CN113341014B - 连续流层析装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了连续流层析装置和方法。该装置包括进料装置、第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱、出口阀、检测装置和收集装置。

Description

连续流层析装置和方法
技术领域
本发明涉及一种层析装置和方法，特别是涉及一种连续流层析装置和方法。
背景技术
在生物制药领域，目前主要采用单柱层析设备对发酵收获液进行批次纯化，即在一根层析柱上一条流路进行纯化。但是在灌流培养模式中，发酵液会从发酵罐中连续产生，采用批次的单流路单柱层析设备，不能实现发酵收获液的连续纯化，需要将发酵收获液暂存于缓存容器中，不利于维持产品的稳定。
连续流层析可以有效解决上述问题。主要原理是利用多个阀门、多个层析柱，通过切换阀门连接方式使得不同层析柱同时上样或洗脱，从而实现对发酵收获液的连续纯化。其基本原理就是实现可以同时存在两个流路，一个流路进行样品上样，另一个流路进行上样前平衡以及上样后淋洗、洗脱和再生。当前有以下几种连续流层析装置：
Cadence BioSMB PD/Process是Pall公司的连续流层析设备，它支持8根或16根层析柱，采用一次性流路可以应用于GMP生产，以及预设好的切换时间。但是它不具备收集器，并且无法进行实时动态控制。BioSC是Novasep公司的连续流层析设备，支持两条流路三根层析柱，但是它的流速范围是0.06-90L/h，远低于AKTA pcc的0.03-2000 L/h，只能采用预设好的切换时间，也不能进行实时动态控制。
中国专利申请201910992652.0公开了一种组合式层析装置和连续流层析方法，它公开了一种包括多个基础层析设备、多个层析柱和多个多通阀的层析装置，可以实现多流路多层析柱的连续流层析。但是它要求基础层析设备的数量与层析柱的数量相同，这大大提高了层析装置的成本。
中国专利申请201710594337.3公开了一种用于连续流层析的改良的层析装置，通过增加三个多功能阀，一个柱位阀和一个Loop环阀，使三根柱子形成两个流路同时运作。但是在运行过程中，样品泵需要间歇性停止，无法实现发酵收获液的连续上样。
同时，上述层析装置通常需要专门设计的控制系统和阀，成本很高。本领域仍需要寻找一种可用于连续流层析，通用性强，同时进行上样、洗脱和再生且无需间歇性停止，可实现实时动态控制，降低实验成本，稳定性高且易于放大的装置和方法。
发明内容
本发明的目的是提供连续流层析装置和方法，该装置和方法可用于连续流层析，同时进行上样、洗脱和再生且无需间歇性停止，可实现实时动态控制，降低实验成本，稳定性高且易于放大。
因此，本发明的一个方面涉及一种连续流层析装置，其特征在于，所述连续流层析装置包括进料装置、第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱、出口阀、检测装置和收集装置，
其中，所述第一流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第一柱的入口、第二柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第二流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第一柱的出口、第二柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第三流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第三柱的入口、第四柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第四流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第三柱的出口、第四柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第五流路切换阀还包括2个端口，其分别连接至进料装置和第六流路切换阀的一个端口；所述第六流路切换阀还包括一个端口，其连接至所述收集装置和/或检测装置；并且所述出口阀还包括3个端口，其分别连接至所述检测装置和/或收集装置。
本发明的另一个方面涉及一种连续流层析方法，该方法包括：
a.提供一种连续流层析装置，包括进料装置、第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱、出口阀、检测装置和收集装置，
其中，所述第一流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第一柱的入口、第二柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第二流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第一柱的出口、第二柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第三流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第三柱的入口、第四柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第四流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第三柱的出口、第四柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第五流路切换阀还包括2个端口，其分别连接至进料装置和第六流路切换阀的一个端口；所述第六流路切换阀还包括一个端口，其连接至所述收集装置和/或检测装置；并且所述出口阀还包括3个端口，其分别连接至所述检测装置和/或收集装置；
b.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
c.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
d.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
e.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；并且
f.任选地依次重复步骤b-e。
本发明的另一个方面涉及另一种连续流层析方法，该方法包括：
a.提供一种连续流层析装置，包括进料装置、第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱、出口阀、检测装置和收集装置，
其中，所述第一流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第一柱的入口、第二柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第二流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第一柱的出口、第二柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第三流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第三柱的入口、第四柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第四流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第三柱的出口、第四柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第五流路切换阀还包括2个端口，其分别连接至进料装置和第六流路切换阀的一个端口；所述第六流路切换阀还包括一个端口，其连接至所述收集装置和/或检测装置；并且所述出口阀还包括3个端口，其分别连接至所述检测装置和/或收集装置；
b.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
c.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第三柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体先后进入第一柱和第二柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
d.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
e.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第二柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体先后进入第三柱和第四柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
f.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
g.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第四柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体先后进入第二柱和第一柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
h.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
i.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第一柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体先后进入第四柱和第三柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；并且
j.任选地依次重复步骤b-i。
附图说明
下面结合附图更详细地说明本发明，附图中：
图1是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置的示意图。
图2是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置中流路切换阀V1-4的不同阀位的内部连接示意图。
图3是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置中流路切换阀V9-C和V9-L的示意图。
图4是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置中出口阀V9-IX/IS的示意图。
图5是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置中阀V9-Inj的示意图。
图6是根据本发明的一个实施方式的连续流层析装置中阀V9-O的示意图。
图7是来自根据本发明的一个实施方式的连续流层析方法中的检测器的层析图谱(0-4800min)。
图8是图7所示的层析图谱的-部分(第一个循环)。
图9是图7所示的层析图谱的-部分(中间循环)。
图10是图7所示的层析图谱的一部分(最后一个循环)。
具体实施方式
本发明涉及一种连续流层析装置，包括进料装置。进料装置可以是本领域已知的任何合适的进料装置。在本发明的一个实施方式中，进料装置是AKTA pure设备(GE医疗集团)。在本发明的一个实施方式中，进料装置包括样品泵、第一进口泵、第一选择阀、第二进口泵和第二选择阀，第一进口泵连接至第一选择阀，并且第二进口泵连接至第二选择阀。在本发明的一个实施方式中，样品泵连接至样品容器。在本发明的一个实施方式中，样品包括但不限于发酵液、裂解液上清和其他蛋白质样品。在本发明的一个实施方式中，进料装置还包括多个溶液容器。在本发明的一个实施方式中，第一选择阀包括多个进口端和一个出口端，该进口端分别连接多个溶液容器，并且该出口端连接第一进口泵。在本发明的一个实施方式中，第二选择阀包括多个进口端和一个出口端，该进口端分别连接多个溶液容器，并且该出口端连接第二进口泵。在本发明的一个实施方式中，多个溶液容器分别装有选自下组的溶液：平衡液、淋洗液、再生液、消毒液和洗脱液。在本发明的一个实施方式中，第一进口泵连接至装有第一液体的第一溶液容器，并且第二进口泵连接至装有第二液体的第二溶液容器。在本发明的另一个实施方式中，第一进口泵连接至装有第二液体的第二溶液容器，并且第二进口泵连接至装有第一液体的第一溶液容器。第一液体和第二液体可以是本领域已知的任何合适的溶液，并且可根据样品和层析柱选择。在本发明的一个实施方式中，第一液体包括选自下组的一种或多种：再生液、消毒液和平衡液，并且第二液体包括选自下组的一种或多种：淋洗液和洗脱液。在本发明的一个优选实施方式中，第一液体包括再生液、消毒液和平衡液，并且第二液体包括淋洗液和洗脱液。样品泵、第一进口泵和第二进口泵可以是本领域已知的任何合适的泵。第一选择阀和第二选择阀可以是本领域已知的任何合适的选择阀。在本发明的一个实施方式中，进料装置还可包括混合池。
本发明的连续流层析装置包括第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱和出口阀。本发明的流路切换阀可包括本领域已知的任何合适的流路切换装置。在本发明的一个实施方式中，第一流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第- 柱的入口、第二柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第二流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的-个端口、第一柱的出口、第二柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第三流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第三柱的入口、第四柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第四流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第三柱的出口、第四柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第五流路切换阀还包括2个端口，其分别连接至进料装置和第六流路切换阀的一个端口；所述第六流路切换阀还包括一个端口，其连接至收集装置和/或检测装置；并且所述出口阀还包括3个端口，其分别连接至检测装置和/或收集装置。在本发明的一个实施方式中，第五流路切换阀的一个端口连接至样品泵的出口。在本发明的一个实施方式中，第一流路切换阀的一个端口连接至第一进口泵的出口。在本发明的一个实施方式中，所述第三流路切换阀的一个端口连接至第二进口泵的出口。第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀和出口阀可以是本领域已知的任何合适的流路切换阀。第一柱、第二柱、第三柱和第四柱可以是本领域已知的任何合适的色谱柱。在本发明的一个实施方式中，第一柱、第二柱、第三柱和第四柱是相同的色谱柱。
本发明的连续流层析装置还包括检测装置。本发明的检测装置可包括本领域已知的任何合适的检测器。在本发明的一个实施方式中，检测装置包括选自下组的一个或多个：UV检测器、电导检测器和pH检测器。UV检测器、电导检测器和pH检测器分别可以是本领域已知的任何合适的UV检测器、电导检测器和pH检测器。在本发明的一个实施方式中，UV检测器、电导检测器和pH检测器是串联连接的。在本发明的一个实施方式中，检测装置是AKTApure设备(GE医疗集团)。在本发明的一个实施方式中，出口阀的一个端口连接UV检测器，其后依次连接电导检测器和pH检测器。
本发明的连续流层析装置还包括收集装置。在本发明的一个实施方式中，收集装置包括切换装置，所述切换装置包括3个端口，其分别连接至出口阀的2个端口和检测装置。切换装置可以是本领域已知的任何合适的将两个流路合并为一个流路的装置。在本发明的一个实施方式中，切换装置是流路切换阀。在本发明的一个实施方式中，切换装置是三通接头。在本发明的一个实施方式中，收集装置包括分选器，所述分选器连接至检测装置。分选器可以是本领域已知的任何合适的将一个流路分选到多个流路的装置。在本发明的一个实施方式中，分选器是流路切换阀。在本发明的一个实施方式中，分选器包括3个端口，其分别连接至检测装置和2个容器。在本发明的一个实施方式中，切换装置的一个端口连接检测装置，最后连接分选器。在本发明的一个实施方式中，切换装置的一个端口连接UV检测器，其后依次连接电导检测器和pH检测器，最后连接分选器。本发明的收集装置还可包括本领域已知的任何合适的容器。在本发明的一个实施方式中，收集装置包括第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器。在本发明的一个实施方式中，第一容器连接至第六流路切换阀的一个端口，第二容器连接至出口阀的一个端口，第三容器连接至出口阀的另一个端口，第四容器连接至分选器的一个端口，并且第五容器连接至分选器的另一个端口。在本发明的一个实施方式中，收集装置可与检测装置连接以检测收集装置中的液体。在本发明的一个实施方式中，容器可与 UV检测器、电导检测器和/或pH检测器连接。
在本发明的一个实施方式中，本发明的连续流层析装置还包括自动控制系统，用于根据通过检测器检测的数据实时控制流路切换阀和出口阀。在本发明的一个实施方式中，自动控制系统包括计算机可执行程序。
本发明还涉及一种连续流层析方法，包括：a.提供如上所述的连续流层析装置。在本发明中，第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀和第四流路切换阀的阀位包括1-2和3-4以及1-4和2-3，其中阀位1-2和3-4表示端口1连通端口2，端口3 连通端口4，并且阀位1-4和2-3表示端口1连通端口4，端口2连通端口3。
该连续流层析方法还包括：b.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤b的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，并调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/ 或收集装置。
该连续流层析方法还包括：c.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤c的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-2和3-4，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，并调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/ 或收集装置。
该连续流层析方法还包括：d.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤d的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，并调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/ 或收集装置。
该连续流层析方法还包括：e.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤e的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，并调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/ 或收集装置。
该连续流层析方法还包括：f.任选地依次重复步骤b-e。在本发明的一个实施方式中，步骤f包括任选地重复步骤b-e一次或多次，例如，1-100次。
在本发明的一个实施方式中，第一液体包括选自下组的一种或多种：再生液、消毒液和平衡液，并且第二液体包括选自下组的一种或多种：淋洗液和洗脱液。
本发明还涉及另一种连续流层析方法，包括：a.提供如上所述的连续流层析装置。
该连续流层析方法还包括：b.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的- 个实施方式中，步骤b的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。
该连续流层析方法还包括：c.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第三柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体先后进入第一柱和第二柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤c的调整流路切换阀和出口阀使得第三流路切换阀的阀位至1-2和 3-4，第一流路切换阀、第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。在本发明的一个实施方式中，该步骤中的第二液体是淋洗液。
该连续流层析方法还包括：d.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤d的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-2和3-4，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。
该连续流层析方法还包括：e.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第二柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体先后进入第三柱和第四柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤e的调整流路切换阀和出口阀使得第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。在本发明的一个实施方式中，该步骤中的第二液体是淋洗液。
该连续流层析方法还包括：f.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤f的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。
该连续流层析方法还包括：g.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第四柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体先后进入第二柱和第一柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤g的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀、第二流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。在本发明的一个实施方式中，该步骤中的第二液体是淋洗液。
该连续流层析方法还包括：h.调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤h的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第三流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第一流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第二流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。
该连续流层析方法还包括：i.调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第一柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体先后进入第四柱和第三柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置。在本发明的一个实施方式中，步骤i的调整流路切换阀和出口阀使得第一流路切换阀和第四流路切换阀的阀位至1-2和3-4，第二流路切换阀和第三流路切换阀的阀位至1-4和2-3，调整第五流路切换阀的阀位以使样品流入第一流路切换阀并使来自第六流路切换阀的流体流入第三流路切换阀，调整第六流路切换阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入第五流路切换阀，调整出口阀的阀位以使来自第四流路切换阀的流体流入检测装置和/或收集装置。在本发明的一个实施方式中，该步骤中的第二液体是淋洗液。
该连续流层析方法还包括：j.任选地依次重复步骤b-i。在本发明的一个实施方式中，步骤j包括任选地重复步骤b-i一次或多次，例如，1-100次。
在本发明的一个实施方式中，第一液体包括选自下组的一种或多种：再生液、消毒液和平衡液，并且第二液体包括选自下组的一种或多种：淋洗液和洗脱液。在本发明的一个实施方式中，在步骤c、e、g和i中，第二液体是淋洗液。
在本发明中，除另外说明，所有的连接都是流体连通。例如，X连接至Y表示X 与Y流体连通。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本申请保护的范围。
实施例
实验材料：
层析柱：Mabselect PrismA，0.66*6cm(D*H)，柱体积：2.15mL(GE医疗集团)
样品：含抗体(1.5g/L)的澄清后发酵液，发酵液为使用HyClone ActiPro培养基培养14天后的CHO K1细胞发酵液。
流速：1.9mL/min
保留时间：1.13min
载量：31个柱体积
试剂：
名称 全称 厂商 货号
Tris-base 三羟甲基氨基甲烷 Merck 1.08386.5000
NaAc.3H2O 三水醋酸钠 Merck 1.37012.5000
HAc 醋酸 J.T.Baker 9526-03
NaCl 氯化钠 Merck 1.16224.5000
NaOH 氢氧化钠 Merck 1.06482.5000
设备
图1是根据本发明 的一个实施方式的连续流层析装置的示意图，其中，该连续流层析装置包括：样品泵P、第一进口泵A、第二进口泵B、第一流路切换阀V1、第二流路切换阀V2、第三流路切换阀V3、第四流路切换阀V4(第一流路切换阀V1、第二流路切换阀V2、第三流路切换阀V3和第四流路切换阀V4的不同阀位的内部连接如图 2所示)、第五流路切换阀V9-C(如图3所示)、第六流路切换阀V9-Inj(如图5所示)、第一柱C1、第二柱C2、第三柱C3、第四柱C4、出口阀V9-L(如图3所示)、阀V9-IX/IS (如图4所示)、阀V9-O(如图6所示)、UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH 检测器pH，各阀的端口编号如图2-6所示，其中：样品泵P的出口连接至第五流路切换阀V9-C的端口IN，第一进口泵A的出口连接至第一流路切换阀V1的端口1，第二进口泵B的出口连接至第三流路切换阀V3的端口1，第一柱C1的入口连接至第一流路切换阀V1的端口4，第二柱C2的入口连接至第一流路切换阀V1的端口2，第三柱C3的入口连接至第三流路切换阀V3的端口4，第四柱C4的入口连接至第三流路切换阀V3 的端口2，第一柱C1的出口连接至第二流路切换阀V2的端口4，第二柱C2的出口连接至第二流路切换阀V2的端口2，第三柱C3的出口连接至第四流路切换阀V4的端口 4，第四柱C4的出口连接至第四流路切换阀V4的端口2，第五流路切换阀V9-C的端口 3A连接至第三流路切换阀V3的端口3，第五流路切换阀V9-C的端口3B连接至第一流路切换阀V1的端口3，第六流路切换阀V9-Inj的端口Col连接至第四流路切换阀V4 的端口1，第六流路切换阀V9-Inj的端口W1连接至第二流路切换阀V2的端口1，第五流路切换阀V9-C的端口OUT连接至第六流路切换阀V9-Inj的端口SyP。出口阀V9-L 的端口E连接至第二流路切换阀V2的端口3，出口阀V9-L的端口F连接至第四流路切换阀V4的端口3，出口阀V9-L的端口2E连接至阀V9-IX/IS的端口S1，出口阀V9-L 的端口4F连接至阀V9-IX/IS的端口S2。阀V9-IX/IS的端口OUT依次顺序连接至UV 检测器UV1，电导检测器Cond和pH检测器pH，pH检测器连接至阀V9-O的端口IN。
实施例1
UNICORN方法编辑：
0.00 Block：Load C1_C3_1
0.00 Base：SameAsMain
0.00 Inlet B：(B1)
0.00 Inlet A：(A6)
0.00 Gradient：(50.0)#Percent B for Rinse Step{％B}，0.00{base}
0.00 Column position：3，Up flow
0.00 Versatile valve：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 3：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 2：1-4&2-3
0.00 Versatile valve 4：1-4&2-3
0.00 Inlet valve X1：5
0.00 Loop valve：4
0.00 Outlet valve：Frac
5.00 Inlet B：B3
5.00 Inlet A：A1
10.00 Inlet A：A2
10.00 Inlet B：B4
13.00 Inlet A：A1
15.00 Inlet B：B5
15.00 Peak fractionation parameters：UV1，Level，0.15{min}，100.00{mAU}，100.00{mAU/min}，100.00{mAU}，75.00{mAU/min}
15.00 Peak frac in outlet valve：0utlet 1，1，5000.00{ml}
20.00 Inlet B：B1
31.00 Stop peak frac in outlet valve
31.00 Outlet valve：Frac
(31.00)#Rinse_Vol_2_3_1 End_Block
0.00 Block：Load C3_C2_1
0.00 Base：SameAsMain
0.00 Inlet B：(B6)
0.00 Inlet A：A1
0.00 Gradient：(50.0)#Percent B for Rinse Step{％B}，0.00{base}
0.00 Column position：3，Down flow
0.00 Set mark：Load C3_C2
0.00 Injection valve：Sample pump load
0.00 Alarm inlet A air sensor：Enabled
0.00 Versatile valve：1-4&2-3
0.00 Versatile valve 3：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 2：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 4：1-4&2-3
0.00 Inlet valve X1：6
0.00 Loop valve：2
0.00 Outlet valve：Frac
5.00 Inlet A：A3
5.00 Inlet B：B1
10.00 Inlet B：B2
10.00 Inlet A：A4
13.00 Inlet B：B1
15.00 Inlet A：A5
15.00 Peak fractionation parameters：UV1，Level，0.15{min}，100.00{mAU}，00.00{mAU/min}，100.00{mAU}，75.00{mAU/min}
15.00 Peak frac in outlet valve：Outlet 1，1，5000.00{ml}
20.00 Inlet A：A1
31.00 Stop peak frac in outlet valve
31.00 Outlet valve：Frac
(31.00)#Rinse_Vol_2_1_2 End_Block
0.00 Block：Load C2_C4_1
0.00 Base：SameAsMain
0.00 Inlet B：(B1)
0.00 Inlet A：(A6)
0.00 Gradient：(50.0)#Percent B for Rinse Step{％B}，0.00{base}
0.00 Column position：3，Up flow
0.00 Set mark：Load C2_C4
0.00 Injection valve：Direct inject
0.00 Alarm inlet A air sensor：Enabled
0.00 Versatile valve：1-4&2-3
0.00 Versatile valve 3：1-4&2-3
0.00 Versatile valve 2：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 4：1-2&3-4
0.00 Inlet valve X1：5
0.00 Loop valve：4
0.00 Outlet valve：Frac
5.00 InletB：B3
5.00 Inlet A：A1
10.00 Inlet A：A2
10.00 Inlet B：B4
13.00 InletA：Al
15.00 Inlet B：B5
15.00 Peak fractionation parameters：UV1，Level，0.15{min}，100.00{mAU}，100.00{mAU/min}，100.00{mAU}，75.00{mAU/min}
15.00 Peak frac in outlet valve：Outlet1，1，5000.00{ml}
20.00 Inlet B：B1
31.00 Stop peak frac in outlet valve
31.00 Outlet valve：Frac
(31.00)#Rinse_Vol_2_2_1_1 End_Block
0.00 Block：Load C4_C1_1
0.00 Base：SameAsMain
0.00 Inlet B：(B6)#
0.00 Inlet A：A1
0.00 Gradient：(50.0)#Percent B for Rinse{％B}，0.00{base}
0.00 Column position：3，Down flow
0.00 Set mark：Load C4 C1
0.00 Injection valve：Sample pump load
0.00 Alarm inlet A air sensor：Enabled
0.00 Versatile valve：1-2&3-4
0.00 Versatile valve 3：1-4&2-3
0.00 Versatile valve 2：1-4&2-3
0.00 Versatile valve4：1-2&3-4
0.00 Inlet valve X1：6
0.00 Loop valve：2
0.00 Outlet valve：Frac
5.00 Inlet A：A3
5.00 InletB：B1
10.00 InletB：B2
10.00 Inlet A：A4
13.00 Inlet B：B1
15.00 Inlet A：A5
15.00 Peak fractionation parameters：UV1，Level，0.15{min}，100.00{mAU}，100.00{mAU/min}，100.00{mAU}，75.00{mAU/min}
15.00 Peak frac in outlet valve：Outlet 1，1，5000.00{ml}
20.00 Inlet A：A1
31.00 Stop peak frac in outlet valve
31.00 Outlet valve：Frac
(31.00)#Rinse_Vol_2_1_1_1 End_Block
实施例2
该实施例的连续流层析方法采用实施例1所示的方法编辑的程序运行，其具体步骤如下：
1.C1、C3上样，C2再生，C4洗脱
当使用该连续流层析装置进行连续流层析时，先调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口IN连通端口3B，使端口OUT连通端口3A；调整第一流路切换阀V1和第三流路切换阀V3的阀位至1-2和3-4，调整第二流路切换阀V2和第四流路切换阀V4 的阀位至1-4和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至4E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S2。样品泵P泵入澄清后的发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第一柱C1和第三柱C3进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第二柱C2进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第四柱C4进行淋洗和洗脱。样品流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀 V4的端口4、第四流路切换阀V4的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀V9-Inj的端口SaP流至第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口4E流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口4F流至阀V9-IX/IS的端口S2，然后经其出口0UT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器 pH和收集容器(未显示)。在第1步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
2.C3、C2上样，C4再生，C1洗脱
第1步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口 IN连通端口3A，使端口OUT连通端口3B；调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-4和2-3，调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至1-2 和3-4，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液 1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第三柱C3和第二柱C2进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第四柱C4进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第一柱C1进行淋洗和洗脱。样品流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2、第二流路切换阀V2的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L 的端口SaP流入第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口 3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E流至阀V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口0UT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器 (未显示)。在第2步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
3.C2、C4上样，C1再生，C3洗脱
第2步骤结束后再切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口IN连通端口3B，使端口0UT连通端口3A；调整第一流路切换阀V1和第三流路切换阀V3的阀位至1-4和2-3，调整第二流路切换阀V2和第四流路切换阀V4的阀位至1-2 和3-4，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至4E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S2。样品泵P泵入澄清后的发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液。通过上述调整，可以实现样品进入第二柱C2和第四柱C4进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第一柱C1进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第三柱C3进行淋洗和洗脱。样品流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2、第四流路切换阀V4的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀 V9-Inj的端口SaP流至第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口4E流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4和第四流路切换阀V4 的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口4F流至阀V9-IX/IS的端口S2，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第3步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
4.C4、C1上样，C3再生，C2洗脱
第3步骤结束后再切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口IN连通端口3A，使端口OUT连通端口3B；调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-2和3-4，调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至 1-4和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以实现样品进入第四柱C4和和第一柱C1进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第三柱C3进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第二柱C2进行淋洗和洗脱。样品流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4、第二流路切换阀V2的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L 的端口SaP流入第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F出口流至废液收集容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2和第二流路切换阀 V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E出口流至阀V9-IX/IS的端口 S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH 和收集容器(未显示)。在第4步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
重复上述步骤1-4，同时记录来自UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器 pH的读数并绘制成层析图谱(如图7-10所示)。
实施例3
该实施例的连续流层析方法运行的具体步骤如下：
1.C1、C3上样，C2再生，C4洗脱
当使用该连续流层析装置进行连续流层析时，先调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口IN连通端口3B，使端口OUT连通端口3A；调整第一流路切换阀V1和第三流路切换阀V3的阀位至1-2和3-4，调整第二流路切换阀V2和第四流路切换阀V4 的阀位至1-4和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至4E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S2。样品泵P泵入澄清后的发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第一柱C1和第三柱 C3进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第二柱C2进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第四柱C4进行淋洗和洗脱。样品流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀 V4的端口4、第四流路切换阀V4的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀V9-Inj的端口SaP流至第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口4E流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口4F流至阀V9-IX/IS的端口S2，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器 pH和收集容器(未显示)。在第1步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
2.C3上样，C4再生，C1和C2淋洗
第1步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口IN连通端口3A，使端口0UT连通端口3B；调整第三流路切换阀V3的阀位至1-2和 3-4，调整第一流路切换阀V1、第二流路切换阀V2和第四流路切换阀V4的阀位至1-4 和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液1、淋洗液2和淋洗液3，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第三柱C3进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第四柱C4进行消毒和平衡，并且淋洗液进入第一柱C1和第二柱C2进行淋洗。样品流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4、第四流路切换阀V4 的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀V9-L的端口SaP流至废液容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F流至废液容器(未显示)。淋洗液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀 V2的端口2和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口 2E流至阀V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第2步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
3.C3、C2上样，C4再生，C1洗脱
第2步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口 IN连通端口3A，使端口0UT连通端口3B；调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-4和2-3，调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至1-2 和3-4，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液 1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第三柱C3和第二柱C2进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第四柱C4进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第一柱C1进行淋洗和洗脱。样品流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2、第二流路切换阀V2的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L 的端口SaP流入第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E流至阀V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器 (未显示)。在第3步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
4.C2上样，C1再生，C3和C4淋洗
第3步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口IN连通端口3B，使端口OUT连通端口3A；调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至1-2和3-4，调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-4 和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2和淋洗液3。通过上述调整，可以同时实现样品进入第二柱C2进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第一柱C1进行消毒和平衡，并且淋洗液进入第三柱C3和第四柱C4进行淋洗。样品流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2、第二流路切换阀V2的端口 1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L的端口SaP流入第二UV 检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口 F，然后经其端口2F流至废液容器(未显示)。淋洗液流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E流至阀V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第4步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
5.C2、C4上样，C1再生，C3洗脱
第4步骤结束后再切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口IN连通端口3B，使端口OUT连通端口3A；调整第一流路切换阀V1和第三流路切换阀V3的阀位至1-4和2-3，调整第二流路切换阀V2和第四流路切换阀V4的阀位至1-2 和3-4，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至4E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S2。样品泵P泵入澄清后的发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液。通过上述调整，可以实现样品进入第二柱C2和第四柱C4进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第一柱C1进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第三柱C3进行淋洗和洗脱。样品流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2、第四流路切换阀V4的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀 V9-Inj的端口SaP流至第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口4E流至废液容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4和第四流路切换阀V4 的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口4F流至阀V9-IX/IS的端口S2，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第5步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
6.C4上样，C3再生，C1和C2淋洗
第5步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口 IN连通端口3A，使端口OUT连通端口3B；调整第一流路切换阀V1、第二流路切换阀 V2和第四流路切换阀V4的阀位至1-2和3-4，调整第三流路切换阀V3的阀位至1-4和 2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的左图所示(system pump waste)，使端口SyP连通端口W1，端口SaP连通端口Col，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀 V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液1、淋洗液2和淋洗液3，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以同时实现样品进入第四柱C4进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第三柱C3进行消毒和平衡，并且淋洗液进入第一柱C1和第二柱C2进行淋洗。样品流过第四柱C4后依次经过第四流路切换阀V4的端口2、第四流路切换阀V4的端口 1、第六流路切换阀V9-Inj的端口Col和第六流路切换阀V9-L的端口SaP流至废液容器 (未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4 的端口4和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F 流至废液容器(未显示)。淋洗液流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口 4和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E流至阀 V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond 和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第6步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
7.C4、C1上样，C3再生，C2洗脱
第6步骤结束后再切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3A，使端口IN连通端口3A，使端口OUT连通端口3B；调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-2和3-4，调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至 1-4和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3和洗脱液，并且第二进口泵B依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液。通过上述调整，可以实现样品进入第四柱C4和和第一柱C1进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第三柱C3进行消毒和平衡，并且淋洗液和洗脱液进入第二柱C2进行淋洗和洗脱。样品流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4、第二流路切换阀V2的端口1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L 的端口SaP流入第二UV检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4和第四流路切换阀V4的端口 3流入出口阀V9-L的端口F，然后经其端口2F出口流至废液收集容器(未显示)。淋洗液和洗脱液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2和第二流路切换阀 V2的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E出口流至阀V9-IX/IS的端口 S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH 和收集容器(未显示)。在第7步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
8.C1上样，C2再生，C3和C4淋洗
第7步骤结束后切换流路，包括调整第五流路切换阀V9-C的阀位至3B，使端口 IN连通端口3B，使端口0UT连通端口3A；调整第一流路切换阀V1和第四流路切换阀V4的阀位至1-2和3-4，调整第二流路切换阀V2和第三流路切换阀V3的阀位至1-4 和2-3，调整第六流路切换阀V9-Inj的阀位如图5的右图所示(Sample pump load)，使端口SyP连通端口Col，端口SaP连通端口W1，调整出口阀V9-L的阀位至2E，调整阀V9-IX/IS的阀位至S1。样品泵P泵入澄清后发酵液，第一进口泵A依次泵入再生液、平衡液、消毒液和平衡液，并且第二进口泵B依次泵入淋洗液1、淋洗液2和淋洗液3。通过上述调整，可以同时实现样品进入第一柱C1进行上样，再生液、消毒液和平衡液进入第二柱C2进行消毒和平衡，并且淋洗液进入第三柱C3和第四柱C4进行淋洗。样品流过第一柱C1后依次经过第二流路切换阀V2的端口4、第二流路切换阀V2的端口 1、第六流路切换阀V9-Inj的端口W1和第六流路切换阀V9-L的端口SaP流入第二UV 检测器UV2和收集容器(未显示)。再生液、消毒液和平衡液流过第二柱C2后依次经过第二流路切换阀V2的端口2和第二流路切换阀V2的端口3流入出口阀V9-L的端口 F，然后经其端口2F流至废液容器(未显示)。淋洗液流过第三柱C3后依次经过第四流路切换阀V4的端口4和第四流路切换阀V4的端口3流入出口阀V9-L的端口E，然后经其端口2E流至阀V9-IX/IS的端口S1，然后经其出口OUT依次流至UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器pH和收集容器(未显示)。在第8步骤运行至第31分钟时结束该步骤。
重复上述步骤1-8，同时记录来自UV检测器UV1、电导检测器Cond和pH检测器 pH的读数并绘制成层析图谱(未显示)。
实施例3的方法是对实施例2的方法的进一步改进，在实施例2的四个步骤后各添加一个步骤，通过阀位调整可以实现满载层析柱中未结合产品的再次捕获，可进一步改善连续流层析的产率。
与现有技术相比，本发明成本较低，通用性强，可适用于广泛的进样设备和层析系统，减少使用的阀数量，不需要使用特制的阀，提高系统稳定性，易于放大，收率和效率提高，续流层析，同时进行上样、洗脱和再生且无需间歇性停止，并可实现对连续流层析过程的实时动态控制。
同时，对于现有阀门的新应用也是本发明的一个亮点。由于AKTA pure对于同功能阀门或检测器的使用有数量限制，本发明为了实现4柱6阀的核心功能，创造性拓展了以下阀门的新应用：使用第五流路切换阀和出口阀实现双流路以及使用第六流路切换阀实现来自第二和第四切换阀的流路交替切换。这些新使用方式为其他流路和阀门连接方式带来可能。
最后要说明的是，以上所描述的仅为本发明的优选实施例，但本发明的保护范围不局限于此，对于熟悉本领域的技术人员，依然可以对本发明中的技术方案和构思修改或同等替换，凡是在本发明的精神原则内所作的修改、替换和改进等，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种连续流层析装置，其特征在于，所述连续流层析装置包括进料装置、第一流路切换阀、第二流路切换阀、第三流路切换阀、第四流路切换阀、第五流路切换阀、第六流路切换阀、第一柱、第二柱、第三柱、第四柱、出口阀、检测装置和收集装置，
其中，所述第一流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第一柱的入口、第二柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第二流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第一柱的出口、第二柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第三流路切换阀包括4个端口，其分别连接至进料装置、第三柱的入口、第四柱的入口和第五流路切换阀的一个端口；所述第四流路切换阀包括4个端口，其分别连接至出口阀的一个端口、第三柱的出口、第四柱的出口和第六流路切换阀的一个端口；所述第五流路切换阀还包括2个端口，其分别连接至进料装置和第六流路切换阀的一个端口；所述第六流路切换阀还包括一个端口，其连接至所述收集装置或检测装置；并且所述出口阀包括5个端口，其中所述出口阀的3个端口分别连接至所述检测装置或收集装置，所述出口阀的一个端口连接至第二流路切换阀的一个端口，并且所述出口阀的另一个端口连接至第四流路切换阀的一个端口，
其中，所述进料装置包括样品泵、第一进口泵、第一选择阀、第二进口泵和第二选择阀，所述第一进口泵连接至所述第一选择阀，并且所述第二进口泵连接至所述第二选择阀，并且
其中，所述第五流路切换阀的一个端口连接至所述样品泵的出口，所述第一流路切换阀的一个端口连接至所述第一进口泵的出口，并且所述第三流路切换阀的一个端口连接至所述第二进口泵的出口。
2.如权利要求1所述的连续流层析装置，其特征在于，所述检测装置包括选自下组的一个或多个：UV检测器、电导检测器和pH检测器。
3.如权利要求1所述的连续流层析装置，其特征在于，所述收集装置包括分选器，所述分选器连接至所述检测装置。
4.一种连续流层析方法，其特征在于，所述方法包括：
a. 提供如权利要求1-3中任一项所述的连续流层析装置；
b. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
c. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
d. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
e. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；并且
f. 任选地依次重复步骤b-e。
5.如权利要求4所述的连续流层析方法，其特征在于，所述第一液体包括选自下组的一种或多种：再生液、消毒液和平衡液，并且所述第二液体包括选自下组的一种或多种：淋洗液和洗脱液。
6.一种连续流层析方法，其特征在于，所述方法包括：
a. 提供如权利要求1-3中任一项所述的连续流层析装置；
b. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第一柱和第三柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体进入第四柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
c. 调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第三柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体先后进入第一柱和第二柱，使流过第三柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
d. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第三柱和第二柱，使第一液体进入第四柱，使第二液体进入第一柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第四柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
e. 调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第二柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体先后进入第三柱和第四柱，使流过第二柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第四柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
f. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第二柱和第四柱，使第一液体进入第一柱，使第二液体进入第三柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第一柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
g. 调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第四柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体先后进入第二柱和第一柱，使流过第四柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第一柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
h. 调整流路切换阀和出口阀，使样品先后进入第四柱和第一柱，使第一液体进入第三柱，使第二液体进入第二柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第二柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第三柱的液体进入出口阀后进入收集装置；
i. 调整流路切换阀和出口阀，使样品进入第一柱，使第一液体进入第二柱，使第二液体先后进入第四柱和第三柱，使流过第一柱的液体进入第六流路切换阀后进入收集装置和/或检测装置，使流过第三柱的液体进入出口阀和检测装置和/或收集装置，并使流过第二柱的液体进入出口阀后进入收集装置；并且
j. 任选地依次重复步骤b-i。
7.如权利要求6所述的连续流层析方法，其特征在于，所述第一液体包括选自下组的一种或多种：再生液、消毒液和平衡液，并且所述第二液体包括选自下组的一种或多种：淋洗液和洗脱液。
8.如权利要求7所述的连续流层析方法，其特征在于，在步骤c、e、g和i中，所述第二液体是淋洗液。
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