル) -Ν'- (4-アジド- 2-ピリジルメチ
ル) - 1， 3 -ジァミノプロパン- 2 -オール
Ή-NMR (CDC13， 300MHz) ： 6 2.58-2.74 (4H, m, NC¾)， 3.83-3.92 (8H, m, CH2Py) , 3.92-4.01 (1H, m, OCH), 6.74(1H, dd, Py), 7.09-7.14(3H, i, Py), 7.20(1H, d， Py), 7.32-7.36 (311, m, Py), 7.55-7.60 (3H, m, Py), 8.39(1H, d, Py), 8.49-8.52 (3H, m, Py) 製造例 4一 6 Ν,Ν,Ν'-トリ（2-ピリジルメチル） - Ν'- (4-ァミノ- 2-ピリジルメチ ル）- 1， 3 -ジァミノプロパン - 2-オール
3.92-4.01 (1H, m, OCH), 6.35(1H, dd, Py), 6.63(1H, d, Py), 7.08-7.14 (3H, m,
Py), 7.27-7.39 (3H, m, Py), 7.54-7.62 (3H, m, Py), 8.10(1H, d, Py), 8.49-8.50 (3H, m, Py) ' 製造例 4— 7 N，N，N'_トリ（2-ピリジルメチル） -Ν'- (4- D -ピオチンアミド- 2-ピ リジルメチル) - 1， 3 -ジアミノプロパン - 2-オール
D -ピオチン 62.4mg (0.26腿 ol) をジクロロメタン (5niL) に懸濁し、 4-ジメチ ルァミノピリジン 5.2mg (0.04匪。1)、 トリェチルァミン 35.8^L (0.26mmol) を 室温で加えた。 ここへ、 上記製造例 4一 6で合成した Ν,Ν,Ν'-トリ（2-ピリジルメ チル) -Ν'- (4-ァミノ- 2-ピリジルメチル) -1, 3 -ジァミノプロパン- 2 -オール lOOmg (0.21mmol) のジクロロメ夕ン （2mL) 溶液を室温で滴下後、 1-ェチル -3_(3-ジメ チルァミノプロピル）カルボジィミド塩酸塩 9. Onig (0.26醒 ol) を室温で添加し た。反応液を加熱し、還流下 5時間反応させた。当該反応液に、 D -ピオチン 6. Omg (0.02腿 ol)、 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩 10. Omg (0.05删 ol)、 ジクロロメタン (2mL) を追加しさらに還流下 6時間反応し た。 反応液を冷却し、 水 (40mL) に投入後、 クロ口ホルムで抽出 (30iiiLX 3) し た。 有機層を、 水 （30mLX 2)、 飽和食塩水 （30mL) で洗浄した。 無水硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 濃縮して得られた粗製品を HP LC分取で精製し、 62.5mgの目 的物を得た。
Ή-NMR (CDC13, 300MHz) ： δ 1.37-1. 5 (2Η, m, CH2), 1.53-1.71 (4H, m, CH2)， 2.19-2.25 (2H, m, C0CH2) , 2.62-2.75 (5H, m, NCH2, SCH2) , 2.87-2.93 (1H, dd, SC¾) 3.09-3.15 (1H, m, SCH), 3.67-3.80 (9H, m, OCH, NCH2Py) , 4.28-4.32 (1H, m, NCH),
4.48-4.52 (1H, i, CH), 5.15-5.40 (2H, m, NHCO) 5.89(1H, bs, NHCO) 6.48-6.50 (1H, m, Py), 6: 72-6.76 (1H, m, Py), 7 .13-7.17 (3H, m, Py), 7.27-7.29 (1H, m, Py), 7.37(2H, d， Py), 7.56-7.66 (3H, i, Py), 8.00(1H, dd, Py), 8.49-8.50 (3H， m, Py)
当該化合物について、 CHCA (ひ-シァノ -4 -ヒドロキシシンナミックァシッ ド） をマトリクスとして、 MALD I— TOFマススペクトルを測定した。 結果 を図 5に示す。 図 5によれば、 プロトン付加体 （M++l) の分子イオンピークとし て 696.2が観測された。 製造例 5 6-ァミノへキサン酸メチルエステル塩酸塩
6 -ァミノへキサン酸 10. Og (76.2mmol) のメタノール (300mL) 懸濁液に、 濃硫 酸 5.51gを加えた。 当該懸濁液を加熱昇温し、 エステル化反応が進行するにつれ 生じる水をメタノールと共に留去しつつ、 60mLのメタノールを適時 4回加えなが ら 8時間反応させた。 反応液を冷却後 28%ナトリウムメトキシ'ドメ夕ノール 溶液で pHを 6. 2に調整した。 溶媒を留去し、 残渣を水 500mLに投入した。 炭 酸ナトリウムで pHを 10. 3に調整し、 ジクロロメタンで抽出 (350mLX 3) し た。 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒を留去した。 得られた 6-ァミノへキサ ン酸メチルエステルをジォキサン (40mL) に溶解し、 4N-塩酸/ジォキサン溶液 7. lmL を加えた。 室温で 30分撹拌後、 溶媒を留去し、 残渣にエーテルを加えて 析出した結晶を濾取して減圧乾燥することによって、 3.3gの目的物を得た。
Ή-NMR (DMS0-d6, 300MHz) ： δ 1.26-1.36 (2Η, m, CH2), 1. 8-1.61 (4H, m, CH2), 2.3K2H, t, CH2C0) , 2.73(2H, t, CH2N) , 3.59(3H, s, CH3), 8.1 (3H， bs, NH3)
製造例 5— 2 5-カルポメトキシペンチル- D -ピオチンアミド
Ή-NMR (DMS0-d6, 300MHz) ： δ 1.18-1.65 (12H, m, C¾)， 2.04(2H, t, CH2C0), 2.28C2H, t, CH2C0)， 2.57(1H, d, CH2S) , 2.82(1H, dd, CH2S)， 3.00(1H, dt， NHCO) , 3.06-3.12 (IH, 111, CH2S) , 3.58 (3H, s， 0CH3)， 4.09-4.15 (IH, m, CH ) , 4.28-4.32 (IH, m, CHN)， 6.35(1H, bs, NHCO)， 6.41 (IH, bs, NHCO)， 7.72(1H, t, NHCO) 製造例 5一 3 5-カルボキシペンチル- D -ピオチンアミド
Ή-NMR (DMS0-d6, 300MHz) ： δ 1.17-1.67(12H, m, CH2), 2.04(2H, t, CH2C0) , 2.19 (2H, t, CH2C0) , 2.57(1H, d, CH2S) , 2.82(1H, dd， CH2S) , 3.00(1H， dt， NHCO) , 3.06-3.12 (1H, m, CH2S) , 4.13(1H, t, CHN), 4.30(1H, t, CHN)， 6.36(1H, bs, NHCO) , 6.43C1H, bs, NHCO) , 7.74(1H, t, NHCO) , 11.95(1H, bs, C02H) 製造例 5— 4 Ν,Ν,Ν' -トリ（2 -ピリジルメチル） -Ν'- [4 -（6-D-ピオチンアミドへ キサカルポキシアミド）- 2-ピリジルメチル] -1， 3 -ジァミノプロパン- 2-オール
-腿 (CDC13, 300MHz) ： δ 1.30-1.80 (12H, m, CH2), 2.14-2.25 (4H, m, C0CH2) , 2.60-2.76 (5H, m, NCH2, CH2S) , 2.87(1H, dd, CH2S) , 3.10-3.25 (3H, m, CH2NHC0, SCH), 3.68-3.82 (9H, m, NCH2Py, OCH), 4.28-4.33 (1H, m, NCH), 4.45-4.52 (1H, m， NCH), 5.27(1H, bs, NHCO) , 5.50(1H, bs, NHCO), 5.60(1H, bs, NHCO) 6.22(1H, bs, NHCO) , 6.52-6.57 (1H, m, Py), 6.72-6.75 (1H, m, Py), 7.16(3H, t, Py),
7.27-7.30 (1H, m, Py), 7.37(2H, d， Py), 7.57-7.66 (3H, m, Py), 7.99(1H, d, Py),
8.46-8.52 (3H, m, Py)
当該化合物について、 CHCAをマトリクスとして MA LD I—TOFマスス ぺクトルを測定した。 結果を図 6に示す。 図 6によれば、 プロトン付加体 （M++1) の分子ィオンピークとして 809.5が観測された。 製造例 6 2-ブロモメチル -3-ヒドロキシピリジン
HBr
ゝ〜 OH
HC1
25 %臭化水素酢酸溶液 12.8g (39.6inmol) に 3-ヒドロキシ- 2-ヒドロキシメ チルピリジン塩酸塩 5.0g (54.7匪01) を添加し、 1 10°Cで 1時間反応させた。 更に、 25 %臭化水素酢酸溶液 4.90g (15.1匪 ol)を滴下し、 2時間反応させた。 反応液を冷却後、 水 50mL に投入し、 飽和炭酸水素ナトリゥム溶液で p Hを 8に 調整した。 ジクロロメタンで抽出 (50mLX4) し、 ジクロロメタン層を濃縮して 得られた粗製品をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、 1.36g の目的 物を得た。
Ή-NMR (CDC13， 300MHz) ： δ 5.31 (2Η, s， CH2Br) , 7.20-7.32 (2H, m, Py), 8.18-8.21 (1H, m, Py), 8.55 (1H, bs, OH)
製造例 6— 2 N， N， N' -トリ（2-ピリジルメチル) - N' - (3-ヒドロキシ- 2-ピリジル メチル )-1， 3 -ジァミノプロパン -2-オール
Ή-NMR (CDC13， 300MHz) ： δ 2.51-2.69 (4Η, m, NC ), 3.71-4.08 (9H, m, CH2Py, 0CH) 3 7.05-7.14 (4H, m, Py) , 7.15-7.19 (1H, t, Py), 7.23-7.28 (311, in, Py), 7.55 (2H, dt, Py) , 7.64(1H, dt, Py) , 7.9K1H, dd, Py), 8.48-8.55 (311, m, Py) 製造例 6— 3 Ν,Ν,Ν'-トリ (2-ピリジルメチル） -N' - (3-D-ピオチニルォキシ - 2 - ピリジルメチル) -1, 3-ジアミノプロパン -2-オール
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ZL8L0/ 00Z OAV
OFマススペクトル分析することによって、 上記亜鉛錯体の存在を確認した。 M ALD I— TOFマススペクトルの結果を、 図 7として示す。 図 7中、 分子ィォ ンピークは 919.1 (exact mass :919.13) として観測された。 製造例 7— 1 Ν,Ν,Ν'-トリ（2-ピリジルメチル） - Ν'- [5_Ν''- (2-ダンシルァミノ ェチル）力ルバモイル- 2-ピリジルメチル] -1 , 3-ジァミノプロパン- 2-オール
Ή-NMR (CDC13, 500MHz) ： δ 2.57 (IH, dd, CH2), 2.60 (IH, dd, CH2), 2.67 (IH, dd, CH2), 2.69(1H, dd, C¾), 2.85(6H, s， NCH3) , 3.17(211, dd, NCH2CH2N) , 3.50(2H, dd, NC¾C¾N), 3.88C8H, dd, NC¾Py)， 3.83-3.92 (IH, m, OCH) , 6.31 (IH, m, S02NH) , 7.11 (IH, d, Ar), 7.13(311, ddd, Py), 7.35(3H, d, Py), 7.36(1H, d, Py), 7.42(1H, m, COM), 7.46(1H, dd, Ar), 7.49(1H, dd, Ar), 7.60(2H, dt, Py), 7.60(1H, dt, Py), 7.90(1H, dd, Py), 8.23(1H， dd, Ar), 8.27(1H, d， Ar), 8.49(2H, ddd, Py), 8.50(1H, ddd, Py), 8.5K1H, dd, Ar), 8.80(1H, d, Py)
13C-NMR (CDC13, 125MHz) ： 39.9 (NCH2CH2N) , 42.7 (NCH2CH2N) , 45.3(NCH3), 59.0(CH2), 59.1(CH2), 60.6(CH2Py), 60.7(CH2Py), 61.3(CH2Py), 67. l(CHO), 115.2(Ar),
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5Sl '(·ΐν) · ΐ '(·ΐν)9·02ΐ '(人 d)6'6ZI '(JV)9'6ZI '(W6 '(·ΐν)3·8
'(·ΐν)Γ82ΐ '(^ί)Ζ Ζ\ '( Z'Ul '(Λ«Ι)8·^Ϊ '^Ι ΖΙ '(·ΐν)9·8Π
ZL8L0/ 00Z OAV
一腿 R (DMS0-d6, 300MHz) ： δ 2.33-2.43 (2Η, m, CH2), 2.50-2.61 (2H, m, CH2), 3.38-3.57(411, m, NCH2C¾N) , 3.67-3.92 (9H, m, NCH2Py, CHO)， 6.52-6.67 (6H, m, Ar), 7.16-7.23 (3H, m, Py), 7.17(1H, d, Ar), 7.34-7.41 (3H, m， Py), 7.52(1H, d, Py), 7.69 (3H, dt， Py), 7.68-7.77 (IH, m, Ar), 8.1 (IH, dd, Py), 8.24(1H, d， Ar), 8.41-8.46 (3H, ni, Py), 8.78(1H, m， NHCO), 8.92(1H, d, Py) 試験例 3 10% Native-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
先ず、 上記試験例 1と同様の条件で、 電気泳動用ゲル， 泳動用 pH緩衝液とサ ンプル溶解用色素液を調製した。
次に、 1 :ゥシ血清アルブミン， 2 :ヒト血清アルブミン， 3 :炭酸脱水酵素， 4： jS—ガラクトシ夕一ゼ， 5 ： α—カゼイン （リン酸化型）， 6 : α—カゼイン (脱リン酸化型）， 7： /3—カゼイン （リン酸化型）， 8 ： i3—カゼイン （脱リン酸
化型）， 9 ：ペプシン （リン酸化型）， 10 ：ペプシン （脱リン酸化型） それぞれ 2 gをサンプル溶解用色素液に溶解して試料とし、 これを調製した電気泳動用 ゲルにプロットした後、 泳動色素マーカーが流れ出るまで 40mAの定電流電気 泳動を行なった。
得られたゲルを、 上記製造例 8— 1で調製した N，N，N'_トリ（2-ピリジルメチ ル） - N' - [5-N' '一 (2-N-5-フルォレセィ二ルチオゥレイドエチル）力ルバモイル- 2 - ピリジルメチル] - 1,3 -ジァミノプロパン- 2 -オール 1 iMと、 酢酸亜鉛 lOO^Mを 含む 10mM トリスー酢酸 pH緩衝液 （pH=7. 4) に 30分間浸漬した後、 溶 液から取り出した。このゲルを 10mMトリスー酢酸 pH緩衝液（pH=7.4)100mL で 10分間 2回洗浄した後、フルォロイメージアナライザ一 FLA— 5000 (富 士写真フィルム（株)社製) を使用して励起波長 473 nm、 蛍光検出フィルター 5 1 0 nmの条件で蛍光画像を撮影した。 続いて、 クマシ一ブリリアントブル一 によって通常の染色を行ない、 写真撮影した。 本発明に係る亜鉛錯体溶液による 染色後のゲルを A, 続いてクマシ一プリリアントブル一染色後のゲルを Bとして 図 9に示す。
図 9の通り、 通常の染色を行なった場合 (B) では全てのぺプチドが染色され るのに対し、 本発明に係る亜鉛錯体の溶液で処理しこ場合には、 リン酸が結合し た （5) ex—カゼイン （リン酸化型）， (7) ]3—カゼイン （リン酸化型）， (9) ペプシン (リン酸化型) のみを特定することができる。 従って、 本発明方法によ れば、 生体試料からリン酸化されたペプチドのみを特定でき得ることが明らかと なった。
Claims
請求の範囲
. 式 （I ) で表わされる錯体化合物によって、 リン酸化ペプチドを標識する とを特徴とする方法。
[式中、 Xは結合基を示し、 Yは標識基を示す。]
2 . 上記錯体化合物として、 上記標識基がピオチンである化合物を用いる請求 項 1に記載の方法。
3 . 式 ( I ) で表わされる錯体化合物によって、 リン酸化ペプチドを選択的に 吸着することを特徴とする方法。
[式中、 Xは結合基を示し、 Yは標識基を示す。]
4. 上記錯体化合物として、 上記標識基がピオチンである化合物を用いる請求 項 3に記載の方法。
5. 式 （I) で表わされる錯体化合物:
[式中、 Xは結合基を示し、 Yは標識基を示す。] 6. 上記標識基がピオチンである請求項 5に記載の錯体化合物。 スキーム 1を含むことを特徴とする化合物 （I) の製造方法。
[式中、 R1と R2は、 結合基 Xを形成するための反応性基を示し、 Yは標識基を 示す。]
8. 式 （II) で表わされる化合物。
[式中、 R1は反応性基を示す。 但し、 アミノメチル基， ヒドロキシメチル基 アミノ基およびカルボキシル基を除く。]
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ADAMS H. ET AL: "Zinc(II) complexes of tetrapodal ligands derived from tetra-substituted 1,n-diaminoalcohols", J. CHEM. SOC., DALTON TRANSACTIONS, vol. 6, 2002, pages 925 - 930, XP002285126 * |
| YAMAGUCHI K. ET AL: "Hydrolysis of phosphodiester with hydroxo- or carboxylate-bridged dinuclear Ni(II) and Cu(II) complexes", CHEM. COMMUN., vol. 4, 2002, pages 375 - 376, XP002979077 * |
| YASHIRO M.: "Preparation and study of dinuclear zinc (II) complex for the efficient hydrolysis of the phosphodiester linkage in a diribonucleotide", J. CHEM. SOC., CHEM. COMMUN., 1995, pages 1793 - 1794, XP002976409 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010210630A (ja) * | 2003-10-16 | 2010-09-24 | Nard Inst Ltd | リン酸化ペプチドのラベル方法 |
| JPWO2007015312A1 (ja) * | 2005-08-01 | 2009-02-19 | 株式会社ナード研究所 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 |
| WO2007018225A1 (ja) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Manac Inc. | リン酸基を有する物質の染色方法 |
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