JP5688826B2

JP5688826B2 - カルパイン活性検出蛍光プローブ

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Publication number: JP5688826B2
Application number: JP2014550589A
Authority: JP
Inventors: 哲雄長野; 健二郎花岡; 優串田
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: JPWO2014136780A1; US20160102336A1; WO2014136780A1

Description

本発明は、カルパインの活性を検出することができる赤色蛍光プローブに関する。

システインプロテアーゼの一種であるカルパインは、Ｃａ^２＋濃度依存的に酵素活性化され、基質の限定分解を通して様々な細胞機能を調整する重要なモジュレーター分子であり、その細胞内活性はカルパスタチンというタンパク質によって厳密に制御されている。生体内の細胞に普遍的に存在するカルパインとして、酵素活性化に必要なＣａ^２＋濃度の異なるカルパイン−１（μ−カルパイン）、カルパイン−２（ｍ−カルパイン）が知られており、これらは８０ｋＤａ＋３０ｋＤａのヘテロダイマーとして存在している。カルパインは特に細胞死、細胞遊走の調整に深く関与しており、カルパイン活性の制御不全と神経変性疾患やがんの悪性化の関連を示唆する報告が近年増えている。また、カルパインは多発性硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー病など有効な治療薬が少ない神経・筋疾患に関与していることから、創薬ターゲットとして関心が高まっている。疾患メカニズムの解明、創薬研究を行うためにはカルパイン活性の可視化が重要である。

カルパインの疾患への関与を明らかにするためには、様々な刺激の付与や遺伝子ノックダウンに応じた生細胞内のカルパイン活性の変化を検出することが重要である。現在、生細胞内のカルパイン活性を検出するために、青色蛍光プローブが主に用いられている。しかしながら、これら青色蛍光プローブは、その使用にあたり様々な問題が生じている。具体的には、（１）生体組織や動物個体等、測定試料に含まれる生体分子による自家蛍光が高いため、高い組織透過性が必要とされる系において使用することが困難であり、（２）細胞内Ｃａ^２＋濃度とカルパイン活性を同時に観測できることが好ましいが、Ｃａ^２＋プローブであるＦｕｒａ−２と青色蛍光プローブとの併用は不可能であり、（３）光照射依存的にＣａ^２＋を放出するケージド化合物であるＮＰ−ＥＧＴＡを脱ケージする際に、ＵＶ照射すると青色蛍光プローブの光褪色が起こることが報告されている。

このように、従来のカルパイン活性を検出する蛍光プローブには様々な問題があり、これらの問題点を解決したカルパイン活性検出蛍光プローブは未だ報告されていない。

本発明は、カルパイン活性を検出する新規蛍光プローブを提供することを目的とする。

本発明者らは、カルパイン活性の検出に新たな赤色領域を加えることにより、Ｆｕｒａ−２やケージド化合物の利用、更には緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）による基質の標識など、カルパインと他の生体分子とのマルチカラーイメージングの幅を広げ、カルパイン研究の進展に大きく寄与できるのではないかと考え、鋭意検討した。その結果、ローダミンの基本骨格であるパイロニンＹ（ＰＹ）の酸素原子を珪素原子に置換した化合物を母核とした赤色蛍光プローブにおいて、従来技術の問題を解決できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ^２は一価の置換基を示し；
Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子、又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立に炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員としてＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、さらに該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルアルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ^１１は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示し；
Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ^１１が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）、（２）又は（３）で表される、［２］に記載の化合物又はその塩。

［４］Ｘが珪素原子又はゲルマニウム原子である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］以下の式（４）で表される化合物又はその塩。

［６］以下の式（５）で表される化合物又はその塩。

［７］以下の式（６）で表される化合物又はその塩。

［８］［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［９］カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
を、提供するものである。

本発明の化合物を用いることにより、長波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れた蛍光プローブを提供することができる。また、本発明の化合物を用いることにより、Ｆｕｒａ−２やケージド化合物の利用、更には緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）による基質の標識など、カルパインと他の生体分子とのマルチカラーイメージングの幅を広げることが可能である。

Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価結果Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価結果Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いたＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性イメージングＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いたＡ５４９細胞内におけるカルパイン活性イメージングＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒによる共染色２ＭｅＳｉＲ６００とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒによる共染色

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、さらに好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。Ｒ^１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ^１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくはＲ^１はいずれも水素原子を示すか、或いは１個の置換基が存在する（当該置換基以外のＲ^１は水素原子である）場合である。

Ｒ^１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基はさらに任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ^１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ^１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ^１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。さらに、Ｒ^１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^２は一価の置換基を示す。Ｒ^２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ^１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ^３又はＲ^４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^３又はＲ^４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^３及びＲ^４がともに水素原子である場合、又はＲ^３及びＲ^４がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ^５及びＲ^６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ^５及びＲ^６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^５又はＲ^６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^５又はＲ^６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ^３及びＲ^４について説明したものと同様である。Ｒ^７及びＲ^８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。また、Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員としてＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、さらに該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルアルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい態様においては、Ｒ^９及びＲ^１０が共に水素原子である。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１１は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す。カルパインとの接触により切断される一価の置換基としては、好ましくは、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である。

オリゴペプチド残基を含む一価の置換基としては、好ましくは、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒの配列を有するオリゴペプチド残基（配列の右端のアミノ酸がパイロニンＹ（ＰＹ）に結合したＮＨ基と直接結合している）を含む一価の置換基である。
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基のＮ末端は保護されていてもよく、保護基としては、スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などが挙げられるが、これら以外の置換基を用いてもよい。

本発明の一つの実施態様において、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基は、以下の式（１）〜（３）で表される。

本発明の一つの好ましい実施態様は、以下の式（４）、（５）又は（６）で表される化合物又はその塩である。

本発明における上記一般式（Ｉ）、式（４）、式（５）及び式（６）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。

一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。

本発明により提供される一般式（Ｉ）、式（４）、式（５）又は式（６）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、カルパインとの接触によりＲ^１１置換基又はオリゴペプチド残基を含む一価の置換基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ^１１が水素原子になった化合物に相当する）を生成することができ、カルパインの測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。

上記した蛍光プローブを用いるカルパインの測定は、当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：（ａ）カルパインと接触することで切断される一価の置換基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。

本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれるカルパインの活性測定や、生細胞内でのカルパイン活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、Ｍｅはメチル基を意味する。

［実施例１〜３］
以下の合成スキーム１により３種類の本発明の化合物を合成した。

９−ｏ−トルイル−９Ｈ−Ｓｉ−キサンテン−３，６−ジアミン（１）（合成法は特許ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／５３８５５に記載）を原料化合物として用い、以下のスキームに示す工程によりオリゴペプチド残基（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）を導入した化合物（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００：Ｓｕｃはスクシニル基を意味する、Ｓｕｃ−ＴＰＬＬ−ＳｉＲ６００、及びＢｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００：Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を意味する）を合成した
。

側鎖保護ペプチド（２、４、６）

側鎖保護ペプチド（２、４、６）を２−クロロトリチルクロライドレジン（１．３ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ）を用いて以下に示す通常のＦｍｏｃ固相合成法で合成した。
（ａ）ペプチドカップリングサイクル：Ｆｍｏｃアミノ酸（レジンの５当量）とＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ：レジンの５当量）をＤＭＦに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：レジンの１０当量）を加えて攪拌した。この溶液をＮ末脱保護ペプチドをカップリングさせたレジンに加えて４０分攪拌した。
（ｂ）Ｆｍｏｃ脱保護サイクル：Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液をレジンに加え、１２分攪拌することで行った。
（ｃ）レジンからの切り出し：トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン＝２：９８の溶液をレジンに加え、１分攪拌を１０回行なうことで、ペプチドをレジンから切り出した。レジンを濾過で除き、ろ液を減圧留去し、残渣に過剰量の冷水を加えて生じた沈殿をろ取し、粗ペプチドを得た。
（ｄ）粗ペプチドの精製：粗ペプチドを水／アセトニトリルに溶解させ、分取用逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、側鎖保護ペプチド（２、４、６）を得た。

（１）Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００の合成（実施例１）

９−ｏ−トルイル−９Ｈ−Ｓｉ−キサンテン−３，６−ジアミン（３．６ｍｇ、１０．５μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド２（８．３ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８．７ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８μｌ、４６．１μｍｏｌ）を加え、２１時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（６ｍｌ）に溶解してｐ−クロラニル（４ｍｇ、０．０１６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（４ｍｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液，３２％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（３０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００（２．８ｍｇ、２．６８μｍｏｌ，収率２６％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚＦｏｕｎｄ９３１．４８３２，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ９３１．４７９０ｆｏｒ［Ｍ］^＋（−４．２ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１２．８分に単一ピークを認めた。

（２）Ｓｕｃ−ＴＰＬＬ−ＳｉＲ６００の合成（実施例２）

９−ｏ−トルイル−９Ｈ−Ｓｉ−キサンテン−３，６−ジアミン（３．７１ｍｇ、１０．８μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド４（７．９ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（９．０４ｍｇ、２３．８μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８．３μｌ、４７．５μｍｏｌ）を加え、２３時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（６ｍｌ）に溶解してｐ−クロラニル（５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（３ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓｕｃ−ＴＰＬＬ−ＳｉＲ６００（２．８ｍｇ、２．８６μｍｏｌ、収率２６％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚＦｏｕｎｄ８６７．４４８０，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ８６７．４４７７ｆｏｒ［Ｍ］^＋（＋０．３ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１０．６分に単一ピークを認めた。

（３）Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の合成（実施例３）

９−ｏ−トルイル−９Ｈ−Ｓｉ−キサンテン−３，６−ジアミン（３．９ｍｇ、１１．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド６（４．５ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（９．５ｍｇ、２４．９μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８．７μｌ、４９．７μｍｏｌ）を加え、２４時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解してｐ−クロラニル（４ｍｇ、０．０１６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００（０．６ｍｇ、０．７５μｍｏｌ、収率７％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚＦｏｕｎｄ６８７．３４４０，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ６８７．３４００ｆｏｒ［Ｍ］^＋（−４．０ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１７．０分に単一ピークを認めた。

［実施例４］
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００及びＢｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の光学特性の測定
１％ＤＭＳＯを含むｐＨ３の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００及びＢｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の光化学特性を測定した。上記の表１に酵素反応生成物である２ＭｅＳｉＲ６００の光学特性と共に示す。
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００はカルパインと接触して生成する２ＭｅＳｉＲ６００の極大吸収（５９３ｎｍ）付近の光は吸収せず、５９３ｎｍ付近の励起光を使用するカルパイン活性測定がＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の影響を受けずに行えることが確認された。

［実施例５］
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価
実施例１で得られたＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００についてカルパイン蛍光プローブとしての評価を行った。
図１の（ａ）は、カルパイン−１とＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００との反応スキームを示す。
図１の（ｂ）は、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン−１を添加する前及びカルパイン−１を５μｇ添加してから１８０分後の蛍光スペクトルを示す。
図１の（ｃ）〜（ｅ）は、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン−１を５μｇ添加してから１０〜６０分後の蛍光スペクトルを示す。
図１の（ｂ）〜（ｅ）では、１００μＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有し、１％のＤＭＳＯを共溶媒として含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）０．７５ｍｌ中で反応を行った。（ｄ）では、１．５ｍM ＣａＣｌ_２が存在しない条件で、（ｅ）では、１μＭのカルペプチンが存在する条件で反応を行った。
反応温度は、図１の（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）においては２５℃、図１の（ｃ）では３７℃である。

表１に示すようにＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００の極大吸収波長は５００ｎｍ付近であるが、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００がカルパインと反応して生成する２ＭｅＳｉＲ６００は５９３ｎｍに極大吸収を持つため、カルパインとの反応前後において５９３ｎｍの励起光を用いて測定を行った。
その結果、図１の（ｂ）に示すように、反応前にはほとんど蛍光が観察されず、反応後に非常に強い蛍光が観察できた。従って、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００がカルパインに対する蛍光プローブとして好適に使用できることが示された。また、図１の（ｃ）で示すように、反応溶液が３７℃の場合カルパイン−１の自己分解が２５℃の場合と比べて速いため、蛍光強度上昇はより速く停止した。
また、カルパインはＣａ^２＋と結合すると酵素活性を示すため、Ｃａ^２＋を含まない溶液中では蛍光上昇は起こらないことが確認された（図１の（ｄ））。更に、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンを添加すると蛍光上昇は起こらないことが図１の（ｅ）で示された。

［実施例６］
Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価
実施例３で得られたＢｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００についてカルパイン蛍光プローブとしての評価を行った。
図２の（ａ）は、カルパイン−１とＢｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００との反応スキームを示す。
図２の（ｂ）は、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン−１を添加する前及びカルパイン−１を５μｇ添加してから１８０分後の蛍光スペクトルを示す。図２の（ｃ）は、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン−１を５μｇ添加してから１０〜６０分後の蛍光スペクトルを示す。
図２の（ｂ）〜（ｃ）では、１００μＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有し、１％のＤＭＳＯを共溶媒として含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）０．７５ｍｌ中で反応を行った。図２の（ｃ）では１μＭのカルペプチンが存在する条件で反応を行い、（ｂ）ではカルペプチンが存在しない状態で反応を行った。
図２の（ｂ）及び（ｃ）とも反応温度は２５℃であり、励起波長は５９３ｎｍである。
図２の（ｂ）で示すように、Ｂｏｃ−ＬＭ−ＳｉＲ６００はカルパイン−１の添加により蛍光上昇を示した。また、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンを添加すると蛍光上昇は起こらなかった（図２の（ｃ））。

［実施例７］
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いた生細胞イメージング
（１）ＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性イメージングへの応用
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いて、ＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（ａ）コントロールとしてＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ）、（ｂ）２０μＭカルペプチンを含有するＨＢＳＳ、を夫々用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１０分間培養し、更に、２μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００で２０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて微分干渉像、及び蛍光像を撮影した。その結果を図３の（ａ）、（ｂ）に示す。図中のスケールバーは２０μｍである。
図３の（ａ）で示すように、細胞外液にＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。また、図３の（ｂ）で示すように、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンの添加により細胞内の蛍光強度は低下した。
また、カルペプチンが存在する場合と、存在しない場合について、３回の実験におけるＨｅｌａ細胞内の平均蛍光強度を図３の（ｃ）に示す。スチューデントのｔ検定により統計解析を行った（ｎ＝１８）。エラーバーは標準偏差を示す。

（２）Ａ５４９細胞内におけるカルパイン活性イメージングへの応用
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いて、Ａ５４９細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（ａ）コントロールとしてＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ、（ｂ）２０μＭカルペプチンを含有するＨＢＳＳ、を夫々用いて、Ａ５４９細胞を３７℃で１０分間培養し、更に、２μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００で２０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて微分干渉像、及び蛍光像を撮影した。その結果を図４の（ａ）、（ｂ）に示す。図中
のスケールバーは２０μｍである。
また、カルペプチンが存在する場合と、存在しない場合について、３回の実験におけるＡ５４９細胞内の平均蛍光強度を図４の（ｃ）に示す。スチューデントのｔ検定により統計解析を行った（ｎ＝１８）。エラーバーは標準偏差を示す。
図４（ａ）で示す通り、Ａ５４９細胞においても同様に、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００を用いて細胞内カルパイン活性を可視化することができた。

（３）色素の細胞内局在
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００とリソソーム局在型色素ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒにより共染色を行った。
ＨｅＬａ細胞をＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００（２μＭ）で３０分間培養し、その後、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎＤＮＤ２６（５０ｎＭ）を取り込ませた。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像を撮影した。その結果を図５に示す。
図５（ａ）では、励起波長／検出波長は５０４ｎｍ／５１４−５３４ｎｍであり、図５（ｂ）では、励起波長／検出波長は５９３ｎｍ／６０３−６２３ｎｍである。図中のスケールバーは１０μｍである。
次に、２ＭｅＳｉＲ６００とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒにより共染色を行った。
ＨｅＬａ細胞を２ＭｅＳｉＲ６００（５０μＭ）とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎＤＮＤ２６（５０ｎＭ）で培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像を撮影した。その結果を図６に示す。図６（ａ）では、励起波長／検出波長は５０４ｎｍ／５２０−５５０ｎｍであり、図５（ｂ）では、励起波長／検出波長は５９３ｎｍ／６０８−６３８ｎｍである。（ｃ）は前者二つの画像の重ね合わせである。図中のスケールバーは１０μｍである。
このように、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００は、リソソーム局在型色素ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと同様の細胞内局在を示し、また、プローブの酵素反応生成物である２ＭｅＳｉＲ６００は細胞内においてリソソームに集積することが判明した。従って、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＳｉＲ６００は、生細胞内におけるカルパイン活性の可視化に有効に使用することができる。

Claims

以下の式（４）、式（５）又は式（６）で表される化合物又はその塩。
請求項１に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。