BR112012016308B1 - Processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (pufa) e composição - Google Patents

Abstract

"processo de separação cromatoigráfica para recuperar um produto de ácido graxo, composição, e, programa de computador". a presente invenção fornece um processo de separação cromatográfico para recuperar um produto de ácido graxo poliinsaturado (pufa) de uma mistura de alimentação, cujo processo compreende introduzir a mistura de alimentação a um aparato de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas cromatográficas ligadas contendo, como eluente, um álcool aquoso, em que o aparato tem uma pluralidade de zonas compreendendo pelo menos uma primeira zona e segunda zona, cada zona tendo uma corrente de extrato e uma corrente de rafinato da qual o l´quido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas cromatográficas ligadas, e em que (a) uma corrente de rafinato contendo o produto pufa junto com componente mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e/ou (b) uma corrente de extrato contendo o produto pufa junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, o dito produto pufa sendo separado de diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona.

Description

“PROCESSO DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA PARA RECUPERAR UM PRODUTO DE ÁCIDO GRAXO POLI-INSATURADO (PUFA) E COMPOSIÇÃO”

A presente invenção diz respeito a um processo de fracionamento cromatográfico melhorado para purificar ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) e seus derivados Em particular, a presente invenção diz respeito a um melhor processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real para purificar PUFAs e seus derivados.

Ácidos graxos, em particular PUFAs, e seus derivados são precursores para moléculas biologicamente importantes, que desempenham um papel importante na regulação de funções biológicas tais como agregação de plaqueta, inflamação e respostas imunológicas. Assim, PUFAs e seus derivados podem ser terapeuticamente úteis no tratamento de uma ampla faixa de condições patológicas incluindo condições de CNS, neuropatias, incluindo neuropatia diabética, doenças cardiovasculares, sistema imune geral e condições inflamatórias, incluindo doenças de pele inflamatória.

Observou-se que PUFAs são matérias primas naturais, tais como óleos vegetais e óleos marinhos. Tais PUFAs estão, entretanto, frequentemente presentes em tais óleos em mistura com ácidos graxos saturados e inúmeras outras impurezas. PUFAs devem, portanto desejavelmente ser purificados antes de usos nutricionais ou farmacêuticos.

Infelizmente, PUFAs são extremamente frágeis. Assim, quando aquecidos na presença de oxigênio, eles são propensos a isomerização, peroxidação e oligomerização. O fracionamento e purificação de produtos PUFA para preparar ácidos graxos puros é, portanto difícil. Destilação, mesmo sob vácuo, pode levar a degradação de produto não aceitável.

Cromatografia de leito móvel simulada e real são técnicas conhecidas, familiar aos de versados na técnica. O princípio de operação

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 12/176 envolve movimento contracorrente de uma fase eluente líquida e uma fase adsorvente sólida. Esta operação permite uso mínimo de solvente tornando o processo economicamente viável. Tal tecnologia de separação encontrou várias aplicações em áreas diversas, incluindo hidrocarbonetos, substâncias químicas industriais, óleos, açúcares e APIs. Tal tecnologia de separação tem também sido aplicada para purificar PUFAs e seus derivados.

Como é bem conhecido, em um sistema cromatográfico de leito estacionário convencional, uma mistura cujos componentes tem de ser separados percola através de um recipiente. O recipiente é geralmente cilíndrico, e é tipicamente referido como a coluna. A coluna contém um empacotamento de um material poroso (geralmente chamado a fase estacionária) que exibe uma alta permeabilidade a fluidos. A velocidade de percolação de cada componente da mistura depende das propriedades físicas deste componente, de forma que os componentes saiam da coluna sucessivamente e seletivamente. Assim, alguns dos componentes tendem fixar fortemente na fase estacionária e assim percolarão lentamente, enquanto que outros tendem a fixar fracamente e saem da coluna mais rapidamente. Muitos diferentes sistemas cromatográficos de leito estacionários foram propostos e são usados tanto para propósitos de produção analíticos quanto industriais.

Ao contrário, um sistema de leito móvel simulado consiste em inúmeras colunas individuais contendo adsorvente que são conectadas umas nas outras em série. Eluente passa através das colunas em uma primeira direção. Os pontos de injeção do estoque de alimentação e do eluente, e os pontos de coleta do componentes separados no sistema, são periodicamente deslocados por meio de uma série de válvulas. O efeito geral é simular a operação de uma única coluna contendo um leito móvel do adsorvente sólido. Assim, um sistema de leito móvel simulado consiste em colunas que, como em um sistema de leito estacionário convencional, contêm leitos estacionários de adsorvente sólido através dos quais o eluente passa, mas em um sistema de

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 13/176 leito móvel simulado a operação é tal como simular um leito móvel contracorrente contínuo.

Processos e equipamento para cromatografia de leito móvel simulado são descritos em diversas patentes, incluindo US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 e FR-A-2651149, as quais são incorporadas na sua íntegra aqui pela referência. O tópico é também tratado com detalhes em “Preparative and Production Scale Chromatography”, editado por Ganetsos and Barker, Marcel Dekker Inc, New York, 1993, que está incorporado na sua íntegra aqui pela referência.

Um sistema de leito móvel real é similar em operação a um sistema de leito móvel simulado. Entretanto, em vez de deslocar os pontos de injeção da mistura de alimentação e o eluente, e os pontos de coleta do componente separados por meio de um sistema de válvulas, em vez de uma série de unidades de adsorção (isto é, colunas) é movida fisicamente em relação aos pontos de alimentação e retirada. Novamente, a operação é tal como simular um leito móvel contracorrente contínuo.

Processos e equipamento para cromatografia de leito móvel real são descritos em diversas patentes; incluindo US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276, as quais são incorporadas na sua íntegra aqui pela referência.

Tecnologia de leito móvel simulado e real é geralmente adequada para separar misturas binárias. Assim, um componente mais polar moverá com o eluente, e será coletado como uma corrente de rafinado e um componente menos polar moverá com o adsorvente, e será coletado como uma corrente de extrato. É, portanto difícil usar tecnologia de leito móvel simulado ou real para separar um produto desejado de uma mistura bruta contendo tanto impurezas polares quanto não polares. Isto limita a aplicabilidade de tais técnicas na purificação dos produtos PUFA dos óleos de

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 14/176 peixe, por exemplo.

Dessa maneira, quando tecnologia de leito móvel simulado ou real era usada para separar PUFAs dos óleos naturais no passado, era geralmente necessário primeiro submeter o óleo natural a uma etapa de separação preliminar (por exemplo, cromatografia de coluna fixa) antes da purificação do produto intermediário obtido usando tecnologia de leito móvel simulado ou real (vide, por exemplo, EP-A-0697034). Tipicamente, a etapa de purificação inicial remove componentes polares ou não polares, assim criando uma mistura essencialmente binária que é então submetida a cromatografia de leito móvel.

Este processo de separar uma mistura binária está ilustrado com referência à figura 1. O conceito de um processo cromatográfico de separação contracorrente contínuo simulado ou real é explicado considerando uma coluna cromatográfica vertical contendo fase S estacionária dividida em seções, mais precisamente em quatro subzonas I, II, III e IV sobrepostas indo da base até o topo da coluna. O eluente é introduzido na base em IE por meio de uma bomba P. A mistura dos componentes A e B que têm de ser separados é introduzida em IA + B entre a subzona II e subzona III. Um extrato contendo principalmente B é coletado em SB entre a subzona I e subzona II e um rafinado contendo principalmente A é coletado em SA entre a subzona III e subzonaIV.

No caso de um sistema de leito móvel simulado, um movimento para baixo simulado da fase S estacionária é causado por movimento dos pontos de introdução e coleta relativos a fase sólida. No caso de um sistema de leito móvel real, movimento para baixo da fase S estacionária é causado por movimento das várias colunas cromatográficas relativas aos pontos de introdução e coleta. Na figura 1, eluente escoa para cima e mistura A + B é injetada entre a subzona II e subzona III. Os componentes moverão de acordo com suas interações cromatográficas com a

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 15/176 fase estacionária, por exemplo, adsorção em um meio poroso. O componente B que exibe afinidade mais forte na fase estacionária (o componente que corre mais lento) será arrastado mais lentamente pelo eluente e o seguirá com atraso. O componente A que exibe a afinidade mais fraca na fase estacionária (o componente que corre mais rápido) arrastado será facilmente pelo eluente. Se o conjunto correto de parâmetros, especialmente a vazão em cada zona, for corretamente estimado e controlado, o componente A que exibe a afinidade mais fraca na fase estacionária será coletado entre a subzona III e subzona IV como um rafinado e o componente B que exibe a afinidade mais forte na fase estacionária será coletado entre a subzona I e subzona II como um extrato.

Portanto, deve-se perceber que o sistema de leito móvel convencional esquematicamente ilustrado na figura 1 é limitado a fracionamento binário.

Dessa maneira, existe uma necessidade de um único processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real que pode separar PUFAs ou seus derivados de componentes que correm tanto mais lento quanto mais rápido (isto é, impurezas mais polares e menos polares), para produzir um PUFA essencialmente puro ou derivado deste. Deseja-se adicionalmente que o processo envolva eluentes baratos que operam em condições de temperatura e pressão padrões.

Surpreendentemente, observou-se agora que um produto PUFA pode ser efetivamente purificado com um único aparelho de leito móvel simulado ou real usando um eluente de álcool aquoso. A presente invenção, portanto fornece a um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA), de uma mistura de alimentação, cujo processo compreende introduzir a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real com uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas contendo, como eluente, um álcool aquoso, em que o aparelho tem uma pluralidade de

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 16/176 zonas compreendendo pelo menos uma primeira zona e segunda zona, cada zona com uma corrente de extrato e uma corrente de rafinado das quais o líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e em que (a) uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzido em uma coluna não adjacente na segunda zona e/ou (b) uma corrente de extrato contendo produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida na coluna não adjacente na primeira zona, o dito produto PUFA sendo separado dos diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona.

Também é provido um produto PUFA obtenível pelo processo da presente invenção.

Os produtos PUFA produzidos pelo processo da presente invenção são produzidos em alto rendimento, e têm alta pureza. Adicionalmente, o teor das distintas impurezas que tipicamente aumentam a partir da destilação de PUFAs é muito baixo. Da maneira aqui usada, os termos “impurezas isoméricas” são usados para denotar aquelas impurezas tipicamente produzidas durante a destilação de PUFA contendo óleos naturais. Essas incluem isômeros de PUFA, produtos de peroxidação e oligomerização.

A figura 1 ilustra os princípios básicos de um processo de leito móvel simulado ou real para separar a mistura binária.

A figura 2 ilustra uma primeira modalidade preferida da invenção que é adequada para separar EPA de componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 3 ilustra uma segunda modalidade preferida da invenção que é adequada para separar DHA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 4 ilustra com mais detalhes a primeira modalidade

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 17/176 preferida da invenção que é adequada para separar EPA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 5 ilustra com mais detalhes a segunda modalidade preferida da invenção que é adequada para separar DHA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 6 ilustra com mais detalhes um método alternativo para a primeira modalidade preferida da invenção que é adequado para separar EPA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 7 ilustra com mais detalhes um método alternativo para a segunda modalidade preferida da invenção que é adequado para separar DHA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 8 ilustra uma modalidade particularmente preferida da invenção para purificar EPA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 9 ilustra um método alternativo para uma modalidade particularmente preferida da invenção para purificar EPA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 10 ilustra uma modalidade particularmente preferida da invenção para purificar EPA dos componentes que correm mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).

A figura 11 mostra uma análise GC de um produto EPA produzido de acordo com a invenção.

A figura 12 mostra traços FAMES de GC das primeiras correntes de extrato e rafinado obtidos de acordo com a invenção.

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A figura 13 mostra traços FAMES de GC da segunda correntes de extrato e rafinado obtidos de acordo com a invenção.

A figura 14 mostra um traço FAMES de GC de um produto de DHA produzido de acordo com a invenção.

A figura 15 mostra um traço FAMES de GC de um produto de DHA produzido por destilação.

Os termos “ácido graxo poli-insaturado” (PUFA) referem-se a ácidos graxos que contêm mais que uma ligação dupla. Tais PUFAs são bem conhecidos pelos versados na técnica. Da maneira aqui usada, um derivado de PUFA é um PUFA na forma de um mono, di ou triglicerídeo, éster, fosfolipídio, amida, lactona ou sal. Triglicerídeos e ésteres são preferidos. Ésteres são mais preferidos. Ésteres são tipicamente ésteres de alquila, preferivelmente ésteres de alquila C1-C6, mais preferivelmente ésteres de alquila C1-C4. Exemplos de ésteres incluem ésteres de metila e etila. Ésteres etílicos são mais preferidos.

Da maneira usada aqui, os termos “produto PUFA” referem-se a um produto compreendendo um ou mais ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) e/ou seus derivados, tipicamente de significância nutricional ou farmacêutica. Tipicamente, o produto PUFA é um único PUFA ou derivado deste. Alternativamente, o produto PUFA é uma mistura de dois ou mais PUFAs ou seus derivados, por exemplo, dois.

Da maneira aqui usada, o termo “zona” refere-se a uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas contendo, como eluente, um álcool aquoso, e com um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou álcool, uma corrente de remoção de rafinado da qual o líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e uma corrente de remoção do extrato da qual o líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas. Tipicamente, cada zona tem somente um

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 19/176 ponto de injeção para uma mistura de alimentação em uma modalidade, cada zona tem somente um ponto de injeção para o eluente de álcool aquoso. Em uma outra modalidade, cada zona tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou álcool.

O termo “rafinado” é bem conhecido pelos versados na técnica. No contexto de cromatografia de leito móvel real e simulado ele refere-se à corrente de componentes que se movem mais rapidamente com a fase eluente líquida comparada com a fase adsorvente sólida. Assim, uma corrente de rafinado é tipicamente enriquecida com componentes mais polares, e empobrecida de componentes menos polares comparada com uma corrente de alimentação.

O termo “extrato” é bem conhecido pelos versados na técnica. No contexto de cromatografia de leito móvel real e simulado ele refere-se à corrente de componentes que se movem mais rapidamente com a fase adsorvente sólida comparada com a fase eluente líquida. Assim, uma corrente de extrato é tipicamente enriquecida com componentes menos polares, e empobrecida de componentes mais polares comparada com uma corrente de alimentação.

Da maneira aqui usada, os termos “não adjacente” quando aplicados às colunas no mesmo aparelho referem-se às colunas separadas por uma ou mais colunas, preferivelmente 3, ou mais colunas, mais preferivelmente 5 ou mais colunas, acima de tudo preferivelmente cerca de 5 colunas.

Assim, onde (a) uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, a corrente de rafinado coletada da primeira zona é a mistura de alimentação para a segunda zona. Onde (b) uma corrente de extrato contendo o produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 20/176 segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, a corrente de extrato coletado da segunda zona é a mistura de alimentação na primeira zona.

Tipicamente, o produto PUFA compreende pelo menos um PUFA ω-3 ou ω-6, preferivelmente pelo menos um PUFA ω-3. Exemplos dos ω-3 PUFAs incluem ácido alfa-linolênico (ALA), ácido estearidônico SDA), ácido eicosatrienóico (ETE), ácido eicosatetraenóico (ETA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenóico (DPA) e ácido (docosaexaenóico DHA). SDA, EPA, DPA e DHA são preferidos. EPA e DHA são mais preferidos. Exemplos de PUFAs ω-6 incluem ácido linoléico (LA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido eicosadienóico, ácido diomogama-linolênico (DGLA), ácido araquidônico (ARA), ácido docosadienóico, ácido adrênico e ácido docosapentaenóico (ω-6). LA, ARA , GLA e DGLA são preferidos.

Em uma modalidade, o produto PUFA é éster etílico EPA e/ou EPA (EE).

Em uma outra modalidade, o produto PUFA é éster etílico DHA e/ou EPA (EE).

Ainda em uma modalidade adicional, o produto PUFA é uma mistura de EPA e DHA e/ou EPA EE e DHA EE.

Misturas de alimentação adequadas para fracionamento pelo processo da presente invenção podem ser obtidas de fontes naturais incluindo óleos e gorduras vegetais e animais, e de fontes sintéticas incluindo óleos obtidos de plantas geneticamente modificadas, animais, e microorganismos incluindo leveduras. Exemplos incluem óleos de peixe, óleos de algas e microalgas e óleos de planta, por exemplo, óleo de borragem, óleo de Echium e óleo de prímula. Em uma modalidade, a mistura de alimentação é um óleo de peixe. Em uma outra modalidade, a mistura da alimentação é um óleo de alga. Óleos de alga são particularmente adequados quando o produto PUFA

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 21/176 desejado é EPA e/ou DHA. Óleo de girassol geneticamente modificado é particularmente adequado quando o produto PUFA desejado é GLA. Levedura geneticamente modificada é particularmente adequada quando o produto PUFA desejado é EPA.

A mistura de alimentação pode passar por tratamento químico antes do fracionamento pelo processo da invenção. Por exemplo, ela pode passar por transesterificação de glicerídeo ou hidrólise de glicerídeo seguida em certos casos por processos seletivos tais como cristalização, destilação molecular, fracionamento de uréia, extração com nitrato de prata ou outras soluções de sal de metal, iodolactonização ou fracionamento do fluido supercrítico.

As misturas de alimentação tipicamente contêm o produto PUFA e pelo menos um componente mais polar e pelo menos um componente menos polar. Os componentes menos polares têm uma aderência mais forte no adsorvente usado no processo da presente invenção do que o produto PUFA. Durante operação, tais componentes menos polares tipicamente se movem com a fase adsorvente sólida em preferência para a fase eluente líquida. Os componentes mais polares têm uma aderência mais fraca no adsorvente usado no processo da presente invenção do que o produto PUFA. Durante operação, tais componentes mais polares tipicamente se movem com a fase eluente líquida em preferência da fase adsorvente sólida. Em geral, componentes mais polares serão separados em uma corrente de rafinado, e componentes menos polares serão separados em uma corrente de extrato.

Exemplos dos componentes mais e menos polares incluem (1) outros compostos que ocorrem em óleos naturais (por exemplo, óleos marinhos ou óleos vegetais), (2) subprodutos formados durante as etapas de armazenamento, refino e concentração prévia e (3) contaminantes dos solventes ou reagentes que são utilizados durante etapas de refino ou purificação prévia.

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Exemplos de (1) incluem outro PUPAs indesejáveis; ácidos graxos saturados; esteróis, por exemplo, colesterol; vitaminas, e poluentes ambientais, tais como policlorobifenila (PCB), hidrocarboneto poliaromático (PAH) pesticidas, pesticidas cloradas, dioxinas e metais pesados. PCB, PAH, dioxinas e pesticidas cloradas são todos componentes altamente não polares.

Exemplos de (2) incluem isômeros e produtos de oxidação ou decomposição do produto PUFA, por exemplo, produtos poliméricos da autooxidação de ácidos graxos ou seus derivados.

Exemplos de (3) incluem uréia que pode ser adicionada para remover ácidos graxos saturados ou mono insaturados da mistura de alimentação.

Preferivelmente, a mistura de alimentação é um óleo marinho contendo PUFA, mais preferivelmente um óleo marinho compreendendo EPA e/ou DHA.

Uma mistura de alimentação típica para preparar EPA concentrado pelo processo da presente invenção compreende 50-75 % de EPA, 0 a 10 % de DHA, e outros componentes incluindo outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais.

Uma mistura de alimentação preferida para preparar EPA concentrado pelo processo da presente invenção compreende 55 % de EPA, 5 % de DHA, e outros componentes incluindo outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais. DHA é menos polar que EPA.

Uma mistura de alimentação típica para preparar DHA concentrado pelo processo da presente invenção compreende 50-75 % de DHA, 0 a 10 % de EPA, e outros componentes incluindo outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais.

Uma mistura de alimentação preferida para preparar DHA concentrado pelo processo da presente invenção compreende 75 % de DHA, 7% de EPA e outros componentes incluindo outros ácidos graxos ω-3 e ω-6

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Uma mistura de alimentação típica para preparar uma mistura concentrada de EPA e DHA pelo processo da presente invenção compreende mais que 33 % de EPA e mais que 22 % de DHA.

O processo da invenção exige uma pluralidade de zonas no dito aparelho de cromatografia. Tipicamente, duas ou mais zonas são usadas. O número de zonas não é particularmente limitado, mas no geral existem 2 a 5 zonas. Preferivelmente, existem duas ou três zonas, mais preferivelmente existem duas zonas.

Tipicamente, os componentes separados em cada zona do aparelho usado no processo da presente invenção têm diferentes polaridades.

Tipicamente, a) o eluente de álcool aquoso presente em cada zona tem uma razão água:álcool diferente; e/ou (b) a taxa na qual líquido coletado por meio das correntes de extrato e rafinado em cada zona é reciclado para a mesma zona é ajustada de maneira tal que o produto PUFA pode ser separado de diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona.

Quando o aparelho usado no processo da presente invenção tem duas zonas, a presente invenção tipicamente fornece um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poliinsaturado (PUFA), de uma mistura de alimentação, cujo processo compreende introduzir a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real com uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas contendo, como eluente, um álcool aquoso, em que o aparelho tem uma primeira zona e uma segunda zona, cada zona com uma corrente de extrato e uma corrente de rafinado das quais o líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e em que (a) uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 24/176 introduzida na coluna não adjacente na segunda zona, e/ou (b) uma corrente de extrato contendo o produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, o dito produto PUFA sendo separado de componentes menos polares da mistura de alimentação na primeira zona, e o dito produto PUFA sendo separado dos componentes mais polares da mistura de alimentação na segunda zona.

Tipicamente, quando o aparelho usado no processo da presente invenção contém duas zonas, o eluente na primeira zona contém mais álcool do que o eluente na segunda zona, e a segunda zona é à jusante da primeira zona com relação ao fluxo de eluente no sistema. Assim, o eluente no sistema tipicamente se move da primeira zona para a segunda zona. Ao contrário, a fase adsorvente sólida tipicamente se move da segunda zona para a primeira zona. Tipicamente, as duas zonas não se sobrepõem, isto é, não existe nenhuma coluna cromatográfica que esteja em ambas zonas.

Em uma modalidade adicional da invenção, o aparelho tem uma primeira zona, uma segunda zona e uma terceira zona. As razões água:alcoóis do eluente de álcool aquoso presente nas primeira segunda e terceira zonas são tipicamente diferentes. Conforme ficará evidente aos versados na técnica; isto tem a consequência de que impurezas com diferentes polaridades podem ser removidas em cada zona.

Preferivelmente, quando o aparelho tem três zonas, o eluente na primeira zona contém mais álcool do que o eluente na segunda zona e na terceira zona e a primeira zona são à montante da segunda e terceira zonas com relação ao fluxo de eluente no sistema. Tipicamente, o eluente na segunda zona contém mais álcool do que o eluente na terceira zona e a segunda zona é à montante da terceira zona com relação ao fluxo de eluente no sistema. Tipicamente, na primeira zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 25/176 produto PUFA. Tipicamente, na segunda zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação, que são menos polares do que o produto PUFA, mas mais polares que os componentes separados na primeira zona. Tipicamente, na terceira zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são mais polares do que o produto PUFA.

Em uma modalidade adicional, na primeira zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto PUFA, na segunda zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são mais polares que o produto PUFA e, na terceira zona, o dito produto PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são mais polares que o produto PUFA e também mais polares do que os componentes separados na segunda zona.

Uma configuração como essa com três zonas seria adequada para separar EPA e DHA de uma mistura contendo impurezas que são menos polares do que DHA e EPA e também contendo impurezas que são mais polares que EPA. Na primeira zona, os componentes que são menos polares do que DHA e EPA são removidos como uma corrente de extrato e uma corrente de rafinado compreendendo DHA, EPA e componentes que são mais polares que EPA é coletada e introduzida na segunda zona. Na segunda zona, DNA é removido como uma corrente de extrato e uma corrente de rafinado compreendendo EPA e componentes que são mais polares que EPA é coletada e introduzida na terceira zona. Na terceira zona, os componentes que são mais polares que EPA são removidos como uma corrente de rafinado e EPA purificado é coletado como uma corrente de extrato. Nesta modalidade, o EPA purificado é o produto PUFA purificado. Uma configuração como essa tem uma vantagem de que um PUFA secundário pode também ser recuperado. Neste caso, o PUFA secundário é o DNA

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Tipicamente, além do dito produto PUFA, um adicional produto PUFA secundário é coletado no processo de separação cromatográfica da invenção. Preferivelmente, o produto PUFA é EPA e o adicional produto PUFA secundário é DHA.

Em uma modalidade adicional da invenção, o aparelho é configurado para coletar um produto PUFA que é uma mistura concentrada de EPA e DHA. Assim, é usada uma mistura de alimentação que contém EPA, DNA, componentes que são mais polares que EPA e DHA, e componentes que são menos polares do que EPA e DNA. Na primeira zona, material menos polar do que EPA e DHA é removido. Na segunda zona, material que é mais polar que EPA e DHA é removido, e uma mistura concentrada de EPA e DHA é coletada como o produto PUFA.

Qualquer aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real conhecido pode ser utilizado para os propósitos do método da presente invenção, desde que o aparelho seja configurado com as múltiplas zonas, em particular duas, que caracterizam o processo da presente invenção, cujos aparelhos descritos em US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148, FR-A-2651149, US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276 podem todos ser usados se configurados de acordo com o processo da presente invenção.

O número de colunas usadas no aparelho não é particularmente limitado. Versados na técnica poderão facilmente determinar um número apropriado de colunas para usar. O número de colunas é tipicamente 8 ou mais, preferivelmente 15 ou mais. Em uma modalidade mais preferida, 15 ou 16 colunas são usadas. Em uma outra modalidade mais preferida, 19 ou 20 colunas são usadas. Em outras modalidades mais preferidas, 30 ou mais colunas são usadas. Tipicamente, não existem mais que 50 colunas, preferivelmente não mais que 40.

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Cada zona tipicamente consiste em uma porção aproximadamente igual de o número total de colunas. Assim, no caso de um aparelho configurado com duas zonas, cada zona tipicamente consiste em aproximadamente metade do número total de colunas cromatográficas no sistema. Assim, a primeira zona tipicamente compreende 4 ou mais, preferivelmente 8 ou mais, mais preferivelmente cerca de 8 colunas. A segunda zona tipicamente compreende 4 ou mais, preferivelmente 7 ou mais preferivelmente 7 ou 8 colunas.

As dimensões das colunas da maneira usada no aparelho não são particularmente limitadas, e dependerão do volume de mistura de alimentação a ser purificado. Versados na técnica poderão facilmente determinar apropriadamente colunas dimensionadas para usar. O diâmetro de cada coluna é tipicamente entre 10 e 500 mm, preferível entre 25 e 250 mm, mais preferível entre 50 e 100 mm, e acima de tudo preferivelmente entre 70 e 80 mm. O comprimento de cada coluna é tipicamente entre 10 e 200 cm, preferivelmente entre 25 e 150 cm, mais preferivelmente entre 70 e 110 cm, e acima de tudo preferivelmente entre 80 e 100 cm.

As colunas em cada zona tipicamente têm dimensões idênticas, mas podem, para certas aplicações, tem diferentes dimensões.

As vazões para a coluna são limitadas por pressões máximas através da série de colunas e dependerão das dimensões da coluna e tamanho de partícula das fases sólidas. Versados na técnica poderão facilmente estabelecer a vazão exigida para cada dimensão da coluna para garantir dessorção eficiente. Colunas de diâmetro maior em geral precisarão de maiores fluxos para manter fluxo linear através das colunas.

Para os tamanhos de coluna típicos esboçados anteriormente, e para um aparelho com duas zonas, tipicamente a vazão de eluente para a primeira zona é de 1 a 4,5 L/min, preferivelmente de 1,5 a 3,5 L/min. Tipicamente, a vazão do extrato para a primeira zona é de 0,1 a 2,5 L/min,

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 28/176 preferivelmente de 0,5 a 2,25 L/min. Em modalidades onde parte do extrato da primeira zona é reciclada para a primeira zona, a vazão de reciclagem é tipicamente de 0,7 a 1,4 L/min, preferivelmente cerca de 1 L/min. Tipicamente, a vazão do rafinado da primeira zona é de 0,2 a 2,5 L/min, preferivelmente de 0,3 a 2,0 L/min. Em modalidades onde parte do rafinado da primeira zona é reciclada para a primeira zona, a vazão de reciclagem é tipicamente de 0,3 a 1,0 L/min, preferivelmente cerca de 0,5 L/min. Tipicamente, a vazão de introdução da mistura de alimentação para a primeira zona é de 5 a 150 mL/min, preferivelmente de 10 a 100 L/min, mais preferivelmente de 20 a 60 mL /min.

Para os tamanhos de coluna típicos esboçados anteriormente, e para um aparelho com duas zonas, tipicamente a vazão de eluente para a segunda zona é de 1 a 4 L/min, preferivelmente de 1,5 a 3,5 L/min. Tipicamente, a vazão do extrato da segunda zona é de 0,5 a 2 L/min, preferivelmente de 0,7 a 19 L/min. Em modalidades onde parte do extrato da segunda zona é reciclada para a segunda zona, a vazão de reciclagem é tipicamente de 0,6 a 1,4 L/min, preferivelmente de 0,7 a 1,8 mL/min, mais preferivelmente cerca de 0,9 L/min. Tipicamente, a vazão do rafinado da segunda zona é de 0,5 a 2,5 L/min, preferivelmente de 0,7 a 1,8 L/min, mais preferivelmente cerca de 1,4 L/min.

Conforme versados na técnica perceberão, referências às taxas nas quais o líquido é coletado ou removido por meio das várias correntes de extrato e rafinado referem-se aos volumes de líquido removido em um período de tempo, tipicamente L/minuto. Similarmente, referências às taxas nas quais o líquido é reciclado para a mesma zona, tipicamente para uma coluna adjacente na mesma zona, referem-se aos volumes de líquido reciclado em um período de tempo, tipicamente L/minuto.

Tipicamente, parte de uma ou mais das correntes de extrato da primeira zona, da corrente de rafinado da primeira zona, da corrente de

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 29/176 extrato da segunda zona e da corrente de rafinado da segunda zona é reciclada para a mesma zona, tipicamente para uma coluna adjacente na mesma zona.

Esta reciclagem é diferente da alimentação de uma corrente de extrato ou de rafinado em uma coluna não adjacente em uma outra zona. Em vez disso, a reciclagem envolve alimentação de parte da corrente de extrato ou rafinado fora de uma zona de volta para a mesma zona, tipicamente para uma coluna adjacente na mesma zona.

A taxa na qual líquido coletado por meio do extrato ou corrente de rafinado da primeira ou segunda zonas é reciclado para a mesma zona é a taxa na qual líquido coletado por meio desta corrente é alimentado de volta para a mesma zona, tipicamente para uma coluna adjacente na mesma zona. Isto pode ser observado com referência à figura 9. A taxa de reciclagem de extrato na primeira zona é a taxa na qual o extrato coletado da base da coluna 2 é alimentado no topo de coluna 3, isto é, a vazão de líquido no topo da coluna 3. A taxa de reciclagem de extrato na segunda zona é a taxa na qual o extrato coletado na base da coluna 10 é alimentado no topo da coluna 11, isto é, a vazão de líquido para o topo da coluna 11.

A reciclagem das correntes de extrato e/ou rafinado é tipicamente realizada alimentando o líquido coletado por meio desta corrente em um recipiente, e então bombeando uma quantidade deste líquido do recipiente de volta para a mesma zona. Neste caso, a taxa de reciclagem de líquido coletado por meio de uma corrente de extrato ou rafinado particular, tipicamente de volta para uma coluna adjacente na mesma zona, é a taxa na qual líquido é bombeado para fora do recipiente de volta para a mesma zona, tipicamente para uma coluna adjacente.

Conforme versados na técnica perceberão, a quantidade de líquido sendo introduzida em uma zona por meio do eluente e correntes de estoque de alimentação é equilibrada com a quantidade de líquido removida de uma zona e reciclada para a mesma zona. Assim, com referência à figura 9,

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 30/176 para a corrente de extrato, a vazão de eluente (dessorvente) para a primeira ou segunda zona (D) é igual à taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato desta zona acumula em um recipiente (E1/E2) somada com taxa na qual o extrato é reciclado para a mesma zona (D-E1/DE2). Para a corrente de rafinado em uma zona, a taxa na qual o extrato é reciclado para uma zona (D-E1/D-E2) somada com a taxa na qual o estoque de alimentação é introduzido em uma zona (F/R1) é igual à taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado desta zona acumula em um recipiente (R1/R2) somada com a taxa na qual rafinado é reciclado para a mesma zona (D+F-E1-R1 /D+R1=E2-R2).

A taxa na qual líquido coletado de uma corrente de rafinado ou extrato particular proveniente de uma zona acumula em um recipiente pode também ser considerada a taxa líquida de remoção desta corrente de rafinado ou extrato desta zona.

Tipicamente, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato para fora da primeira zona é reciclado para a primeira zona difere daquela na qual o líquido coletado por meio da corrente de extrato para fora da segunda zona é reciclado para a segunda zona, e/ou a taxa na qual líquido coletado por meio desta corrente de rafinado para fora da primeira zona é reciclado para a primeira zona difere da taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado para fora da segunda zona é reciclado para a segunda zona.

A variação da taxa na qual líquido coletado por meio das correntes de extrato e ou rafinado em cada zona é reciclado para a mesma zona tem o efeito de variar a quantidade de componentes mais polares e menos polares presentes nas outras correntes de extrato e rafinado. Assim, por exemplo, uma menor taxa de reciclagem do extrato faz com que alguns dos componentes menos polares nesta zona sejam carregados através da corrente de rafinado nesta zona. Uma maior taxa de reciclagem do extrato faz com que

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 31/176 mais dos componentes menos polares nesta zona sejam carregados através da corrente de rafinado nesta zona. Isto pode ser observado, por exemplo, na modalidade específica da invenção mostrada na a figura 6. A taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato na primeira zona é reciclado para a mesma zona (D-E1) afetará até que ponto qualquer componente A é carregado através da corrente de rafinado na primeira zona (R1).

Tipicamente, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da primeira zona é reciclado para a primeira zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona é reciclado para a segunda zona. Preferivelmente, uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da primeira zona é reciclado para a primeira zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona é reciclado para a segunda zona.

Alternativamente, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da primeira zona é reciclado para a primeira zona é menor do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona é reciclado para a segunda zona.

Tipicamente, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da segunda zona é reciclado para a segunda zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da primeira zona é reciclado para a primeira zona. Preferivelmente, uma corrente de extrato contendo o produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, e o taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da segunda zona é reciclado para a segunda zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 32/176 primeira zona é reciclado para a primeira zona.

Alternativamente, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da segunda zona é reciclado para a segunda zona é menor do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da primeira zona é reciclado para a primeira zona.

O tempo da etapa, isto é, o tempo entre o deslocamento dos pontos de injeção da mistura de alimentação e eluente, e os vários pontos de retirada das frações coletadas, não é particularmente limitado, e dependerá do número e dimensões das colunas usadas, e a vazão através do aparelho. Versados na técnica poderão facilmente determinar o tempo apropriado das etapas para usar no processo da presente invenção. O tempo da etapa é tipicamente de 100 a 1.000 segundos, preferivelmente de 200 a 800 segundos, mais preferivelmente de cerca de 250 a cerca de 750 segundos. Em algumas modalidades, um tempo da etapa de 100 a 400 segundos, preferivelmente 200 a 300 segundos, mais preferivelmente cerca de 250 segundos é apropriado. Em outras modalidades, um tempo da etapa de 600 a 900 segundos, preferivelmente 700 a 800 segundos, mais preferivelmente cerca de 750 segundos é apropriado.

No processo da presente invenção, cromatografia de leito móvel real é preferida.

Adsorventes convencionais conhecidos na técnica para sistemas de leito móvel real e simulado podem ser usados no processo da presente invenção. Cada coluna cromatográfica pode conter o mesmo adsorvente, ou um adsorvente diferente. Tipicamente, cada coluna contém o mesmo adsorvente. Exemplos de tais materiais comumente usados são microesferas poliméricas, preferivelmente poliestireno reticulado com DVB (divinilbenzeno), e sílica gel, preferivelmente sílica gel ligada na fase reversa com alcanos C8 ou C18; especialmente C18. Sílica gel ligada na fase reversa C18 é preferida. O adsorvente usado no processo da presente invenção é

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 33/176 preferivelmente não polar.

A forma do material da fase estacionária do adsorvente pode ser, por exemplo, granulados esféricos ou não esféricos, preferivelmente granulados de forma substancialmente esféricos. Tais microesferas tipicamente têm um diâmetro de 40 a 500 microns; preferivelmente 100 a 500 microns, mais preferivelmente, 250 a 500 microns, ainda mais preferivelmente 250 a 400 microns, acima de tudo preferivelmente 250 a 350 microns. Esses tamanhos de partícula preferidos são um pouco maior que os tamanhos de partícula de microesferas usadas no passado em processos de leito móvel simulado e real. Uso de partículas grandes permite que uma pressão menor de eluente seja usada no sistema. Isto, por sua vez, tem vantagens em termos de reduções de custo, eficiência e vida útil do aparelho. Observou-se surpreendentemente que microesferas adsorventes de tamanho de partícula grande podem ser usadas no processo da presente invenção (com suas vantagens associadas) sem nenhuma perda em resolução.

O adsorvente tipicamente tem um tamanho de poro de 10 a 50 nm, preferivelmente 1,5 a 45 nm, mais preferivelmente 20 a 40 nm, acima de tudo preferivelmente 25 a 35 nm.

O eluente usado no processo da presente invenção é um álcool aquoso. O álcool aquoso tipicamente compreende água e um ou mais álcoois de cadeia pequena. O álcool de cadeia pequena tipicamente tem de 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos de álcoois adequados incluem metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol e t-butanol. Metanol e etanol, são preferidos. Metanol é mais preferido.

Tipicamente, o eluente não é em um estado supercrítico. Tipicamente, o eluente é um líquido.

Tipicamente, a razão água:álcool média do eluente em todo o aparelho é de 0,1:99,9 a 9:91 partes em volume, preferivelmente de 0,25:99,75 a 7:93 partes em volume, mais preferivelmente de 0,5:99,5 a 6:94

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 34/176 partes em volume.

A potência de eluição do eluente em cada uma das zonas é tipicamente diferente. Preferivelmente, a potência de eluição do eluente na primeira zona é maior que aquela do eluente na segunda zona e nas zonas subsequentes. Na prática, isto é obtido variando as quantidades relativas de água e álcool em cada zona. Álcoois são geralmente dessorventes mais potentes do que água. Assim, a quantidade de álcool no eluente na primeira zona é tipicamente maior que a quantidade de álcool no eluente da segunda zona e zonas subsequentes.

Em modalidades onde o álcool aquoso presente em cada zona tem um diferente teor de água e álcool, a razão água:álcool do eluente na primeira zona é tipicamente de 0:100 a 5:95 partes em volume, preferivelmente de 0,1:99,9 a 2,5:97,5 partes em volume, mais preferivelmente de 0,25:99,75 a 2:98 partes em volume, e acima de tudo preferivelmente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume. Nessas modalidades, a razão água:álcool do eluente na segunda zona é tipicamente de 3:97 a 7:93 partes em volume, preferivelmente de 4:96 a 6:94 partes em volume, mais preferivelmente de 4,5:95,5 a 5,5:94,5 partes em volume.

Em uma modalidade particularmente preferida onde o álcool aquoso presente em cada zona tem um diferente teor de água e álcool, a razão água:álcool do eluente na primeira zona é de 0,5:99,5 a 1,5:99,5 partes em volume, e a razão água:álcool do eluente na segunda zona é de 4:5 95:5 a 5,5:94,5 partes em volume.

Em modalidades onde a taxa na qual líquido coletado por meio das correntes de extrato e rafinado em cada zona é reciclado para a mesma zona é ajustada de maneira tal que o produto PUFA pode ser separado a partir de diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona, a razão água:álcool dos eluentes em cada zona pode ser a mesma ou diferente. Tipicamente, razão água:álcool do eluente em cada zona é de

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0,5:99,5 a 5,5:94,5 partes em volume. Em uma modalidade, a razão água:álcool do eluente na primeira zona é menor que a razão água:álcool do eluente na segunda zona. Em uma outra modalidade, a razão água:álcool do eluente na primeira zona é maior que a razão água:álcool do eluente na segunda zona. Em uma modalidade adicional, a razão água:álcool do eluente na primeira zona é a mesma da razão água:álcool na segunda zona.

Percebe-se que as razões de água e álcool em cada zona referida anteriormente são razões médias na totalidade da zona.

Tipicamente, a razão água:álcool do eluente em cada zona é controlada introduzindo água e/ou álcool em uma ou mais colunas nas zonas. Assim, por exemplo, para se obter uma razão água:álcool menor na primeira zona do que na segunda zona, água é tipicamente introduzida mais lentamente na primeira zona do que na segunda zona. Em algumas modalidades, álcool essencialmente puro e água essencialmente pura podem ser introduzidos em diferentes pontos em cada zona. As vazões relativas dessas duas correntes determinarão o perfil do solvente geral através da zona. Em outras modalidades, diferentes misturas de álcool/água podem ser introduzidas em diferentes pontos em cada zona. Isto envolverá introduzir duas ou mais diferentes misturas de álcool/água na zona, cada mistura de álcool/água com uma diferente razão álcool:água. As vazões relativas e concentrações relativas das misturas de álcool/água nesta modalidade determinarão o perfil do solvente geral através da zona. Em outras modalidades onde a razão água:álcool do eluente em cada zona é a mesma, a mesma mistura de álcool/água é introduzida em cada zona.

Tipicamente, o processo da presente invenção é conduzido de 15 a 55°C, preferivelmente de 20 a 40°C; mais preferivelmente a cerca de 30°C. Assim, o processo é tipicamente realizado à temperatura ambiente, mas pode ser conduzido em temperaturas elevadas.

O processo da presente invenção envolve introduzir uma

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 36/176 corrente de alimentação em uma zona (por exemplo, a primeira zona), coletar uma primeira corrente intermediária enriquecida com o produto PUFA e introduzir a primeira corrente intermediária em uma outra zona (por exemplo, a segunda zona). Assim, quando o aparelho tiver duas zonas, o processo envolve tanto (a) coletar uma primeira corrente intermediária da primeira zona e introduzi-la na segunda zona, quanto (b) coletar uma primeira corrente intermediária da segunda zona e introduzi-la na primeira zona. Desta maneira, o produto PUFA pode ser separado tanto dos componentes mais quanto menos polares em um único processo.

Tanto (a) uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, quanto (b) uma corrente de extrato contendo o produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona.

Em uma modalidade particularmente preferida, o aparelho tem duas zonas e o processo da presente invenção compreende:

(i) introduzir a mistura de alimentação na primeira zona, e remover uma primeira corrente de rafinado enriquecida com o produto PUFA e uma primeira corrente de extrato empobrecida do produto PUFA, e (ii) Introduzir a primeira corrente de rafinado na segunda zona, mover uma segundo corrente de rafinado empobrecida do produto PUFA, e coletar uma segunda corrente de extrato para obter o produto PUFA.

Esta modalidade particularmente preferida é adequada para purificar EPA de uma mistura de alimentação.

Esta modalidade particularmente preferida está ilustrada na figura 2. Uma mistura de alimentação F compreendendo o produto PUFA (B)

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 37/176 e componentes mais polares (C) e menos polares (A) é introduzida na primeira zona. Na primeira zona, os componentes menos polares (A) são removidos como corrente de extrato E1. O produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R1. A corrente de rafinado R1 é então introduzida na segunda zona. Na segunda zona, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R2. O produto PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2.

Esta modalidade está ilustrada com mais detalhes na figura 4. A figura 4 é idêntica à figura 2, exceto que os pontos de introdução de o dessorvente álcool (D) e água (W) em cada zona são mostrados. O dessorvente álcool (D) e água (W) juntos constituem o eluente. A fase (D) é tipicamente álcool essencialmente puro, mas pode, em certas modalidades, ser uma mistura de álcool/água compreendendo principalmente álcool. A fase (W) é tipicamente água essencialmente pura, mas pode, em certas modalidades, ser e mistura de álcool/água compreendendo principalmente água, por exemplo, uma mistura de 98 % de água/2 % de metanol.

Uma ilustração adicional desta modalidade particularmente preferida é mostrada na figura 6. Aqui não existe nenhum ponto de injeção de água separado e em vez disso um dessorvente álcool aquoso é injetado em (D).

A separação na corrente de rafinado e extrato pode ser ajudada variando a potência de dessorção do eluente em cada zona. Isto pode ser obtido introduzindo o componente álcool (ou rico em álcool) do eluente e o componente água (ou rico em água) em diferentes pontos em cada zona. Assim, tipicamente, o álcool é introduzido à montante do ponto de retirada de extrato e a água é introduzida entre o ponto de retirada de extrato e o ponto de introdução da alimentação na zona, com relação ao fluxo de eluente no sistema. Isto é mostrado na figura 4.

Alternativamente, a separação pode ser ajudada variando as

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 38/176 taxas nas quais o líquido coletado por meio das correntes de extrato e rafinado das duas zonas é reciclado para a mesma zona.

Tipicamente, nesta modalidade particularmente preferida, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da primeira zona é reciclado para a primeira zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona é reciclado para a segunda zona, ou a razão água:álcool do eluente na primeira zona é menor que aquela na segunda zona.

Nesta modalidade particularmente preferida a primeira corrente de rafinado na primeira zona é tipicamente removida à jusante do ponto de introdução da mistura de alimentação, na primeira zona, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Nesta modalidade particularmente preferida, a primeira corrente de extrato na primeira zona é tipicamente removida à montante do ponto de introdução da mistura de alimentação na primeira zona, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Nesta modalidade particularmente preferida, a segunda corrente de rafinado na segunda zona é tipicamente removida à jusante do ponto de introdução da primeira corrente de rafinado na segunda zona, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Nesta modalidade particularmente preferida, a segunda corrente de extrato na segunda zona é tipicamente coletada à montante do ponto de introdução da primeira corrente de rafinado na segunda zona, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Tipicamente, nesta modalidade particularmente preferida, o álcool ou álcool aquoso é introduzido na primeira zona à montante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Tipicamente, nesta modalidade particularmente preferida,

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 39/176 quando água é introduzida na primeira zona, a água é introduzida na primeira zona à montante do ponto de introdução da mistura de alimentação, mas à jusante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Tipicamente, nesta modalidade particularmente preferida, o álcool ou álcool aquoso é introduzido na segunda zona à montante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Tipicamente, nesta modalidade particularmente preferida, quando água é introduzida na segunda zona, a água é introduzida na segunda zona à montante do ponto de introdução da primeira corrente de rafinado, mas à jusante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Em uma outra modalidade particularmente preferida, o aparelho tem duas zonas, e o processo compreende:

(i) introduzir a mistura de alimentação na segunda zona, e remover uma primeira corrente de rafinado empobrecida do produto PUFA e uma primeira corrente de extrato enriquecida no produto PUFA, e (ii) introduzir a primeira corrente de extrato na primeira zona, remover uma segunda corrente de extrato empobrecida do produto PUFA, e coletar uma segunda corrente de rafinado para obter o produto PUFA.

Esta modalidade particularmente preferida é adequada para purificar DHA de uma mistura de alimentação.

Esta modalidade está ilustrada na figura 3. Uma mistura de alimentação F compreendendo o produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) e menos polares (A) é introduzido na segunda zona na segunda zona, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente R1 de rafinado. O produto PUFA (B) e componentes menos polares (A) são

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 40/176 coletados como corrente de extrato E1. A corrente de extrato E1 é então introduzida na primeira zona. Na primeira zona, os componentes menos polares (A) são removidos como corrente de extrato E2. O produto PUFA (B) é coletado como corrente de rafinado R2.

Esta modalidade está ilustrada com mais detalhes na figura 5. A figura 5 é idêntica à figura 3, exceto que os pontos de introdução do dessorvente álcool de cadeia pequena (D) e água (W) em cada zona são mostrados. Conforme anteriormente, a fase (D) é tipicamente álcool essencialmente puro, mas pode em certas modalidades ser uma mistura de álcool/água compreendendo principalmente álcool. A fase (W) é tipicamente água essencialmente pura, mas pode, em certas modalidades, ser um mistura álcool/água compreendendo principalmente água, por exemplo, uma mistura de 98 % de água/2 % de metanol.

Uma ilustração adicional desta modalidade particularmente preferida é mostrada na figura 7. Aqui, não existe nenhum ponto de injeção de água separado e em vez disso um dessorvente álcool aquoso é injetado em (D).

Tipicamente, nesta modalidade, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da segunda zona é reintroduzida na segunda zona é maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de rafinado da primeira zona é reintroduzida na primeira zona ou a razão água:álcool do eluente na primeira zona é menor que aquele na segunda zona.

Nesta segunda modalidade particularmente preferida, a primeira corrente de rafinado, na segunda zona é tipicamente removida à jusante do ponto de introdução da mistura de alimentação na segunda zona, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Nesta segunda modalidade particularmente preferida, a primeira corrente de extrato na segunda zona é tipicamente coletada à montante do ponto de introdução da mistura de alimentação na segunda zona,

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 41/176 com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Nesta segunda modalidade particularmente preferida, a segunda corrente de rafinado na primeira zona é tipicamente coletada à jusante do ponto, de introdução da primeira corrente de extrato na primeira zona, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Nesta segunda modalidade particularmente preferida, a segunda corrente de extrato na primeira zona é tipicamente removida à montante do ponto de introdução da primeira corrente de extrato na primeira zona, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Tipicamente, nesta segunda modalidade particularmente preferida, o álcool ou álcool aquoso é introduzido na segunda zona à montante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Tipicamente, nesta segunda modalidade particularmente preferida, quando água é introduzida na segunda zona, a água é introduzida na segunda zona à montante do ponto de introdução da mistura de alimentação, mas à jusante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na segunda zona.

Tipicamente, nesta segunda modalidade particularmente preferida, o álcool ou álcool aquoso é introduzido na primeira zona à montante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Tipicamente, nesta segunda modalidade particularmente preferida, quando água é introduzida na primeira zona, a água é introduzida na primeira zona à montante do ponto de introdução da primeira corrente de rafinado, mas à jusante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com relação ao fluxo de eluente na primeira zona.

Em uma modalidade preferida da invenção, o aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real consiste em quinze colunas

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 42/176 cromatográficas. Essas são referidas como colunas 1 a 15. As quinze colunas são arranjadas em série de forma que a base da coluna 1 seja ligada no topo da coluna 2, a base da coluna 2 seja ligada no topo da coluna 3 etc. Isto pode opcionalmente ser por meio de um recipiente de contenção, com uma corrente de reciclagem na coluna seguinte. O fluxo de eluente através do sistema é da coluna 1 para coluna 2 para coluna 3 etc. O fluxo de adsorvente através do sistema é da coluna 15 para coluna 14 para coluna 13, etc.

Em uma modalidade acima de tudo preferida, a primeira zona tipicamente consiste em oito colunas adjacentes, colunas 1 a 8, que são conectadas conforme discutido anteriormente. Nesta modalidade acima de tudo preferida, a segunda zona tipicamente consiste em sete colunas, colunas 9 a 15, que são conectadas conforme discutido anteriormente. Para evitar duplicidade, a base da coluna 8 na primeira zona é ligada no topo da coluna 9 na segunda zona.

Uma modalidade acima de tudo preferida está ilustrada na figura 8. Uma mistura de alimentação F compreendendo o produto PUFA, (B) e componentes mais polares (C) e menos polares (A) é introduzida no topo da coluna 5 na primeira zona. Dessorvente álcool é introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona. Água é introduzida no topo da coluna 4 na primeira zona. Na primeira zona, os componentes menos polares (A) são removidos como corrente de extrato E1 da base da coluna 2. O produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R1 da base da coluna 7. A corrente de rafinado R1 é então introduzida na segunda zona no topo da coluna 13. Dessorvente álcool é introduzido no topo da coluna 9 na segunda zona. Água é introduzida no topo da coluna 12 na segunda zona. Na segunda zona, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R2 na base da coluna 15. O produto PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2 na base da coluna 10.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, álcool é

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 43/176 tipicamente introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, água é tipicamente introduzida no topo da coluna 4 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, álcool é tipicamente introduzido no topo da coluna 9 na segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, álcool é tipicamente introduzido no topo da coluna 12 na segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, a corrente de alimentação é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma primeira corrente de rafinado é tipicamente coletada da base da coluna 7 na primeira zona e introduzida no topo da coluna 13 na segunda zona. A primeira corrente de rafinado pode opcionalmente ser coletada em um recipiente antes de ser introduzida na coluna 13.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma primeira corrente de extrato é tipicamente removida da base da coluna 2 na primeira zona. A primeira corrente de extrato pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 3 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma segunda corrente de rafinado é tipicamente removida da base da coluna 15 na segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma segunda corrente de extrato é tipicamente coletada da base da coluna na segunda zona. Esta segunda corrente de extrato tipicamente contém o produto PUFA purificado. A segunda corrente de extrato pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 11 na segunda zona.

Tipicamente, nesta modalidade acima de tudo preferida, a razão água:álcool na primeira zona é menor que a razão água:álcool na segunda zona.

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Uma modalidade adicional acima de tudo preferida está ilustrada na figura 9. Uma mistura de alimentação F compreendendo o produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) e menos polares (A) é introduzida no topo da coluna 5 na primeira zona. Dessorvente álcool aquoso é introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona. Na primeira zona, os componentes menos polares (A) são removidos como corrente de extrato E1 da base da coluna 2. O produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R1 da base da coluna 7. A corrente de rafinado R1 é então introduzida na segunda zona no topo da coluna 12. Dessorvente álcool aquoso é introduzido no topo da coluna 9 na segunda zona. Na segunda zona, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R2 na base da coluna 14. O produto PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2 na base da coluna 10.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, álcool aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, álcool aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 9 na segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, a corrente de alimentação é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 na primeira zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma primeira corrente de rafinado é tipicamente coletada da base da coluna 7 na primeira zona e introduzida no topo da coluna 12 na segunda zona. A primeira corrente de rafinado pode opcionalmente ser coletada em um recipiente antes de ser introduzida na coluna 12.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma primeira corrente de extrato é tipicamente removida da base da coluna 2 na primeira zona. A primeira corrente de extrato pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e uma porção reintroduzida no topo da coluna 3 na primeira zona. A taxa de reciclagem de líquido coletado por meio da corrente de extrato da

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 45/176 primeira zona de volta para a primeira zona é a taxa na qual líquido é bombeado deste recipiente para o topo da coluna 3.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma segunda corrente de rafinado é tipicamente removida da base da coluna 14 na segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, uma segunda corrente do extrato é tipicamente coletada da base da coluna 10 na segunda zona. Esta segunda corrente de extrato tipicamente contém o produto PUFA purificado. A segunda corrente de extrato pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e uma porção reintroduzida no topo da coluna 11 na segunda zona. A taxa de reciclagem de líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona de volta na segunda zona é a taxa na qual líquido é bombeado deste recipiente no topo da coluna 11.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da primeira zona é reciclado para a primeira zona é tipicamente maior do que a taxa na qual líquido coletado por meio da corrente de extrato da segunda zona é reciclado para a segunda zona.

Nesta modalidade acima de tudo preferida, o eluente de álcool aquoso é substancialmente a mesma em cada zona.

Em uma modalidade adicional preferida da invenção, o aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real consiste em dezenove colunas cromatográficas. Essas são referidas como colunas 1 a 19. As quinze colunas são arranjadas em série de forma que a base da coluna 1 seja ligada no topo da coluna 2, a base da coluna 2 seja ligada no topo da coluna 3, etc. O fluxo de eluente através do sistema é da coluna 11 para coluna 2 para coluna 3 etc. O fluxo de adsorvente através do sistema é da coluna 19 para coluna 18 para coluna 17, etc.

Nesta modalidade, a primeira zona tipicamente consiste em

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 46/176 dez colunas adjacentes, colunas 1 a 10, que são conectadas conforme discutido anteriormente. A segunda zona tipicamente consiste em oito colunas, colunas 11 a 19 que são conectadas conforme discutido anteriormente.

Esta modalidade adicional preferida está ilustrada na figura 10. Uma mistura de alimentação F compreendendo o produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) e menos polares (A e A') é introduzida no topo da coluna 7 na primeira zona. Um primeiro dessorvente (D1) compreendendo 100 % de álcool é introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona. Um segundo dessorvente (D2) compreendendo uma mistura água/álcool (preferivelmente 2 % de metanol e 98 % de água) é introduzido no topo da coluna 5 na primeira zona. Na primeira zona, componentes menos polares (A') e (A) são removidos como correntes de extrato E1' e E1 das bases das colunas 1 e 4, respectivamente O produto PUFA (B) e componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R1 da base da coluna

10. A corrente de rafinado R1 é então introduzida na segunda zona no topo da coluna 17. Um segundo dessorvente (D2) compreendendo uma mistura água/álcool (preferivelmente, 2 % de metanol e 98 % de água) é introduzido no topo da coluna 11 na segunda zona. Na segunda zona, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinado R2 na base da coluna 19. O produto PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2 na base da coluna, 14.

Nesta modalidade preferida, álcool é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 na primeira zona.

Nesta modalidade preferida, uma mistura de 2 % de MeOH/98 % de água é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 na primeira zona.

Nesta modalidade preferida, uma mistura de 2 % de MeOH/98 % de água é tipicamente introduzida no topo da coluna 11 na segunda zona.

Nesta modalidade preferida, a corrente de alimentação é

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Nesta modalidade preferida, uma primeira corrente de rafinado é tipicamente coletada da base da coluna 10 na primeira zona e introduzida no topo da coluna 17 na segunda zona. A primeira corrente de rafinado pode opcionalmente ser coletada em um recipiente antes de ser introduzida na coluna 17.

Nesta modalidade preferida, correntes de extrato são tipicamente removidas das bases das colunas 1 e 4 na primeira zona. A corrente de extrato coletada da base ou coluna 4 pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 5 na primeira zona.

Nesta modalidade preferida, uma segunda corrente de rafinado é tipicamente removida da base da coluna 19 na segunda zona.

Nesta modalidade preferida, uma segunda corrente de extrato é tipicamente coletada da base da coluna 14 na segunda zona. Esta segunda corrente de extrato tipicamente contém o produto PUFA purificado. A segunda corrente de extrato pode opcionalmente ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 15 na segunda zona.

Tipicamente, nesta modalidade acima de tudo preferida, a razão água:álcool na primeira zona é menor que a razão água:álcool na segunda zona.

O processo da invenção permite que purezas muito maiores de produto PUFA sejam obtidas do que foi possível com técnicas de cromatográfica convencionais. Os produtos PUFA produzidos pelo processo da invenção também têm perfis de impureza particularmente vantajosos, que são muito diferentes daqueles observados nos óleos preparados por técnicas conhecidas. A presente invenção portanto também diz respeito a composições compreendendo um produto PUFA, por exemplo, um obtenível pelo processo da presente invenção.

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Assim, em uma modalidade, a presente invenção também diz respeito a uma composição compreendendo um produto PUFA, em que o produto PUFA é EPA, o produto PUFA está presente em uma quantidade maior que 93 % em peso, e o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 é até 0,40 % em peso.

Da maneira aqui usada, % em peso de um componente é com relação ao peso total da composição.

O produto PUFA e PUFAs ω-6 são opcionalmente na forma de seus ésteres de alquila, tipicamente ésteres etílicos. Preferivelmente, o produto PUFA EPA é na forma de its éster etílico.

Tipicamente, nesta modalidade, o produto PUFA EPA está presente em uma quantidade maior que 94 % em peso, preferivelmente maior que 95 % em peso, maior preferivelmente maior que 96 % em peso, ainda maior preferivelmente maior que 97 % em peso, e acima de tudo preferivelmente maior que 98 % em peso.

O teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 nesta modalidade é até 0,40 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 até nesta quantidade. Tipicamente, o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 é até 0,35 % em peso, preferivelmente até 03 % em peso, mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,22 % em peso. Tipicamente, o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor de ácido araquidônico é até 025 % em peso, preferivelmente até 0,24 % em peso, mais preferivelmente até 0,23 % em peso e acima de tudo preferivelmente até 0,22 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido araquidônico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido araquidônico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 49/176 ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-3 é maior que 97 % em peso, preferivelmente maior que 97,5 % em peso, mais preferivelmente maior que 97,9 % em peso, em certas modalidades, o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-3 é maior que 99 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de DHA é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,6 % em peso, mais preferivelmente até 0,3 % em peso, acima de tudo preferivelmente até 0,2 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de DHA até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de DHA é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de DHA é até 0,2 % em peso, preferivelmente até 0,175 % em peso, mais preferivelmente até 0,16 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de DHA até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de DHA é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido αlinolênico é até l % em peso, preferivelmente até 0,6 % em peso, mais preferivelmente até 0,3 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido α-linolênico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido α-linolênico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido αlinolênico é até 0,35 % em peso, preferivelmente até 0,3 % em peso, mais preferivelmente até 0,29 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido α-linolênico nestas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido α-linolênico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

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Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido estearidônico é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,6 % em peso, mais preferivelmente até 0,3 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido estearidônico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido estearidônico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido estearidônico é até 0,4 % em peso, preferivelmente até 0,35 % em peso, mais preferivelmente até 0,34 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido estearidônico até essas quantidades.Tipicamente, o teor total de ácido estearidônico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0 1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido eicosatetraenóico é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,75, % em peso, mais preferivelmente até 0,5 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido eicosatetraenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido estearidônico é 0,5 % em peso ou mais preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido eicosatetraenóico é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,75 % em peso, mais preferivelmente até 0,5 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido eicosatetraenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido eicosatetraenóico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido eicosatetraenóico é até 0,5 % em peso, preferivelmente até 0,475 % em peso, mais preferivelmente até 0,46 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido eicosatetraenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido eicosatetraenóico é 0,05 % em peso ou

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 51/176 mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido docosapentaenóico é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,6 % em peso, mais preferivelmente até 0,3 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido docosapentaenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido docosapentaenóico é 0,5 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor total de ácido docosapentaenóico é até 0,4 % em peso, preferivelmente até 0,35 % em peso, mais preferivelmente até 0,33 % em peso Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido docosapentaenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido docosapentaenóico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Nesta modalidade, a composição preferivelmente compreende mais que 96,5 % em peso de EPA, até 1 % em peso de DHA até 1 % em peso de ácido α-linolênico, até 1 % em peso de ácido estearidônico, até 1 % em peso de ácido eicosatetraenóico, até 1 % em peso de ácido docosapentaenóico, e até 0,25 % em peso de ácido araquidônico.

Nesta modalidade, a composição preferivelmente compreende mais que 96,5 % em peso de EPA, até 0,2 % em peso de DHA, até 0,3 % em peso de ácido α-linolênico, até 0,4 % em peso de ácido estearidônico, até 0,5 % em peso de ácido eicosatetraenóico, até 0,35 % em peso de ácido docosapentaenóico, e até 0,25 % em peso de ácido araquidônico.

Nesta modalidade, a composição mais preferivelmente compreende de 96,5 a 99 % em peso de EPA, até 0,6 % em peso de DHA, até 0,6 % em peso, ácido α-linolênico de 0,15 a 0,6 % em peso de ácido estearidônico de 0,1 a 0,75 % em peso de ácido eicosatetraenóico, até 0,6 % em peso de ácido docosapentaenóico, e até 0,6 % em peso de ácido araquidônico.

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Nesta modalidade, a composição mais preferivelmente compreende de 96,5 a 99 % em peso de EPA, até 0,2 % em peso de DHA, até 0,3 % em peso de ácido α-linolênico, de 0,15 a 0,4 % em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido eicosatetraenóico, até 0,35 % em peso de ácido docosapentaenóico e até 0,25 % em peso de ácido araquidônico.

Nesta modalidade, a composição acima de tudo preferivelmente compreende de 98 a 99 % em peso de EPA, de 0,1 a 0,3 % em peso de DHA, de 0,3 a 035 % em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,3 % em peso de ácido eicosatetraenóico, e de 0,3 a 0,35 % em peso de ácido docosapentaenóico.

Nesta modalidade, a composição acima de tudo preferivelmente compreende de 96,5 a 99 % em peso de EPA, de 0,1 a 0,5 % em peso de DHA, de 0,1 a 05 % em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido eicosatetraenóico, e de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido docosapentaenóico, e de 0,1 a 0,3 % em peso de ácido araquidônico.

Nesta modalidade, a composição acima de tudo preferivelmente compreende de 98 a 99 % em peso de EPA, de 0,1 a 0,2 % em peso de DHA, de 0,3 a 0,35 % em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a, 0,2 % em peso de ácido eicosatetraenóico e de 0,3 a 0,35, % em peso de ácido docosapentaenóico.

Nesta modalidade, a composição acima de tudo preferivelmente compreende de 96,5 a 97,5 % em peso de EPA, de 0,25 a 0,35 % em peso de ácido α-linolênico, de 0,18 a 0,24 % em peso de ácido estearidônico, de 0,4 a 0,46 % em peso de ácido eicosatetraenóico e de 0,15 a 0,25 % em peso de ácido araquidônico.

Tipicamente, nesta modalidade, o teor de impurezas isoméricas é até 1,5 % em peso. Tipicamente, o teor de impurezas isoméricas é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,5 % em peso, mais preferivelmente

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 53/176 até 0,25 % em peso, ainda mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,1 % em peso.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção também diz respeito a uma composição compreendendo um produto PUFA, em que o produto PUFA é uma mistura de EPA e DHA, em que (i) o teor total de EPA e DHA é 80 % em peso o ou mais, (ii) o teor de EPA é de 41 a 60 % em peso e o teor de DHA é de 16 a 48 % em peso, e (iii) o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-3 é 94 % em peso ou mais e/ou o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-3 é até 4 % em peso.

O produto PUFA, PUFAs ω-3 e ω-6 são opcionalmente na forma de seus ésteres de alquila, tipicamente ésteres etílicos. Preferivelmente, o produto PUFA EPA/DHA é na forma de seus ésteres etílicos.

Assim, nesta modalidade adicional a composição é tipicamente uma composição compreendendo um produto PUFA, em que o produto PUFA é uma mistura de EPA e DHA, em que (i) o teor total de EPA e DHA é 80 % em peso ou mais, (ii) o teor de EPA é de 41 a 60 % em peso e o teor de DHA é de 16 a 48, % em peso, e (iii) o teor total de ácidos graxos poliinsaturados ω-3 é 94 % em peso ou mais.

Alternativamente, nesta modalidade adicional a composição é uma composição compreendendo um produto PUFA, em que o produto PUFA é uma mistura de EPA e DHA, em que (i) o teor total de EPA e DHA é 80 % em peso ou mais, (ii) o teor de EPA é de 41 a 60 % em peso e o teor de DHA é de 16 a 4,8 % em peso e (iii) o teor total de ácidos graxos poliinsaturados ω-6 é até 4 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de EPA e DHA é 82 % em peso ou mais, preferivelmente 83 % em peso ou mais, mais preferivelmente 84 % em peso ou mais, ainda mais preferivelmente 85 % em peso ou mais, e acima de tudo preferivelmente 86 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor de EPA é de

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 54/176 a 60 % em peso, preferivelmente de 45 a 60 % em peso, mais preferivelmente de 47 a 60 % em peso ainda mais preferivelmente de 47 a 57 % em peso, e acima de tudo preferivelmente de 50 a 55 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor de DHA é de 16 a 48 % em peso, preferivelmente de 20 a 45 % em peso, mais preferivelmente de 25 a 42 % em peso, ainda mais, preferivelmente de 28 a 38 % em peso, e acima de tudo preferivelmente de 30 a 35 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-3 é 94 % em peso ou mais, preferivelmente 95 % em peso ou mais, mais preferivelmente 96 % em peso ou mais, e acima de tudo preferivelmente 97 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido α-linolênico é até 0,4 % em peso, preferivelmente até 0,35 % em peso, mais preferivelmente até 0,31 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido α-linolênico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido α-linolênico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais, mais preferivelmente 0,2 % em peso ou mais, e ainda preferivelmente de 0,2 a 0,4 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido estearidônico é até 1,9 % em peso, preferivelmente até 1,5 % em peso, mais preferivelmente até 1,25, % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido estearidônico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido estearidônico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido eicosatetraenóico é até 2,0 % em peso, preferivelmente até 1,9 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido eicosatetraenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido eicosatetraenóico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 55/176 ou mais, mais preferivelmente 1,0 % em peso ou mais, e ainda mais preferivelmente de 1,0 a 1,9 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido eicosapentaenóico é até 3.0 % em peso, preferivelmente até 2.75 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido eicosapentaenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido eicosapentaenóico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais, mais preferivelmente 2 % em peso ou mais, ácido ainda mais preferivelmente de 2 a 2,75 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido docosapentaenóico é até 6 % em peso, preferivelmente até 5,5 % em peso, mais preferivelmente até 5,25 % em peso. Assim, tipicamente a composição compreende uma quantidade de ácido docosapentaenóico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido docosapentaenóico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais, mais preferivelmente 4 % em peso ou mais, e ainda mais preferivelmente de 4 a 5,25 % em peso.

O teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 nesta modalidade adicional é tipicamente até 4 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácidos graxos poli-insaturados ω6 até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácidos graxos poliinsaturados ω-6 é até 3,75 % em peso preferivelmente até 3,5 % em peso, mais preferivelmente até 3,25 % em peso, ainda mais preferivelmente até 3 % em peso, acima de tudo preferivelmente até 2,85 % em peso. Tipicamente, o teor total de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 é 0 05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido linoléico é até 0,5 % em peso, preferivelmente até 0,4 % em peso mais preferivelmente até 0,25 % em peso. Assim, tipicamente, a composição

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 56/176 compreende uma quantidade de ácido linoléico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido linoléico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais, mais preferivelmente 0,15 % em peso ou mais, e ainda mais preferivelmente de 0,15 a 0,25 % em peso.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido gama-linolênico é até 0,19 % em peso, preferivelmente até 0,15 % em peso, mais preferivelmente até 0,1 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido gama-linolênico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido gama-linolênico é 6,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido diomo-gama-linolênico é até 0,1 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido diomo-gama-linolênico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido diomo-gama-linolênico é 0,05 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido araquidônico é até 2,5 % em peso, preferivelmente até 2,25 % em peso, mais preferivelmente até 2,1 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido araquidônico até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido araquidônico é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido adrênico é até 0,1 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido adrênico até nesta quantidade. Tipicamente, o teor total de ácido adrênico é 0,05 % em peso ou mais.

Tipicamente, nesta modalidade adicional o teor total de ácido docosapentaenóico (ω-6) é até 0,9 % em peso, preferivelmente até 0,75 % em peso. Mais preferivelmente até 0,65 % em peso. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de ácido docosapentaenóico (ω-6)

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 57/176 até essas quantidades. Tipicamente, o teor total de ácido docosapentaenóico (ω-6) é 0,05 % em peso ou mais, preferivelmente 0,1 % em peso ou mais.

Nesta modalidade adicional, a composição preferivelmente compreende de 50 a 55 % em peso de EPA, de 30 a 35 % em peso de DHA, até 0,4 % em peso de ácido α-linolênico, até 1,25 % em peso de ácido estearidônico, até 1,9 % em peso de ácido eicosatetraenóico, até 2,75 % em peso de ácido eicosapentaenóico, até 5,25 % em peso de ácido docosatetraenóico, até 0,25 % em peso de ácido linoléico, até 0,1 % em peso de ácido gama-linolênico, até 0,1 % em peso de ácido diomo-gamalinolênico, até 2,1 % em peso de ácido araquidônico, até 0,1 % em peso de ácido adrênico, e até 0,75 % em peso do ácido docosapentaenóico (ω-6).

Nesta modalidade adicional, a composição mais preferivelmente compreende de 50 a 55 % em peso de EPA, de 30 a 35 % em peso de DHA, de 0,2 a 0,4 % em peso de ácido α-linolênico, até 1,25 % em peso de ácido estearidônico, de 1,0 a 1,9 % em peso de ácido eicosatetraenóico, de 2 a 2,75 % em peso de ácido eicosapentaenóico, de 4 a 5,25 % em peso de ácido docosapentaenóico, de 0,15 a 0,25 % em peso de ácido linoléico, até 0,1 % em peso de ácido gama-linolênico, até 0,1 % em peso de ácido diomo-gama-linolênico, até 2,1 % em peso de ácido araquidônico, até 0,1 % em peso de ácido adrênico, e até 0,75 % em peso de ácido docosapentaenóico (ω-6).

Tipicamente, nesta modalidade adicional, o teor de impurezas isoméricas é até 1,5 % em peso. Tipicamente, o teor de impurezas isoméricas é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,5 % em peso, mais preferivelmente até 0,25 % em peso, ainda mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,1 % em peso.

Os inventores observaram também surpreendentemente que podem ser produzidos óleos com uma pequena quantidade de poluentes ambientais, comparados com óleos conhecidos. Assim, ainda em uma

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 58/176 modalidade adicional, a presente invenção também diz respeito a uma composição compreendendo um produto PUFA, conforme definido aqui, em que (a) a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromático sem a composição é até 0,89 pg/kg (b) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,35 pg/g (c) a quantidade total de bifenilas policloradas é até 0,0035 mg/kg, e/ou (d) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas, dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 1 pg/g.

Tipicamente, a presente invenção diz respeito a uma composição compreendendo um produto PUFA conforme definido aqui, em que (a) a quantidade total de poliaromático hidrocarbonetos na composição é até 0,89 pg/kg (b) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,35 pg/g e/ou (d) a quantidade total de dioxinas, furanos e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 1 pg/g.

A quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos ainda nesta modalidade adicional na composição é até 0,89 pg/kg. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de hidrocarbonetos poliaromáticos até esta quantidade, Tipicamente, a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,85 pg/kg, preferivelmente até 0,9 pg/kg, mais preferivelmente até 0,7 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,5 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,5 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,4 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,3 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,2 pg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,1 pg/kg e acima de tudo preferivelmente até 0,05 pg/kg.

Hidrocarbonetos poliaromáticos típicos são bem conhecidos pelosos versados na técnica e incluem acenafteno, acenaftileno, antraceno, benzo [a]antraceno, benzo[a]pireno, benzo[e]pireno, benzo[b]fluoranteno, benzo[ghi]perileno, benzo[j]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, criseno,

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 59/176 dibenz(ah)antraceno, fluoranteno, flúor, indeno(1,2,3-cd)pireno, fenantreno, pireno, coroneno, coranuleno, tetraceno, naftaleno, pentaceno, trifenileno, e ovaleno. Tipicamente, as quantidades referidas anteriormente referem-se ao teor de benzo[a]pireno.

A quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-paradioxinas e dibenzofuranos policlorados ainda nesta modalidade adicional é até 0,35 pg/g. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados até esta quantidade. Tipicamente, a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,325 pg/g, preferivelmente até 0,3 pg/g, mais preferivelmente até 0,275 pg/g, ainda mais preferivelmente até 0,25 pg/g, ainda mais preferivelmente até 0,225 pg/g, ainda mais preferivelmente até 0,2 pg/g, e acima de tudo preferivelmente até 0,185 pg/g. Essas quantidades são expressas em World Health Organisation (WHO) de equivalência tóxica usando fatores equivalente tóxicos WHO (TEFs). Fatores equivalentes tóxicos WHO são bem conhecidos pelos versados na técnica.

Dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas (PCDDs) e dibenzofuranos policlorados (PCDFs) são bem conhecidos pelos versados na técnica. Tipicamente, esses são conforme definido em Community regulations (EC) No. 1881/2006 e 1883/2006 cuja íntegra é incorporada aqui pela referência.

O PCDDs, PCDFs e PCBs tipo dioxina definidos em

Community regulations (EC) No. 1881/2006 e 1883/2006 junto com suas áreas de valores TEF a seguir.

_________Congênere______

Dibenzo-p-dioxinas (PCDDs)

2.3.7.8-TCDD

1,2,3,7,S-PeCDD

1.2.3.4.7.8-HxCDD

1.2.3.6.7.8-HxCDD

1.2.3.7.8.9-HxCDD

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

V alor de TEF

0,1

0,1

0,1

0,01 ____________Congênere_______

PCBs tipo dioxina: PCBs não orto + PCBs mono orto

PCBs não orto

PCB 77

PCB 81

PCB 126

Valor de TEF

0,0001

0,0001

0,1

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 60/176

Congênere	V alor de TEF	Congênere	Valor de TEF
OCDD	0,0001	KB 169	0,01
Dibenzofuranos (PCDFs)		PCBs mono orto
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,0001
1,2,3,7,8-PeCDF	0,05	PCB 114	0,0005
2,3,4,7,8-PeCDF	0,5
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 118	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	KB 123	0,0001
1,2,3,7,S,9-HxCDF	0,1	PCB 156	0,0005
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 157	0,0005
1,2,3,4,6,7,S-HpCDF	0,01
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01	KB 167	0,00001
OCDF	0,0001	PCB 189	0,0001

Abreviações usadas: T = tetra, Pe = penta, Hx = hexa, Cx= octa, CDD = clorodibenzodioxina, CDF = clorodibenzofurano, CB = clorobifenila

Tipicamente, a quantidade de PCDDs, PCDFs PCBs tipo dioxina é determinada de acordo com o método demonstrado em Community regulations (EC) No: 1881/2006 e 1883/2006.

A quantidade total de bifenilas policloradas ainda nesta modalidade adicional é até 0,0035 mg/kg. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de bifenilas policloradas até estas quantidades Tipicamente, a quantidade total de bifenilas policloradas é até 0,03 mg/kg, preferivelmente até 0,0025 mg/kg mais preferivelmente até 0,002 mg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,0015 mg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,001 mg/kg, ainda mais preferivelmente até 0,00075 mg/kg, e acima de tudo preferivelmente até 0,0007 mg/kg.

Policlorobifenilas (PCBs) são bem conhecidas na técnica e incluem bifenila, morioclorobifenila, diclorobifenil triclorobifenila, tetraclorobifenila, pentaclorobifenila, hexaclorobifenil heptaclorobifenila, octaclorobifenila, nonaclorobifenila, e decaclorobifenila.

A quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-paradioxinas, dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina ainda nesta modalidade adicional é até l pg/g. Assim, tipicamente, a composição compreende uma quantidade de dioxinas, furanos, dibenzenopara-dioxinas, dibenzofuranos policlorados, e bifenilas policloradas até nesta quantidade. Tipicamente, a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzenopara-dioxinas, dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 0,75 pg/g, preferivelmente até 0,5 pg/g, mais preferivelmente até

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 61/176

0,45 pg/g, ainda mais preferivelmente até 0,4 pg/g, ainda mais preferivelmente até 0,35 pg/g, e acima de tudo preferivelmente até 0,3 pg/g.

Dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas (PCDDs), dibenzofuranos policlorados (PCDFs) e bifenilas policloradas tipo dioxina são bem conhecidos pelos versados na técnica. Tipicamente, esses são conforme definido em Community regulation (EC) No. 1881/2006 e 1883/2006 cuja íntegra está incorporada aqui pela referência.

O PCDDs, PCDFs e PCBs tipo dioxina definidos em Community regulation (EC) No. 1881/2006 e 1883/2006 junto com seus valores de TEF são conforme definido anteriormente.

Ainda nesta modalidade adicional, preferivelmente (a) a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,05 pg/kg, (b), a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,2 pg/g (c) a quantidade total de bifenilas policloradas é até 0,0015 mg/kg, e/ou (d) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 0,3 pg/g.

Ainda nesta modalidade adicional, preferivelmente (a) a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,05 pg/kg, (b), a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,2 pg/g e/ou (d) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 0,3 pg/g.

Ainda nesta modalidade adicional, mais preferivelmente (a) a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,05 pg/kg, (b), a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas, e dibenzofuranos policlorados é até 0,2 pg/g (c) a quantidade total de bifenilas policloradas é até 0,0015 mg/kg, e (d) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados e bifenilas

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 62/176 policloradas tipo dioxina é até 0,3 pg/g.

Ainda nesta modalidade adicional, mais preferivelmente (a) a quantidade total de hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,05 gg/kg, (b), a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é até 0,2 pg/g e (d) a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é até 0,3 pg/g.

Tipicamente, ainda nesta modalidade adicional, o teor de impurezas isoméricas é até 1,5 % em peso. Tipicamente, o teor de impurezas isoméricas é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,5 % em peso, mais preferivelmente até 0,25 % em peso, ainda mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,1 % em peso.

Os inventores também observaram que óleos de alta pureza podem ser produzidos que evitam os problemas de isomerização, peroxidação e oligomerização associados com óleos destilados. A quantidade de impurezas isoméricas presente em um produto PUFA da presente invenção dependerá da quantidade de impurezas isoméricas presente na mistura da alimentação. Crucialmente, entretanto, a quantidade de impurezas isoméricas é maior pelo processo da presente invenção, ao contrário de destilação. Assim, o limite do teor de isômeros no produto PUFA é o teor isomérico do material de partida. Se o material de partida não tiver nenhum isômero presente, então o produto PUFA resultante também será substancialmente livre de isômeros. Esta vantagem não é observada na destilação.

Assim, em uma modalidade, o processo de separação cromatográfica da presente invenção não aumenta substancialmente a quantidade de impurezas isoméricas no produto PUFA com relação à quantidade de impurezas isoméricas presentes na mistura de alimentação. “Aumentar substancialmente tipicamente significa aumentar em 10 % em peso ou menos, preferivelmente 5 % em peso ou menos, mais preferivelmente

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 63/176 % em peso ou menos, ainda mais preferivelmente 1 % em peso ou menos, ainda mais preferivelmente 0,5, % em peso ou menos e acima de tudo preferivelmente, 0,1 % em peso ou menos.

Assim, ainda em uma modalidade adicional, a presente invenção também fornece a uma composição compreendendo um produto PUFA, em que o teor de impurezas isoméricas é até 1,5 % em peso. Tipicamente, a composição contém uma quantidade de impurezas isoméricas até esta quantidade. Tipicamente, o teor de impurezas isoméricas é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,5 % em peso, mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,1 % em peso. Isomerização é particularmente problemática na preparação de DHA de alta pureza por destilação, devido a maiores temperaturas exigidas para separação. Tipicamente, o produto PUFA é DHA, opcionalmente na forma de seu éster etílico. Tipicamente a composição compreende mais que 85 % em peso do produto PUFA, preferivelmente mais que 90 % em peso, mais preferivelmente mais que 92,5 % em peso, acima de tudo preferivelmente mais que 95 % em peso. Preferivelmente, a composição compreende mais que 85 % em peso de DHA, opcionalmente na forma de seu éster etílico, preferivelmente mais que 90 % em peso mais preferivelmente mais que 92,5 % em peso, acima de tudo preferivelmente mais que 95 % em peso. Nesta modalidade, a composição tipicamente compreende o produto PUFA DHA opcionalmente, na forma de seu éster etílico, em uma quantidade maior que 95 % em peso, em que o teor de impurezas isoméricas é até 1 % em peso, preferivelmente até 0,5 % em peso, mais preferivelmente até 0,25 % em peso, e acima de tudo preferivelmente até 0,1, % em peso.

O processo melhorado da invenção permite que purezas muito maiores de produto PUFA sejam obtidas eficientemente, uma vez que as impurezas tanto mais quanto menos polares podem ser removidas em um único processo.

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 64/176

O produto PUFA da presente invenção tipicamente tem uma pureza maior que 80 % em peso, preferivelmente maior que 85 %, em peso mais preferivelmente maior que 90 % em peso, ainda mais preferivelmente maior que 95 peso %, ainda mais preferivelmente maior que 97 % em peso, e acima de tudo preferivelmente maior que 99 % em peso. Quando o produto PUFA é um único PUFA ou derivado deste, as concentrações anteriores referem-se à concentração deste PUFA ou derivado. Quando o produto PUFA é uma mistura de dois ou mais PUFAs ou seus derivados, por exemplo, dois, as concentrações anteriores referem-se à concentração combinada dos PUFAs, ou seus derivados.

O método da presente invenção também evita os problemas de isomerização, peroxidação e oligomerização associados com óleos destilados. O produto PUFA da presente invenção tipicamente tem um teor de impurezas isoméricas de menos que 5 % em peso, preferivelmente menos que 3 % em peso, e mais preferivelmente menos que 1 % em peso. Conforme mencionado anteriormente, as impurezas isoméricas incluem produtos de isômeros de PUFA peroxidação e oligomerização. Isômeros de PUFA incluem isômeros posicionais e/ou geométricos. Exemplos de isômeros posicionais e/ou geométricos de EPA incluem 17E-EPA, 5E-EPA, 5E, 8E-EPA, 8E, 11E-EPA, 5E, 14E-EPA, e 5E, 8E, 11E, 17E-EPA, Tais isômeros são discutidos com mais detalhes em Wijesundera, R.C., et al, Journal of the American Oil. Chemists Society, 1989, vol. 66, no: 12, 1822-1830, cuja íntegra está incorporada aqui pela referência.

Na prática, o processo da presente invenção geralmente será controlado por um computador. A presente invenção portanto também diz respeito a um programa de computador para controlar um aparelho cromatográfico conforme definido aqui, o programa de computador contendo dispositivo de código que quando executado instrui o aparelho para realizar o processo da invenção.

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Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe (55 % em peso de EPA EE, 5 % em peso de DHA EE) é fracionado usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando sílica gel C18 ligada (tamanho de partícula 300 pm) como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na figura

8. 15 colunas (diâmetro: 76,29 mm, comprimento: 914,40 mm) são conectadas em série como mostrado na figura 8.

Os parâmetros e vazões operacionais são como a seguir para oito diferentes casos. Para as condições a seguir, EPA EE é produzido a um alto nível de pureza (85 a 98 % por GC FAMES). Traços FAMES de GC do extrato e rafinado da zona 1 são mostrados como figuras 11 e 12 respectivamente.

Exemplo 1a

Tempo da etapa: 750 s

Tempo do ciclo: 200 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 70 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D): 850 mL/min

Taxa de extrato: 425 mL/min

Taxa de rafinado: 495 mL/min

Exemplo 1b

Tempo da etapa: 250 s

Tempo do ciclo: 66,67 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 210 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D): 2.550 mL/min

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 66/176

Taxa de extrato: 1.275 mL/min

Taxa de rafinado: 1.485 mL/min

Exemplo 1c

Tempo da etapa; 500 s

Tempo do ciclo: 13,133 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 25 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

2.050 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1) na primeira zona: 1.125 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona: 925 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 950 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

1.700 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E2) na segunda zona: 900 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona: 800 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 800 mL/min

Exemplo 1d

Tempo da etapa: 250 s

Tempo do ciclo: 66,67 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 50 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

4.125 mL/min.

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1) na primeira

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 67/176 zona: 2.250 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona:

1.875 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 1.925 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona

3.375 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E2) na segunda zona: 1.800 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona 1.575 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 1.575 mL/min

Exemplo 1e

Tempo da etapa: 500 s

Tempo do ciclo: 133,33 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 50 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona: 4.000 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1) na primeira zona: 2.250 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona:

1.750 mL/min

Taxa de rafinado (RI) na primeira zona: 18,00 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona: 3.200 mL/min.

Taxa de acúmulo de extrato líquido (E2) na segunda zona:

1.750 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona:

1.450 mL/min

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Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 1.450 mL/min

Exemplo 1f

Tempo da etapa: 250 s

Tempo do ciclo: 66,67 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 100 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

4.050 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1) na primeira zona: 2.100 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona;

1.950 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 2.050 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

3.300 mL/min

Taxa de acúmulo de extrato líquido (E2) na segunda zona:

1.700 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona:

1.600 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 1.600 mL/min

Exemplo 1g

Tempo da etapa: 500 s

Tempo do ciclo: 133,33 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 25 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

1275 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1), na primeira zona: 750 mL/min

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 69/176

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona: 550 mL/min

Taxa de rafinado (RI) na primeira zona: 575 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

1.275 mL/min

Taxa de acúmulo de extrato líquido (E2) na segunda zona: 950 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona: 325 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 325 mL/min

Exemplo 1h

Tempo da etapa: 25,0 s

Tempo do ciclo: 66,67 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 50 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

2.550 mL/min

Taxa de acúmulo do recipiente de extrato (E1) na primeira zona: 1.500 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D1-E1) na primeira zona: 950 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 1.000 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

2.000

Taxa de acúmulo de extrato líquido (E2) na segunda zona: 900 mL/min

Taxa de reciclagem do extrato (D2-E2) na segunda zona: 600 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 600 mL/min

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 70/176

Exemplo 2

Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe compreendendo éster etílico do ácido eicosatetraenóico (ETA EE), EPA EE, seus isômeros e DHA EE foram fracionados usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando sílica gel C18 ligada (tamanho de partícula 40-604 pm) como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na figura 10. 19 colunas (diâmetro: 10 mm, comprimento: 250 mm) são conectadas em série conforme mostrado na figura 10.

Os parâmetros e vazões operacionais são com a seguir.

Tempo do ciclo: 600 s.

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 0,5 mL/min.

Dessorvente (Dl, 100 % de metanol) taxa de alimentação na primeira zona: 6 mL/min

Dessorvente (D2, 99 % de metanol/1% de água) taxa de alimentação na primeira zona: 6 mL/min.

Taxa de extrato (E1) da primeira zona: 3 mL/min

Taxa de extrato (E1) da primeira zona: 1,9 mL/min

Taxa de rafinado (R1) da primeira zona: 4,6 mL/min

Dessorvente (D2, 97 % de metanol/3 % de água) taxa de alimentação na segunda zona 6 mL/min

Taxa de extrato (E2) da segunda zona: 2,4 mL/min

Taxa de rafinado (R2) da segunda zona: 4,6 mL/min

Novamente, EPA EE foi produzido a um alto nível de pureza (mais que 90 % em peso, mais que 95 % em peso, mais que 98 % em peso).

Exemplo 3

Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe (55 % em peso de EPA EE, 5 % em peso de DHA EE) foi fracionado usando um

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 71/176 sistema de cromatografia de leito móvel real usando silica gel C18 ligada (tamanho de partícula 300 pm, porosidade da partícula 150 angstroms) como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na figura 8. 15 colunas (diâmetro: 10 mm, comprimento: 250 mm) são conectadas em série conforme mostrado na figura 8.

Os parâmetros e vazões operacionais são com a seguir.

Tempo do ciclo: 380 s

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 0,5 mL/min

Dessorvente (D, 98,5 % de metanol/1,5 % de água) taxa de alimentação na primeira zona: 9 mL/min

Fase rica em água (W, 85 % de metanol/15 % de água) taxa de alimentação na primeira zona: 3,1 mL/min

Taxa de extrato (E1) da primeira zona: 4 mL/min

Taxa de rafinado (R1) da primeira zona: 8,6 mL/min

Dessorvente (D, 97 % de metanol/3 % de água) taxa de alimentação na segunda zona: 10,8 mL/min

Fase rica em água (W, 85 % de metanol/15 % de água): taxa de alimentação na segunda zona: 3,1 mL/min

Taxa de extrato (E2) da segunda zona: 4,1 mL/min

Taxa de rafinado (R2) da segunda zona: 10,3 mL/min

EPA EE foi produzido a um alto nível de pureza (>95 % de pureza). Um traço GC do produto é mostrado como figura 13

Exemplo 4

Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe (70 % em peso de DHA EE, 7 % em peso de EPA EE) é fracionado usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando sílica gel C18 ligada (tamanho de partícula 300 μm) como fase estacionária e metanol aquoso

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 72/176 como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na figura

8. 15 colunas (diâmetro: 76,29 mm, comprimento: 914,40 mm) são conectadas em série conforme mostrado na figura 8.

Os parâmetros e vazões operacionais são com a seguir.

Tempo da etapa: 600 s

Tempo do ciclo: 160 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 25 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona 2.062,5 mL/min

Taxa de extrato (E1) na primeira zona: 900 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 1.187,5 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

1.500 mL/min

Taxa de extrato (E2) na segunda zona: 450 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 1.050 mL/min

DHA EE é produzido a um alto nível de pureza (>97 % por GC FAMES). Um traço GC FAMES de extrato da zona 2 é mostrado como figura

14.

Exemple 5

Um estoque de alimentação (3,3 % em peso de EPA EE 22, % em peso de DHA EE) é fracionado usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando silica gel C18 ligada (tamanho de partícula 300 qm) como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na figura 8. 15 colunas (diâmetro: 76,29 mm, comprimento 914,40 mm) são conectadas em série conforme mostrado na figura 8.

Os parâmetros e vazões operacionais são com a seguir.

Tempo da etapa: 380 s

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 73/176

Tempo do ciclo: 101,33 min

Taxa de alimentação de estoque de alimentação (F): 40 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D1) na primeira zona:

1.950 mL/min

Taxa de extrato (E1) na primeira zona: 825 mL/min

Taxa de rafinado (R1) na primeira zona: 1.165 mL/min

Taxa de alimentação de dessorvente (D2) na segunda zona:

1.425 mL/min

Taxa de extrato (E2) na segunda zona: 787,5 mL/min

Taxa de rafinado (R2) na segunda zona: 637,5 mL/min.

Uma mistura de EPA EE e DHA EE é produzida a um alto nível de pureza >80 % de EPA EE e DHA EE total).

Exemplo 6

Um experimento foi realizado para comparar a quantidade de poluentes ambientais presente em dois produtos PUFA de acordo com a presente invenção com óleos similares preparados por destilação. Os perfis poluentes dos óleos são mostrados na tabela 1 a seguir.

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 74/176

Tabela 1

Parâmetro	Especificação liberação	da	Óleo destilado [1]	Óleo destilado [2]	Produto PUFA de acordo com a invenção [1]	Produto PUFA de acordo com a invenção [2]
Hidrocarbonetos poliaromáticos (PAH) (pg/kg) Benzo(a)pireno	NMT 2,0		0,90	0,90	<0,05	<0,05
Impurezas Dioxinas e furanos PCDDs e PCDFs1	NMT 2,0		0,46	0,37	0,2	0,184
(pg WHO-PCDD/F-TEQ/g)	NMT 0,09		0,0037	0,0103	0,0007	0,0012
PCBs (mg/kg)	NMT 10,0		1,03	0,466	0,30	0,298
Soma de dioxinas, furanos e PCBS2 tipo dioxina (pg WHO- PCDD/F-PCB-TEQ/g)

1) Limites de dioxina incluem a soma de dibenzo-paradioxinas policloradas (PCDDs) e dibenzofuranos policlorados (PCDFs) e expresso nos de equivalência tóxica World Health Organisation (WHO) usando fatores de equivalência tóxica-WHO (TEFs). Isto significa que resultados analíticos relacionados aos 17 congêneres de dioxinas individuais de preocupação toxicológica são expressos em uma única unidade quantificável: concentração de equivalência tóxica TCDD ou TEQ.

2) máximo para dioxina e furanos permanecem em 2pg/g.

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 75/176

Exemplo 7

Um experimento foi realizado para determinar a quantidade de impurezas isoméricas presente em um óleo preparado de acordo com a presente invenção comparada com um óleo equivalente preparado por destilação.

Um traço GC do óleo rico em DHA preparado de acordo com a invenção é mostrado como figura 14. Não existe evidência de impurezas isoméricas no traço GC.

Um traço GC do óleo preparado por destilação é mostrado como figura 15. Os quatro picos com maiores tempos de eluição do que o pico DHA correspondem aos isômeros de DHA. A partir do traço GC pode-se observar que o óleo preparado por destilação contém cerca de 1,5 % em peso de impurezas isoméricas.

Exemplo 8

Dois produtos ricos em EPA, do processo da presente invenção foram comparados com óleos ricos em EPA produzidos por destilação. A análise de % em peso de seus PUFAs componentes é mostrada a seguir.

Ácido graxo	Produto PUFA de acordo com a invenção [1]	Produto PUFA de acordo com a invenção [2]	Óleo destilado [1]	Óleo destilado [2]
EPA (C20:5n-3)	98,33	97,04	98,09	98,14
DHA (C22:6n-3)	0,15	<LOD	0,34	< LOD
C18:3 n-3	< LOD	0,28	0,24	< LOD
C18:4 n-3	0,33	0,20	0,14	0,26
C20:4 n-3	0,14	0,45	0,18	0,46
C21:5 n-3	< LOD	< LOD	< LOD	< LOD
C22:5 n-3	0,32	<LOD	< LOD	< LOD
Ômega-3 total	99,27	97,97	98,94	98,86
C18:3n-6	< LOD	< LOD	0,05	< LOD
C20:3 n-6	< LOD	< LOD	0,13	0,11
C20:4 n-6	< LOD	0,21	0,26	0,37
Ômega-6 total	< LOD	0,21	0,44	0,48

Exemplo 9

Um produto rico em EPA/DHA, do processo da presente invenção foi comparado com um óleo rico em EPA DHA produzido por destilação. A análise de % em peso de seus PUFAs componentes é

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 76/176 mostrada a seguir.

Ácido graxo	Éster etílico Maxomega (Ésteres etílicos Omega-3 90) % da área	Éster etílico destilado (Ésteres etílicos Omega-3 901) % da área
EPA (C20:5n-3)	53,3	46,6
DHA (C22:6n-3)	32,9	38,2
TOTAL EPA + DHA	86,2	84,8
C18:3 n-3	0,3	0,1
C18:4 n-3	1,2	2,0
C20:4 n-3	1,8	0,6
C21:5 n-3	2,7	1,8
C22:5 n-3	5,0	3,8
Total Omega-3	97,2	93,1
C18:2 n-6	0,2	0,1
C18:3n-6	<0,1	0,2
C20:3 n-6	<0,1	0,1
C20:4 n-6	2,0	2,6
C22:4 n-6	<0,1	0,1
C22:5 n-6	0,6	1,0
Total Omega-6	2,8	4,1

Petição 870190102397, de 11/10/2019, pág. 77/176

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA), a partir de uma mistura de alimentação, caracterizado pelo fato de que o processo compreende introduzir a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas contendo, como eluente, um álcool aquoso, em que o aparelho tem uma pluralidade de zonas compreendendo pelo menos uma primeira zona e segunda zona, cada zona tendo uma corrente de extrato e uma corrente de rafinado da qual o líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e em que (a) uma corrente de rafinado contendo o produto PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e/ou (b) uma corrente de extrato contendo o produto PUFA junto com componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, o dito produto PUFA sendo separado de diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que parte de uma ou mais da corrente de extrato da primeira zona, a corrente de rafinado da primeira zona, a corrente de extrato da segunda zona, e a corrente de rafinado da segunda zona são recicladas de volta na mesma zona, tipicamente em uma coluna adjacente na mesma zona.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que (a) o eluente álcool aquoso presente em cada zona tem uma diferente razão água:álcool; e/ou (b) a taxa na qual o líquido coletado pelas correntes do extrato

   Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 11/17 e de rafinado em cada zona é reciclada de volta na mesma zona é ajustada de maneira tal que o produto PUFA pode ser separado de diferentes componentes da mistura de alimentação em cada zona.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a taxa na qual o líquido coletado pela corrente de extrato fora da primeira zona é reciclada de volta na primeira zona difere da taxa na qual o líquido coletado pela corrente de extrato fora da segunda zona é reciclada de volta na segunda zona e/ou a taxa na qual líquido coletado pela corrente de rafinado fora da primeira zona é reciclada de volta na primeira zona difere da taxa na qual líquido coletado pela corrente de rafinado fora da segunda zona é reciclada de volta na segunda zona.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o aparelho tem uma primeira zona e uma segunda zona, o dito produto PUFA sendo separado de componentes menos polares da mistura de alimentação na primeira zona, e o dito produto PUFA sendo separado de componentes mais polares da mistura de alimentação na segunda zona.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o produto PUFA compreende pelo menos um ω-3 PUFA, e em que produto PUFA compreende preferivelmente EPA e/ou DHA.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que além do dito produto PUFA, um produto PUFA secundário adicional é recuperado no processo de separação cromatográfica, e em que o produto PUFA é preferivelmente EPA e o produto PUFA secundário adicional é preferivelmente DHA.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as colunas cromatográficas contêm, como adsorvente, granulados substancialmente esféricos, em que os granulados são

   Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 12/17 preferivelmente formados de gel de sílica ligado C18; e/ou em que os granulados substancialmente esféricos preferivelmente têm um diâmetro de 250 a 500 qm.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o eluente é uma mistura de água e um álcool C1-C6, em que o álcool C1-C6 é preferivelmente metanol ou etanol.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o eluente na primeira zona contém mais álcool que o eluente na segunda zona, e em que a segunda zona é à jusante da primeira zona, com relação ao fluxo do eluente no sistema; e/ou em que a razão água:álcool do eluente na primeira zona é de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume, e a razão de água:álcool do eluente na segunda zona é de 4,5:95,5 a 5,5:94,5 partes em volume; e/ou em que a razão água:álcool do eluente na primeira e segunda zonas é controlada introduzindo água e/ou álcool em uma ou mais colunas na primeira e segunda zonas.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado pelo fato de que a taxa na qual líquido coletado pela corrente de extrato da primeira zona é reciclada de volta na primeira zona é mais rápida que a taxa na qual líquido coletado pela corrente de extrato da segunda zona é reciclada de volta na segunda zona.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) (i) introduzir a mistura de alimentação na primeira zona, e remover uma primeira corrente de rafinado enriquecida com o produto PUFA e uma primeira corrente de extrato esgotada do produto PUFA, e (ii) introduzir a primeira corrente de rafinado na segunda zona, remover uma segunda corrente de rafinado empobrecida do produto PUFA e coletar uma segunda corrente de extrato para obter o produto PUFA; ou

    Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 13/17 (b) (i) introduzir a mistura de alimentação na segunda zona, e remover uma primeira corrente de rafinado esgotada do produto PUFA e uma primeira corrente de extrato enriquecida no produto PUFA, e (ii) introduzir a primeira corrente de extrato na primeira zona, remover uma segunda corrente de extrato esgotada do produto PUFA e coletar uma segunda corrente de rafinado para obter o produto PUFA.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tem quinze colunas cromatográficas 1 a 15; e/ou em que a primeira zona consiste em oito colunas adjacentes 1 a 8; e/ou em que a segunda zona consiste em sete colunas adjacentes 9 a

    15.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que (i) (a) álcool é introduzido na coluna 1, e/ou (b) álcool é introduzido na coluna 9, e/ou (c) água é introduzida na coluna 4 e/ou (d) água é introduzida na coluna 12; ou (ii) álcool aquoso é introduzido na coluna 1 e/ou coluna 9.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a primeira corrente de rafinado é coletada de coluna 7 e introduzida na coluna 13.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aparelho tem uma primeira zona, uma segunda zona e uma terceira zona e em que (a) o eluente na primeira zona contém mais álcool que o eluente na segunda e terceira zonas e a primeira zona é à montante da segunda e terceira zonas com relação ao fluxo do eluente no sistema e (b) o eluente na segunda zona contém mais álcool que o eluente na terceira zona e a segunda zona é à montante da terceira zona com relação ao fluxo do eluente no sistema, o dito produto PUFA sendo separado na primeira zona dos

    Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 14/17 componentes da mistura de alimentação que são menos polares que o produto PUFA, o dito produto PUFA sendo separado na segunda zona dos componentes da mistura de alimentação que são menos polares que o produto PUFA, mas mais polares que os componentes separados na primeira zona, e o dito produto PUFA sendo separado na terceira zona dos componentes da mistura de alimentação que são mais polares que o produto PUFA.
17. 17. Composição obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende um produto PUFA, ácidos graxos poli-insaturados ω-6 e ácido eicosatetraenóico ω-3, em que o produto PUFA é EPA presente em uma quantidade de 96,5 a 99 % em peso, a composição compreende uma quantidade de ácidos graxos poli-insaturados ω-6 de até 0,40 % em peso; e a composição compreende ainda ou:

    (a) - uma quantidade de ácido eicosatetraenóico ω-3 de 0,1 a 0,75% em peso;

    - uma quantidade de DHA de até 0,6% em peso;

    - uma quantidade de α-linoléico de até 0,6% em peso;

    - uma quantidade de ácido estearidônico de 0,15 a 0,6% em peso;

    - uma quantidade de ácido docosapentaenóico de até 0,6% em peso;

    uma quantidade de ácido araquidônico de até 0,6% em peso; ou (b) - uma quantidade de ácido eicosatetraenóico ω-3 de 0,1 a 0,5% em peso;

    - uma quantidade de DHA de até 0,2% em peso;

    - uma quantidade de α-linoléico de até 0,3% em peso;

    - uma quantidade de ácido estearidônico de 0,15 a 0,4% em peso;

    Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 15/17

    - uma quantidade de ácido docosapentaenóico de até 0,35% em peso; e

    - uma quantidade de ácido araquidônico de até 0,25% em peso.
18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a composição (a) compreende de 98 a 99% em peso de EPA, de 0,1 a 0,3% em peso de DHA, de 0,3 a 0,35% em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,3% em peso de ácido eicosatetraenóico ω-3 e de 0,3 a 0,35% em peso de ácido docosapentaenóico; ou (b) composição compreende de 96,5 a 99 % em peso de EPA, de 0,1 a 0,5 % em peso de DHA, de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido eicosatetraenóico ω-3, de 0,1 a 0,5 % em peso de ácido docosapentaenóico, e de 0,1 a 0,3 % em peso ácido araquidônico; ou (c) compreende de 98 a 99% de EPA, de 0,1 a 0,2% em peso de DHA, de 0,3 a 0,35% de ácido estearidônico, de 0,1 a 0,2% em peso de ácido eicosatetraenóico ω-3 e de 0,3 a 0,35% em peso de ácido docosapentaenóico; ou (d) compreende de 96,5 a 97,5% de EPA, de 0,25 a 0,35% em peso de ácido α-linoléico, de 0,18 a 0,24% em peso de ácido estearidônico, de 0,4 a 0,46% em peso de ácido eicosatetraenóico ω-3, e de 0,15 a 0,25 % em peso ácido araquidônico.
19. 19. Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma quantidade de impurezas isoméricas de até 1% em peso.
20. 20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade de purezas isoméricas de até 0,5% em peso, até 0,25% em peso ou até 0,1% em peso.
21. 21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que (a) a quantidade total de

    Petição 870200012258, de 27/01/2020, pág. 16/17 hidrocarbonetos poliaromáticos na composição é até 0,89 pg/kg, (b), a quantidade total de dioxinas, furanos, dibenzeno-para-dioxinas e dibenzofuranos policlorados é de até 0,35 pg/g (c) a quantidade total de bifenilas policloradas é de até 0,0035 mg/kg, e/ou (d) a quantidade total de 5 dioxinas, furanos, dibenzeno-pare-dioxinas, dibenzofuranos policlorados e bifenilas policloradas tipo dioxina é de até 1 pg/g.